Methodenartikel

Lens-gratis videomicroscopie voor de dynamiek en de kwantitatieve analyse van aanhangend celkweek

DOI:

10.3791/56580

⸱

23 februari 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1CEA, LETI, DTBS, LISA, Université Grenoble Alpes, 2CEA, LETI, DTBS, LBAM, Université Grenoble Alpes, 3CEA, INSERM, BIG, Université Grenoble Alpes, 4CNRS, FR CNRS 3425, 5CNRS, UMR 144, Molecular Mechanisms of Intracellular Transport, PSL Research University, Institut Curie, 6TIMC-IMAG

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lens-vrije videomicroscopie ons in staat stelt om te controleren van celculturen direct in de incubator. Hier beschrijven we het volledige protocol gebruikt voor het verwerven en analyseren van een 2.7 dag lang verwerving van gekweekte HeLa cellen, wat leidt tot een dataset van 2.2 x 106 metingen van individuele cel morfologie en 10584 celcyclus tracks.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier, wij tonen die lens-gratis video microscopie laat ons tegelijkertijd vastleggen de kinetiek van duizenden cellen rechtstreeks binnen de incubator en dat het mogelijk is om te controleren en te kwantificeren van afzonderlijke cellen langs verschillende cel cycli. We beschrijven de volledige protocol dat wordt gebruikt om te controleren en te kwantificeren van een celkweek van HeLa 2.7 dagenlang. Eerst, cel cultuur overname is uitgevoerd met een lens-gratis video Microscoop, en vervolgens de gegevens wordt geanalyseerd na een proces van vier stappen: multi golflengte holografische wederopbouw, cel-tracking, mobiele segmentatie en celdeling detectie algoritmen. Dientengevolge, laten we zien dat het mogelijk is te verzamelen een dataset met meer dan 10.000 celcyclus tracks en meer dan 2 x 106 cel morfologische metingen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Monitoring van gekweekte zoogdiercellen in heel verschillende cel cycli en nauwkeurig meten cel grootte en cel drooggewicht is een uitdagende taak. Verschillende label-vrije optische technieken kunnen uitvoeren van deze taak1,2: fase-verschuiving interferometrie3, digitale holografische microscopie (DHM)4,5,6, 7, quadriwave laterale schuintrekken interferometrie8,9 en kwantitatieve fase tomografie10,11. Deze methoden hebben geleid tot veel nieuwe inzichten in het begrijpen van de celcyclus van zoogdiercellen. Maar zij worden zelden in combinatie met automatische cel bijhouden van algoritmen en hun doorvoer beperkt blijft bij het meten van massa trajecten1 cel (N < 20 in respectievelijk3,4,5 , 6). Vandaar een nieuwe optische methode voor het meten van de massa trajecten cel met grote statistieken nodig is (N > 1000).

In dit document tonen wij de mogelijkheden van de lens-vrije videomicroscopie voor gelijktijdig beeld duizenden cellen rechtstreeks binnen de incubator, en vervolgens het kwantificeren van eencellige statistieken langs duizenden individuele cel fietspaden. Lens-vrije microscopie is een kwantitatieve fase imaging techniek waarmee de overname van fase beeld van dichtbevolkte verpakte cellen over een zeer groot gezichtsveld (meestal enkele tientallen mm2, hier 29,4 mm2)12,13 ,14,15. Diverse maatstelsels op het niveau van één cel worden bepaald, bijvoorbeeldcel gebied, cel drooggewicht, cel dikte, lengte van de hoofdas cellen en cel hoogte-/ breedteverhouding12,15, van elke afbeelding. Vervolgens, door toepassing van een algoritme cel-tracking, deze functies kunnen worden uitgezet voor iedere enkele cel als functie van het experiment tijd14,15. Bovendien, door het detecteren van de aanwezigheid van celdelingen in de cel nummers, het is mogelijk om uit te pakken van andere belangrijke informatie, zoals de eerste cel droge massa (net na de celdeling), de laatste cel drooggewicht (net voor de afdeling van de cel) en de cel cyclus duur, dat wil zeggen, de tijd tussen twee opeenvolgende divisies15. Alle deze metingen kunnen worden berekend met zeer goede statistieken (N > 1000) Aangezien het groot gezichtsveld zou meestal de analyse van 200 naar 10000 cellen in een enkele lens-gratis overname.

