Methodenartikel

Gestandaardiseerde methode voor High-throughput sterilisatie van Arabidopsis zaden

DOI:

10.3791/56587

⸱

17 oktober 2017

 ,  ,  ,  , 
1Arabidopsis Biological Resource Center, Center for Applied Plant Sciences, The Ohio State University, 2Department of Molecular Genetics, Center for Applied Plant Sciences, The Ohio State University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel van deze studie was om te bepalen van de effecten van bleekmiddel en chloor gas sterilisatie op kiemkracht van zaad van een bereik van Arabidopsis genotypen geteeld op steriele media. Geoptimaliseerde sterilisatie protocollen zijn ontwikkeld om te voorkomen dat de groei van microbiële verontreinigingen terwijl het verstrekken van bevredigende zaad overleven.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) zaailingen moeten vaak worden gekweekt op steriele media. Dit vereist de voorafgaande zaad sterilisatie om te voorkomen dat de groei van microbiële verontreinigingen aanwezig op het oppervlak van het zaad. Op dit moment zijn Arabidopsis zaden gesteriliseerd met behulp van twee verschillende sterilisatie technieken in omstandigheden die verschillen tussen laboratoria en niet zijn gestandaardiseerd, vaak resulteert in slechts gedeeltelijk doeltreffende sterilisatie of buitensporige zaad sterfte. Ook zijn de meeste van deze methoden niet eenvoudig schaalbaar naar een groot aantal zaad lijnen van verschillende genotypen. Daar technologieën voor high-throughput analyse van Arabidopsis vermenigvuldigen blijven, steeds gestandaardiseerde technieken voor het steriliseren van grote aantallen van zaden van verschillende genotypen essentieel zijn voor het uitvoeren van dit soort experimenten. De reactie van een aantal Arabidopsis lijnen op twee verschillende sterilisatie technieken werd geëvalueerd op basis van seed germination tarief en de mate van zaad besmetting met bacteriën en andere ziekteverwekkers. De behandelingen opgenomen verschillende concentraties van steriliseren van agenten en tijden van blootstelling, gecombineerd om optimale voorwaarden voor sterilisatie van Arabidopsis zaad te bepalen. Geoptimaliseerde protocollen zijn ontwikkeld voor twee verschillende sterilisatie-methodes: bleekmiddel (vloeistof-fase) en (Cl2) chloorgas (damp-fase), beide als gevolg hoge zaad kieming tarieven en minimale bacteriële besmetting. Het nut van deze protocollen werd geïllustreerd door middel van het testen van zowel wild type en mutant zaden met een bereik van kiemkracht potentieel. Onze resultaten tonen aan dat zaden kunnen worden effectief gesteriliseerd met beide methoden zonder buitensporige zaad sterfte, hoewel de nadelige effecten van sterilisatie werden waargenomen voor zaden met minder dan optimale kieming potentieel. Daarnaast werd een vergelijking ontwikkeld om onderzoekers aan het toepassen van de gestandaardiseerde chloor gas sterilisatie voorwaarden bij luchtdichte containers van verschillende grootte. De hier beschreven protocollen toestaan gemakkelijk, efficiënt en goedkoop zaad sterilisatie voor een groot aantal Arabidopsis lijnen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) is een eersteklas modelorganisme voor fundamenteel en toegepast onderzoek in de plant biologie1,2,3. Terwijl standaardvoorwaarden voor Arabidopsis groei gevestigde4 zijn, is het effect van zaad sterilisatie op zaad levensvatbaarheid niet grondig getest. Vaste voedingsbodems in platen of vakken is routinematig gebruikt om de groei van Arabidopsis zaailingen voor vele experimentele toepassingen, zoals identificatie van homozygoot dodelijke mutanten in een laagniveau populatie, observatie van de shoot en wortel fenotypen op vroeg stadia, isolatie van pathogenen vrije weefsel, verzameling van grote hoeveelheden van zaailing weefsel, selectie van transformants of resistente planten en evaluatie van kiemkracht1,2,3,4 . Zaden geoogst van planten gekweekt in een kas of groei kamer af en toe zijn besmet met micro-organismen en stof. Groei van Arabidopsis zaailingen op verschillende soorten steriele media vereist vooraf zaad sterilisatie te verwijderen van microbiële verontreinigingen zoals schimmels en bacteriën op het zaad oppervlak aanwezig. Het gebruik van een effectieve zaad sterilisatie regime is essentieel voor een evenwicht tussen hoge kiemkracht, minimale besmetting en krachtige plantengroei.

De twee meest voorkomende methoden gebruikt voor sterilisatie van Arabidopsis zaad zijn gebaseerd op commerciële bleekmiddel (vloeistof-fase) en chloorgas (damp-fase). Verschillende procedures hebben gewerkt voor beide vloeistof-fase sterilisatie1,4,5,6,7,8,9 , 10 en damp-fase sterilisatie van Arabidopsis zaden8,10,11,12,13,14,15 ,16. Nochtans, terwijl deze procedures hebben gefunctioneerd in het volbrengen van zaad sterilisatie van de benutte genotypen, een gedetailleerde analyse van het effect van verschillende sterilisatie behandelingen op de zaden van verschillende genotypen heeft niet gemeld. Daarom is het optimaliseren van deze sterilisatie procedures vereist voorwaarden waarin efficiënte sterilisatie wordt gecombineerd met hoge kiemkracht tarief vast te stellen.

