Vloeistof-voeding insecten hebben de mogelijkheid om minieme hoeveelheden van vloeistoffen uit poreuze oppervlakken te verwerven. Dit protocol beschrijft een methode om te bepalen direct de mogelijkheid voor insecten innemen van vloeistoffen uit poreuze oppervlakken met behulp van voeding oplossingen met fluorescerende, magnetische nanodeeltjes.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
De inname van TL, magnetische nanodeeltjes voor de bepaling van de vloeistof-opname capaciteiten in de insecten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Vloeistof-voeding insecten inslikken een verscheidenheid van vloeistoffen, die in het milieu aanwezig zijn als zwembaden, films, of beperkt tot kleine poriën. Studies van vloeibare verwerving moeten beoordelen van de structuur en functie relaties mouthpart; vloeibare opname mechanismen worden echter historisch afgeleid uit waarnemingen van structurele architectuur, soms niet-begeleide met experimenteel bewijs. Wij rapporteren hier een nieuwe methode voor de beoordeling van de vloeistof-opname capaciteiten met vlinders (Lepidoptera) en vliegen (Diptera) met behulp van kleine hoeveelheden vloeistoffen. Insecten zijn gevoed met een 20% sacharoseoplossing gemengd met fluorescerende, magnetische nanodeeltjes van filtreerpapier van specifieke porie-grootte. Het gewas (interne structuur gebruikt voor de opslag van vloeistoffen) is verwijderd uit het insect en geplaatst op een confocal microscoop. Een magneet is gezwaaid door het gewas om te bepalen van de aanwezigheid van nanodeeltjes, waaruit blijkt als de insecten kunnen vloeistoffen inslikken. Deze methodologie wordt gebruikt voor het onthullen van een wijdverbreide voeding mechanisme (capillaire actie en vloeibare brug vorming) die potentieel door Lepidoptera en Diptera wordt gedeeld bij het voederen van poreuze oppervlakken. Bovendien, deze methode kan worden gebruikt voor studies van het voederen mechanismen onder een verscheidenheid van vloeistof-voeding insecten, met inbegrip van die belangrijk in de transmissie van de ziekte- en biomimetics en potentieel andere studies die betrekking hebben op nano - of micro-gerangschikte leidingen waar vloeibare vervoer is verificatie vereist.
Inleiding
Veel insecten groepen hebben monddelen (proboscises) aangepast voor het voederen van op vloeistoffen, zoals nectar, rottend fruit, sap stroomt (bijvoorbeeld Diptera1, Lepidoptera2, Hymenoptera (Vliesvleugeligen)3), xylem (Hemiptera4), tranen (Lepidoptera 5), en bloed (Phthiraptera6, vlooien7, Diptera7, Hemiptera8, Lepidoptera,9). Het vermogen van de insecten te voeden met vloeistoffen is relevant zijn voor de gezondheid van het ecosysteem (bv bestuiving10), ziekte transmissie4,11, biodiversification2,12en studies van convergente evolutie13. Ondanks de grote verscheidenheid van voedselbronnen is een thema onder sommige insecten vloeistof-voeding de mogelijkheid om het verwerven van kleine hoeveelheden vloeistoffen, die kunnen worden beperkt tot micro - of nano-gerangschikte druppels, vloeibare films of poreuze oppervlakken.
Gezien de uitgebreide verscheidenheid aan vloeistof-voeding insecten (meer dan 20% van alle diersoorten14,15) en hun vermogen om te voeden met een scala aan voedselbronnen, begrijpen hun voeding gedrag en vloeistof-opname mechanismen is belangrijk in veel gebieden. Insecten mouthpart functionaliteit, bijvoorbeeld, heeft een rol gespeeld in de ontwikkeling van biomimetische technologie, bijvoorbeeld, microfluidic apparaten die kunnen taken uitvoeren zoals de overname van kleine hoeveelheden vloeistoffen met behulp van methoden die vergelijkbaar zijn met die werkzaam door insecten16. Een fundamenteel probleem in de studies van vloeibare opname mechanismen, echter, is bepalen niet alleen hoe insecten voeden zich met vloeistoffen, maar verwerven van experimentele bewijs dat het mechanisme ondersteunt. Uitsluitend met behulp van gedrag (bijvoorbeeld sonderen met de proboscis12,17) als een indicator voor het voederen onvoldoende, is omdat het niet dat de succesvolle opname van vloeistoffen bevestigt, noch verstrekt het een middel om de route te bepalen dat vloeistoffen reizen als ze het insect passeren. Daarnaast vertegenwoordigt het uitvoeren van experimenten met kleine hoeveelheden vloeistoffen beter natuurlijke voeding scenario's te bedenken waar vocht een beperkende resource2,12.
