Een eenvoudige fluorescentie gebaseerde verslaggever Assay identificatie van cellulaire bestanddelen die nodig zijn voor ricine toxine een keten (RTA) handel in gist

Samenvatting

In het manuscript beschrijven we het gebruik van een kwantitatieve analyse van gist gebaseerde fluorescentie, verslaggever te identificeren van cellulaire componenten betrokken bij de handel en het doden van processen van de cytotoxische een subeenheid van de plant toxine ricine (RTA).

Samenvatting

Bacteriële en plant A / B toxines exploit de natuurlijke mensenhandel trajecten in eukaryotische cellen te bereiken hun intracellulaire doelgroep in het cytosol en uiteindelijk doden. Dergelijke A / B-toxine in het algemeen bestaan uit een enzymatisch actieve Asubunit (b.v., ricine toxine een (RTA)) en een of meer cellen bindende Bsubunit(s), die verantwoordelijk zijn voor de toxine binden aan specifieke cel oppervlakte receptoren. Onze huidige kennis van hoe A / B toxines in staat efficiënt bedwelmende cellen geholpen wetenschappers om te begrijpen fundamentele cellulaire mechanismen, zoals endocytose en intracellulaire eiwitten sorteren in hogere eukaryotische cellen zijn. Vanuit een medisch oogpunt is het ook belangrijk om te identificeren van de aanvoerroutes van grote toxine adequate behandeling om oplossingen te vinden voor patiënten of uiteindelijk therapeutische toxine gebaseerde om toepassingen te ontwikkelen voor kankertherapie.

Sinds het genoom-brede analyse van A / B-toxine handel in zoogdiercellen is complex, tijdrovend en duur, verschillende studies over A / B-toxine vervoer zijn uitgevoerd in de modelorganisme gist Saccharomyces cerevisiae. Ondanks het feit dat minder complex, fundamenteel cellulaire processen in gist en hogere eukaryotische cellen kunnen zijn vergelijkbaar en heel vaak de resultaten die zijn verkregen in gist worden overgedragen aan de zoogdieren situatie.

Hier beschrijven we een snelle en makkelijk te gebruiken verslaggever assay voor het analyseren van de intracellulaire mensenhandel van RTA gist. Een essentieel voordeel van de nieuwe bepaling is de mogelijkheid te onderzoeken van niet alleen RTA retro-translocatie van het endoplasmatisch reticulum (ER) in het cytosol, maar eerder endocytose en retrograde toxine transport uit het plasma-membraan in de ER. De bepaling maakt gebruik van een verslaggever plasmide waarmee indirecte meting van RTA toxiciteit door fluorescentie emissie van de groen fluorescente proteïne (GFP) na in vivo vertaling. Sinds de opening van de proteïne biosynthese RTA efficiënt door 28 rRNA depurination voorkomt, kan deze test de identificatie van de ontvangende cel eiwitten die betrokken zijn bij intracellulair RTA transport via de detectie van veranderingen in fluorescentie emissie.

Inleiding

Patiënten met infecties door toxine producerende bacteriën vertegenwoordigen een ernstige medische en financiële lasten voor elke sociale systeem van de gezondheidszorg, in het bijzonder aangezien efficiënte therapeutische behandelingen nog grotendeels ontbreekt zijn. Ontwikkelen van nieuwe therapeutische strategieën, de mechanismen van de complexe intoxicatie van medisch relevante A / B toxines zoals cholera-toxine, Shiga-toxine of ricine moeten volledig worden begrepen op moleculair niveau gebaseerd op de roman krachtige tests die moeten worden uitgevoerd.

In de afgelopen jaren geprobeerd verschillende studies voor het analyseren van A / B-toxine vervoer in gist en zoogdiercellen met behulp van tijdrovende en kostenintensieve methoden zoals radioactieve toxine labeling^1,2 , alsmede siRNA gebaseerde screening ³benaderingen. In sommige gevallen toxine mensenhandel gevisualiseerde geweest in vivo door fluorescentie microscopie na chemische en/of genetische koppeling van individuele toxine subeenheden met fluorophores, quantumdots of fluorescerende eiwitten^4,5. Helaas leiden dergelijke wijzigingen vaak tot inactieve en/of gewijzigde natuurlijke eigenschappen van de toxines. Een andere elegante manier om niet indirect een breed scala aan wetenschappelijke vragen te beantwoorden is het gebruik van verslaggever systemen op basis van enzymen zoals lacZ, luciferase of fluorescerende eiwitten (bijvoorbeeld GFP of Discosoma sp. rood fluorescerende eiwit () dsRed)).

