Methode voor het labelen van afschriften in individuele Escherichia coli cellen voor Single-molecuul fluorescentie In Situ hybridisatie experimenten

Samenvatting

Dit manuscript beschrijft een methode voor het labelen van individuele boodschapper-RNA (mRNA) afschriften met fluorescently-geëtiketteerden DNA sondes, voor gebruik in single-molecuul fluorescentie in situ hybridisatie (smFISH) proeven in E. coli. smFISH is een visualisatie methode waarmee de simultane detectie-, lokalisatie- en kwantificering van afzonderlijke mRNA moleculen in vaste afzonderlijke cellen.

Samenvatting

Een methode is beschreven voor het labelen van individuele boodschapper-RNA (mRNA) afschriften in vaste bacteriën voor gebruik in single-molecuul fluorescentie in situ hybridisatie (smFISH) proeven in E. coli. smFISH kunt de meting van cel naar cel variabiliteit in exemplaaraantal van mRNA van genen van belang, evenals de subcellular locatie van de transcripten. De belangrijkste stappen zijn fixatie van de cultuur van de bacteriële cel, permeabilization van celmembranen en kruising van de afschriften van de doelgroep met sets van verkrijgbare korte fluorescently-geëtiketteerden oligonucleotide sondes. smFISH kunnen de beeldvorming van de transcripties van meerdere genen in dezelfde cel, met de beperkingen die worden opgelegd door de spectrale overlap tussen verschillende fluorescente markeringen. Na voltooiing van het protocol hieronder geïllustreerd, cellen kunnen worden gemakkelijk beeld met behulp van een combinatie met een camera geschikt voor lage-intensiteit fluorescentie Microscoop. Deze beelden, samen met de cel contouren verkregen uit segmentatie van fase contrast frames, of uit het celmembraan kleuring, toestaan dat de berekening van de mRNA kopie nummer verdeling van een steekproef van cellen met behulp van open-source of aangepaste-geschreven software. De hier beschreven labeling methode kan ook worden toegepast op afbeelding chat-kopieën met de wederopbouw van stochastische optische microscopie (STORM).

Inleiding

Onzekerheden is een fundamentele en onvermijdelijk aspect van genexpressie en geeft aanleiding tot cel heterogeniteit¹, zowel op het niveau van afschriften en eiwitten^2,3. Kwantificeren van de variabiliteit tussen de cellen onder welomschreven voorwaarden biedt een uniek venster in de fundamentele processen die ten grondslag liggen van genexpressie en de verordening. Een belangrijke bron van cel-cel heterogeniteit in bacteriën vindt plaats op het transcriptional niveau. De nummers van de transcript variëren niet alleen vanwege de onzekerheden van transcriptie, maar ook voor post-transcriptional processen zoals verordening door kleine RNAs en RNAases². Unidirectioneel van het direct toegang tot deze heterogeniteit op een kwantitatieve manier is door fluorescently tagging afzonderlijke afschriften van een bepaald gen in smFISH. Deze methode kan de detectie en subcellular localisatie van bepaalde molecules van RNA in vaste, individuele bacteriecellen⁴. mRNAs zijn gekruist met een set van fluorescently-geëtiketteerden ~ 20 base-lange oligonucleotides, die zijn ontworpen om selectief te binden aan afschriften van belang^5,6. Meerdere labeling zorgt voor detectie boven achtergrond fluorescentie en individuele mRNA moleculen als diffractie-limited vlekken onder een fluorescentie Microscoop⁷ (Zie Figuur 1). Er zijn andere benaderingen voor het labelen van mRNA moleculen, waarin de aanvullende oligomeren sondes voeren geconjugeerd haptens (b.v., biotine of Heksenkruid) die met behulp van secundaire fluorescently-geëtiketteerden verslaggever technieken⁸worden gedetecteerd.

