Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Synthese van monocyt-targeting Peptide Amfifiel micellen voor beeldvorming van atherosclerose

7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56625

⸱

17 november 2017

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Southern California

In dit artikel

Samenvatting

Dit document stelt een methode waarbij de synthese en de karakterisering van monocyt-targeting peptide Amfifiel micellen en de corresponderende testen om te testen voor biocompatibiliteit en het vermogen van de micel binden aan monocyten.

Samenvatting

Atherosclerose is een belangrijke bijdrage aan hart-en vaatziekten, de belangrijkste oorzaak van overlijden wereldwijd, die 17,3 miljoen doden per jaar beweert. Atherosclerose is ook de belangrijkste oorzaak van plotselinge dood en myocardinfarct, aangespoord door unstable plaques die scheuren en occlude van het bloedvat zonder waarschuwing. Huidige imaging modaliteiten kan niet differentiëren tussen stabiele en de instabiele plaques die scheuren. Peptide amfifielen micellen (PAMs) kunnen dit nadeel overwinnen als ze kunnen worden gewijzigd met een verscheidenheid van targeting wordt die specifiek aan zieke weefsels binden. Monocyten zijn gebleken te zijn van vroege markers van atherosclerose, terwijl grote opeenstapeling van monocyten geassocieerd met plaques vatbaar wordt voor scheuren. Vandaar, nanodeeltjes die zijn op monocyten gericht kan kan worden gebruikt om te discrimineren verschillende stadia van atherosclerose. Te dien einde, hier, beschrijven we een protocol voor de bereiding van monocyt-targeting PAMs (monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) PAMs). MCP-1 PAMs zelf worden geassembleerd door synthese onder milde voorwaarden aan formulier nanodeeltjes van 15 nm in diameter met in de buurt van neutrale oppervlakte lading. In vitro, PAMs bleken te zijn biocompatibel en had een hoge bindende affiniteit voor monocyten. De hierin beschreven methoden tonen belofte voor een brede waaier van toepassingen in atherosclerose, alsmede andere ontstekingsziekten.

Inleiding

Cardiovasculaire aandoeningen moeten nog worden de belangrijkste doodsoorzaken wereldwijd met ongeveer 17,3 miljoen doden wereldwijd1. Cardiovasculaire aandoeningen zijn bijgedragen door atherosclerose, een toestand waarin plaques in de slagaders, waardoor remmende bloed en zuurstof stroom aan de cellen van het lichaam,2,3 opbouwen. De progressie van aderverkalking houdt de verdikking en de verharding van de slagaders door een ontstekingsreactie, onregelmatige lipide metabolisme en plaque-opbouw, leidt tot plaque breuk en myocardiaal infarct4,5. Endotheliale cellen express cytokines en hechting moleculen, waaronder MCP-1, dat zich aan de C-C chemokine receptor (CCR2 bindt) gevonden op het oppervlak van de monocyten6,7,8. Geoxideerde cholesterol omgezet in monocyten macrofagen in de vroege fase van de vorming van de plaque, die de ontstekingsreactie in de regio versterkt en leidt tot weefsel schade en de vorming van onstabiele of kwetsbare plaques9, 10.

Traditioneel, wordt atherosclerose geëvalueerd door de beoordeling van luminal stenose door de anatomische geschikt zijn met behulp van angiografie of echografie11,12. Deze methoden kunnen echter alleen bepalen ernstige vernauwing van de arteriële muur en niet het beginstadium van atherosclerose, als eerste plaque groei arteriële remodelleren veroorzaakt voor het onderhouden van de grootte van de slagader en bloed stroom tarief12,13, 14. Daarom, angiograms underrepresent atherosclerose prevalentie. Bovendien berekend noninvasive beeldvormingstechnieken zoals één foton emissie tomografie, positron emissie tomografie en magnetische resonantie beeldvorming zijn onlangs gebruikt om plaque morfologie karakteriseren als zij eerste details bieden kunnen en karakterisering van plaques. Echter, deze modaliteiten zijn vaak beperkt door het gebrek aan gevoeligheid, ruimtelijke resolutie, of vereisen het gebruik van ioniserende straling, waardoor imaging plaque progressie in verschillende stadia veel meer uitdagende15,16, 17. Een imaging bezorgingssysteem dat specifiek plaques in verschillende stadia van atherosclerose zou identificeren moet nog worden ontwikkeld.

