Methodenartikel

Ontwikkeling van een elektrochemische DNA Biosensor te detecteren een Foodborne Pathogen

13.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56585

⸱

3 juni 2018

 ,  ,  , 
1Laboratory of Food Safety and Food Integrity, Institute of Tropical Agriculture and Food Security, Universiti Putra Malaysia, 2Laboratory of Functional Device, Institute of Advanced Technology, Universiti Putra Malaysia, 3Department of Chemistry, Faculty of Science, Universiti Putra Malaysia, 4La Trobe Institute for Molecular Science, La Trobe University

In dit artikel

Samenvatting

Een protocol voor de ontwikkeling van een elektrochemische DNA biosensor bestaat uit een polylactic acid-gestabiliseerde, gouden nanodeeltjes gemodificeerde, gezeefdrukt koolstof elektrode voor het detecteren van Vibrio parahaemolyticus wordt gepresenteerd.

Samenvatting

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is een gemeenschappelijk foodborne ziekteverwekker die aan een groot aantal problemen voor de volksgezondheid wereldwijd bijdraagt, aanzienlijke invloed zijn op het tempo van de menselijke mortaliteit en morbiditeit. Conventionele methodes voor het opsporen van V. parahaemolyticus zoals cultuur gebaseerde methoden, immunologische testen en moleculaire gebaseerde methoden vereisen ingewikkeld monster behandeling en zijn duur, tijdrovend en vervelend. Onlangs, biosensoren hebben bewezen een veelbelovende en uitgebreide detectiemethode met de voordelen van snelle detectie, kosteneffectiviteit en bruikbaarheid. Dit onderzoek richt zich op het ontwikkelen van een snelle methode voor het opsporen van V. parahaemolyticus met hoge selectiviteit en gevoeligheid op basis van de beginselen van DNA hybridisatie. In het werk, werd karakterisering van gesynthetiseerde polylactic acid-gestabiliseerde gouden nanodeeltjes (PLA-AuNPs) bereikt met behulp van röntgendiffractie (XRD), UV-zichtbaar-spectroscopie (UV-Vis), transmissie-elektronenmicroscopie (TEM), veld-emissie Scanning elektronen microscopie (FESEM), en cyclische voltammetrie (CV). Ook voerden we verder testen van stabiliteit, gevoeligheid en reproduceerbaarheid van de PLA-AuNPs. We vonden dat de PLA-AuNPs een degelijke structuur van gestabiliseerde nanodeeltjes in waterige oplossing gevormd. We hebben ook vastgesteld dat de gevoeligheid verbeterd als gevolg van de kleinere gratis overdracht (Rct) weerstandswaarde en een toename van actieve oppervlakte (0.41 cm2). De ontwikkeling van onze DNA biosensor was gebaseerd op de wijziging van een gezeefdrukt koolstof-elektrode (SPCE) met PLA-AuNPs en het gebruik van methyleenblauw (MB) als de redox-indicator. Wij beoordeeld vinden de gebeurtenissen immobilisatie en kruising door differential pulse voltammetrie (DPV). Vonden we dat aanvullende, niet-complementaire en niet-overeenkomende oligonucleotides werden specifiek onderscheiden door de verzonnen biosensor. Het bleek ook betrouwbaar gevoelige detectie in Kruisallergie studies tegen verschillende voedsel overgedragen ziekteverwekkers en de identificatie van de V. parahaemolyticus in verse kokkels.

Inleiding

Een belangrijk onderwerp van openbare en wetenschappelijke debat in de afgelopen jaren, voedselvergiftiging is vooral geassocieerd met 3 agenten: micro-organismen1, chemische stoffen2en3van de parasieten. Besmet voedsel kan ernstige gezondheidsproblemen veroorzaken bij de mens, vooral in de hogere risicogroep voor mensen met een zwak immuunsysteem, ouderen, zwangere vrouwen, baby's en jonge kinderen4. Met meer dan een miljoen gevallen van acute diarree zich jaarlijks bij kinderen jonger dan 5 jaar in Afrika, Azië en Latijns-Amerika, voedselvergiftiging is een belangrijke wereldwijde ziekte5,6 en de World Health Organization heeft vastgesteld micro-organismen als de belangrijkste contribuant7. Vibrio parahaemolyticus onderscheidt zich onder de meest bekende virulente stammen. Meestal gevonden in kustgebieden, estuariene en mariene omgevingen8, is het een gram-negatieve bacterie, die actief zijn in hoge zout omgevingen wordt, en veroorzaakt ernstige menselijke gastro-enteritis toen gegeten in onvoldoende gekookt, onjuist afgehandelde of rauw marine producten-9. Zorg bovendien voor bestaande medische aandoeningen bij sommige mensen hen vatbaar voor infectie, sepsis of oor infecties die voortvloeien uit de V. parahaemolyticus10wond. De virulentiefactoren van V. parahaemolyticus hemolysine zijn onderverdeeld in twee soorten die tot de pathogenese van de ziekte bijdragen: thermostable directe hemolysine (TDH) gecodeerd door tdh genen en TDH-gerelateerde hemolysine gecodeerd door trh genen11. De markers (tdh en trh genen) van de virulentie van de V. parahaemolyticus zijn voornamelijk gevonden in klinische monsters in plaats van milieu exemplaren.