X-Ray fase contrast imaging werd gebruikt met de monarchvlinder (Danaos plexippus L.) om te beoordelen hoe vlinders voeden met kleine hoeveelheden vloeistoffen uit poreuze oppervlakken12. Monarch butterflies gebruiken capillair actie via spaties tussen cuticular projecties (dorsale legulae) langs de proboscis om vloeistoffen beperkt tot kleine poriën in de voedingsmiddelen-kanaal. De binnenkomende vloeistoffen vormen een film op de muur van de voedsel-kanaal dat groeit en stort in een vloeibare brug door Plateau instabiliteit12,18, die vervolgens wordt getransporteerd naar de vlinder de darm door inwerking van de zuigende pomp in het hoofd. Hoewel x-ray fase contrast imaging een optimale hulpmiddel is voor het visualiseren van vloeistofstromen binnen insecten12,19,20,21, de techniek is niet beschikbaar en een handiger methode is nodig voor snelle beoordeling gegeven van een insect vermogen tot opname vloeistoffen en inslikken hen.
Om te bepalen als de voeding mechanisme voor D. plexippus geldt voor andere Lepidoptera, maar ook om te vliegen (Diptera) (beide groepen voeden met vloeistoffen uit poreuze oppervlakken), Majestic et al. 13 toegepast een techniek ter evaluatie van een insect vermogen te voeden op kleine hoeveelheden vloeistoffen van poreuze oppervlakken, die wordt gerapporteerd in detail hier. Hoewel het protocol hier geschetst voor studies die gebruikmaken van bevochtigd en poreuze oppervlakken, kan de methodologie voor andere studies, zoals de aanpak van de zwembad-voederen mechanismen worden veranderd. Bovendien, uitbreiden de toepassingen tot andere gebieden, met inbegrip van microfluidics en bioinspired technologie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. insecten soorten, voorbereiding van oplossingen en het voederen Station Setup
Noot: kool vlinders (Pieris rapae L., Witjes) worden geselecteerd als de soorten vertegenwoordiger Lepidoptera omdat ze zijn gebruikt in eerdere studies van vloeistof-opname capaciteiten en22,23van de morfologie van de mouthpart. Huis vliegt (Musca domestica L., Muscidae) en blauwe fles vliegen (Calliphora vomitoria L., Calliphoridae) worden gebruikt, omdat ze worden vaak waargenomen voederen op poreuze oppervlakken13.
- Volgorde P. rapae als larven van een insect leverancier en achter hen op kunstmatige voeding (Zie Tabel van materialen) totdat ze verpoppen en emerge als volwassenen in een milieu kamer ingesteld op 23 ° C en een 18 L: 6D fotoperiode. Volgorde M. domestica en C. vomitoria als poppen en ze aan de achterkant op de dezelfde milieu-omstandigheden als P. rapae. Don't feed volwassen vlinders en vliegen nadat ze uit de poppen voorafgaand aan de voeding experimenten voortkomen.
- Een 20% sacharoseoplossing (control) en een sacharoseoplossing nanoparticle 20% om te testen voor vloeibare opname voorbereiden. Bereid de oplossing van de nanoparticle door het toevoegen van fluorescerende magnetische nanodeeltjes (iron oxide met een zuur laagje van polyacryl, ongeveer 20 nm diameter)24 tot en met een 20% sacharoseoplossing (1 mg/mL dH2O nanodeeltjes met 20 gewichtspercenten sacharose oplossing, 1:1). Bereid een oplossing 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (10 x verdund tot 1 x in dH2O, pH 7.4), die wordt gebruikt voor ontledingen.