Er zijn andere methoden die kwantitatieve informatie over afschriften, naast smFISH verschaffen. Sommigen, zoals de noordelijke vlek of kwantitatieve PCR, sonde van de bulk en dus het aantal exemplaren van mRNA, noch hun positie in afzonderlijke cellen kunnen meten. Deze methoden zijn dus niet geschikt om te kwantificeren van cel naar cel variabiliteit. Een recente beeld-gebaseerde techniek die het mogelijk maakt voor de kwantificering van zowel het exemplaaraantal van RNAs binnen cellen evenals hun intracellulaire locatie, genaamd multiplexed fout-robuuste fluorescentie in situ hybridisatie (MERFISH) ontwikkeld. MERFISH is gebaseerd op de toewijzing van een unieke barcode die bestaat uit een gedefinieerde combinatie van een vast aantal fluorescently-geëtiketteerden oligonucleotide sondes. Deze streepjescodes worden gelezen uit in opeenvolgende ronden van smFISH metingen, met photobleaching na elke ronde van hybridisatie, waardoor de doorvoer door twee ordes van grootte^9,10. Deze techniek vereist een geautomatiseerde Vloeistofbehandeling systeem en het juiste ontwerp van de sonde set.

De combinatie van meerdere fluorescentie labeling van afzonderlijke afschriften, samen met roman super resolutie technieken zoals stochastische optische wederopbouw microscopie (STORM)¹¹, maakt een tienvoudige toename van de resolutie in de Subcellular Localisatie van afschriften. In de STORM zorgt een geschikte combinatie van fluorescent sondes en imaging buffer voor meerdere cycli van fluorescentie emissie per sonde molecuul (knippert). STORM kan ook worden gebruikt voor image E. coli transcriptome & genoom-brede ruimtelijke organisatie van RNA, observeren door gelijktijdig alle de transcripties van belang¹²labeling.

Alle methoden van de eencellige herzien boven zijn gebaseerd op imaging afschriften in vaste cellen. Vandaar, zij bieden niet alle informatie met betrekking tot de kinetische eigenschappen van afschriften binnen cellen. Volg afschriften in levende cellen¹³en kan mRNAs worden aangeduid door de fusie van het gen van belang zijn voor een matrix van bindende sites. Deze laatste worden vervolgens herkend door een RNA-bindende eiwit, zoals de bacteriofaag MS2 jas-eiwit, dat aan een fluorescente proteïne zoals de groen fluorescente proteïne (GFP)^10,14,15is gesmolten.

Hier beschrijven we een methode voor het labelen van individuele mRNAs met een set van fluorescently-geëtiketteerden DNA sondes, voor gebruik in smFISH proeven, met name in E. coli. Bovendien laten we zien dat het dezelfde labelschema mogen worden gebruikt voor STORM metingen met kleine wijzigingen.

Protocol

1. sonde Design

Opmerking: Dit protocol maakt gebruik van commercieel beschikbare oligonucleotide sondes al gelabeld met fluorophores. De sondes bestaan uit een set van specifieke opeenvolgingen complementair aan een doelwit mRNA, elke sonde wordt geconjugeerd met een enkel fluorescerende molecuul. Anderzijds is het fluorescente markeringen koppelen aan sondes, zoals elders beschreven^5,16.

1. Ontwerp smFISH sondes met behulp van de sonde Designer¹⁶ algoritme ontwikkeld door Arjun Raj (van Oudenaarden Lab, Massachusetts Institute of Technology); sequenties van smFISH sondes gebruikt in dit manuscript staan in de tabel van materialen.
   Opmerking: Het minimum aantal sondes in een set voor een opspoorbaar signaal is ~ 30. Het precieze aantal kan variëren volgens het gen van belang, met name als zeer korte afschriften worden gemeten.
2. Kies een kleurstof die de optische setup past (zie tabel van materialen).
   Opmerking: De Cy3 kleurstof of een optisch gelijkwaardig kleurstof met een lage gevoeligheid voor foto-bleken wordt sterk aanbevolen. Een kandidaat voor het labelen van dual is Cy5 of een optisch gelijkwaardige kleurstof (zie tabel van materialen). Geschikte kleurstoffen voor STORM beeldvorming van gelabelde mRNA worden gekenmerkt door hun capaciteit voor meerdere cycli van fluorescentie emissie. Sommige smFISH-kleurstoffen kunnen worden gebruikt voor STORM beeldvorming (zie tabel van materialen). Naar image twee (of meer) afschriften overeenkomt met verschillende genen in dezelfde cel staan, moet men kiezen oligonucleotide sondes geconjugeerd met kleurstoffen waarvan spectra weinig of geen overlapping hebben.