In dit manuscript, is een eenvoudig protocol beschreven waarin het cellulaire componenten die nodig zijn voor het intracellulair transport van extracellularly toegepaste RTA in S. cerevisiae. Daarmee fungeert een fluorescentie-reporter plasmide met een N-terminal ER-import signaal gevolgd door GFP als een eiwit biosynthese sensor, die niet indirect RTA-gemedieerde eiwit vertaling remming door GFP fluorescentie emissie na in vivo meet vertaling⁶. In geval dat RTA endocytose en/of intracellulaire handel negatief (of positief) ondergaat in een bepaalde gist schrapping mutant in vergelijking met wild-type, kan dit worden gedetecteerd via een toename (of afname) in GFP fluorescentie emissie⁶.

Tot nu toe waren alle methoden analyseren van RTA vervoer in gistcellen beperkt tot de ER-te-cytosol retro-translocatie proces van RTA. In zulk een kunstmatige systeem, RTA met een signaal van de import ER zich van een afleidbare promotor, resulterend in een suïcidale fenotype^1,7. Hoewel de cel B-subunit van ricine bindend eveneens in de experimentele opstelling wordt beschreven in dit manuscript ontbreekt en, zo niet geheel representatief is de natuurlijke situatie van ricine holotoxin intoxicatie⁸, vervoer van toxine van het plasma membraan door het Golgi-apparaat naar de ER kan nauw met deze nieuwe test worden geïmiteerd. Interessant is dat blijkt de voorlopige resultaten van de pilot-studie dat de mensenhandel trajecten gebruikt door RTA opvallende gelijkenissen met de route van de dronkenschap van ricine holotoxin onthullen.

Kortom, kan de beschreven methode worden gebruikt om te bepalen van de specifieke rol van geselecteerde cellulaire eiwitten in RTA endocytose en handel in gist. Bovendien, deze experimentele opstelling kan gemakkelijk worden aangepast aan andere ribosoom inactiveren toxines geproduceerd en uitgescheiden door verschillende gist en bacteriesoorten zoals zymocin of Shiga-toxine.

Protocol

Opmerking: Een overzicht van de algemene experimentele workflow is afgebeeld in Figuur 1.

Let op: RTA is zeer giftig voor de mens. Veiligheid lab toestemming S2 (biosafety level 2 equivalent) is nodig. Gelieve handschoenen te dragen tijdens het hele experiment.

1. heterologe uitdrukking van zijn-gelabeld RTA in Escherichia coli

1. Transformeren van E. coli of cellen met waarden de expressie plasmide pET24-RTA_{(zijn) 6} de lege vector pET24a⁽⁺⁾ met behulp van standaard electroporation protocollen^9,10. Cellen met de lege plasmide dienen als een negatieve controle.
2. Na selectie van positieve klonen op kanamycine-bevattende (100 µg/mL) LB platen, cellen met de RTA expressie plasmide of de lege vector in 5 mL LB_kan medium (LB medium met 100 µg/mL kanamycine) beënten en incuberen bij 37 ° C en 220 rpm gedurende 24 uur.
3. Aanvulling 1 L LB_kan medium met 5 mL pre cultuur en Incubeer de cellen bij 37 ° C en 220 rpm tot cellen hebben bereikt een OD-₆₀₀ voor 0.8-1.0 (ongeveer 3-4 h). Daarna Verlaag cultuur temperatuur tot 28 ° C en bereiden een 1 M van isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)-stockoplossing in H₂O.
4. Induceren RTA uitdrukking van de E. coli door toevoeging van IPTG aan een eindconcentratie van 1 mM.
5. Na 3,5 uur bij 28 ° C en 220 rpm, oogst cellen door centrifugeren op 10.000 x g- en 4 ° C gedurende 10 min, het wassen van de pellet tweemaal met 5 mL bindende buffer (500 mM NaCl, imidazool 10 mM en 20 mM KH₂PO₄ pH = 7.4) op 10.000 x g- en 4 ° C gedurende 10 min, en resuspendeer pellet in 5 mL bindende buffer.
   Opmerking: Protocol kan in dit stadium worden onderbroken en cellen kunnen worden achtergelaten bij 80 ° C voor meerdere dagen.