V. parahaemolyticus bezit het vermogen om te overleven onder een brede waaier van voorwaarden, snel reageren op veranderingen in het milieu12. Het mechanisme voor proliferatie escaleert zijn potentieel gevaar naarmate de toxiciteit in parallel met cel massa13toeneemt. Erger nog, klimaatverandering is het verstrekken van deze bacteriën met voldoende voorwaarden om te versnellen hun cel bevolking groei14. Als gevolg van de hoge frequentie moet V. parahaemolyticus worden gecontroleerd langs de levensmiddelenketen, met name in de handels- en productie van zeevruchten omdat deze producten waar ze worden aangetroffen in enorme hoeveelheden15,16 over de hele wereld. Op dit moment de bacteriën worden geïdentificeerd en geïsoleerd met behulp van een aantal methoden, met inbegrip van biochemische tests, verrijking en selectieve media17, enzyme-linked immunomagnetic sorptiemiddel assay (ELISA)18, pulse-field gelelektroforese (PFGE) 19, latex agglutinatietests en polymerase kettingreactie (PCR) tests20. Deze methoden vereisen meestal gekwalificeerd personeel, geavanceerde instrumenten en moeizame technieken die geen informatie over verontreiniging onmiddellijk geven. Dit beperkt ernstig de kans op schadelijke verontreiniging en on-site toepassingen onmiddellijk te detecteren. Snelle detectieprogramma's blijven een belangrijke uitdaging is.

Biosensing is in opkomst als een veelbelovende optie voor de detectie van door voedsel overgedragen ziekteverwekkers omdat het biedt u een tijdbesparende, rendabele, praktische en real-time analyse methode21,22,23,24 . Al zijn er veel positieve resultaten voor de detectie van de analyt in verrijkte monsters en standaardoplossing met behulp van biosensoren, is er echter nog steeds een gebrek aan onderzoek toegepast op echte monsters in waterige mengsels of organische extracten25. Onlangs, elektrochemische biosensoren met behulp van directe en/of indirecte deoxyribonucleic acid (DNA) detectie verhoogde aandacht onder wetenschappers, als gevolg van hun specifieke detectie van de complementaire doelstelling via een kruising gebeurtenis26 hebben gekregen , 27 , 28 , 29. deze unieke benaderingen zijn stabieler in vergelijking met enzym gebaseerde biosensoren, waardoor een veelbelovende technologie voor miniaturisatie en commercialisering. Het doel van de studie gemeld hier is voor de bouw van een snel hulpmiddel dat V. parahaemolyticus met hoge selectiviteit, gevoeligheid en bruikbaarheid detecteren kan, gebaseerd op de DNA sequentie specificiteit tijdens hybridisatie. Identificatie strategieën betrekking hebben op de combinatie van polylactic acid-gestabiliseerde gouden nanodeeltjes (PLA-AuNPs)30 en gezeefdrukt Koolelektroden (SPCEs) in aanwezigheid van de kruising indicator, methyleenblauw (MB). Het potentieel van de ontwikkelde detectie constructie wordt verder onderzocht met behulp van bacteriën DNA lysate en verse kokkel monsters.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Opmerking: Alle chemische en biochemische reagentia moeten worden gebruikt moeten worden van p.a. en gebruikt zonder verdere zuivering. Alle oplossingen met behulp van steriel gedeïoniseerd water voor te bereiden. Autoclaaf alle glaswerk vóór sterilisatie.

Let op: Gebruik alle passende veiligheidspraktijken bij het uitvoeren van laboratoriumactiviteiten met inbegrip van het gebruik van technische controles (zuurkast ' glovebox ') en persoonlijke beschermingsmiddelen (veiligheidsbril, handschoenen, laboratoriumjas, volledige lengte broek, gesloten-teen schoenen).

1. fabricage en karakterisering van bewerkt elektrode met behulp van PLA-AuNPs

  1. Bereiding en karakterisatie van PLA-AuNPs
    1. Snel toevoegen van 10 mL Natriumcitraat oplossing (38.8 mM) tot 100 mL kokend waterige chloroauric zure oplossing (1 mM) en afkoelen tot omgevingstemperatuur. Observeer de veranderingen in kleur in de bereide oplossing van de AuNPs die als geel, wijzigingen in zwartachtig begint en eindigt uiteindelijk als donker Robijnrood.
    2. Plaats de PLA-pellets in een mal van roestvrij staal voor het smeltproces en verwarm ze bij een temperatuur van 190 ° C gedurende 10 minuten volgen met de dringende procedure: leg ze onder een druk van 2,2 MPa voor 1 min als onderdeel van de voorbereiding van PLA blad. Het PLA blad zal zijn klaar voor gebruik na afkoelen voor ongeveer 3 h.
    3. Krachtig roeren, Los 0.68 mg PLA bladen in 5 mL chloroform bij kamertemperatuur. Meng de opgeloste PLA met 10 mL van de oplossing AuNPs eerder bereid en roer het homogeen bij kamertemperatuur. De homogene mengsels kunnen vervolgens worden aangeduid als PLA-AuNPs en gekenmerkt met behulp van UV-Vis, XRD, TEM en FESEM met EDX.
  2. Bereiding en karakterisatie van gemodificeerde gezeefdrukt koolstof elektrode
    Opmerking: Het SPCE gebruikt in deze studie omvat een drie-elektrode-systeem: een teller-elektrode, een koolstof werken elektrode en een Ag/AgCl-elektrode.
    1. Pipetteer 25 µL van de homogene oplossing van PLA-AuNPs op de SPCE en vervolgens de lucht droog het snel voor 24 h vóór gebruik.
    2. Elektrochemisch karakteriseren de gemodificeerde elektroden, SPCE/PLA-AuNPs, in ferro kaliumcyanide (K3[Fe(CN)6]3 -/4 -) voor het meten van de werkzame oppervlakte, elektrochemische impedantie spectroscopie, herhaalbaarheid, reproduceerbaarheid, en stabiliteit30.