2. reagens voorbereiding

Opmerking: Het is belangrijk om te houden van de RNAse-gratis monsters met behulp van RNase-vrije verbruiksartikelen zoals gefilterde Pipetteer tips en buizen, en elke werkomgeving schoon te houden. Om te voorkomen dat de aantasting van de afschriften van de doelgroep, moeten alle reagentia gebruikt na cel fixatie nuclease-gratis (zie tabel van materialen) of diethylpyrocarbonate (DEPC)-behandeld en gesteriliseerd.

1. Buffers voor smFISH
   1. Bereiden RNase-gratis 1 x PBS (phosphate buffered saline, oplossing met een fosfaat buffer concentratie van 0,01 M en een concentratie van het natriumchloride 0.154 m, (pH 7.4)). Verdun RNase-gratis 10 x PBS (zie tabel van materialen) in nuclease-vrij water (zie tabel van materialen) op een 1:10 v/v-verhouding.
      1. Alternatief bereiden DEPC-behandelde 1 x PBS.
   2. Bereiden RNase-gratis 2 x SSC (saline-Natriumcitraat buffer, 0.3 M NaCl in 0.03 M Natriumcitraat, (pH 7.0)). Verdun RNase-vrije 20 x SSC (zie tabel van materialen) in nuclease-gratis water bij een 1:10 v/v-verhouding.
      1. Als alternatief, het bereiden van 2 DEPC-behandeld x SSC.
2. Oligonucleotide sonde stamoplossing.
   1. Opnieuw het ontbinden van de gedroogde oligonucleotide sonde mix in 200 µL van TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) maken een sonde voorraad van 25 µM. Meng goed door pipetteren op en neer, en vervolgens vortex en centrifuge kort.
   2. Om te voorkomen bevriezen en ontdooien van de stockoplossing buis, moet u verschillende hoeveelheden van de stamoplossing, overeenkomt met het bedrag moeten worden gebruikt in een enkele experimentele uitvoeren. Opslaan van de stockoplossing bij-20 ° C of lager en beschermen tegen licht.
      Opmerking: Een sonde set 5 nmol bieden maximaal 250 hybridisatie reacties.
3. Hybridisatie buffer (naar aanleiding van Skinner et al. ⁷ ):
   1. Voeg 5 mL nuclease-gratis water toe tot een polypropyleen conische bodem-tube van 50 mL. 1 g dextran sulfaat toevoegen aan het water en los het door krachtige vortexing. Meng de inhoud in een roteerschudapparaat tot bubbels verdwijnen (~ 30 min).
   2. Voeg aan de oplossing 3,530 µL gedeïoniseerd formamide, 10 mg van E. coli tRNA, 1 mL 20 x SSC, 100 µL van 200 mM vanadyl-ribonucleoside complex en 40 µL van 50 mg/mL BSA. Breng het eindvolume tot 10 mL door toevoeging van water DEPC-behandeld of nuclease-gratis water en vortex de oplossing totdat het homogene.
      Opmerking: Om te voorkomen dat bevriezen en ontdooien van de oplossing, maken verschillende hoeveelheden van de stamoplossing, overeenkomt met het bedrag moeten worden gebruikt in een enkele experimentele uitvoeren. Opslaan van de stockoplossing bij-20 ° C. Zorg ervoor dat laat de formamide warm tot kamertemperatuur alvorens de fles te openen. Verklein de achtergrond en wordt voorgesteld om het kalibreren van de concentratie van de optimale formamide (10-40% v/v-verhouding).