The Arabidopsis biologische Resource Center (ABRC) is uniek gepositioneerd om een) testen zaad levensvatbaarheid van een verscheidenheid van verschillende genotypen in de collectie en b) te profiteren van de kwaliteitscontroleprocedures toegepast intern en in reactie op feedback van gebruikers over de kieming van het zaad. De doelstellingen van de hier gepresenteerde experimenten waren om te bepalen van de effecten van verschillende sterilisatie-methodes op kiemkracht van zaad van een bereik van Arabidopsis genotypen. Geoptimaliseerde sterilisatie procedures die in hoge zaad kieming tarieven resulteren met behoud van minimaal pathogen besmetting worden uitgereikt aan zowel bleekmiddel en chloor gas sterilisatie.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. voorbereiding voor 1 x Murashige en Skoog (MS) medium

  1. toevoegen 4.31 g van MS basale zout mengsel, 10 g sacharose en 0,5 g 2-(N-Morpholino) ethanesulfonic zuur (MES) in een bekerglas met 0.8 L gedestilleerd water toe en roer te ontbinden. Controleren en aanpassen van de pH ten slotte op 5.7 met behulp van 1 M kaliumhydroxide (KOH). Voeg gedistilleerd water zodat 1 L.
    2. De media verdeel
  2. in twee 1 L flessen, elk 500 mL. Voeg toe 5 g agar op elke fles. Houd het deksel los.
  3. Autoclaaf gedurende 20 minuten bij 121 ° C, 15 psi met een magnetische roer-bar in de fles.
  4. Na autoclaaf, plaats de flessen op een plaat van de roer bij lage snelheid, en laat het MS medium afkoelen tot 45-50 ° C (totdat de fles kan worden gehouden met blote handen).
  5. Vanaf deze stap, alle stappen uit te voeren onder steriele omstandigheden in een laminaire flow-kap. Voeg 500 µL Gamborg ' s vitamine oplossing voor elk flesje en roer het MS medium om de vitamine-oplossing gelijkmatig te verdelen.
  6. Giet genoeg media in platen ter dekking ongeveer de helft van de diepte van de plaat.
  7. Kunnen de platen afkoelen bij kamertemperatuur gedurende ongeveer 1 uur om de agar te stollen.
    Opmerking: Als de platen gaan niet onmiddellijk worden gebruikt, wikkel ze in kunststof en bewaren bij 4 ° C (de koelkasttemperatuur). Overdekte platen, vakken of buizen met gestolde agar kunnen worden opgeslagen voor enkele weken bij 4 ° C in een luchtdichte verpakking.

2. Sterilisatie van Arabidopsis zaden met bleekmiddel

  1. voorbereiden de MS platen overeenkomstig punt 1 van het protocol. Autoclaaf 100 mL gedestilleerd water op hetzelfde moment als de MS Media. Dit later als spoelwater en gebruiken om te helpen de zaden te schorten om hulp bij het cadmeren.
    Opmerking: Indien gewenst, 0,8% agar overvloeien (w/v) (bijvoorbeeld phytagar) kan ook worden gesteriliseerde met autoclaaf in deze stap. De agar-mix kan worden vervangen voor gedestilleerd water tijdens de beplating (stap 2.5.3.). De extra viscositeit van de agar mix gemakkelijker ruimte zaden op de plaat of de plant in rijen zonodig.
  2. Voorbereiden 50% (v/v) bleekwater oplossing moet worden gebruikt voor het steriliseren van de zaden. Om het bleekwater te verdunnen, voeg 100 mL bleekwater tot 100 mL gedestilleerd water. 50 µL van tween-20 wasmiddel toevoegen aan de bleekwater oplossing.
    Opmerking: Bereid bleekwater oplossing kan worden opgeslagen voor tot een maand, zolang het is alleen geopend in steriele condities.
  3. Aliquoot 100 zaden in een tube van de microcentrifuge 1,5 mL.
  4. De zaden met behulp van een 50% bleekwater oplossing steriliseren.
    1. In de kap van een laminaire flow, voeg 500 µL van de 50% bleekwater oplossing aan de buis van de microcentrifuge de zaden bevatten. Tik op de onderkant van de buis op te schorten de zaden in de bleekwater oplossing.
      Opmerking:, Een rotator of platform shaker kan ook worden gebruikt om te houden van de zaden geschorst.
  5. De bleekwater oplossing uit de buis spoelen.
    1. Na 10 min, van de buis van de microcentrifuge met behulp van een pipet of een aspirator uitgerust met een pipet tip op het einde de bleekwater oplossing verwijderen.
    2. Voeg toe 500 µL van steriel gedistilleerd water aan de buis. Sluit de tube en omkeren als u wilt mengen. Toestaan zaden om af te wikkelen naar de onderkant van de buis. Zodra zaden hebben geregeld naar de onderkant van de buis zorgvuldig verwijderen pipetteren de bleekwater oplossing. Herhaal dit proces 6 keer spoelen.
    3. Voeg 1 mL gesteriliseerde met autoclaaf gedestilleerd water toe aan de buis te schorten de zaden.
  6. De gesteriliseerde zaden op MS platen plaat.
    1. In een laminaire flow-kap, het label van de onderkant van de MS-plaat met de naam van de voorraad en de huidige datum.
    2. Giet de zaden uit de buis van de microcentrifuge op het bord van MS. Verspreid de zaden rond de MS-plaat met een steriele, eenmalig gebruik inoculating lus of een steriele Pipetteer tip.
      Opmerking: Als zaden te zaaien in rijen, een pipet met een tip van 200 µL kan worden gebruikt om individueel zaden in de gewenste positie. Ter verbetering van de stroom van zaden, kan het einde van de pipet tip door 3-5 mm met behulp van schaar ingekort worden. Een misplaatste zaden of clusters van zaden kan dan worden verplaatst of gescheiden met behulp van een steriele eenmalig gebruik inoculating lus.
    3. Plaatst de MS-plaat op de achterzijde van de van de laminaire flow kap met de helft gesloten deksel. Laat het overtollige water te verdampen van de MS plaat.
    4. Plaats de deksel op de MS-plaat. Zegel de MS plaat door inwikkeling van de plaat met microporeuze papier chirurgische tape (Zie de Tabel van de materialen).