2. ontwikkeling van de elektrochemische DNA Biosensor

  1. Sonde voorbereiding
    Opmerking: De sequenties van de ssDNA sonde en cDNA werden gekozen op basis van informatie van het National Center for biotechnologie informatie (NCBI) database.
    1. Aankoop synthetische oligonucleotides (20-mer ssDNA sonde, 20-mer cDNA 20-mer mismatched DNA en 21-mer niet-cDNA) als gelyofiliseerd poeder uit commerciële laboratoria, op basis van de volgende reeks:
      thiolated ssDNA sonde: 5 ' - / 5ThioMC6-D/CGGATTATGCAGAAGCACTG - 3 '
      cDNA: 5 ' - CAGTGCTTCTGCATAATCCG - 3 '
      één-base niet-overeenkomende DNA: 5 ' - CAGTGCTTCTGC-ṪTAATCCG - 3 '
      drie-base niet-overeenkomende DNA: 5 ' - CAGTGCTTCT-Ċ-ṪṪTAATCCG - 3 '
      niet-cDNA: 5 ' - CGCACAAGGCTCGACGGCTGA - 3 '
    2. Bereiden van stamoplossingen van alle oligonucleotides (100 µM) met behulp van een steriele TE oplossing (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5) in analytische gedeelten is gesplitst. Houd dit in-4 ° C en breng de juiste verdunningen enkel voorafgaand aan het gebruiken.
  2. Optimalisatie van immobilisatie en kruising
    Opmerking: Een SPCE gewijzigd met PLA-AuNPs, aangeduid als SPCE/PLA-AuNPs, werd gebruikt voor deze studie en een druppel gieten methode werd gebruikt voor de DNA immobilisatie en kruising.
    1. Ten eerste het immobiliseren van 25 µL van thiolated sonde van de ssDNA op de SPCE/PLA-AuNPs en dan lucht droog het gedurende 24 uur bij kamertemperatuur, waarna het zal worden ten slotte aangeduid als SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA. Optimalisatie van de immobilisatie conditie bepalen met behulp van drie factoren: de concentratie van ssDNA (variërend van 0.2 tot 1.4 µM), tijd (variërend van 30 tot 210 min.) en temperatuur (variërend van 25 tot 75 ° C).
    2. Pipetteer 25 µL van het cDNA op het oppervlak van SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA voor het uitvoeren van de kruising gebeurtenis, waarna het kan worden ten slotte aangeduid als SPCE/PLA-AuNPs/dsDNA. Optimalisatie van de conditie van de kruising via de twee factoren van tijd (variërend van 5 tot 30 min) en temperatuur (variërend van 25 tot 75 ° C) te bepalen.
    3. Dompel de geïmmobiliseerdet en gehybridiseerde elektroden in 20 µM MB voor 30 min. het niet-specifiek geadsorbeerde DNA en overtollige MB verwijderen door te wassen met 0,5 M ABS/20 mM NaCl (pH 4.5) en dan spoelen met gedeïoniseerd water. Maatregel de huidige piek van MB reductie met behulp van DPV techniek. Uitvoeren van de meting van de DPV met 0,1 M PBS (pH 7) met geen indicator.
  3. Karakterisering van de gefabriceerde DNA biosensor
    1. Dompel de SPCE/PLA-AuNPs in 20 µM MB voor 30 min, wassen met 0,5 M ABS/20 mM NaCl (pH 4.5) en spoel na met gedeïoniseerd water voorafgaand aan meten. Volg een soortgelijke procedure voor alle interacties met inbegrip van de sonde DNA, cDNA niet-overeenkomende DNA en niet-complementaire DNA-monsters.
    2. Meet de elektrochemische vermindering.
      Opmerking: We gemeten met behulp van een commercieel vervaardigde Autolab met interfacesoftware DPV.
      De DPV metingen van de MB elektrochemische vermindering uitgevoerd op een potentieel variërend van -0,5 V tot 0,25 V, met een mogelijke stap van 0.005 V, modulatie amplitude van 0,05 V, en een scanfrequentie van 7.73 mVs-1 in 0,1 M PBS (pH 7), waarin geen indicator. De selectiviteit, de gevoeligheid, de reproduceerbaarheid, en de stabiliteit van de warmte van de gefabriceerde DNA biosensor werden verder bestudeerd. Gerapporteerde resultaten werden gepresenteerd als gemiddelde waarde metingen in drie wordt gerepliceerd.