2. de zuivering van zijn-gelabeld RTA via de chromatografie van de affiniteit

1. Bewerk ultrasone trillingen ten cellen op ijs met behulp van de onderstaande voorschriften: 15 s pulse (20 micron), 30 s pauze. Herhaal deze stap vijf keer.
2. Centrifugeer cel lysate op 21.000 x g- en 4 ° C gedurende 15 minuten en filtreer bovendrijvende vloeistof met behulp van een steriele injectiespuit filtersysteem (0,2 µm poriëngrootte).
   Opmerking: Cel pellets van monsters met succes sonicated transparante randen weergeven.
3. Gebruik een geautomatiseerde zuiveringsinstallatie uitgerust met een 5 mL Ni^{2 +}-op basis van affiniteit kolom om te zuiveren van de Fractie zijn-gelabeld RTA uit de steriele gefiltreerd E. coli bezinken. In het algemeen, gebruik een elutie snelheid van 1 mL/min en koel de hele zuiveringsinstallatie om te voorkomen dat niet-efficiënte toxin binding en verlies van toxine activiteit.
   Opmerking: Parameters voor efficiënte RTA zuivering worden weergegeven in tabel 1. Zie ook Becker et al.. voor verdere informatie⁹.
   1. Kort, equilibreer de kolom affiniteit met 20 mL bindende buffer te verwijderen van de opslag-buffer. Steriele-gefilterd op de kolom van de affiniteit met behulp van een injectiespuit supernatant van toepassing.
   2. Was de kolom met 25-35 mL bindende buffer te verwijderen de niet-afhankelijke eiwitten uit de kolom. De wassen stap uitvoeren tot UV-absorptie bij 280 nm is dicht bij de eerste UV-waarde.
   3. Elueer afhankelijke RTA breuk in 20-35 mL elutie buffer (500 mM imidazool, 500 mM NaCl, 20 mM KH₂PO₄, pH = 7.2) en houden van het monster op ijs (figuur 2A en figuur 2B).
      Opmerking: De elutie van de RTA breuk wordt gekenmerkt door een toename van de UV-absorptie. Let op: uitsluitend het verzamelen van deze fractie om te voorkomen dat besmetting met niet-specifieke afhankelijke eiwitten.
   4. 20 µL van geëlueerd monsters kunt uitvoeren Coomassie Blue kleuring¹¹ of Western blot analyse^12,13 (optioneel). Primaire anti-zijn antilichamen (1:1, 000) en secundaire anti-mouse-IgG-HRP (1:10, 000) gebruiken om te detecteren RTA en controleer of monster zuiverheid (Figuur 3).
   5. Desalt geëlueerd RTA breuk op een 5 mL demineralisatie kolom en equilibreer monster in 0,8 M sorbitol.
      1. De column van de affiniteit van de zuiveringsinstallatie van de demineralisatie kolom vervangen en equilibreer eerst de kolom met 20 mL van 0,8 M sorbitol.
      2. De eluted RTA breuk van toepassing op de kolom via een spuit. Was de kolom met 100 mL van 0,8 M sorbitol en elueer de desalted RTA breuk in een tube van 15 mL zodra de UV-absorptie begint te verhogen (figuur 2C).
      3. Winkel de eluted RTA breuk bij 4 ° C.
         Opmerking: Direct vastloopt RTA breuk bemonstering huidgeleiding verhoogt om zout verontreiniging te voorkomen. Parameters voor de demineralisatie procedure worden weergegeven in tabel 1.
4. Concentreer je geëlueerd RTA breuk bij 10.000 x g en 4 ° C gedurende 30-180 minuten met behulp van een 10 kDa cut-off spin kolom een eindvolume van 1-2 mL en opslaan van monster bij 4 ° C voor 3-4 weken.
   Let op: Niet het monster invriezen sinds de bevriezing leidt tot een volledig verlies van RTA activiteit.
5. Bepalen eiwitconcentratie met behulp van een conventionele eiwit bepaling kit. Eiwitconcentratie moet in het bereik van 1 tot 1,5 mg/mL.
   Opmerking: RTA neigt te precipiteren als de eiwitconcentratie te hoog is (> 5 mg/mL).

3. gist transformatie en verwijdering van de celwand

1. Tover wild-type of geselecteerde gist schrapping mutanten met de GFP verslaggever plasmide pRS315-K28_SP- GFP⁶ met behulp van standaard lithium acetaat transformatie methoden¹⁴. Incubeer de cellen op leucine drop-out (d/o) glucose platen (2% glucose, 1,5% agar, 0,5% ammoniumsulfaat, 0,17% gist stikstof Base (YNB) en 0.087% d/o mix zonder leucine) bij 30 ° C gedurende 2-3 dagen voor positieve kloon selectie.
2. Kies 3 verschillende gist klonen van elke plaat en enten van de klonen in 100 mL van leucine d/o raffinose medium (2% raffinose, 0,5% ammoniumsulfaat, 0,17% YNB en 0.087% d/o Meng zonder leucine) bij 220 rpm en 30 ° C tot OD₆₀₀ = 1.0-2.0 (2-4 x 10⁷ cellen/mL).
   Nota: De celgroei van de verschillende giststammen verwijdering is verschillend. Monitor OD₆₀₀ via een spectrofotometer.
3. OD₆₀₀ om waarden te berekenen, Verdun monsters OD₆₀₀ = 0,1-0,3 (1:5 tot 1:10 verdunnen) en OD₆₀₀ in een spectrofotometer meten. Als referentie, H₂O aangevuld met het overeenkomstige bedrag van leucine d/o raffionose medium te gebruiken.