      Let op: WAARSCHUWING! Formamide is zeer giftig en een bekende teratogen. Vermijd contact met ogen of huid, inademing of inslikken. Omgaan onder een zuurkast terwijl het dragen van een laboratoriumjas en beschermende handschoenen.
   3. Het steriliseren van de oplossing in het passeren van een 0.22-µm filter. Houd in aliquots en opslaan bij-20 ° C tot één jaar.
4. Bereiden van fixatie buffer (4,6% formaldehyde in 1 x PBS) door toevoeging van 37% formaldehyde (v/v) naar 1 x PBS (zie 2.1.1) op een 1:8 v/v-verhouding en vortex.
   LET OP: WAARSCHUWING! Formaldehyde is zeer giftig en een bekend carcinogeen. Omgaan onder een zuurkast terwijl het dragen van een laboratoriumjas en beschermende handschoenen.
5. Was buffer voorbereiden smFISH (20% formamide in 2 x SSC) door toevoeging van gedeïoniseerd formamide aan 2 x SSC (ziepunt 2.1.2) naar een 1:4 v/v-verhouding en vortex.
6. SmFISH imaging buffer voorbereiden door toevoeging van 5 mM cysteamine en zuurstof aaseters (7 µM glucose oxidase, 56 nM katalase en 10% glucose (g/v)) om te wassen van de buffer (20% formamide in 2 x SSC)
7. Buffers voor STORM
   1. Bereiden Buffer A door toevoeging van 50 mM Tris-HCl en 10 mM NaCl nuclease-gratis water.
      Opmerking: Winkel op RT jarenlang.
   2. Bereiden Buffer B door toevoeging van 50 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl en 10% w/v glucose tot nuclease-gratis water.
      Opmerking: Bewaren bij 4 ° C voor maximaal een jaar.
   3. Bereiden MEA buffer door ontbinding van 77 mg cysteamine in 1 mL buffer A (maakt een oplossing van 1 M).
      Opmerking: Het kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende 1 maand.
   4. Gloxy buffer bereiden door toe te voegen 8440 AU (willekeurige eenheden) glucose oxidase en 70,200 AU katalase tot 1 mL buffer A.
      Opmerking: 50 x stockoplossing, maakt het voor 1 maand bij 4 ° C kan worden opgeslagen.
   5. STORM imaging buffer voorbereiden door toevoeging van 50 mM van MEA buffer en 1 x Gloxy buffer voor buffer B.
      Opmerking: De imaging buffer voor STORM is samengesteld uit 5 mM cysteamine, zuurstof aaseters (7 µM glucose-oxidase en 56 nM katalase) in 50 mM Tris met 10 mM NaCl en 10% glucose op pH 8,0. Voorbereiden voordat u imaging, kan het worden opgeslagen en gebruikt op RT voor ongeveer 2 h.

3. voorbeeld fixatie

1. Groeien van bacteriële cellen (bijvoorbeeld E.

coli MG1655) in groei media van keuze (bijvoorbeeld, LB medium) overnachting-inan roteerschudapparaat op 260 rpm en 37 ° C.
Opmerking: Om te bepalen van de achtergrond als gevolg van niet-specifieke binding van de sondes, metingen in een stam waarin het gen van belang is verwijderd dienen te worden uitgevoerd, volgens de zelfde procedures (Zie Δ,galk in Figuur 1 en ΔsodB in Figuur 2).