3. bevestiging van de gefabriceerde DNA Biosensor met behulp van echte monsters

  1. Voorbereiding van de bacteriestammen
    1. Selecteer bacteriële monsters op basis van hun significante besmetting van zeevruchten31,32 .
      Opmerking: V. parahaemolyticus als referentie spanningen en 8 andere bacteriestammen (Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritis, Klebsiella longontsteking, Escherichia coli O157:H7, Bacillus cereus, en Vibrio alginolyticus) van de gemeenschappelijke foodborne pathogen werkten voor de elektrochemische DNA biosensor validatie in deze studie.
    2. Voeren een routine subcultuur van bacteriestammen op hun respectieve agar elke twee weken te handhaven hun levensvatbaarheid, Zie tabel 1 voor cultuuromstandigheden.
    3. Behoud op lange termijn van de bacteriestammen in hun respectieve groeiende bouillon met 20% (v/v) glycerol bij-80 ° C als glycerol bacteriën beschermt door te voorkomen dat de vorming van ijskristallen die hen tijdens het vriesproces beschadigen kunnen handhaven. Inoculeer vervolgens een lus van bewaarde bacteriële celcultuur in glycerol voorraden in de respectieve Bouillon. Incubeer de Bouillon volgens hun respectieve groei tijd- en temperatuurdisplays wanneer nodig te doen herleven van de bacteriën.
    4. Bepaalt de hoeveelheid V. parahaemolyticus cellen met behulp van een verspreiding plaat techniek33, een standaard en een bekende methode voor het opsommen van micro-organismen afkomstig van een reeks verdunningen.
      1. Cultuur V. parahaemolyticus in Trypticase soja Bouillon (TSB + 3% NaCl) bij 37 ° C in een 140-rpm schudden voorwaarde. Breng vervolgens 1 mL van de cultuur van de cel van de bacteriën in 9 mL TSB + 3% NaCl te verkrijgen van de verdunningsfactor van een 10-1 .
    5. Herhaal deze stap negen keer om een volledige serie van maximaal 10-10 verdunningsfactor. Vervolgens verspreid 0,1 mL van elk verdunningsfactor (vanaf 10-1 tot 10-10) op een Vibrio van selectieve agarplaat kolonie tellen, respectievelijk. Incubeer de platen geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 24 uur.
    6. Gebruik een Kolonieteller tellen van afzonderlijke kolonies en vervolgens terug-Bereken (graaf het CFU/afgepipetteerde bedrag x verdunningsfactor) om een kolonie-vormende eenheid per milliliter dichtheid (CFU mL-1). De concentratie van de kolonievormende eenheden (CFUs) in de cel suspensies van de bacteriën uit de plot van de kalibratie van CFU mL-1 tegen extinctie ontlenen.
  2. Voorbereiding van de PCR-test
    1. Uittreksel genomic DNA na een gewijzigde lysis procedure34gekookt. Eerste, streep een individuele bacteriële stam op agarmedia en het enten in Bouillon media, gevolgd door het aan het broeden op de relatieve groei voorwaarde, een 140 rpm schudden voorwaarde.
    2. Pipetteer een cultuur van 1 mL Bouillon in een micro centrifugebuis. Centrifugeer dit bij 4830 x g- en 4 ° C voor 1 min te verkrijgen van de pellets. Ongeveer 500 µL van steriele buffer TE gebruiken voor resuspensie met de pellet. Houd de resulterende schorsing gedurende 10 minuten bij 98 ± 2 ° C in een blok van de verwarming en onmiddellijk het koelen bij-18 ° C gedurende 10 min te lyse de cellen en de vrijgave van het DNA.
    3. Centrifugeer het genomic DNA bij 4830 x g- en 4 ° C gedurende 3 minuten aan een duidelijke schorsing verkrijgen en houden van het supernatant bij-20 ° C voor verder gebruik. Gebruik een biophotometer meting met UV-absorptie bij een golflengte van 260 nm (zoals nucleïnezuren absorberen van de golflengte van het licht) en ook bij een golflengte van 280 nm (als de eiwitten het absorberen van de golflengte van het licht) om te bepalen van de concentratie en zuiverheid van de geëxtraheerde genomic DNA en vervolgens identificeren alle stammen met behulp van standaard biochemische tests35 en controleren door 16S rRNA gen sequencing36. Ten slotte, denatureren van de genomic DNA op 92 ° C gedurende 2 minuten en snel afkoelen in ijswater alvorens tot de biosensor.
    4. Verder bevestigen de aanwezigheid V. parahaemolyticus met behulp van PCR te richten op het toxR-gen. Deze procedure uitvoeren in een thermocycler met behulp van een primer (5'-GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3' en 5'-ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3'). Optimaliseren van de PCR versterking in een volume van de totale reactie van 25 µL bestaande uit steriel water (15,5 µL), buffer (5 µL) primer (1 µL, 10 µM), dNTP mix (1 µL), DNA sjabloon (2 µL) en polymerase van DNA Taq (0.2 µL, 10 x).
    5. Goed mengen van de componenten en de PCR versterking voor de doel-sequence in een thermocycler geprogrammeerd voor 30 cycli van versterking te regelen. In onze studie, bestond elke cyclus van drie-stap reacties dwz., eerste denaturatie (94 ° C, 3 min) gevolgd door 30 cycli van denaturatie (94 ° C, 1 min.), gloeien (63 ° C, 1.5 min) en extensie (72 ° C, 1.5 min), gevolgd door definitieve extensie (72 ° C, 7 min).
    6. Bepaal de versterkte producten en hun grootte via elektroforese op 1,5% agarose gel. Het vastleggen van de beelden van de gel met een commercieel geproduceerde gel-documentatie systeem.
  3. Bereiding van de monsters van de kokkel
    1. Verse monsters krijgen.
      Opmerking: Onze verse kokkels (Anadara granosa) werden verkregen uit de natte markt Serdang, Selangor, en snel gebracht naar het laboratorium in een koelere koelbox voor analyse. Verdeel de monsters in 2 groepen, namelijk de behandelde en onbehandelde groep, ervan uitgaande dat de kokkels gelijkmatig zijn geoogst vanaf het begin van de oogst tot het plaatsen van hen in koude opslag.
    2. Pre-Treat kokkels in de behandelde groep door deze te slaan bij-20 ° C gedurende 24 uur, gevolgd door de blootstelling aan UV-licht bij 20 ° C gedurende 4 uur voorafgaand aan DNA-extractie.
      Opmerking: De vriestemperatuur en UV-blootstelling gebruikt voor de gecontroleerde groep doodt of op zijn minst beperkt de natuurlijk accumuleren V. parahaemolyticus in de kokkels. Niet van toepassing een hogere regime van pasteurisatie van 70 ° C, aangezien het doel van de gecontroleerde voorwaarde in deze studie is om na te bootsen de werkelijke situatie van de verse kokkels. Ondertussen, analyseren monsters rechtstreeks vanuit de onbehandelde groep zonder enige voorbehandeling zodra ze in het laboratorium aankomen.
    3. Subcultuur een stam van V. parahaemolyticus ATCC 17802 in TSB (3% NaCl). Bepalen van het aantal levensvatbare cellen in het entmateriaal via beplating van passende verdunningen van TSB (3% NaCl) op Certificeringsinstantie om het verkrijgen van een entmateriaal van 104 CFU mL-1 van V. parahaemolyticus. Elke kokkel in gedistilleerd water wassen en schrobben het vrij zijn van vuil voordat u steriel pincet in een laminaire flow kabinet om de weefsels van de shell.
    4. Meng ongeveer 10 g kokkel weefselsteekproeven met een homogenizer in 90 mL steriele TSB (3% NaCl) voor 60 s. toevoegen een bekende hoeveelheid V. parahaemolyticus tot 9 mL van de Bouillon gehomogeniseerde monster voor de verrijkte monsters. Gebruik de unspiked monsters als een negatieve controle. Schatten van de graven van de cel van de V. parahaemolyticus spiked op de kokkel monsters door plating 0,1 mL van de monsters op CA, en vervolgens 1 mL van de monsters in een microcentrifuge buis voor DNA pipetteren proef extractie, moeten worden gebruikt voor de biosensor en PCR assay.
    5. Pak de genomic DNA van de V. parahaemolyticus uit de monsters van het puntige en unspiked na een gewijzigde lysis procedure36gekookt. Tot slot, het bepalen van de DNA-concentratie en zuiverheid een bio fotometer meting met UV-absorptie bij een golflengte van 260 nm (zoals nucleïnezuren absorberen van de golflengte van het licht) en ook bij een golflengte van 280 nm (als de eiwitten het absorberen van de golflengte van het licht).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Vorming van AuNPs werd geopenbaard door de verandering in de kleur van de waterige oplossing met Natriumcitraat aanwezig. Dit veroorzaakt de kleur overstappen van licht geel op een diep Robijnrood. De generatie van PLA-AuNPs werd bevestigd van de UV-vis-spectra (Figuur 1), waar de groei van de oppervlakte plasmon resonantie (SPR) piek werd aangetroffen bij ongeveer 540 nm. De oprichting en het bestaan van PLA-AuNPs werd aangegeven op de 500-600 nm golflengte ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De kritische stappen in een kader voor de succesvolle ontwikkeling van dit soort elektrochemische biosensor zijn selectie van passende biologische erkenning elementen voor de transducer (nucleïnezuur of DNA hier); chemische aanpak voor de bouw van de sensing laag van de transducer; transductie materiaal; optimalisatie van DNA immobilisatie en kruising; en validatie van de ontwikkelde biosensor met behulp van echte monsters.

