Er is een vraag om preklinische testen voor een nieuwe klasse van "Wees" drugs genoemd farmacologische chaperones reproduceerbaar, snel en efficiënt. Voor patiënten die in aanmerking komen, alsmede nieuwe farmacologische chaperone drugs ontwikkelden we een eenvoudige, sterk gestandaardiseerde en veelzijdig cel cultuur gebaseerde bepaling naar het scherm.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
In Vitro Enzym meting aan Test farmacologische Chaperone responsiviteit in Fabry en de ziekte van Pompe
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het gebruik van gepersonaliseerde geneeskunde voor de behandeling van zeldzame monogeen ziekten zoals lysosomale opslag aandoeningen (LSDs) wordt uitgedaagd door de complexe klinische proef ontwerpen, hoge kosten en lage aantallen van de patiënt. Honderden mutant allelen zijn betrokken in de meeste van de LSDs. De ziekten zijn meestal ingedeeld in 2 tot 3 verschillende klinische typen volgens Ernst. Moleculaire karakterisering van het genotype kan bovendien helpen klinische resultaten voorspellen en informeren van de patiëntenzorg. Daarom ontwikkelden we een eenvoudige cel cultuur assay op basis van HEK293H-cellen geïnfecteerd uiten over de mutaties in de ziekte van Fabry en Pompe geïdentificeerd. Een soortgelijke bepaling is onlangs geïntroduceerd als een preklinische testen te identificeren vatbaar mutaties voor farmacologische Chaperone therapie (PCT's) in de ziekte van Fabry. Dit manuscript beschrijft een gewijzigde cel cultuur assay wat mogelijk maakt snelle fenotypische beoordelingvan allèlique varianten in Fabry en Pompe ziekte vast te stellen die in aanmerking komen patiënten voor PCT en kan steun bij de ontwikkeling van nieuwe pharmacochaperones.
Inleiding
Er zijn meer dan een dozijn lysosomale opslag aandoeningen (LSDs) gerelateerd aan glycosidase dysfunctie als gevolg van de primaire genmutaties. In Fabry (OMIM #301500) en de ziekte van Pompe (OMIM #232300), meer dan 500 en 200 missense mutaties1,2,3 zijn gemeld, respectievelijk, hetgeen overeenkomt met ongeveer 60% van de totale mutatie graaf. Worden nog talloze nieuwe varianten van de gen geïdentificeerd, waarvan vele hebben onbekende betekenis. Uitgebreide biochemische studies is gebleken dat bepaalde genotypes niet tot een volledige verlies-van-functie van het GLA
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. bereiding van Mutant pcDNA3.1/GLA en pcDNA3.1/GAA constructies
Opmerking: De klonen strategieën voor de GLA en GAA codering sequenties (cds) zijn gerapporteerde eerdere15,18.
- Plaats-geleide mutagenese met behulp van plaats-geleide mutagenese
- Gebruik de verwijzing sequenties NM_000169.2 en NM_000152.4 als sjablonen voor de mutagenese van GLA en GAA genen, respectievelijk. Heb een set van hoge zuiverheid zout gratis inleidingen (25-37-mers) gesynthetiseerd door een commerciële aanbieder, met betekenis en a....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De procedure van de mutagenese
Om te beoordelen van de efficiëntie van GLA gene mutagenese, werden de mutaties ingedeeld in één van de volgende categorieën. Deze aanpak voor het genereren van mutaties geopenbaard die ongeveer 66,5% voor de GLA mutaties werden verkregen in de eerste poging. Een verdere 25% kon worden verkregen na een enigszins gewijzigde tweede PCR.