Om uit te leggen deze methode gebaseerd op de lens-vrije videomicroscopie, beschrijven we het protocol om te controleren en te kwantificeren van een celkweek van HeLa 2.7 dagenlang. Data-analyse is een vier-stappen-proces op basis van multi golflengte holografische wederopbouw, cel-tracking, mobiele segmentatie en celdeling algoritmen. Hier wordt aangetoond dat de ruimtelijke resolutie en de relatief snelle framerate (een acquisitie om de 10 minuten) verkregen met deze lens-vrije videomicroscopie setup compatibel met standaard cel-tracking algoritmen. De volledige analyse van deze dataset resulteert in de meting van 10,584 cel nummers over volledige cel cycli.

Om samen te vatten, is lens-vrije videomicroscopie een krachtig hulpmiddel voor het automatisch controleren van duizenden labelloze, niet-gesynchroniseerde en ongewijzigde cellen per experiment; elke cel wordt bijgehouden over meerdere cel cycli. Onze metingen bieden dus de gemiddelde waarde van verschillende parameters van de cel, maar nog belangrijker, de variabiliteit van Inter cel over een grote bevolking van cellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. de controle op verwerving van celkweek

  1. HeLa cellen in DMEM + glutamine (bvGlutaMAX) groeien medium aangevuld met 10% (v/v) warmte-geïnactiveerd foetale kalf serum en 1% penicilline en streptomycine.
  2. Jas 6-goed bodem cultuur glasplaten met fibronectine (25 µg/mL) gedurende 1 uur. Vervolgens zaad 2 x 104 cellen per putje.
  3. Tijdens de overname, veranderen het medium om de 3 dagen.
  4. Voor de time-lapse overname, gebruikt u de video lens-vrije Microscoop (Los verkrijgbaar).
    Opmerking: Dit is gebaseerd op de lens-vrije computationele beeldvormende techniek zoals beschreven door Ozcan et al. 16 die is bewerkt voor het uitvoeren van continue monitoring in een incubator bij een gecontroleerde temperatuur van 37 ° C12,15. Het beschikt over een aanvullend metalen zuurstofverbinding semiconductor (CMOS) spiegelbeeld voeler met een pixelgrootte van 1.67 µm en een opnamegebied van 6.4 x 4,6 mm2. Meerdere golflengte verlichting wordt geleverd door een multichip licht emitterende diode (LED's) apparaat levert van rode, groene en blauwe verlichting. De golflengten zijn gecentreerd, op 636, 521 en 452 nm met een spectrale bandbreedte van 25, 45 en 25 respectievelijk nm respectievelijk. De rood-groen-blauw (RGB) LEDs bevinden zich boven een 150 µm gaatje op een afstand van ongeveer 5 cm uit de cellen. Het licht gemeten dichtbij de LED vermogen is zo laag als 10 μW bij elke golflengte en de tijd van de verlichting is slechts één seconde per acquisitie. Dus, geen foto-toxiciteit problemen worden verwacht wanneer celculturen worden waargenomen onder de lens-gratis video Microscoop.
  5. Zet de cel cultuur container bracht in contact met de CMOS-sensor (Figuur 1). Gebruik een container met een dekglaasje glas aan aan de onderkant, die belangrijk is voor de kwaliteit van de lens-gratis overname. Plastic verpakkingen kunnen ook worden gebruikt, maar de lens-gratis overname zal worden afgebroken als gevolg van de slechte optische kwaliteit van deze containers.
  6. Controle van de video lens-vrije Microscoop met de acquisitie software (Los verkrijgbaar), die zowel de time-lapse acquisitie en de holografische wederopbouw voert. De parameters die moeten worden opgenomen door de gebruiker in de interface van de software zijn de framesnelheid, de duur van het experiment, en het type van de cultuur van de cel, d.w.z. Adherente cellen of zwevende cellen.
  7. Stel de invoerparameters van de acquisitie software. Stel de framesnelheid ingesteld op één verwerving elke 10 minuten en het celtype cultuur te 'aanhanger'.
    Opmerking: Een framesnelheid van een acquisitie om de 10 minuten is een goed compromis, aangezien hierdoor een betrouwbare cel bijhouden terwijl de grootte van de resulterende dataset te analyseren nog redelijk is. De snelste framesnelheid haalbaar met deze lens-vrije microscopie opstelling is een overname elke 5 minuten. Verdere verhoging van de framesnelheid resulteert in buitensporige verwarming van de CMOS sensor die kan invloed hebben op de levensvatbaarheid van de cellen in de cultuur.
  8. Start de time-lapse verwerving en de holografische wederopbouw algoritme (Los verkrijgbaar) verwerkt automatisch de lens-gratis overname met het oog op het imago van de fase van de cultuur van de cel. De holografische wederopbouw-algoritme is gebaseerd op een multi golflengte fase ophalen algoritme17 en biedt een RGB-afbeelding van de gereconstrueerde fase in het bereik van [-π, + π] voor iedere enkele cel over een groot gezichtsveld van 29,4 mm2. Het principe van lens-vrije in-lijn holografie is voor het verlichten van een dunne monster (op z = 0) met een vliegtuig Golf (amplitude 1 na normalisatie) en te detecteren op een CMOS-sensor van de latere diffractie intensiteit afbeelding op een korte afstand z = Z, meestal 1 mm na de monster. In onze opstelling, de verlichting is sequentieel overgeschakeld naar 3 golflengten (λ1= 0.450 µm, λ2= 0.540 µm, λ3= 0.647 µm) voor het meten van drie diffractie patronen van hetzelfde monster.