Verdun de nachtelijke 1:100 van de cultuur in verse medium en meet de optische dichtheid (OD₆₀₀) in een spectrofotometer elke ~ 1 h, tot een waarde van 0,2 - 0,4; een 4 mL cultuur zou voldoende moeten zijn.
Opmerking: Als de gekozen Microscoop geen fase contrast of differentiële interferentie contrast vermogens heeft, E. coli buitenste membranen kunnen gelabeld zijn met 2 μM lipofiele fluorescerende marker (zie tabel van materialen), die moet worden toegevoegd aan de bacteriële suspensie 20 min voorafgaand aan de fixatie¹⁷. Fixatie en verdere behandeling uitgevoerd zoals hieronder beschreven. Wees voorzichtig om te kiezen een fluorescerende marker hebben een verschillende emissie spectrum, te minimaliseren van de spectrale overlap met de label-sonde set.

Pellet cellen door centrifugeren voor 5 min bij 4.500 g bij 4 ° C. Verwijder het supernatant uit alle buizen.

Voeg 1 mL 1 x PBS aan elke buis en resuspendeer de pellet om te minimaliseren van cel naar cel aggregatie. Voeg vervolgens voorzichtig 4 mL fixatie buffer en vortex.

Incubeer monsters in een roteerschudapparaat bij 260 omwentelingen per minuut gedurende 30 minuten bij 24 ° C.

Pellet cellen door centrifugeren voor 10 min, 1.000 g, 4 ° C. Verwijder de bovendrijvende vloeistof. Voeg 1 mL 1 x PBS.

Schorsingen overbrengen 1.8 µL conische bodem micro-centrifuge buizen (zie tabel van materialen) en herhaalt u stap 3.6 tweemaal.

4. monster Permeabilization

1. Supernatant zeer zorgvuldig verwijderen. Gebruik kleine volume pipetten, indien nodig, voor het verwijderen van alle van de vloeistof buiten de pellet.
2. Resuspendeer in 300 µL DEPC-behandeld water of nuclease-gratis water. Voeg 350 µL hoogwaardige absolute ethanol (99%) en meng voorzichtig door het omkeren van de buis. Voeg een ander 350 µL van ethanol en mix opnieuw tot een definitieve ethanol concentratie van 70% (v/v-verhouding).
   LET OP: WAARSCHUWING! Ethanol is ontvlambaar.
3. Draaien van het monster met een buis rotator bij 20 omwentelingen per minuut gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (RT), of bij 4 ° C's nachts. Monsters kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C tot één week.

5. hybridisatie

1. Pellet cellen door centrifugeren voor 7 min, 750 x g, 4 ° C. Verwijder de bovendrijvende vloeistof.
2. Voeg 1 mL 20% buffer om de monsters te wassen en laat staan voor enkele minuten, of pipet te ontbinden de pellet volledig.
3. Pellet cellen door centrifugeren voor 7 min, 750 x g 4 ° C.
4. Verwijder het supernatant heel zachtjes door pipetteren. Gebruik kleine-volume pipetten indien nodig te verwijderen van alle van de vloeistof buiten de pellet.
5. Voeg de sonde oligonucleotide stockoplossing op de kruising buffer aliquot ingesteld zodat de definitieve oligonucleotide concentratie 250 is nM; Vortex krachtig.
   Opmerking: Men kan twee of meer verschillende doelgroepen mRNAs tegelijk in dezelfde cel label. Sonde sets van beide doelen toevoegen aan de hybridisatie buffer. Wees voorzichtig om te kiezen van kleurstoffen hebben verschillende spectra van de uitstoot tot een minimum beperken van de spectrale overlap (bvCy3 en Cy5). Zorg ervoor dat de monsters voor STORM imaging zijn gekruist met een sonde van de oligonucleotide instellen geconjugeerd met een geschikt kleurstof voor STORM (bijvoorbeeldin de tabel van materialen).
6. Schorten monsters (zie stap 5.4) in 50 µL hybridisatie buffer waarin de oligonucleotide sondes, terwijl het vermijden van de generatie van bubbels (de oplossing is zeer visceuze).
7. Laat 's nachts monsters op een warm blok bij 30 ° C in het donker.
   Opmerking: Na dit, monsters kunnen worden opgeslagen voor maximaal 6 maanden bij 4 ° C.