Categorie 1: De mutagenese.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het protocol hierin beschreven levert robuuste resultaten voor de raming van de schade van de enzym in erfelijke Lysosomale ziekten van het metabolisme. Dit manuscript is dat een wijziging van het protocol gepubliceerd eerdere15. De meest cruciale wijzigingen betrekken striktheid (dat wil zeggen, in het proces van voorbereiding van mutant vector construct), standaardisatie van de cel-cultuur-protocol (dat wil zeggen, HEK293H cel onderhoud en transfectie voorwaarden) en de hoge aa.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
De auteurs wil erkennen van Mandy Loebert en Tina Czajka voor uitstekende technische ondersteuning. Wij danken Flora Luo (Harvard Medical School, Boston, MA, USA) voor taal bewerken help.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Materiaal | |||
| QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit | Stratagene, La Jolla, CA, USA | #200522 | |
| Primer GLA[R301Q]-frw: 5´- CTA ATG ACC TCC AAC ACA TCA GCC C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Duitsland | n.a. | |
| Primer GLA[R301Q]-rev: 5´- GGG CTG ATG TGT TGG AGG TCA TTA G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Duitsland | n.a. | |
| Primer GLA[A156V]-frw: 5´-CTA CGA CAT TGA TGT CCA GAC CTT TGC TG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Duitsland | n.a. | |
| Primer GLA[A156V]-rev: 5´-CAG CAA AGG TCT GGA CAT CAA TGT CGT AG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Duitsland | n.a. | |
| Primer GLA[A156V]-frw: 5´-GGA AAT AAA ACC TGC ACA GGC TTC CCT GGG A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Duitsland | n.a. | |
| Primer GLA[A143T]-rev: 5´-TCC CAG GGA AGC CTG TGC AGG TTT TAT TTC C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Duitsland | n.a. | |
| Primer GAA[F455Y]-frw: 5´-CTG CCG GGA GCT TCA GGC CCT ACG A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Duitsland | n.a. | |
| Primer GAA[F455Y]-rev: 5´-TCG TAG GGC CTG AAG CTC CCG GCA G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Duitsland | n.a. | |
| Primer GAA[P545L]-frw: 5´-CAC CCT ACG TGC TTG GGG TGG TTG G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Duitsland | n.a. | |
| Primer GAA[P545L]-rev: 5´-CCA ACC ACC CCA AGC ACG TAG GGT G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Duitsland | n.a. | |
| Primer GAA[L552P]-frw: 5´-TTG GGG GGA CCC CCC AGG CGG CCA C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Duitsland | n.a. | |
| Primer GAA[P545L]-rev: 5´-GTG GCC GCC TGG GGG GTC CCC CCA A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Duitsland | n.a. | |
| Primer T7: 5´-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Duitsland | n.a. | |
| Primer BGHrev: 5´-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Duitsland | n.a. | |
| Trypton | Carl Roth, Karlsruhe, Duitsland | 8952.1 | |
| Gistextract | Merck, Darmstadt, Duitsland | 103,753 | |
| Natriumchloride | Merck, Darmstadt, Duitsland | 1,064,041,000 | |
| Kaliumchloride | Merck, Darmstadt, Duitsland | 1,049,360,500 | |
| MgCl2 x 6H2O | Merck, Darmstadt, Duitsland | 1,058,330,250 | |
| D (+)-Glucose monohydraat | Merck, Darmstadt, Duitsland | 1,083,422,500 | |
| Natriumhydroxide | Merck, Darmstadt, Duitsland | 1,064,980,500 | |
| Glycine | Carl Roth, Karlsruhe, Duitsland | 3908.2 | |
| Citroenzuur | Carl Roth, Karlsruhe, Duitsland | X863.3 | |
| Dinatriumwaterstoffosfaat | Merck, Darmstadt, Duitsland | 1,065,860,500 | |
| Natriumacetaat | Merck, Darmstadt, Duitsland | 1,062,640,050 | |
| IJsazijn | Sigma Aldrich, München, Duitsland | A6283 | |
| LB Agar | Carl Roth, Karlsruhe, Duitsland | X969.2 | |
| LB Medium | Carl Roth, Karlsruhe, Duitsland | X968.2 | |
| Zyppy Plasmid Miniprep Kit | ZymoResearch, Freiburg, Duitsland | D4020 | |
| QIAfilter Plasmid Midi Kit | Qiagen, Hilden, Duitsland | 12245 | |
| HEK293H cellijn | Invitrogen, Karlsruhe, Duitsland | 11631-017 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle Medium | Invitrogen, Karlsruhe, Duitsland | 31966-047 | |
| HyClone foetaal bovien serum | GE Healthcare, South Logan, Utah, VS | SV30160.03 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen, Karlsruhe, Duitsland | 15140-122 | |
| CELLSTAR Standard Cell Culture Flasks, Greiner Bio One | VWR International GmbH, Hannover, Duitsland | 82050-854 | |
| Cell culture plates (24 well) | Sarstedt, Nümbrecht, Duitsland | 831,836 | |
| Cellstar 96 well plate | Greiner bio one, Frickenhausen, Duitsland | 655185 | |
| SafeSeal reactiebuisjes, 1,5mL | Sarstedt, Nümbrecht, Duitsland | 72,706 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Karlsruhe, Duitsland | 11668-019 | |
| 1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride | Sigma Aldrich, München, Duitsland | D9641 | |
| 1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride | Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada | D236500 | |
| 1-Deoxynojirimycin | Sigma Aldrich, München, Duitsland | D9305 | |
| PBS Dulbecco zonder Calcium, zonder Magnesium | Biochrom, Berlijn, Duitsland | L 1825 | |
| Trypsine-EDTA (0,05 |
Referenties
- Cardiff University. , http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index. (2017).
- Meiji Pharmaceutical University. , http://fabry-database.org (2017).
- Erasmus Medical Center. Mutations In Human Acid Alpha-Glucosidase. , http://cluster15.erasmusmc.nl/klgn/pompe/mutations.html?lang=en (2017).
- Ishii, S., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