2. cel cultuur Data-analyse

  1. Voor cel-tracking, gebruikt u de Trackmate-algoritme, een opensource Fiji plugin voor het geautomatiseerde volgen van enkele deeltjes18. At eerst, laad de volledige time-lapse overname in Fiji (de opdracht van de volgorde van de afbeelding van de belasting). Vanwege de grote omvang van de datasets, die meestal 400 RGB frames van 29,7 Mb kenmerkt, is het sneller om ze te laden in 8-bits indeling. Naast begeleidt de plugin van Trackmate Fiji de gebruiker door verschillende stadia van het algoritme van de cel-tracking, namelijk een cel detectie stadium, een cel tracker fase en meerdere filters toegepast op de cel detecties en de berekende nummers. In iedere fase, de algoritmen configureren en weergeven van de resultaten onmiddellijk zodat, indien nodig, een gemakkelijk heen en weer navigeren kunt om te passen de instellingen. De verschillende menu's van de Trackmate-interface worden weergegeven in Figuur 2 met de werkelijke instellingen die worden gebruikt voor de HeLa cellen experiment.
  2. Stel de invoerparameters van de overname-software als volgt (Zie Figuur 2). Stel de geschatte blob-diameter 15 pixels, de drempel van de detector op 0,25, de koppeling maximumafstand 15 pixels, de kloof-sluiting max afstand tot 15 pixels en het aantal plekken in de nummers 3.5.
    Opmerking: Deze instellingen zal uiteraard verschillen van één experiment naar de andere, met name de 'geschatte blob diameter' die overeenkomt met de grootte van de cel (hier gegeven in pixels 1.67 µm). Dezelfde opmerking geldt voor het ' koppelen max' die goed zijn voor de maximumafstand afgelegde afstand door een cel binnen twee opeenvolgende frames (hier gegeven in pixels 1.67 µm). De optimale waarde zou afhangt van de beweeglijkheid van de cel maar ook van de celdichtheid.
  3. Aan het einde van de cel-tracking proces, de resultaten te genereren in de vorm van drie tekstbestanden ('Analyse' knop, Zie Figuur 2). Het nuttigste bestand, genaamd 'Spots in tracks statistieken', bestaat uit een tabel met alle gedetecteerde cellen met hun respectieve (x, y) posities in de verwerving, hun framenummer en hun nummer. Op basis van deze gegevens, uitvoeren van cel segmentatie en celdelingen met speciale algoritmen (Zie aanvullende codebestanden) detecteren. De twee andere bestanden heten 'Links in de statistieken van de tracks' en 'Track statistieken' en omvatten alle resultaten die zich bezighouden met de tracks, zoals de duur van de track, aantal gedetecteerde lacunes, nummer van eerste frame, enz.
  4. Gebruik de cel segmentatie algoritme (Zie aanvullende codebestand) automatisch uitpakken van diverse maatstelsels beschrijven de morfologie van de cel van de gereconstrueerde fase afbeelding. Deze statistieken zijn de cel-oppervlakte (S), de cel hoofdas lengte (L), de cel secundaire as lengte (l) en de hoogte-breedteverhouding van de cel (L/l). De fase die lens-vrije microscopie verhaald is evenredig met de dichtheid en de dikte van de laag van het model zoals eerder besproken15.
  5. Naast de morfologische eigenschappen van de cel, uittreksel kwantitatieve cel droge massa (CDM) metingen van de gereconstrueerde fase13,19,20
    figure-protocol-1EQ. (1)
    waar φ(x,y) is de gereconstrueerde fase verschuiving19, λ de golflengte en α = 1,8 x 10-4 m3/kg de specifieke brekingsindex, namelijk de variatie van de brekingsindex te drogen massa1, 19.
  6. De dikte van de cel met behulp van een schatting van het verschil tussen de brekingsindex van de cel en die van de voedingsbodems evalueren. De relatie tussen de cel dikte h(x,y) en de gemeten faseverschuiving wordt gegeven door20:
    figure-protocol-2EQ. (2.1)
    figure-protocol-3EQ. (2.2)
    met Δn(x,y) = ncel (x,y) - nmedium (x,y), het verschil van de brekingsindex tussen de cel en de cultuur-media. In het volgende veronderstellen een constante waarde van Δn = 0,025, die naar verwachting van de brekingsindex gemeten in HeLa celkernen (n = 1.35511) en dat van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) voedingsbodems (n = 1.33). Hoewel de dikte van de celwaarde uitsluitend indicatief is aangezien het is gebaseerd op een veronderstelling, haar relatieve variaties zijn zinvol en kunnen worden benut om de scheidslijn cellen te detecteren.
  7. Gebruik de toegewijde algoritme (Zie aanvullende codebestand) op te sporen het vóórkomen van celdelingen en pak vervolgens cel tracks die gekoppeld aan de gedetecteerde celdelingen, zijn om op te sporen van een afdeling van de cel, cellen met een gemeten dikte groter dan 8 µm zijn voor het eerst geïdentificeerd, dan controleren of een nieuwe cel voorkomt nauw in ruimte en tijd. Op deze manier is het opsporen van celdelingen afhankelijk van twee robuuste criteria. Alternatief en uitgebreidere methoden voor de detectie van de celdeling kunnen worden toegepast op de lensfree time-lapse overname21,22,23.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voor de holografische wederopbouwproces, het lichte gebied wordt beschreven door een scalair veld een (waar figure-results-1 is de complexe waarde van A op het vliegtuig op afstand z van de monster- en laterale positie figure-results-2 en op de golflengte λ). Lichte vermeerdering is gemodelleerd door de Huygens-Fresnel-theorie waarin een propagator kernel