Core aan de succesvolle ontwikkeling van een gevoelige en selectieve e...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs wil erkentelijk voor de steun van Universiti Putra Maleisië.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AzijnzuurMerck100056
ChloroformMerck102445
Diaminoethaan tetra-azijnzuurPromegaE5134
Twice basisch natriumfosfaat Sigma-AldrichS9763
DinatriumwaterstoffosfaatSigma-Aldrich255793
Ethanol Sigma-Aldrich16368
Goud (III) chloorhydride trihydraatSigma-Aldrich520918
ZoutzuurMerck100317
MethyeenblauwSigma-AldrichM44907
Monobasisch natriumfosfaat, monohydraatSigma-AldrichS3522
Fosfaat gebufferde zoutoplossingSigma-AldrichP5119
Poly(melkzuur)hars, commerciële kwaliteit 4042DNatureWorks4042D
KaliumchlorideR&M Chemicals59435
KaliumdiwaterstoffosfaatSigma-AldrichP9791
Kaliumhexacyanoferraat IIIR&M Chemicals208019
Natriumacetaat anhydrisch zoutSigma-AldrichS2889
NatriumchlorideSigma-AldrichS9888
TrinatriumcitraatSigma-AldrichS1804
Tris(hydroxymethyl) aminomethaanFisher ScientificT395-100
Tris-BaseFisher ScientificBP152-500
2X PCR Master Mix met Dual-DyeNorgen Biotek28240
Agarose gelMerck101236
Bolton AgarMerck100079
Bolton BrothMerck100079
CHROMagar VibrioCHROMagarVB910
dNTP'sPromegaU1511
Nuclease-vrij waterThermo ScientificR0581
Eosine methyleenblauw agar Merck101347
GelRedBiotium41001
GlycerolMerck104092
Go Taq BufferPromegaM7911
Loading dye 100 bp DNA ladderPromegaG2101
Loading dye 1kb DNA ladderPromegaG5711
MagnesiumchloridePromega91176
Mannitol eierdooier polymyxine agarMerck105267
McConkey AgarMerck105465
Nutrient BrothMerck105443
Taq polymeraseMerck71003
Trypticase Soy BrothMerck105459
Trypticase Soy AgarMerck105458