3. Sterilisatie van Arabidopsis zaad met chloorgas

  1. voorbereiden de MS platen overeenkomstig punt 1 van het protocol. Autoclaaf 100 mL gedestilleerd water op hetzelfde moment als de MS Media; Dit zal later worden gebruikt om te helpen met het opschorten van de zaden om hulp bij het cadmeren.
    Opmerking: Indien gewenst, 0,8% agar overvloeien (w/v) (bijvoorbeeld phytagar) kan ook worden gesteriliseerde met autoclaaf in deze stap. De agar-mix kan worden vervangen voor gedestilleerd water tijdens de beplating (stap 3.6.2.). De extra viscositeit van de agar mix gemakkelijker ruimte zaden op de plaat of de plant in rijen zonodig.
  2. Voordat u begint sterilisatie, berekening van de bedragen van bleekwater en zoutzuur (HCl) nodig voor de productie van chloorgas.
    1. Berekenen het bedrag van de HCl nodig voor de productie van de 6,1% Cl 2 vereist voor sterilisatie.
    2. De volgende formule gebruiken:
      figure-protocol-1
      met 7.000 mL als het volume van de container van sterilisatie en 6.1% Cl 2; het volume HCl wordt berekend als 3 mL.
      Opmerking: Een werkblad geprogrammeerd voor het uitvoeren van de berekening voor verschillende volumes voor de container en % Cl 2 wordt geleverd als aanvullende tabel 1.
  3. Aliquoot 100 zaden in 0,5 mL microcentrifuge buis. Sluit de doppen voor elke flacon, plaatst u de flesjes in een kunststof rek en gereserveerd.
    Opmerking: Zaden kunnen worden opgeslagen voor een langere periode van tijd op dit punt zo lang als ze zijn opgeslagen in goede omstandigheden. Opslagcondities vindt u in punt 3.3.2 van het protocol door Rivero en collega's 4. 96-wells-plaat indeling kan ook worden gebruikt.
  4. Bereiden van de materialen die nodig zijn voor het uitvoeren van chloor gas sterilisatie.
    1. Bleekmiddel en HCl te verkrijgen van hun opslagplaatsen.
    2. Knip een strook van grote paraffine film (Zie de Tabel van materialen) gebruiken in stap 3.5.3. te verzegelen van de container sterilisatie.
    3. Plaats de plastic container met deksel die de sterilisatie in een zuurkast plaatsvinden. Open de doppen op alle flesjes van het zaad en plaats het rek van de gehele zaad binnen de kunststoffles.
  5. Uitvoeren van chloor gas sterilisatie bij kamertemperatuur.
    Let op: Werken met bleekwater en zuur afzonderlijk. Laat niet beide fles afgetopte ter vermindering van de risico's van lozingen. Het gebruik van passende persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) met inbegrip van handschoenen en een laboratoriumjas. Als bleekmiddel of zuur op de handschoenen spatten, wijzigt u handschoenen vóór de behandeling van andere materialen. Verwijder altijd handschoenen in de zuurkast in geval van verontreiniging van het bleekmiddel of zuur.
    1. Een bekerglas van 250 mL in de container plaatst en voeg 100 mL bleekwater.
      Opmerking: De reactie tussen de HCl en bleekmiddel vereist ten minste 22 volumes teveel bleekmiddel. De reactie zal verbruiken de HCl en bleekmiddel door het vrijgeven van Cl 2 gas met natriumchloride (NaCl) en water als bijproducten. Met behulp van een grote overmaat van bleekwater kunt het verbruik van extra HCl de de ontluchting periode, dat de hoeveelheid natrium bicarbonaat (NaHCO 3 vermindert) moest de oplossing voor verwijdering neutraliseren.
      Let op: Het bekerglas moeten ten minste tweemaal de totale vloeibare hoeveelheid bleekmiddel + HCl. Dit voorkomt spatten ontsnappen van het bekerglas tijdens de volgende stap, die kunnen schade toebrengen aan zaden, bleekmiddel kleren of blootgestelde huid verbranden.
    2. Voeg 3 mL HCL aan het bekerglas van het bleekmiddel.
      Let op: De eerste reactie zal produceren bubbels, vooral bij gasconcentraties hoger dan 6,1%. Een lange mouwen laboratoriumjas is nodig voor deze stap.
    3. Sluit de sterilisatie container en verzegel het met paraffine film onmiddellijk.
    4. Volgen de sterilisatie container tijdens de sterilisatie tijd om ervoor te zorgen gas accumulatie; de accumulatie van chloorgas moeten zichtbaar als een vage gele waas in de container.
      Let op: Controleer regelmatig de sterilisatie container om ervoor te zorgen dat de druk binnen het deksel niet heeft val of paraffine film. Als de klep losgedraaid gekomen of de paraffine film los is gekomen, sluit het deksel en zorgvuldig verpakken van de container met een extra laag van paraffine film.
    5. Na de 1 h-sterilisatie open periode, de container door het verwijderen van de film van paraffine en bij een hoek van het deksel te openen. Toestaan van de container om te ventileren voor 3 h te vullen de reactie en elimineren de chloorgas.
    6. Sluit de doppen van de alle de microcentrifuge buisjes in het rek zaad.
      Opmerking: Gesteriliseerde zaden kunnen worden opgeslagen tot de tijd van plating, zolang ze zijn opgeslagen in droge toestand.
    7. Verwijderen van de zaad-rack en breng dit in een laminaire flow hood.
    8. Neutraliseren van chloor gas reactie
      1. toevoegen 1.5 g NaHCO 3 poeder langzaam aan het bekerglas van het bleekmiddel/HCl-oplossing en roeren met een roerstaaf te ontbinden van de NaHCO 3 in oplossing. Doorgaan met het toevoegen van NaHCO 3 tot kooldioxide (CO 2) gasbellen hebben gestopt vormen.
        Let op: Voeg langzaam Voorkom spatten. Gebruik van juiste PPE, met inbegrip van handschoenen en een laboratoriumjas.
      2. Test de pH van de oplossing met behulp van pH strips of een pH-meter. Voeg extra NaHCO 3 als nodig tot de pH van de oplossing neutraal is (pH 7.0). Op dit punt de oplossing kan worden verwijderd uit de zuurkast en volgens alle toepasselijke verwijdering richtlijnen verwijderd.
        Let op: Als geen geur is opgemerkt bij verwijdering, vervolgens de oplossing moet onmiddellijk worden teruggestuurd naar de zuurkast.
  6. De gesteriliseerde zaden op MS platen plaat.
    1. In een laminaire flow-kap, het label van de onderkant van de MS-plaat met de naam van de voorraad en de huidige datum.
    2. Voeg toe 500 µL van gesteriliseerde gedistilleerd water aan elke buis van de microcentrifuge op te schorten de zaden. Giet zaden op de MS-plaat en verspreiding van de zaden gelijkmatig rond de plaat met een steriele, eenmalig gebruik inoculating lus of een steriele Pipetteer tip.
    3. Plaatst de MS-plaat op de achterzijde van de van de laminaire flow kap met de helft gesloten deksel. Laat het overtollige water te verdampen van de MS plaat.
    4. Plaats de deksel op de MS-plaat. Zegel van de MS-plaat door inwikkeling van de plaat met microporeuze chirurgische papieren rompslomp.