Ten slotte resuspendeer OD₆₀₀ = 125 in 5 mL steriel water (5 x 10⁸ cellen/mL).

Centrifugeer bij 25 ° C gedurende 5 minuten bij 10.000 x g cellen, cellen tweemaal met 5 mL steriel water wassen en resuspendeer de cellen in 50 mL spheroplasting buffer (0,8 M sorbitol, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM CaCl₂, 2 mM dithiothreitol (DTT) en 200 µg/mL lytische enzym).

Incubeer de 50 mL cultuur op 100 rpm en 30 ° C gedurende 90 min. Optioneel: spheroplast formatie elke 15 min controleren door fase contrast microscopie. Onder de Microscoop, moeten cellen hebben een donker, doorschijnend grijze kleur. Bright (refractile) cellen zijn onvoldoende verteerd, overwegende dat spoken (bleke grijze cellen met weinig of geen, interne structuur) overdreven zijn verteerd.

Controleer spheroplast voorbereiding werkzaamheid voor elk monster.

1. Na afwerking stap 3.5, meng 4 µL van de spheroplasted 50 mL-cultuur met 496 µL spheroplasting buffer (ongeveer 2 × 10⁶ spheroplasts) en gedurende 10 minuten bij 400 x g centrifugeren.
2. Resuspendeer pellet in 10 mL H₂O gedestilleerd, vortex monster voor 30 s en plaat uit 10 µL van het monster op leucine d/o glucose platen (2% glucose, 1,5% agar, 0,5% ammoniumsulfaat, 0,17% YNB en 0.087% d/o mix zonder leucine).
3. Incubeer de cellen gedurende 3 dagen bij 30 ° C. Tel het totale aantal volwassen cel kolonies op de plaat. Voor de evaluatie van de gegevens, alleen monsters te gebruiken met een rendement hoger dan 98% (total celaantal kolonie < 40 kolonies/plaat).

Centrifuge cellen uit stap 3.5 bij 400 x g- en 4 ° C voor 10 min en wassen cellen tweemaal met 5 mL gestabiliseerd leucine d/o raffinose medium (0,8 M sorbitol, 2% raffinose, 0,5% ammoniumsulfaat, 0,17% YNB en 0.087% drop-out mix zonder leucine). Resuspendeer de cellen in 5 mL gestabiliseerde leucine d/o raffinose medium (1 x 10⁸ cellen/mL) en rechtstreeks cellen gebruiken voor de GFP verslaggever assay metingen (afdeling 4).

4. GFP verslaggever Assay meting in 96-wells-platen

1. Zaad uit de gist cel spheroplasts verkregen in stap 3.7 in 96-wells-platen (200 µL per putje).
2. Toevoegen van 70 µL gestabiliseerde leucine d/o raffinose opslagmedium met negatieve controle (eluaat van een Ni^{2 +}-affiniteit gezuiverde cel lysate uit IPTG-geïnduceerde E. coli cellen uiten de lege vector) of RTA gezuiverd in een RTA eindconcentratie van 5 µM ( overeenkomend met 160 g/L RTA) in elk putje.
3. Onmiddellijk vergroten met 30 µL gestabiliseerd galactose oplossing (30% galactose, 0,8 M sorbitol) om te induceren GFP expressie en vervolgens start de meting.
   Opmerking: Voer ten minste 3 technische replicatieonderzoeken per experiment en 3 biologische repliceert per giststam.
4. Na afwerking bereiding van de monsters (stappen 4.1-4.3), leg de 96-wells-plaat in een fluorescentie-lezer en begin van de meting. Gebruik de 475/509 nm filter nodig voor de detectie van GFP fluorescentie instellen. Uitvoeren van metingen bij 30 ° C, 120 omw / m, en met een schudden diameter van 1 mm over een venster van de tijd van 20 h (meting van de intervallen van 10 min).
   Opmerking: De GFP filter set is normaal beschikbaar in alle systemen van de lezer. Temperatuur, in het venster tijd, meten van intervallen en RTA concentratie kan worden aangepast voor eigen behoeften. Representatieve resultaten worden weergegeven in Figuur 4.
5. Optioneel: Gebruik aanvullende interne beheersingsmaatregelen in de meting voor kwaliteitscontrole. Bereid een negatieve controle door het toevoegen van 30 µL gestabiliseerde leucine d/o raffinose medium in plaats van 30% galactose (geen GFP-inductie). Bovendien, 70 µL van 0,8 M sorbitol gestabiliseerd G418 oplossing (300 µg/mL) toe te voegen. De eiwit vertaling remmer G418 fungeert als positieve controle voor de remming van het eiwit zoals het GFP expressie in gist voorkomt.
6. Relatieve GFP fluorescentie in procent voor het tijdstip van 20u volgens de volgende vergelijking berekenen (Zie figuur 4A): waar NC is de negatieve controle
   1. Anderzijds bepalen de relatieve GFP fluorescentie voor elke meting (in dit geval 10 min, zie ook stap 4.4) met behulp van de bovenstaande vergelijking. Zoals blijkt uit figuur 4B, een grafiek maken door het bevlekken van het GFP fluorescentie intensiteiten (y-as) na verloop van tijd (x-as).