Referenties

  1. Gould, L. H., Rosenblum, I., Nicholas, D., Phan, Q., Jones, T. F. Contributing factors in restaurant-associated foodborne disease outbreaks, FoodNet sites, 2006 and 2007. Journal of Food Protection. 76, 1824-1828 (2013).
  2. Arvanitoyannis, I. S., Kotsanopoulos, K. V., Papadopoulou, A. Rapid detection of chemical hazards (toxins, dioxins, and PCBs) in seafood. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 54, 1473-1528 (2014).
  3. Robertson, L. J., Sprong, H., Ortega, Y. R., van der Giessen, J. W. B., Fayer, R. Impacts of globalisation on foodborne parasites. Trends in Parasitology. 30, 37-52 (2014).
  4. Sandilands, E. A., Bateman, D. N. The epidemiology of poisoning. Medicine. 44, 76-79 (2016).
  5. Boschi-Pinto, C., Velebit, L., Shibuya, K. Estimating child mortality due to diarrhoea in developing countries. Bulletin of the World Health Organization. 86, 710-717 (2008).
  6. Farthing, M. J. G. Diarrhoea: A Significant Worldwide Problem. International Journal of Antimicrobial Agents. 14, 65-69 (2000).
  7. World Health Organization. WHO estimates of the global burden of foodborne diseases: foodborne disease burden epidemiology reference group 2007-2015. , 1-255 (2015).
  8. Yeung, M., Boor, K. Epidemiology, pathogenesis, and prevention of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne Pathogens and Disease. 1, 74-88 (2004).
  9. Sakazaki, R. Foodborne Diseases. Cliver, D. O., Riemann, H. P. , Academic Press. 127-136 (2002).
  10. Grochowsky, J., Odom, S. R., Akuthota, P., Stead, W. Primary Septicemia and Abdominal Compartment Syndrome From Vibrio parahaemolyticus Infection in a 40-Year-Old Patient With No Known Immunocompromise. Infectious Disease in Clinical Practice. 22, (2013).
  11. Raghunath, P. Roles of thermostable direct hemolysin (TDH) and TDH-related hemolysin (TRH) in Vibrio parahaemolyticus. Frontiers in Microbiology. 5, 805(2014).
  12. Kalburge, S. S., Whitaker, W. B., Boyd, E. F. High-Salt Preadaptation of Vibrio parahaemolyticus Enhances Survival in Response to Lethal Environmental Stresses. Journal of Food Protection. 77, 246-253 (2014).
  13. Esteves, K., Hervio-Heath, D., Mosser, T., Rodier, C., Tournoud, M. G., Jumas-Bilak, E., Colwell, R. R., Monfort, P. Rapid proliferation of Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, and Vibrio cholerae during freshwater flash floods in French Mediterranean Coastal lagoons. Applied and Environmental Microbiology. 81, 7600-7609 (2015).
  14. Khandeparker, L., Anil, A. C., Naik, S. D., Gaonkar, C. C. Daily variations in pathogenic bacterial populations in a monsoon influenced tropical environment. Marine Pollution Bulletin. 96, 337-343 (2015).
  15. Caburlotto, G., Suffredini, E., Toson, M., Fasolato, L., Antonetti, P., Zambon, M., Manfrin, A. Occurrence and molecular characterization of Vibrio parahaemolyticus in crustaceans commercialised in Venice area, Italy. International Journal of Food Microbiology. 220, 39-49 (2016).
  16. Wong, H. C., Chen, M. C., Liu, S. H., Liu, D. P. Incidence of highly genetically diversified Vibrio parahaemolyticus in seafood imported from Asian countries. International Journal of Food Microbiology. 52, 181-188 (1999).
  17. Rosec, J. P., Causse, V., Cruz, B., Rauzier, J., Carnat, L. The international standard ISO/TS 21872-1 to study the occurence of total and pathogenic Vibrio parahaemolyticus and Vibrio cholerae in seafood: ITS improvement by use of a chromogenic medium and PCR. International Journal of Food Microbiology. 157, 189-194 (2012).
  18. Maniyankode, R. A., Kingston, J. J., Murali, H. S., Batra, H. V. Specific identification of vibrio parahaemolyticus employing monoclonal antibody based immunoassay. International Journal of Pharmacy and Biological Sciences. 4 (2), B156-B164 (2013).
  19. Suffredini, E., Lopez-Joven, C., Maddalena, L., Croci, L., Roque, A. Pulsed-field gel electrophoresis and PCR characterization of environmental Vibrio parahaemolyticus strains of different origins. Applied and Environmental Microbiology. 77, 6301-6304 (2011).
  20. Bhattacharyya, N., Hou, A. A pentaplex PCR assay for detection and characterization of Vibrio vulnificus and Vibrio parahaemolyticus isolates. Letters in Applied Microbiology. 57, 233-240 (2013).
  21. da Silva, E. T. S. G., et al. Electrochemical Biosensors in Point-of-Care Devices: Recent Advances and Future Trends. ChemElectroChem. 4 (4), 778-794 (2017).
  22. Nordin, N., Yusof, N. A., Abdullah, J., Radu, S., Hushiarian, R. Sensitive detection of multiple pathogens using a single DNA probe. Biosensors and Bioelectronics. 86, 398-405 (2016).
  23. Nordin, N., Yusof, N. A., Abdullah, J., Radu, S., Hushiarian, R. A simple, portable, electrochemical biosensor to screen shellfish for Vibrio parahaemolyticus. AMB Express. 7 (1), 41(2017).
  24. Zhang, J., Li, Z., Zhang, H., Wang, J., Liu, Y., Chen, G. Rapid detection of several foodborne pathogens by F0F1-ATPase molecular motor biosensor. Journal of Microbiological Methods. 93, 37-41 (2013).
  25. Barsan, M. M., Ghica, E. M., Brett, C. M. A. Portable biosensing of food toxicants and environmental pollutants. Nikolelis, D. P., Varzakas , T., Erdem, A., Nikoleli, G. P. , CRC Press, Taylor & Francis Group. Boca Raton. 33-69 (2014).
  26. Kwun, J., Yun, S., Park, L., Lee, J. H. Development of 1,1'-oxalyldiimidazole chemiluminescent biosensor using the combination of graphene oxide and hairpin aptamer and its application. Talanta. 119, 262-267 (2014).
  27. Thavanathan, J., Huang, N. M., Thong, K. L. Colorimetric biosensing of targeted gene sequence using dual nanoparticle platforms. International Journal of Nanomedicine. 10, 2711-2722 (2015).