- Instellen van een voederen station dat uit een handmatige manipulator met een klem en een aparte voeding podium (een vlak platform bestaat) (Figuur 1). Plaats een concave dia het werkgebied van voeding en hebben nylon netto filters met een porie grootte diameter van 11, 20, 30, 41 of 60 µm en membraan filters met een diameter van poriën grootte van 1, 5, 8 of 10 µm in de buurt voor de voeding experimenten.
2. voeding Protocol
- Wikkel het insect organen, poten en vleugels in een gevouwen papieren zakdoekje. Plaats het insect zodat alleen het hoofd en de monddelen worden blootgesteld. Plaats de vleugels van het insect tussen twee Microscoop dia's, die bij elkaar door de klem op de manipulator gehouden worden zodat het insect is geschorst boven de voeding werkgebied (Figuur 1).
- Een droplet 30 µL van de 20% sacharoseoplossing of de 20% sacharoseoplossing nanoparticle met een micropipet naar het midden van de holle dia beheren. Plaats een enkel filter papier van een specifieke poriegrootte op de concave dia, zodat het midden van het koffiefilter wordt uitgelijnd met de druppel van de nanoparticle oplossing. Het contact tussen de druppel en het koffiefilter resulteert in de verspreiding langs het koffiefilter, vulling van de poriën (Figuur 1) oplossing.
Opmerking: Het koffiefilter wordt geplaatst op de top van de druppel, in plaats van andersom, om te minimaliseren van de mogelijke aanwezigheid van nanodeeltjes op de top van het koffiefilter waar de insecten zich voeden. - Plaats het insect met de manipulator zodat alleen de distale regio's van de monddelen kunnen contact opnemen met het wordt bevochtigd koffiefilter het werkgebied voeding (Figuur 1). Gebruik een insect pins uit te breiden van de monddelen op het koffiefilter en toestaan van het insect te voeden voor 45 s.
- Om te minimaliseren van de kans van insecten voeden met vloeibare films die kunnen voorkomen op het oppervlak van het koffiefilter, plaatst u de monddelen zodat ze in contact met een deel van het koffiefilter die het vlakke deel van de dia (dwz raakt. niet direct boven het holle gedeelte van de dia). Als het insect doet niet belangstelling in voeding, kunnen de monddelen worden gehouden het filtreerpapier met de insecten pin voor de duur van de voedertijd.
3. dissecties
- Plaats de PBS-oplossing in een 50 mm horloge glas zodat er genoeg oplossing ter dekking van het insect lichaam. Plaats het horlogeglas onder een stereoscoop en positie insect ontrafeling van apparatuur (voorjaar micro ontrafeling van schaar, insect pins, fijne punt ontrafeling van de verlostang) naast de stereoscoop.
- Na het voederen van dieren, het verwijderen van het insect uit het weefsel papier en houd het met gesloten vleugels. Verwijder de kop, poten en vleugels van het insect met de lente micro ontleden schaar en plaats van het insect in de PBS-oplossing in het horlogeglas (Figuur 2).
- Indien nodig, anesthetize insecten voor ontledingen. Gebruik pincet te houden van het insect van de epidermis in de buurt van de distale regio van de buik. Gebruiken met de dominante hand, de lente micro ontrafeling van schaar te snijden van de epidermis in een anterior richting langs de laterale kant van de buik, vanaf eind posterior, totdat de thorax is bereikt. Wees extra voorzichtig om ervoor te zorgen dat alleen de schubbenlaag wordt gesneden en dat het kanaal van de darmkanalen binnen het insect niet beschadigd (Figuur 2).
- Maak extra bezuinigingen van de cuticle bestaat met de ontleden schaar te openen van de buik te onthullen de darmkanalen canal binnen (Figuur 2). Verwijder de abdominale cuticle, vet lichamelijk en andere structuren met de hulp van insect pins en verhuizen ze buiten het horlogeglas voor vervreemding, waardoor alleen de thorax en de darmkanalen canal in het horlogeglas.