4. Groei van Arabidopsis op MS platen

  1. plaats de platen met het deksel op bovenkant voor drie dagen bij 4 ˚C en omgevingsvochtigheid.
    Opmerking: Dit proces heet stratificatie en dient om te synchroniseren van de ontkieming van individuele zaden.
  2. De platen overbrengen in de groei omgeving.
    1. Behouden temperatuur bij 23 ° C en lichtintensiteit op 120-150 µmol/m 2 s met 16 h licht / donker 8u de fotoperiode. Platen vlak in het milieu groeien met het deksel op de top plaatsen zodat de wortels in het medium groeien.
  3. Laat de zaailingen op platen voor 8 dagen groeien.
    Opmerking: Een groeiende periode van 8 dagen kunt laat het ontkiemen van zaden ontkiemen. Platen eerder dan 8 dagen gescoord kunnen worden als alle zaden zijn ontkiemd.
  4. Score van de kieming tarieven.
    1. Record het nummer van zaden die zijn ontkiemd en die hebben niet ontkiemd. Kieming tarief berekenen door het aantal zaden die ontkiemd te delen door het totale aantal zaden op de plaat.
      Opmerking: De kiemkracht wordt geteld wanneer de radicle is geprojecteerd buiten de vacht van het zaad en de twee zaadlobben zichtbaar zijn.
    2. Ook het aantal zaden beïnvloed door schimmel om te bepalen van de effectiviteit van de voorwaarden voor sterilisatie.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Arabidopsis zaden verzameld uit een open veld, kas of groei kamer zijn soms aangetast door verschillende micro-organismen zoals schimmels en bacteriën1,4. Dus, het ontkiemen van zaden op steriele media kunnen bijzonder uitdagende als gevolg van verontreiniging van de platen, vooral wanneer de levering van zaaizaad beperkt is. Het geoptimaliseerde protocol voor zowel bleekmiddel en chloor gas sterilisatie, waarvan de resultaten zijn hieronder, minimaliseert van dit probleem en behoudt de levensvatbaarheid van zaden vereist voor high-throughput toepassingen.

Effecten van bleekmiddel sterilisatie op ontkieming van zaden van Arabidopsis Col-0

Bleekmiddel is de meest gebruikte agent voor zaad sterilisatie bij talrijke plantensoorten. De optimale concentratie van de sterilisatie agent en de blootstellingstijd varieert tussen soorten. Een aantal protocollen zijn tewerkgesteld gebruik van bleekwater voor sterilisatie van Arabidopsis zaden1,4,5,6,7,8,9 , 10. vier verschillende concentraties van bleekmiddel met vijf verschillende belichtingstijd perioden werden getest en de resultaten worden gepresenteerd Figuur 1. De behandelingen waren toegepast op Columbia wild-type (Col-0) zaden. Het effect van de concentratie van het bleekmiddel op de ontkieming van zaden van de Col-0 gevarieerd afhankelijk van het moment van sterilisatie, zoals blijkt uit een belangrijke interactie tussen de concentratie van het bleekmiddel en tijd voor sterilisatie (Figuur 1, P < 0.001, ANOVA-variantie-analyse).