  28. Hushiarian, R., Yusof, N. A., Abdullah, A. H., Ahmad, S. A. A., Dutse, S. W. Facilitating the indirect detection of genomic DNA in an electrochemical DNA biosensor using magnetic nanoparticles and DNA ligase. Analytical Chemistry Research. 6, 17-25 (2015).
  29. Dutse, S. W., Yusof, N. A., Ahmad, H., Hussein, M. Z., Zainal, Z., Hushiarian, R., Hajian, R. An Electrochemical Biosensor for the Determination of Ganoderma boninense Pathogen Based on a Novel Modified Gold Nanocomposite Film Electrode. Analytical Letters. 47 (5), 819-832 (2014).
  30. Nordin, N., Yusof, N. A., Abdullah, J., Radu, S., Hajian, R. Characterization of Polylactide-Stabilized Gold Nanoparticles and Its Application in the Fabrication of Electrochemical DNA Biosensors. Journal of the Brazilian Chemical Society. 27 (9), 1679-1686 (2016).
  31. Vongkamjan, K., Wang, S., Moreno Switt, A. I. Rapid detection of foodborne bacterial pathogens in seafood. Handbook of Seafood: Quality and Safety Maintenance and Applications. , 247-257 (2016).
  32. Wang, F., Jiang, L., Yang, Q., Han, F., Chen, S., Pu, S., Vance, A., Ge, B. Prevalence and antimicrobial susceptibility of major foodborne pathogens in imported seafood. Journal of Food Protection. 74 (9), 1451-1461 (2011).
  33. Szermer-Olearnik, B., Sochocka, M., Zwolinska, K., Ciekot, J., Czarny, A., Szydzik, J., Kowalski, K., Boratynski, J. Comparison of microbiological and physicochemical methods for enumeration of microorganisms. Postepy Higieny i Medycyny Doswiadczalnej. 68, 1392-1396 (2014).
  34. Ivanov, I. G., Bachvarov, D. R. Determination of plasmid copy number by the "boiling" method. Analytical Biochemistry. 165 (1), 137-141 (1987).
  35. Gopireddy, V. R. Biochemical tests for the identification of bacteria. International Journal of Pharmacy and Technology. 3 (4), 1536-1555 (2011).
  36. Böhme, K., Fernández-No, I. C., Pazos, M., Gallardo, J. M., Barros-Velázquez, J., Cañas, B., Calo-Mata, P. Identification and classification of seafood-borne pathogenic and spoilage bacteria: 16S rRNA sequencing versus MALDI-TOF MS fingerprinting. Electrophoresis. 34 (6), 877-887 (2013).
  37. Seoudi, R., Fouda, A. A., Elmenshawy, D. A. Synthesis, characterization and vibrational spectroscopic studies of different particle size of gold nanoparticle capped with polyvinylpyrrolidone. Physica B: Condensed Matter. 405, 906-911 (2010).
  38. Mishra, A., Harper, S., Yun, S. I. Interaction of biosynthesized gold nanoparticles with genomic DNA isolated from E. coli and S. aureus. Nanotechnology (IEEE-NANO). , 1745-1750 (2011).
  39. Sugimoto, T. Formation of modoispersed nano- and micro-particles controlled in size, shape, and internal structure. Chemical Engineering and Technology. 26, 313-321 (2003).
  40. Rath, C., Sahu, K. K., Kulkarni, S. D., Anand, S., Date, S. K., Das, R. P., Mishra, N. C. Microstructure-dependent coercivity in monodispersed hematite particles. Applied Physics Letters. 75, 4171-4173 (1999).
  41. Abbas, M., Wu, Z. Y., Zhong, J., Ibrahim, K., Fiori, A., Orlanducci, S., Sessa, V., Terranova, M. L., Davoli, I. X-ray absorption and photoelectron spectroscopy studies on graphite and single-walled carbon nanotubes: Oxygen effect. Applied Physics Letters. 87 (5), 051923(2005).
  42. Lim, S. C., Choi, Y. C., Jeong, H. J., Shin, Y. M., An, K. H., Bae, D. J., Lee, Y. H., Lee, N. S., Kim, J. M. Effect of gas exposure on field emission properties of carbon nanotubes arrays. Advanced Materials. 13, 1563-1567 (2001).
  43. Kim, B. H., Kim, B. R., Seo, Y. G. A study on adsorption equilibrium for oxygen and nitrogen into carbon nanotubes. Adsorption. 11, 207-212 (2005).
  44. Bard, A. J., Faulkner, L. R. Electrochemical methods: Fundamentals and applications. , John Wiley & Sons Inc. (2000).
  45. Tan, Q., Wang, L., Ma, L., Yu, H., Ding, J., Liu, Q., Xiao, A., Ren, G. Study on anion electrochemical recognition based on a novel ferrocenyl compound with multiple binding sites. Journal of Physical Chemistry B. 112, 11171-11176 (2008).
  46. Manivannan, S., Ramaraj, R. Polymer-embedded gold and gold/silver nanoparticle-modified electrodes and their applications in catalysis and sensors. Pure and Applied Chemistry. 83, 2041-2053 (2011).
  47. Benali, O., Larabi, L., Traisnel, M., Gengembre, L., Hareka, Y. Electrochemical, theoretical and XPS studies of 2-mercapto-1-methylimidazole adsorption on carbon steel in 1 M HClO4. Applied Surface Science. 253, 6130-6139 (2007).
  48. Shi, Y., Wen, L., Li, F., Cheng, H. M. Nanosized Li4Ti5O12/graphene hybrid materials with low polarization for high rate lithium ion batteries. Journal of Power Sources. 196, 8610-8617 (2011).
  49. Bentiss, F., Traisnel, M., Lagrenee, M. The substituted 1,3,4-oxadiazoles: a new class of corrosion inhibitors of mild steel in acidic media. Corrosion Science. 42, 127-146 (2000).
  50. Wang, M., Gong, W., Meng, Q., Zhang, Y. Electrochemical DNA impedance biosensor for the detection of DNA hybridization with polymeric film, single walled carbon nanotubes modified glassy carbon electrode. Russian Journal of Electrochemistry. 47, 1368-1373 (2011).
  51. Herdt, A. R., Drawz, S. M., Kang, Y., Taton, T. A. DNA dissociation and degradation at gold nanoparticle surfaces. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 51 (2), 130-139 (2006).
  52. Bhatt, N., Huang, P. J. J., Dave, N., Liu, J. Dissociation and degradation of thiol-modified DNA on gold nanoparticles in aqueous and organic solvents. Langmuir. 27, 6132-6137 (2011).
  53. Liu, X., Jang, C. H., Zheng, F., Jürgensen, A., Denlinger, J. D., Dickson, K. A., Raines, R. T., Abbott, N. L., Himpsel, F. J. Characterization of protein immobilisation at silver surfaces by near edge X-ray absorption fine structure spectroscopy. Langmuir. 22, 7719-7725 (2006).