Opmerking: De dissectie zal onthullen het gewas, oftewel een sac-achtige structuur (een uitbreiding van het kanaal van de darmkanalen) gelegen in de buurt van het moment van de borstkas en de buik. - Als het gewas niet wordt blootgesteld, Maak extra insnijdingen in de thorax met de schaar, totdat het gewas is geopenbaard. Zodra het gewas zichtbaar is, knip weg de resterende onderdelen van het insect, waardoor alleen de darmkanalen canal met het gewas in het horlogeglas (Figuur 2).
Opmerking: De Lepidoptera gewas is bijna transparant en cellofaan-zoals in de natuur, die moeilijk wellicht te herkennen als het niet is gevuld met vloeistoffen en uitgevouwen of als het wordt gesneden tijdens de dissectie. - Gebruik fijne punt ontrafeling van de verlostang om het gewas op een dekglaasje aan (24 x 24 mm) voor latere imaging (Figuur 2).
4. bepaling van de geconsumeerde nanodeeltjes
- Positie het gewas op het dekglaasje aan met de fijne punt ontleden pincet met behulp van de zorg om te voorkomen dat het gewas bezwijken. Gebruik de CY3 kanaal (of de fase contrast) op een omgekeerde confocal microscoop voor beeldvorming bij 20 X vergroting. Het imago van het gewas onmiddellijk na dissectie te voorkomen uitdroogt.
- Houd een magnetische roer bar (41.3 mm in lengte en diameter van 8 mm) in de hand die niet in de controle van de operationele fase van de Microscoop.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De studie van patronen in vloeistof-opname capaciteiten onder vloeistof-voeding insecten vereist bepaling van wanneer voederen plaatsvindt. De hier geschetste protocol wordt gebruikt voor het testen van de beperkende porie-grootte-hypothese onder Lepidoptera en Diptera13. De beperkende porie grootte hypothese stelt dat insecten vloeistof-voeding uit vloeistof gevulde poriën niet voeden, als de diameter van de porie-grootte kleiner dan de diameter van de voeding con...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Insecten mouthpart functionaliteit is historisch afgeleid uit studies van bruto morfologie (bv., Lepidoptera proboscis functionaliteit aan een drinken stro25,-26gerelateerde); echter, recente studies die experimenteel bewijs nemen hebben geleid tot een paradigmaverschuiving in ons begrip van de complexiteit van insecten monddelen en structuur-functie relaties,2,,12,13...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gesteund door de National Science Foundation (NSF) verlenen geen. IOS 1354956. Wij danken Dr. Andrew D. Warren (McGuire centrum voor Lepidoptera en biodiversiteit, Florida Museum of Natural History in Universiteit van Florida) voor toestemming voor het gebruik van de beelden van de vlinder.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 20% sucrose solution | Domino Sugar | Suiker nodig om de sucrose-oplossing met dH2O te produceren | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P5493 | 10X concentratie verdund tot 1X in dH2O voor insectdissecties |
| Single depression concave slide | AmScope | BS-C6 | Glijs is noodzakelijk voor het voedingsfase-setup |
| Filter paper | EMD Millipore | NY6004700 (60 µm) | Nylon netfilters en isoporefilters nodig om een poreuze oppervlakte voor insectenvoeding te produceren |
| Filter paper | EMD Millipore | NY4104700 (41 µm) | Nylon netfilters en isoporefilters nodig om een poreuze oppervlakte voor insectenvoeding te produceren |
| Filter paper | EMD Millipore | NY3004700 (30 µm) | Nylon netfilters en isoporefilters nodig om een poreuze oppervlakte voor insectenvoeding te produceren |
| Filter paper | EMD Millipore | NY2004700 (20 µm) | Nylon netfilters en isoporefilters nodig om een poreuze oppervlakte voor insectenvoeding te produceren |