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In deze paper, laten we zien dat lens-vrije videomicroscopie binnen een incubator te vangen de kinetiek van duizenden cellen kan worden gebruikt. Om de algemene methodologie beschrijven we uitgelegd hoe een time-lapse verwerving van 2.7 dag van HeLa cellen in cultuur kan worden geanalyseerd met standaard cel-tracking algoritmen. Het resultaat is een dataset met 2.2 x 106 cel metingen en 10,584 tracks van de celcyclus. De acquisities werden uitgevoerd op een cultuur van Hela cellen met een relatief grote afstan...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te erkennen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Cytonote lens-free video microscope Iprasense
Horus acquisitiesoftwareIprasense
6-wells glazen bodem kweekplatenMatTek corporationArtikelnr: P06G-0-14-F 
DMEM + GlutaMAX medium Gibco
hitte-geïnactiveerd foetaal runder serum Eurobio
penicilline en streptomycine Gibco
Fibronectine Sigma Aldrich
Matlab, image processing toolbox Mathworks

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zangle, T. A., Teitell, M. A. Live-cell mass profiling: an emerging approach in quantitative biophysics. Nat Methods. 11 (12), 1221-1228 (2014).
  2. Popescu, G., Park, K., Mir, M., Bashir, R. New technologies for measuring single cell mass. Lab Chip. 14 (4), 646-652 (2014).
  3. Reed, J., et al. Rapid, massively parallel single-cell drug response measurements via live cell interferometry. Biophys J. 101 (5), 1025-1031 (2011).
  4. Mir, M., et al. Optical measurement of cycle-dependent cell growth. Proc Natl Acad Sci. USA. 108 (32), 13124-13129 (2011).
  5. Girshovitz, P., Shaked, N. T. Generalized cell morphological parameters based on interferometric phase microscopy and their application to cell life cycle characterization. Biomed Opt Express. 3 (8), 1757-1773 (2012).
  6. Kemper, B., Bauwens, A., Vollmer, A., Ketelhut, S., Langehanenberg, P. Label-free quantitative cell division monitoring of endothelial cells by digital holographic microscopy. J Biomed Opt. 15 (3), (2010).
  7. Mir, M., Bergamaschi, A., Katzenellenbogen, B. S., Popescu, G. Highly sensitive quantitative imaging for monitoring single cancer cell growth kinetics and drug response. PLoS One. 9 (2), 1-8 (2014).
  8. Bon, P., Savatier, J., Merlin, M., Wattellier, B., Monneret, S. Optical detection and measurement of living cell morphometric features with single-shot quantitative phase microscopy. J Biomed Opt. 17 (7), (2012).
  9. Aknoun, S., et al. Living cell dry mass measurement usinq quantitative phase imaging with quadriwave lateral shearing interferometry: an accuracy and sensitivity discussion. J Biomed Opt. 20 (1), 1-4 (2015).
  10. Cotte, Y., et al. Marker-free phase nanoscopy. Nature Photonics. 7 (2), 113-117 (2013).
  11. Choi, W., et al. Tomographic phase microscopy. Nat Methods. 4 (9), 717-719 (2007).
  12. Kesavan, S. V., et al. High-throughput monitoring of major cell functions by means of lensfree video microscopy. Sci Rep. 4, 1-11 (2014).
  13. Zheng, G., Lee, S. A., Antebi, Y., Elowitz, M. B., Yang, C. The ePetri dish, an on-chip cell imaging platform based on subpixel perspective sweeping microscopy (SPSM). Proc Natl Acad Sci USA. 108 (41), 16889-16894 (2011).