6. wassen

1. Gebruik één nieuwe microcentrifuge tube voor elk monster naar afbeelding. Voeg 1 mL was buffer.
2. 10-15 µL uit de gehybridiseerde monsters toevoegen aan de nieuwe buis waarin de was buffer en mix/vortex.
3. Pellet cellen door centrifugeren voor 7 min, 750 x g bij 4 ° C. Verwijder de bovendrijvende vloeistof.
   Opmerking: Verklein achtergrond en incubeer gedurende 1 h bij 30 ° C.
4. Wassen tweemaal meer (resuspendeer in 1 mL was buffer, centrifugeren en pellet verwijderen).
5. Resuspendeer in 25 µL was buffer.
   Opmerking: Teneinde een foto-bleken kunt toevoegen aan de was buffer een zuurstof opruiming systeem (2.6) om kleurstof stabiliteit in single-molecuul fluorescentie experimenten⁶te verbeteren.

7. bereiding van de monsters voor Imaging

Opmerking: Cellen moeten worden geïmmobiliseerd zodat de juiste beeldvorming onder een Microscoop fluorescentie en fase contrast. De volgende methoden kunnen worden gebruikt ter voorbereiding van de monsters waarin verschillende gezichtsveld image op verschillende vlakken die focal kan worden gemaakt.

1. Voorbereiding van het agarose gel
   1. Voeg 150 mg agarose aan 10 mL 2 x SSC buffer. Voeg geen 2 x SSC aan agarose, of anders het zal niet goed oplossen.
   2. Magnetron voor 10-15 s telkens tot grote bubbels beginnen te vormen. Gereserveerd voor een paar minuten afkoelen.
   3. Plaats een scheitrechter siliconen frame op de dia, zodat de dia center blootgesteld blijft.
   4. Plaatsen van een 10 mm breed (1-2 mm dik) rigide ring in het midden van de dia en storting van een kleine hoeveelheid gel, voor verzegeling. Wacht een paar minuten daarvoor te verharden.
   5. Voeg meer gel totdat de vorm van een hoge koepel wordt gevormd. Wacht 10 min. voor het te verharden en verwijderen van de ring (met fijne pincet of een andere methode).
   6. ~ 10 μL van gewassen bacteriële cellen (zie 6.5) op de gel en de verbinding met een #0 dekglaasje aan dia storten.
2. Bereiding van de monsters van de kamer voor smFISH
   1. U kunt ook (naar stap 7.1) monsters voor imaging te bereiden door het immobilizing van de gewassen bacteriële cellen (zie 6.5) op poly-D-lysine-gecoate glazen bodem wegwerp plastic petrischaaltjes.
   2. Incubeer de monsters in het donker, op kamertemperatuur, 's nachts voor visualisatie waarmee de hechting van de cellen aan de oppervlakte. Voor visualisatie keer wassen met wash buffer (. 5); Houd het monster nat met was buffer(2.5) of imaging buffer voor smFISH (2.6).
3. Bereiding van de monsters van de kamer voor de STORM
   1. Monsters voorbereiden door STORM voor imaging op poly-D-lysine-gecoate glazen bodem wegwerp plastic petrischaaltjes.
   2. Incubeer de monsters in het donker, bij RT, 's nachts. Voor visualisatie wassen eens met was buffer voor smFISH (2.5); en voeg imaging buffer voor STORM (2.7.5).