| Filter paper | EMD Millipore | NY1104700 (11 µm) | Nylon netfilters en isoporefilters nodig om een poreuze oppervlakte voor insectenvoeding te produceren |
| Filter paper | EMD Millipore | TCTP04700 (10 µm) | Nylon netfilters en isoporefilters nodig om een poreuze oppervlakte voor insectenvoeding te produceren |
| Filter paper | EMD Millipore | TETP04700 (8 µm) | Nylon netfilters en isoporefilters nodig om een poreuze oppervlakte voor insectenvoeding te produceren |
| Filter paper | EMD Millipore | TMTP04700 (5 µm) | Nylon netfilters en isoporefilters nodig om een poreuze oppervlakte voor insectenvoeding te produceren |
| Filter paper | EMD Millipore | RTTP04700 (1 µm) | Nylon netfilters en isoporefilters nodig om een poreuze oppervlakte voor insectenvoeding te produceren |
| Iris microdissecting scissors | Carolina Biological Supply Company | 623555 | Scharen gebruikt voor dissecties |
| Insect pins (#1) | Bioquip Products | 1208B1 | Pins gebruikt tijdens dissecties en voedingsproeven |
| Extra-fine point dissecting forceps | Carolina Biological Supply Company | 624684 | Dissectie-apparatuur |
| Leica M205 C Stereoscope | Leica Microsystems | M205 C | Stereoscoop gebruikt voor dissecties |
| Inverted confocal microscope | Olympus | IX81 | Fluorescentiemicroscoop gebruikt om magnetische nanodeeltjes te detecteren |
| Fisherbrand PTFE Disposable Stir Bar | Fisherscientific | S68067 | Magneet gebruikt om nanodeeltjes te detecteren |
| Kimtech Science Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34155 | Doekjes gebruikt om insecten vast te zetten tijdens voedingsproeven |
| House fly (Musca domestica) pupae | Mantisplace.com | insecten voor experimenten | |
| Blue bottle fly (Calliphora vomitoria) pupae | Mantisplace.com | insecten voor experimenten | |
| Cabbage butterfly (Pieris rapae) larvae | Carolina Biological Supply Company | 144102 | insecten voor experimenten |
| Finnpipette F1 | ThermoFisher Scientific | 4641080N | micropipet voor het doseren van vloeistoffen |
| Finntip 250 pipette tips | ThermoFisher Scientific | 9400250 | micropipet tips |
| Microscope Glass cover slides (=coverslips) (24 x 24 mm) | AmScope | CS-S24-100 | coverslips voor het bekijken van de darm van het insect op de confocale microscoop |
Referenties
- Vijaysegaran, S., Walter, G. H., Drew, R. A. I. Mouthpart structure, feeding mechanisms, and natural food sources of adult Bactrocera (Diptera: Tephritidae). Ann Entomol Soc Am. 90, 184-201 (1997).
- Lehnert, M. S., Monaenkova, D., Andrukh, T., Beard, C. E., Adler, P. H., Kornev, K. G. Hydrophobic-hydrophilic dichotomy of the butterfly proboscis. J R Soc Interface. 10, 1-10 (2013).
- Zhao, J., Wu, J., Yan, S. Erection mechanism of glossal hairs during honeybee feeding. J Theor biol. 386, 62-68 (2015).
- Redak, R. A., Purcell, A. H., Lopes, J. R. S., Blua, M. J., Mizell, R. F. 3rd, Andersen, P. C. The biology of xylem fluid-feeding insect vectors of Xylella fastidiosa and their relation to disease epidemiology. Ann. Review Entomol. 49, 243-270 (2004).
- Büttiker, W., Krenn, H. W., Putterill, J. F. The proboscis of eye-frequenting and piercing Lepidoptera (Insecta). Zoomorphology. 116, 77-83 (1996).
- Light, J. E., Smith, V. S., Allen, J. M., Durden, L. A., Reed, D. L. Evolutionary history of mammalian sucking lice (Phthiraptera: Anoplura). BMC Evol Biol. 10, (2010).
- Krenn, H. W., Aspock, H. Form, function and evolution of the mouthparts of blood-feeding Arthropoda. Arthropod Struct Dev. 41, 101-118 (2012).
- Lehnert, M. P., Pereira, R. M., Koehler, P. G., Walker, W., Lehnert, M. S. Control of Cimex lectularius using heat combined with dichlorvos resin strips. Med Vet Entomol. 25, 460-464 (2011).