  54. Willey, T. M., Andrew, L., Vance, T., Buuren, V., Bostedt, C., Terminello, L. J., Fadley, C. S. Rapid degradation of alkanethiol-based self-assembled monolayers on gold in ambient laboratory conditions. Surface Science. 576 (1), 188-196 (2005).
  55. Farjami, E., Clima, L., Gothelf, K., Ferapontova, E. E. DNA interactions with a Methylene Blue redox indicator depend on the DNA length and are sequence specific. Analyst. 135, 1443-1448 (2010).
  56. Lin, X., Ni, Y., Kokot, S. An electrochemical DNA-sensor developed with the use of methylene blue as a redox indicator for the detection of DNA damage induced by endocrine-disrupting compounds. Analytica Chimica Acta. 867, 29-37 (2015).
  57. Zhang, F. T., Nie, J., Zhang, D. W., Chen, J. T., Zhou, Y. L., Zhang, X. X. Methylene Blue as a G-Quadruplex Binding Probe for Label-Free Homogeneous Electrochemical Biosensing. Analytical Chemistry. 86, 9489-9495 (2014).
  58. Ning, L., Li, X., Yang, D., Miao, P., Ye, Z., Li, G. Measurement of Intracellular pH Changes Based on DNA-Templated Capsid Protein Nanotubes. Analytical Chemistry. 86, 8042-8047 (2014).
  59. Sani, N. D. M., Heng, L. Y., Surif, S., Lazim, A. M., et al. AIP Conference Proceedings. Murad, A., et al. 1571, 636-640 (2013).
  60. Xu, P., Wang, J., Xu, Y., Chu, H., Shen, H., Zhang, D., Zhao, M., Liu, J., Li, G. Binding modes and interaction mechanism between different base pairs and methylene blue trihydrate: a quantum mechanics study. Advances in Experimental Medicine and Biology. 827, 187-203 (2015).
  61. Guo, Y., Chen, J., Chen, G. A label-free electrochemical biosensor for detection of HIV related gene based on interaction between DNA and protein. Sensors & Actuators, B: Chemical. 184, 113-117 (2013).
  62. Huang, K. J., Liu, Y. J., Wang, H. B., Wang, Y. Y., Liu, Y. M. Sub-femtomolar DNA detection based on layered molybdenum disulfide/multi-walled carbon nanotube composites, au nanoparticle and enzyme multiple signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 55, 195-202 (2014).
  63. Kong, R. M., Song, Z. L., Meng, H. M., Zhang, X. B., Shen, G. L., Yu, R. Q. A label-free electrochemical biosensor for highly sensitive and selective detection of DNA via a dual-amplified strategy. Biosensors and Bioelectronics. 54, 442-447 (2014).
  64. Rashid, J. I. A., Yusof, N. A., Abdullah, J., Hashim, U., Hajian, R. Novel Disposable Biosensor Based on SiNWs/AuNPs Modified-Screen Printed Electrode for Dengue Virus DNA Oligomer Detection. IEEE Sensors Journal. 15, 4420-4421 (2015).
  65. Yingkajorn, M., Sermwitayawong, N., Palittapongarnpimp, P., Nishibuchi, M., Robins, W. P., Mekalanos, J. J., Vuddhakul, V. Vibrio parahaemolyticus and its specific bacteriophages as an indicator in cockles (Anadara granosa) for the risk of V. parahaemolyticus infection in Southern Thailand. Microbial Ecology. 67, 849-856 (2014).
  66. Ahmad Ganaie, H., Ali, M. N. Short term protocol for the isolation and purification of DNA for molecular analysis. International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research. 24, 266-270 (2014).
  67. Nakano, K., Kimura, T., Kitamura, Y., Ihara, T., Ishimatsu, R., Imato, T. Potentiometric DNA sensing platform using redox-active DNA probe pair for sandwich-type dual hybridization at indicator electrode surface. Journal of Electroanalytical Chemistry. 720-721, 71-75 (2014).
  68. Yang, J., Jim Yang, L., Heng-Phon, T., Gan-Moog, C. Inhibition of DNA hybridization by small metal nanoparticles. Biophysical Chemistry. 120, 87-95 (2006).
  69. Niu, L. M., Liu, F., Wang, W., Lian, K. Q., Ma, L., Shi, H. M., Kang, W. J. Electrochemical Behavior of Paraquat on a Highly Ordered Biosensor Based on an Unmodified DNA-3D Gold Nanoparticle Composite and Its Application. Electrochimica Acta. 153, 190-199 (2015).
  70. Li, Z., Miao, X., Xing, K., Zhu, A., Ling, L. Enhanced electrochemical recognition of double-stranded DNA by using hybridization chain reaction and positively charged gold nanoparticles. Biosensors and Bioelectronics. 74, 687-690 (2015).
  71. Niu, S., Sun, J., Nan, C., Lin, J. Sensitive DNA biosensor improved by 1,10-phenanthroline cobalt complex as indicator based on the electrode modified by gold nanoparticles and graphene. Sensors and Actuators B: Chemical. 176, 58-63 (2013).
  72. Yi, H., Xu, W., Yuan, Y., Bai, L., Wu, Y., Chai, Y., Yuan, R. A pseudo triple-enzyme cascade amplified aptasensor for thrombin detection based on hemin/G-quadruplex as signal label. Biosensors and Bioelectronics. 54, 415-420 (2014).
  73. Das, R., Sharma, M. K., Rao, V. K., Bhattacharya, B. K., Garg, I., Venkatesh, V., Upadhyay, S. An electrochemical genosensor for Salmonella typhi on gold nanoparticles-mercaptosilane modified screen printed electrode. Journal of Biotechnology. 188, 9-16 (2014).
  74. Han, X., Fang, X., Shi, A., Wang, J., Zhang, Y. An electrochemical DNA biosensor based on gold nanorods decorated graphene oxide sheets for sensing platform. Analytical Biochemistry. 443 (2), 117-123 (2013).
  75. Huang, K. J., Liu, Y. J., Zhang, J. Z., Cao, J. T., Liu, Y. M. Aptamer/Au nanoparticles/cobalt sulfide nanosheets biosensor for 17β-estradiol detection using a guanine-rich complementary DNA sequence for signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 67, 184-191 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Detectie van Vibrio parahaemolyticusgouden nanodeeltjes van polymelkzuurgescreende koolstofelektrodedifferentiaal puls voltammetriemethyleenblauw redoxindicatorDNA hybridisatieprincipeanalyse van door voedsel overdraagbare pathogenenactief oppervlaktegebiedladingsoverdrachtweerstand

Gerelateerde artikelen