In de experimenten met sterilisatie keer tussen 5 en 10 min, behandelingen met alle bleekmiddel concentraties geresulteerd in even hoge kiemkracht tarief van Col-0 zaden (Figuur 1). Hoge kieming tarieven werden ook waargenomen voor huishoudelijk bleekmiddel concentraties van 40% en 50% voor alle tijden van de sterilisatie. Behandelingen met 80% en 100% bleekwater voor perioden langer dan 10 min in een significante resulteerde afname van kiemkracht tarief ten opzichte van de kortere inweken times (P < 0,01, ANOVA). Bovendien, voor zowel 80% en 100% bleekmiddel behandelingen voor 20 min, kiemkracht was sterk gedaald ten opzichte van de overeenkomstige 40% en 50% bleekwater behandelingen (P < 0,001, ANOVA).

Zaden worden weergegeven op verschillende niveaus van bleken en shriveling bij gebruik van hoge bleekmiddel concentraties gedurende 15 minuten of langer. In aanvulling op relatief hoog (tot 32%) zaad sterfte, gekiemde zaden gesteriliseerd in deze omstandigheden vaak toonde groei gebreken, weerspiegeld in een mislukking van de zaadlobben en hypocotyls te ontvouwen en elongate, resulterend in developmental arrestatie. De meeste behandelingen (14 van de 20) werden volledig vrij van schimmel, resulterend in algemene schimmel niveau gemiddelde van 0,21% ± 0.003 (tabel 1).

Een behandeling met 50% bleekwater en een inweken tijd van 10 min werd geselecteerd als het beste sterilisatie regime, omdat het hoog Ontkiem percentage gecombineerd met goede remming van oppervlakte pathogen groei. Deze behandeling werd geselecteerd voor het testen van het effect van het bleekwater sterilisatie op verschillende mutant regels zoals hieronder beschreven.

Effecten van chloor gas sterilisatie op ontkieming van zaden van de Col-0

Voor het optimaliseren van chloor gas sterilisatie voorwaarden, werden drie verschillende concentraties van chloorgas gebruikt voor het steriliseren van Col-0 zaden gedurende twee perioden (tabel 2). De gasconcentratie was berekend op basis van de hoeveelheid geconcentreerde HCl en het volume van de container van de sterilisatie met behulp van de volgende vergelijking:

figure-results-1

Deze vergelijking was afgeleid met behulp van de wet van de ideaal gas uitgaande van 12,3 M HCl, een temperatuur van 23 ° C en atmosferische standaarddruk van 101,3 kPa.

Het effect van chloor gasconcentratie op de ontkieming van zaden van de Col-0 bleek af te hangen van het moment van sterilisatie, zoals aangegeven door een belangrijke interactie tussen het tijdstip en de concentratie-factoren (figuur 2A, P < 0,01, ANOVA) . Chloor gasconcentratie hadden geen significant effect op de ontkieming van zaden van de Col-0 onderworpen aan 1 h sterilisatie. Met ditmaal sterilisatie, alle concentraties van chloorgas bevorderd ook hoge niveaus van kiemkracht, boven de 85% (P > 0,05, ANOVA). Aan de andere kant, een 3 h durende sterilisatie resulteerden in een aanzienlijke daling in de kiemkracht tarief voor de hoogste concentratie van chloorgas, vergeleken met de twee lagere gasconcentraties (P < 0,05, ANOVA). Deze resultaten wijzen erop dat behandelingen van Arabidopsis zaden met om het even welk van de geteste chloor gasconcentraties gedurende 1 uur, of met gasconcentraties beneden 16,5% voor 3 h, even effectief zijn in het bewaren van zaad levensvatbaarheid aangezien kieming tarieven altijd groter waren dan 82%. Steriliseren van zaden voor 3U met 16,5% gas was echter nadelig zijn voor de kieming van het zaad.

De incidentie van schimmel was ook afhankelijk van de gasconcentratie en de blootstellingstijd. Schimmel groei was effectief geremd met de relatief hoge concentraties van 6,1% en 16,5% chloorgas voor 1 h durende behandeling en met alle gasconcentraties voor 3 h (figuur 2B).

Op basis van deze resultaten, werd een behandeling met een gasconcentratie van 6,1% gedurende 1 uur (tabel 2) geselecteerd als de beste damp-fase sterilisatie conditie te testen van het effect van gas sterilisatie op verschillende mutant lijnen, omdat het hoog Ontkiem percentage (gecombineerd 85%) met zeer lage mate van besmetting van de schimmel (0,02%).