- Zaspel, J. M., Kononenko, V. S., Goldstein, P. Z. Another blood feeder? Experimental feeding of a fruit-piercing moth species on human blood in the Primorye Territory of far eastern Russia (Lepidoptera: Noctuidae: Calpinae). J Insect Behav. 20, 437-451 (2007).
- Barth, F. G. Insects and flowers: the biology of a partnership. , Princeton University Press. Princeton. (1991).
- Foil, L. D., Adams, W. V., McManus, J. M., Issel, C. J. Bloodmeal residues on mouthparts of Tabanus fuscicostatus (Diptera: Tabanidae) and the potential for mechanical transmission of pathogens. J Med Entomol. 24, 613-616 (1987).
- Monaenkova, D., et al. Butterfly proboscis: combining a drinking straw with a nanosponge facilitated diversification of feeding habits. J R Soc Interface. 9, 720-726 (2012).
- Lehnert, M. S., et al. Mouthpart conduit sizes of fluid-feeding insects determine the ability to feed from pores. Proc. R. Soc. B. 284, (2017).
- Grimaldi, D., Engel, M. S. Evolution of the insects. , Cambridge University Press. New York, NY. (2005).
- Adler, P. H., Foottit, R. G. Insect biodiversity: science and society. , Wiley Blackwell. Chichester, UK. (2009).
- Tsai, C. C., et al. Nanoporous artificial proboscis for probing minute amount of liquids. Nanoscale. 3, (2011).
- Krenn, H. W. Proboscis sensilla in Vanessa cardui (Nympahlidae, Lepidoptera): Functional morphology and significance of flower-probing. Zoomorphology. 118, 23-30 (1998).
- Plateau, J. A. F. Experimental and theoretical researches on the figures of equilibrium of liquid mass withdrawn from the action of gravity. (Transl). Annual Report of the Board Regents Smithsonian Institution. , Government Printing Office. Washington, DC. 207-285 (1863).
- Socha, J. J., Westneat, M. W., Harrison, J. F., Waters, J. S., Lee, W. -K. Real-time phase-contrast x-ray imaging: a new technique for the study of animal form and function. BMC Biol. 5, 6(2007).
- Westneat, M. W., Socha, J. J., Lee, W. -K. Advances in biological structure, function and physiology using synchrotron x-ray imaging. Annu Rev Physiol. 70, 119-142 (2008).
- Lee, W. -K., Socha, J. J. Direct visualization of hemolymph flow in the heart of a grasshopper (Schistocerca americana). BMC Physiology. 9, 2(2009).
- Lehnert, M. S., Mulvane, C. P., Brother, A. Mouthpart separation does not impede butterfly feeding. Arthropod Struct Dev. 43, 97-102 (2014).
- Lehnert, M. S., Beard, C. E., Gerard, P. D., Kornev, K. G., Adler, P. H. Structure of the lepidopteran proboscis in relation to feeding guild. J Morphol. 277, 167-182 (2016).
- Yan, H., Sung, B., Kim, M. -H., Kim, C. A novel strategy for functionalizable photoluminescent magnetic nanoparticles. Mater. Res. Express. 1, 045032(2014).
- Kingsolver, J. G., Daniel, T. L. On the mechanics and energetics of nectar feeding in butterflies. J Theor Biol. 76, 167-179 (1979).
- Krenn, H. W. Feeding mechanisms of adult Lepidoptera: Structure, function, and evolution of the mouthparts. Ann Rev Entomol. 55, 307-327 (2010).
- Tsai, C. -C., Monaenkova, D., Beard, C. E., Adler, P. H., Kornev, K. G. Paradox of the drinking-straw model of the butterfly proboscis. J Exp Biol. 217, 2130-2138 (2014).
- Bauder, J. A. S., Handschuh, S., Metscher, B. D., Krenn, H. W. Functional morphology of the feeding apparatus and evolution of proboscis length in metalmark butterflies (Lepidoptera: Riodinidae). Biol J Linn Soc. 110, 291-304 (2013).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