8.Transcript visualisatie

1. Het beeld van cellen met een breed-gebied fluorescentie Microscoop uitgerust met een gemotoriseerde stadium (zie tabel van materialen).
   Opmerking: Voor het wijzigen van de STORM, cellen aangeduid met een staat van meerdere cycli van fluorescentie emissie kleurstof gebruiken. Afbeelding van het monster met behulp van de resolutie van 3D Super imaging systeem (b.v., zie tabel van materialen).
2. Gebruiken (aanbevolen) een 60-100 x N.A > 1.3 olie onderdompeling fase contrast objectief met een sterke lichtbron, zoals een kwik- of metaal halide lamp; LED-gebaseerde lichtbronnen worden ook aanbevolen.
3. Gebruik een standaard CCD camera, ideaal voor laag-licht niveau beeldvorming plaats snelheid gekoelde (wij gebruiken een camera met 16 µm pixelgrootte) geoptimaliseerd (zie tabel van materialen).
   Opmerking: Het gebruik van een gekoeld EMCCD (elektron te vermenigvuldigen charge gekoppeld apparaat) camera CCD camera is nodig om te verminderen van thermische ruis, waardoor de detectie, met name van afzonderlijke moleculen.
4. Gebruik filter ingesteld geschikt is voor de fluorophores gekozen.
5. Om te bepalen naar behoren celbegrenzing, beelden van verschillende gezichtsveld in elk monster met fase contrast optiek of door labeling fluorescently de buitenste celmembraan te verwerven. Verwerven van afbeeldingen op verschillende focal vlakken (z-stack) voor alle kanalen (meestal 13 segmenten gescheiden door 250 nm worden genomen).
   Opmerking: De gemotoriseerde fase van de Microscoop en de filter sets moet worden gecontroleerd door commerciële (zie tabel van materialen) of in-house software die een stapel van beelden in volgorde vangen kan.

9. de gegevensanalyse

1. De afbeeldingsstapels omzetten in een geschikt formaat voor data-analyse.
2. Schatten van het exemplaaraantal van het streefcijfer mRNA van de totale intensiteit van fluorescerende foci in de cel, in plaats van het tellen van discrete 'spots' zoals in de andere beschikbare protocollen.
3. Beeldanalyse met open-sourcesoftware¹⁸ of met een op maat gemaakte programma uitvoeren. Zie voor details gegevens beeldvorming en analyse Skinner et al. ⁷

Resultaten

Wij uitgevoerd smFISH metingen van afschriften van de galK en sodB in cellen van E. coli . De transcripties werden gekruist met een aantal specifieke opeenvolgingen complementair aan de target-reeks, elke sonde wordt geconjugeerd met een enkel fluorescerende molecuul (zie tabel van materialen). Fluorescentie en fase contrast beelden van MG1655 wild-type E. coli stam (WT) of een JW0740 (Keio-collectie)¹⁹ galK-deleted stam (ΔgalK) werden bl...

Discussie

Wij hebben gemeten in ons laboratorium het transcript aantal verschillende genen in E. coli cellen met behulp van de smFISH methode². Kortom, deze procedure bestaat uit de volgende stappen: cel fixatie, permeabilization van membranen voor sonde penetratie, hybridisatie sonde, en proef de geschikt zijn met behulp van een standaard fluorescentie Microscoop. Deze procedure is gebaseerd op eerder gepubliceerde degenen met enkele wijzigingen^6,