Effecten van bleekmiddel en chloor gas sterilisatie op zaden met verschillende kiemkracht potentiële

Statistische analyses bleek dat de kieming reactie op sterilisatie methoden afhankelijk zijn van het potentieel van de ontkieming van de lijnen (figuur 3A, P < 0,01, ANOVA). Bleekmiddel noch chloor gas sterilisatie verlaagd tarief van de ontkieming van zaden met hoge kiemkracht potentiële (groepen 4 en 5). Noch behandeling had een effect op de toch al lage kiemkracht tarief van de groep met de laagste kiemingpotentieel (groep 1). In tegenstelling, chloor gas sterilisatie resulteerde in een significante vermindering van ongeveer 12-18% (P < 0,01, ANOVA) in de ontkieming van zaden met tussenliggende kiemkracht potentieel (groepen 2 en 3). Bleekmiddel sterilisatie ook kiemkracht tarief daalde met 13% van groep 2, maar het deed niet verlagen het tarief van de ontkieming van groep 3. Hoewel er geen significant verschil in kiemkracht tarief tussen de bleekmiddel en chloor gas behandelingen in elke groep kiemkracht was (figuur 3A, P > 0.442, ANOVA), zaden gesteriliseerd met bleekmiddel hadden een iets hoger kieming tarief dan gas-gesteriliseerde zaden in alle groepen van de kiemkracht.

Sterilisatie behandelingen ingrijpend veranderd (P < 0,001, ANOVA) het percentage aan zaden beïnvloed door schimmel (figuur 3B). Beide chloor gas en bleekmiddel sterilisatie geresulteerd in minder groei van de schimmel (P < 0,05, ANOVA) in vergelijking met geen sterilisatie. Er was geen verschil in het niveau van de schimmel ontdekt tussen gas en bleekmiddel sterilisatie in elke groep (figuur 3B, P > 0.4, ANOVA).

figure-results-2
Figuur 1: effecten van bleekmiddel concentratie en sterilisatie tijd op de ontkieming van zaden van Arabidopsis Col-0. Waarden zijn middelen ± SD verkregen 5 onafhankelijke replicaties van het experiment. * geeft significante verschillen ten opzichte van de 5 minuten inweken duur voor een gamma van bleekmiddel concentraties (P < 0,01, ANOVA). #geeft significante verschillen van 80% en 100% bleekwater concentraties ten opzichte van de 40% en 50% voor een 20 min periode (P < 0,01, ANOVA). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-3
Figuur 2: effecten van chloor gas concentratie en sterilisatie tijd op Arabidopsis Col-0 zaden. (A) kieming tarief en (B) schimmel niveau. Foutbalken vertegenwoordigen middelen ± SD verkregen 5 biologische en 5 technische replicaties van het experiment. Betekent dat een brief niet eens aanzienlijk verschillen (P < 0,05, ANOVA). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-4
Figuur 3: effecten van bleekmiddel en chloor gas sterilisatie op zaden met verschillende kiemkracht potentiële. (A) kieming tarief en (B) schimmel niveau. De 100 SALK T-DNA-regels werden ingedeeld in vijf groepen volgens hun kiemkracht potentiële gedefinieerd als de kiemkracht tarief bij gebrek aan een sterilisatie-agent. De groepen op basis van het tarief van de kiemkracht waren als volgt: groep 1 (0-20%), groep 2 (21-50%), groep 3 (51-70%), groep 4 (71-90%) en groep 5 (91-100%). De lijnen werden willekeurig gekozen en hun kiemkracht potentiële niet afhankelijk zijn van genotype. Waarden zijn middelen ± SD verkregen uit drie onafhankelijke replicaties van het experiment. Brieven ("a", "ab", "c", enz.) boven elke waarde geven de statistische groeperingen van categorie middelen. Betekent dat een brief niet eens aanzienlijk verschillen (P < 0,05, ANOVA). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Sterilisatie tijd (min)Bleekmiddel concentratie (%)
405080100
50,00%0,00%0,00%2,13%
80,00%0,00%0,00%0,00%
100,00%0,50%0,00%0.36%
150,00%0,00%0,00%0,68%
200,19%0,28%0,00%0,00%

Tabel 1: Schimmel niveau van bleekwater-gesteriliseerde Col-0 zaden.

BleekmiddelHClTijd% Chloorgas (mol Cl2gedraaide totale gas)
(mL)(mL)(h)
25112.1
25132.1
100316.1
100336.1
2009116,5
2009316,5

Tabel 2: Chloor (Cl2) gas sterilisatie behandelingen op Columbia wild-type zaden met behulp van een 7 L container.

Aanvullende tabel 1: Een werkblad geprogrammeerd voor het uitvoeren van de berekening voor verschillende volumes voor de container en % Cl2. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bij het kweken van Arabidopsis zaden op steriele media, moet enige vorm van sterilisatie worden toegepast. Zowel bleekmiddel en chloor gas sterilisatie behandelingen leiden tot soortgelijke kiemkracht tarief en schimmel groeiremming. Noch sterilisatie methode zorgt ervoor dat een aanzienlijke vermindering in kiemkracht tarief voor zaden met hoge kiemkracht potentiële; maar, bleekmiddel sterilisatie wordt aangeraden voor lijnen met lagere kiemkracht potentieel (20-70%), als gevolg van de kleine, zij het niet-significante, verbetering van kiemkracht t.o.v. gas sterilisatie (figuur 3A).

Arabidopsis zaden met een bleekmiddel concentratie van 40-100% gedurende maximaal 10 minuten steriliseren biedt bevredigend kiemkracht percentages en effectieve schimmel onderdrukking. Hoewel bleekmiddel concentraties van minder dan 40% bieden voldoende sterilisatie voor meeste partijen zaad, met een concentratie van 40% of hoger garanties doeltreffende sterilisatie van zelfs zwaar verontreinigde zaad-percelen. Het is belangrijk dat niet meer bedragen dan 10 min van sterilisatie bij het gebruik van bleekwater concentraties gelijk of hoger dan 80% hoge zaad sterfte en afwijkingen in zaailing ontwikkeling te voorkomen.

