Methodenartikel

Lens-gratis videomicroscopie voor de dynamiek en de kwantitatieve analyse van aanhangend celkweek

DOI:

10.3791/56580

⸱

23 februari 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1CEA, LETI, DTBS, LISA, Université Grenoble Alpes, 2CEA, LETI, DTBS, LBAM, Université Grenoble Alpes, 3CEA, INSERM, BIG, Université Grenoble Alpes, 4CNRS, FR CNRS 3425, 5CNRS, UMR 144, Molecular Mechanisms of Intracellular Transport, PSL Research University, Institut Curie, 6TIMC-IMAG

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lens-vrije videomicroscopie ons in staat stelt om te controleren van celculturen direct in de incubator. Hier beschrijven we het volledige protocol gebruikt voor het verwerven en analyseren van een 2.7 dag lang verwerving van gekweekte HeLa cellen, wat leidt tot een dataset van 2.2 x 106 metingen van individuele cel morfologie en 10584 celcyclus tracks.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier, wij tonen die lens-gratis video microscopie laat ons tegelijkertijd vastleggen de kinetiek van duizenden cellen rechtstreeks binnen de incubator en dat het mogelijk is om te controleren en te kwantificeren van afzonderlijke cellen langs verschillende cel cycli. We beschrijven de volledige protocol dat wordt gebruikt om te controleren en te kwantificeren van een celkweek van HeLa 2.7 dagenlang. Eerst, cel cultuur overname is uitgevoerd met een lens-gratis video Microscoop, en vervolgens de gegevens wordt geanalyseerd na een proces van vier stappen: multi golflengte holografische wederopbouw, cel-tracking, mobiele segmentatie en celdeling detectie algoritmen. Dientengevolge, laten we zien dat het mogelijk is te verzamelen een dataset met meer dan 10.000 celcyclus tracks en meer dan 2 x 106 cel morfologische metingen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Monitoring van gekweekte zoogdiercellen in heel verschillende cel cycli en nauwkeurig meten cel grootte en cel drooggewicht is een uitdagende taak. Verschillende label-vrije optische technieken kunnen uitvoeren van deze taak1,2: fase-verschuiving interferometrie3, digitale holografische microscopie (DHM)4,5,6, 7, quadriwave laterale schuintrekken interferometrie8,9 en kwantitatieve fase tomografie

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. de controle op verwerving van celkweek

  1. HeLa cellen in DMEM + glutamine (bvGlutaMAX) groeien medium aangevuld met 10% (v/v) warmte-geïnactiveerd foetale kalf serum en 1% penicilline en streptomycine.
  2. Jas 6-goed bodem cultuur glasplaten met fibronectine (25 µg/mL) gedurende 1 uur. Vervolgens zaad 2 x 104 cellen per putje.
  3. Tijdens de overname, veranderen het medium om de 3 dagen.
  4. Voor de time-lapse overname, gebruikt u de video lens-vrije Microscoop (Los verkrijgbaar).
    Opmerking: Dit is gebaseerd op de lens-vrije computationele beeldvormende techniek zoals beschreven door Ozcan et al.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voor de holografische wederopbouwproces, het lichte gebied wordt beschreven door een scalair veld een (waar figure-results-1 is de complexe waarde van A op het vliegtuig op afstand z van de monster- en laterale positie figure-results-2 en op de golflengte λ). Lichte vermeerdering is gemodelleerd door de Huygens-Fresnel-theorie waarin een propagator kernel

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In deze paper, laten we zien dat lens-vrije videomicroscopie binnen een incubator te vangen de kinetiek van duizenden cellen kan worden gebruikt. Om de algemene methodologie beschrijven we uitgelegd hoe een time-lapse verwerving van 2.7 dag van HeLa cellen in cultuur kan worden geanalyseerd met standaard cel-tracking algoritmen. Het resultaat is een dataset met 2.2 x 106 cel metingen en 10,584 tracks van de celcyclus. De acquisities werden uitgevoerd op een cultuur van Hela cellen met een relatief grote afstan.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te erkennen.

....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Cytonote lens-free video microscope Iprasense
Horus acquisitiesoftwareIprasense
6-wells glazen bodem kweekplatenMatTek corporationArtikelnr: P06G-0-14-F 
DMEM + GlutaMAX medium Gibco
hitte-geïnactiveerd foetaal runder serum Eurobio
penicilline en streptomycine Gibco
Fibronectine Sigma Aldrich
Matlab, image processing toolbox Mathworks

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zangle, T. A., Teitell, M. A. Live-cell mass profiling: an emerging approach in quantitative biophysics. Nat Methods. 11 (12), 1221-1228 (2014).
  2. Popescu, G., Park, K., Mir, M., Bashir, R. New technologies for measuring single cell mass. Lab Chip. 14 (4), 646-652 (2014).....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Holografische reconstructieceltrackingcelsegmentatiedetectie van celdelingtime lapse acquisitieHeLa celanalysemulti golflengte verlichtingTrackMate algoritme

Gerelateerde artikelen