Resultaten

De algemene workflow voor het protocol beschreven in dit manuscript wordt geïllustreerd in Figuur 1, ruwweg de samenvatting van de enkele stappen voor succesvol RTA zuivering en de daaropvolgende GFP verslaggever assay experiment. Een meer gedetailleerde beschrijving van elke individuele stap kan worden gevonden in het protocol. Figuur 2 illustreert het verwachte resultaat van een succesvolle RTA zuivering door chromatografie van...

Discussie

Bij het uitvoeren van het bovengenoemde protocol, raden we de volgende suggesties om een geslaagde uitkomst van het experiment.

Voor heterologe eiwit expressie is het belangrijk niet meer bedragen dan de concentratie van de IPTG van 1 mM. IPTG concentraties > 1 mM remmen promotor-geïnduceerde RTA expressie en leiden tot lagere opbrengsten van de toxine. Bovendien moeten cellen niet gekweekt worden bij temperaturen hoger dan 28 ° C om te voorkomen dat integratie lichaam vorming, inefficiënt...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Bacterie- en giststammen
E. coli BL21 DE3(Gold)	Aligent Technologies	230130
S. cerevisiae BY4742	Euroscarf	Y10000
S. cerevisiae BY4742-deletiekmutanten	Dharmacon	YSC1054	hele collectie
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Plasmiden gebruikt in dit protocol
pET24a(+) (Novagen)	Millipore	69772-3
pET-RTA(His6)	Becker et al. (2016)3
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Reagentia
Zymolyase 20T	USBio	Z1000.250	lytisch enzym voor celwandverwijdering
LB-bouillonmedium	Thermo Scientific	10855021	15 g agar werd toegevoegd voor plaatproductie
YNB	Thermo Scientific	DF0335-15-9
Ammoniumsulfaat	Sigma-Aldrich	A4418-100G
Gist-dropoutmix-supplementen zonder leucine	Sigma-Aldrich	Y1376-20G
Agar	Sigma-Aldrich	05040-100G
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8270-100G
DTT	Sigma-Aldrich	10197777001
D-raffinose	Sigma-Aldrich	83400-25G
D-sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876-1KG
D-galactose	Sigma-Aldrich	G0750-10MG
G418	Thermo Scientific	11811031
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758-1G
Imidazool	Roth	3899.1
PAGE ruler vooraf gekleurd	Fermentas	26616	eiwitreek gebruikt voor Western-analyse
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Materiaal voor RTA-zuivering, ontzouting en leesmetingen
Spectrofotometer Ultrospec 2100 pro	Amersham
Soniprep 150	MSE		oud model, andere modellen beschikbaar
Fluoroskan Ascent	Thermo Scientific	5210470	oud model, niet meer verkrijgbaar
ÄKTAPurifier	Thermo Scientific	28406266	Product is stopgezet en vervangen
HisTRAP HP-kolom	GE Healthcare	17-5248-02
HiTRAP-ontziltingskolom	GE Healthcare	11-0003-29
Midisart steriele filter	Sartorius	16534K	0,2 µm poriegrootte
BCA-eiwitassaykit	Pierce	23225
660 nm-assaykit	Thermo Scientific	22660
96-wellsplaten	Thermo Scientific	260860
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Antilichamen (optioneel)
Anti-Tetra-His	Qiagen	34670	primair antilichaam; 1:1.000 verdunning
Anti-muis-HRP	Sigma-Aldrich	A9044-2ML	secundair antilichaam, 1:10.000 verdunning