Het behandelen van Arabidopsis zaden met chloor gasconcentraties van 6,1% of 16,5% voor 1 h resultaten hoge kieming tarieven en voldoende schimmel te bannen. Lage chloor gasconcentratie (2,1%) kan worden gebruikt met succes door het verhogen van de duur van sterilisatie tot 3 h.

Bij enkele regels worden gesteriliseerd moeten, wordt vloeibare sterilisatie in een oplossing van 50% bleekwater voor 10 min aanbevolen. Voor grotere aantallen lijnen is gas sterilisatie met een gasconcentratie van 6,1% voor 1 h een betere optie omdat vele lijnen kunnen worden gesteriliseerd snel en eenvoudig met minder manipulatie.

Onze resultaten verstrekken gestandaardiseerde condities voor het steriliseren van zowel groot aantal zaden van verschillende genotypen en de zaden met lagere kiemkracht potentiële. De enige beperking van deze sterilisatie technieken is dat ze kunnen niet worden toegepast op de zaden met kieming tarieven, minder dan 20% als gevolg van uitgebreide zaad sterfte. Alternatieve methoden, zoals ultrasoonapparaat17, tot kieming verhogen bij gebrek aan sterilisatie kunnen zinvol zijn in die gevallen.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij wil Gauri Datta bedanken voor haar hulp bij de voorbereiding van de experimentele materialen. Wij zijn ook dankbaar Bettina Wittler en James Mann voor de kritische evaluatie van het manuscript. Dit werk werd gesteund door de NSF subsidies DBI-1049341 en MCB-1143813.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.65 mL Microcentrifuge tubesGeneMateC-3260-5Buis waarin Arabidopsis thaliana zaden worden geplaatst om sterilisatie uit te voeren
1.7 mL Microcentrifuge tubeGeneMateC-3262-1Buis waarin Arabidopsis thaliana zaden worden geplaatst om sterilisatie uit te voeren
7 L plastic containerSistema1016265438Container waarin gassterilisatie wordt uitgevoerd
Concentrated HClSigma-Aldrich320331Chemisch middel dat wordt gebruikt in het proces van het creëren van chloorgas
Disposable sterile inoculating loopFisher Scientific22-363-603Loop wordt gebruikt om Arabidopsis zaden op MS-platen te verspreiden of te plaatsen
Gamborg’s vitamin solutionSigma-AldrichG1019Vitamineoplossing die wordt gebruikt in het proces van het maken van MS-media
Household bleachCloroxRegular-BleachChemisch middel dat wordt gebruikt in het proces van het creëren van chloorgas en vloeibare sterilisatie
MES hydrateSigma-AldrichM2933Chemisch middel dat wordt gebruikt in het proces van het maken van MS-media
Micropore surgical tape3M1530-1Microporeuze chirurgische papiertape die wordt gebruikt om MS-platen te verzegelen
Murashige and Skoog basal salt mixture (MS)Sigma-AldrichM5524Chemisch middel dat wordt gebruikt in het proces van het maken van MS-media
Parafilm MBemis Company#PM996Paraffine film die wordt gebruikt om de sterilisatiecontainer te verzegelen
Petri dish 100 X 15 mm Fisher ScientificFB0875713Petrischalen waarin MS-media wordt gegoten met het doel Arabidopsis thaliana te laten groeien
pH indicator stripsWhatman2613991Gebaten om de pH van geneutraliseerd chloor en natriumbicarbonaat oplossing te controleren
PhytoagarFisher Scientific50-255-212Gebaten om te helpen bij het ophangen van Arabidopsis zaden in het proces van het beplaten van zaden
Sodium bicarbonateSigma-AldrichS5761Chemisch middel dat wordt gebruikt in het proces van het neutraliseren van chloorgas reactie
SucroseSigma-AldrichS0389Chemisch middel dat wordt gebruikt in het proces van het maken van MS-media
Tween 20Fisher BioReagentsBP337-100Chemisch middel dat wordt gebruikt in het proces van vloeibare sterilisatie
Arabidopsis thaliana seedsABRC; order through TAIR www.arabidopsis.orgCS70000 (Col-0)Arabidopsis wild-type zaden 
Arabidopsis thaliana seedsABRC; order through TAIR www.arabidopsis.orgSALK_037606CArabidopsis zaden gebruikt bij het testen als onderdeel van Groep 1
Arabidopsis thaliana seedsABRC; order through TAIR www.arabidopsis.orgSALK_041402CArabidopsis zaden gebruikt bij het testen als onderdeel van Groep 1
Arabidopsis thaliana seedsABRC; order through TAIR www.arabidopsis.orgSALK_059101CArabidopsis zaden gebruikt bij het testen als onderdeel van Groep 1
Arabidopsis thaliana seedsABRC; order through TAIR www.arabidopsis.orgSALK_063470CArabidopsis zaden gebruikt bij het testen als onderdeel van Groep 1
Arabidopsis thaliana seedsABRC; order through TAIR www.arabidopsis.orgSALK_072048CArabidopsis zaden gebruikt bij het testen als onderdeel van Groep 1
Arabidopsis thaliana seedsABRC; order through TAIR www.arabidopsis.orgSALK_072240CArabidopsis zaden gebruikt bij het testen als onderdeel van Groep 1
Arabidopsis thaliana seedsABRC; order through TAIR www.arabidopsis.orgSALK_081989CArabidopsis zaden gebruikt bij het testen als onderdeel van Groep 1
Arabidopsis thaliana seedsABRC; order through TAIR www.arabidopsis.orgSALK_084124CArabidopsis zaden gebruikt bij het testen als onderdeel van Groep 1
Arabidopsis thaliana seedsABRC; order through TAIR www.arabidopsis.orgSALK_085049CArabidopsis zaden gebruikt bij het testen als onderdeel van Groep 1
Arabidopsis thaliana seedsABRC; order through TAIR www.arabidopsis.orgSALK_089717CArabidopsis zaden gebruikt bij het testen als onderdeel van Groep 1
Arabidopsis thaliana seedsABRC; order through TAIR www.arabidopsis.orgSALK_107354CArabidopsis zaden gebruikt bij het testen als onderdeel van Groep 1
Arabidopsis thaliana seedsABRC; order through TAIR www.arabidopsis.orgSALK_110111CArabidopsis zaden gebruikt bij het testen als onderdeel van Groep 1
Arabidopsis thaliana seedsABRC; order through TAIR www.arabidopsis.orgSALK_111322CArabidopsis zaden gebruikt bij het testen als onderdeel van Groep 1
Arabidopsis thaliana seedsABRC; order through TAIR www.arabidopsis.orgSALK_113109CArabidopsis zaden gebruikt bij het testen als onderdeel van Groep 1
Arabidopsis thaliana seedsABRC; order through TAIR www.arabidopsis.orgSALK_114702CArabidopsis zaden gebruikt bij het testen als onderdeel van Groep 1
Arabidopsis thaliana seedsABRC; order through TAIR www.arabidopsis.orgSALK_114872CArabidopsis zaden gebruikt bij het testen als onderdeel van Groep 1
Arabidopsis thaliana seedsABRC; order through TAIR www.arabidopsis.orgSALK_115657CArabidopsis zaden gebruikt bij het testen als onderdeel van Groep 1
Arabidopsis thaliana seedsABRC; order through TAIR www.arabidopsis.orgSALK_116803CArabidopsis zaden gebruikt bij het testen als on