  14. Pushkarsky, I., et al. Automated single-cell motility analysis on a chip using lensfree microscopy. Sci Rep. 4, 4717(2014).
  15. Allier, C., et al. Imaging of dense cell cultures by multiwavelength lens-free video microscopy. Cytom Part A. 91 (5), 1-10 (2017).
  16. Su, T. -W., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. High-throughput lensfree imaging and characterization of a heterogeneous cell solution on a chip. Biotechnol Bioeng. 102 (3), 856-868 (2009).
  17. Delacroix, R., et al. Cerebrospinal fluid lens-free microscopy: a new tool for the laboratory diagnosis of meningitis. Sci Rep. 7, 39893(2017).
  18. Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: an open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2016).
  19. Popescu, G. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol Physiol. 295 (2), 538-544 (2008).
  20. Liu, P. Y., et al. Cell refractive index for cell biology and disease diagnosis: past, present and future. Lab Chip. 16, 634-644 (2016).
  21. Rapoport, D. H., Becker, T., Mamlouk, A. M., Schicktanz, S., Kruse, C. A novel validation algorithm allows for automated cell tracking and the extraction of biologically meaningful parameters. PLoS One. 6 (11), e27315(2011).
  22. Al-Kofahi, O., et al. Automated cell lineage construction: A rapid method to analyze clonal development established with murine neural progenitor cells. Cell Cycle. 5 (3), 327-335 (2006).
  23. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I., van Cappellen, W. A. Tracking in cell and developmental biology. Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 894-902 (2009).
  24. Posakony, J. W., England, J. M., Attardi, G. Mitochondrial growth and division during the cell cycle in HeLa cells. J Cell Biol. 74 (2), 468-491 (1977).
  25. Zocchi, E., et al. Expression of CD38 Increases Intracellular Calcium Concentration and Reduces Doubling Time in HeLa and 3T3 Cells. J Biol Chem. 273 (14), 8017-8024 (1979).
  26. Reitzer, L. J., Wice, B. M., Kennell, D. Evidence that glutamine, not sugar, is the major energy source for cultured HeLa cells. J Biol Chem. 254 (8), 2669-2676 (1979).
  27. Benedetti, A. D. E., Joshi-barve, S., Rinker-Schaeffer, C., Rhoads, R. E. Expression of Antisense RNA against Initiation Factor eIF-4E mRNA in HeLa Cells Results in Lengthened Cell Division Times, Diminished Translation Rates, and Reduced Levels of Both eIF-4E and the p220 Component of eIF-4F. Mol Cell Biol. 11 (11), 5435-5445 (1991).
  28. Kumei, Y., Nakajima, T., Sato, A., Kamata, N., Enomoto, S. Reduction of G1 phase duration and enhancement of c-myc gene expression in HeLa cells at hypergravity. J Cell Sci. 93 (2), 221-226 (1989).
  29. Ginzberg, M. B., Kafri, R., Kirschner, M. On being the right (cell) size. Science. 348 (6236), 1245075(2015).
  30. Mathieu, E., et al. Time-lapse lens-free imaging of cell migration in diverse physical microenvironments. Lab Chip. 16 (17), 3304-3316 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Holografische reconstructieceltrackingcelsegmentatiedetectie van celdelingtime lapse acquisitieHeLa celanalysemulti golflengte verlichtingTrackMate algoritme

Gerelateerde artikelen