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Dextran sulfate sodium salt	Sigma-Aldrich	D8906
Pure Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute	Mallinckrodt Baker - Avantor	8025.25
Diethylpyrocarbonate (DEPC)	Sigma-Aldrich	D5758
RNase-free 20X SSC	Life Technologies/Ambion	AM9763
RNase-free 10X PBS	Life Technologies/Ambion	AM9625
TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) BioUltra, for molecular biology	Sigma-Aldrich	93283
nuclease-free water	Thermo Fisher Scientific	10977035
Formaldehyde solution for molecular biology, 36.5-38% in water	Sigma-Aldrich	F8775
Deionized formamide, nuclease free	Thermo Fisher Scientific/Ambion	AM9342
E. coli tRNA (ribonucleic acid, transfer type xx from escherichia)	Sigma-Aldrich	R1753-500UN
UltraPure BSA (50mg/ml)	Thermo Fisher Scientific/Ambion	AM2616
Vanadyl-ribonucleoside complex,VRC, 200 mM	New England Biolab	S1402S
Poly-L-Lysine	Sigma	P4707
Cysteamine and oxygen	Sigma-Aldrich	30070
Glucose Oxidase from Aspergillus niger, Type VII, 50KU	Sigma-Aldrich	G2133
Catalase	Sigma-Aldrich	C40
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8270
D-fucose	Sigma-Aldrich	F8150
Vybrant DiO Cell-Labeling Solution	Life Technologies	V2286
Agarose,low melting reagent	Sigma-Aldrich	A9414
Adhesive silicone isolator 24-2mm Dia. X 1.8 mm depth JTR24R-A2-2.0	Grace Bio-Labs	JTR24R-A2-2.0 666208
poly-D-lysine-coated glass bottom Glass Bottom Culture Dishes	MatTek Corporation	P35GC-1.5-14-C
Super life nitrile powder free examination gloves	Supermax	TC-N-9889
Brand sterilization incubator tape	Sigma-Aldrich	BR61750
Microcentrifuge tubes (1.8 ml)	Axygen - Corning Life Sciences	MCT-175C
Falcon round-bottom polypropylene tubes (14 ml)	BD Biosciences	352059
Conical-bottom centrifuge polypropylene tubes (50 ml)	Corning	430828
Serological pipettes (Corning 5 ml)	Corning Life Sciences	4051
Serological pipettes (Corning 10 ml)	Corning Life Sciences	4488
Serological pipettes (Corning 25 ml)	Corning Life Sciences	4251
Spectrophotometer cuvettes	Sarstedt	67.742
RNase-free pipette tips 0.2 - 20 μl	FroggaBio	FT20
RNase-free pipette tips 10 - 200 μl	Axigene/corning	TF-200
RNase-free pipette tips 100 - 1000 μl	FroggaBio	FT1000
RNase-free pipette tips 100 - 1000 μl	Sorenson	14200
Syringe disposile 10 mL needle G-21	Becton Dickinson, Biosciences	BD-309643
Minisart 0.2 um Syringe Filter	Sartorius	16534 K
Nikon instruments microscope type A immersion oil A, 8cc	Nikon	MXA20233
Microscope slides 76 x26, 3"x1"x1mm	Thermo Fisher Scientific	421-004ET
#0 coverslip slide 24x60	Thermo Fisher Scientific/Menzel	BNBB024060A0
Orbital shaker	M.R.C	TOU-50
Hot block	M.R.C
Vortex	Fried Electric Company	G-560-E
Microcentrifuge	Eppendorf	5427R
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Portable Pipet-Aid XP2, Pipette Controller	Drummond Scientific Company	4-000-501-I
OD600 Spectrophotometer for Bacterial Growth Rates DiluPhotometer	Midsci	OD600-10
iXon X3 EMCCD camera	Andor	DU-897E-CS0-#BV
Eclipse Ti microscope	Nikon	MEA53100
CFI plan apochromat DM 100X oil objective lambda PH-3 N.A 1.45 WD 0.13	Nikon	MRD31905
Filter set (TRITC/CY3): EX - ET545/30X; EM - ET620/60M; BS - T570LP	Nikon	49005
Filter set (CY5): EX - ET640/30X; EM - ET690/50M; BS - T660P	Nikon	49009
Nis-elements AR auto reaserch software	Nikon	MQS31000
STORM microscope	Vutara	SR-200
NA 1.2 water immersion objective	Olympus
SRX image acquisition and analysis software	Vutara
Evolve 512 EMCCD camera	Photometrics
Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with CAL Fluor® Red 590 Dye	Biosearch Technologies Inc	SMF-1083-5
Probe Sequence for galK mRNA:
gtgttttttctttcagactc
tagccaaatgcgttggcaaa
ctgaatggtgtgagtggcag
caccaatcaaattcacgcgg
acgaaaccgtcgttg