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weigel, D., Glazebrook, J. Arabidopsis: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2002).
  2. Koornneef, M., Meinke, D. The development of Arabidopsis as a model plant. Plant J. 61 (6), 909-921 (2010).
  3. The Arabidopsis Genome Initiative. Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature. 408 (6814), 796-815 (2000).
  4. Rivero, L., et al. Handling Arabidopsis plants: growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses. Methods Mol Biol. 1062, 3-25 (2014).
  5. Yamada, K., et al. Empirical analysis of transcriptional activity in the Arabidopsis genome. Science. 302 (5646), 842-846 (2003).
  6. Alonso, J. M., Stepanova, A. N. Arabidopsis transformation with large bacterial artificial chromosomes. Methods Mol Biol. 1062, 271-283 (2014).
  7. Savage, L. J., Imre, K. M., Hall, D. A., Last, R. L. Analysis of essential Arabidopsis nuclear genes encoding plastid-targeted proteins. PLoS One. 8 (9), e73291(2013).
  8. Podar, D. Plant growth and cultivation. Methods Mol Biol. 953, 23-45 (2013).
  9. Xu, W., et al. An improved agar-plate method for studying root growth and response of Arabidopsis thaliana. Sci Rep. 3, 1273(2013).
  10. Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16, (1998).
  11. Cederholm, H. M., Benfey, P. N. Distinct sensitivities to phosphate deprivation suggest that RGF peptides play disparate roles in Arabidopsis thaliana root development. New Phytol. 207 (3), 683-691 (2015).
  12. Ye, G. N., et al. Arabidopsis ovule is the target for Agrobacterium in planta vacuum infiltration transformation. Plant J. 19 (3), 249-257 (1999).
  13. Kuromori, T., et al. A collection of 11 800 single-copy Ds transposon insertion lines in Arabidopsis. Plant J. 37 (6), 897-905 (2004).
  14. Fiers, M., et al. The 14-amino acid CLV3, CLE19, and CLE40 peptides trigger consumption of the root meristem in Arabidopsis through a CLAVATA2-dependent pathway. Plant Cell. 17 (9), 2542-2553 (2005).
  15. Stepanova, A. N., Alonso, J. M. PCR-based screening for insertional mutants. Methods Mol Biol. 323, 163-172 (2006).
  16. O'Malley, R. C., Alonso, J. M., Kim, C. J., Leisse, T. J., Ecker, J. R. An adapter ligation-mediated PCR method for high-throughput mapping of T-DNA inserts in the Arabidopsis genome. Nat Protoc. 2 (11), 2910-2917 (2007).
  17. López-Ribera, I., Vicient, C. M. Use of ultrasonication to increase germination rates of Arabidopsis seeds. Plant Methods. 13 (31), (2017).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Sterilisatie van Arabidopsis zadenbleekmiddeloplossingchloorgaszaadkiemingspercentagemicrobi le contaminatielaminaire flowkastzuurkaststeriel gedestilleerd waterMS plaatzaadstratificatie

Gerelateerde artikelen