Nanodeeltjes hebben aangetoond een opkomende platform voor in-vivo plaque targeting en diagnostiek18,19,20,21. In het bijzonder zijn PAMs voordelig vanwege hun chemische diversiteit en de mogelijkheid om een verscheidenheid van wordt, composities, maten, vormen en oppervlakte functionalization22tegemoet te komen. Peptide amfifielen (BK) bestaan uit een hydrofiele, peptide "headgroup" gekoppeld aan een hydrofobe staart, die doorgaans lipiden; deze structuur amfifiele verleent zelfassemblerende mogelijkheden en zorgt voor een multivalent weergave van peptiden op het oppervlak van het deeltje22,23,24. De headgroups peptide kan invloed hebben op de vorm van de deeltjes via vouwen en waterstof binding tussen peptiden25. Peptiden die spatel door β-sheet interactie is aangetoond dat het vormen van een verlengde micellen, terwijl α-Helix bevestiging beide bolvormig en verlengde micellen22,23,24, vormen kan 25,26,27. Polyethyleenglycol (PEG) linkers die schild van de oppervlakte lading van de peptide kunnen worden geplaatst tussen de hydrofiele peptide en de hydrofobe staart van PAMs, verbetering van de beschikbaarheid van de nanoparticle in de systemische circulatie28, 29 , 30 , 31. PAMs zijn ook voordelig omdat ze biocompatibel en is aangetoond dat ze hebben een breed scala aan toepassingen32,33. De oplosbaarheid in water van micellen biedt een voordeel ten opzichte van andere nanoparticle-gebaseerde systemen zoals bepaalde polymere nanodeeltjes die niet oplosbaar is in water en moeten worden opgeschort in solubilizers voor injecties34. Bovendien, maakt de mogelijkheid om PAMs die demonteren maken in reactie op een specifieke stimuli PAMs een aantrekkelijke kandidaat voor gecontroleerde intracellulaire drug delivery35.

Door binding aan de receptor CCR2 en zich ophopen in de aortaboog, werden PAMs eerder ontwikkeld voor monocyt gericht op voor het controleren van de verschillende stadia van atherosclerotische laesies in de aorta9. In ApoE- / - muizen, monocyt accumulatie verhoogt proportioneel plaque progressie36. Bovendien bleek dat patiënten met breuk-gevoelig, alsnog plaques hogere hoeveelheden monocyten37 bevatten. De wijziging van PAMs te nemen MCP-1 is daarom nuttig, omdat het zorgt voor meer doelgerichtheid specificiteit en differentiatie tussen atherosclerotische laesies van de vroege - en late-stadium. Deze proof-of-concept studies ook verifiëren dat PAMs zijn veilig genoeg om te worden pre-clinically gebruikt en worden leeggemaakt renally38. Aangezien monocyten en ontsteking karakteristiek voor andere ziekten zijn, hebben MCP-1 PAMs het potentieel om te worden gebruikt voor therapeutische en diagnostische toepassingen in andere ziekten buiten atherosclerose8,39,40 , 41.

Hierin, rapporteren we de fabricage van uiterst schaalbare en zelf gemonteerd MCP-1 PAMs dat aangetoond van het deeltje optimale omvang, oppervlakte lading en selectieve richten aan monocyten voor verbeterde beeldbewerkingstoepassingen in atherosclerose.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Opmerking: Lees de MSDS voor reagentia en volg alle chemische veiligheidsmaatregelen zoals vereist door de lokale instelling.

1. bereiding van MCP-1 PAMs

  1. Voorbereiding van MCP-1 peptide
    1. Weeg 0,25 mmol van Fmoc-L-Lys (Boc)-Wang in een reactievat (RV). Spoel de kant van de RV met 5 mL dimethylforamide (DMF) in een chemische zuurkast.
    2. Laden van de RV op een geautomatiseerde benchtop peptide synthesizer. Belasting voorverpakte aminozuur flesjes, N '- CYNFTINRKISVQRLASYRRITSS - C', van de C aan N-terminus. Omvatten een lege vial eind voor de definitieve deprotection stap.
      Opmerking: Een gecodeerde peptide met opeenvolging, N '- CNNSIIRSKQVLRSTRYFRSATYK - C', kan ook worden gesynthetiseerd met behulp van hetzelfde protocol.
    3. Zodra synthese wordt gebeëindigd, overbrengen in de peptiden op hars van de RV de Scintillatie flacon met 2-3 mL methanol totdat alle van de harsen zijn overgebracht. Nadat de hars is gezonken aan de onderkant, verwijdert u de methanol supernatant en verdampen de resterende tot droog. Vacuüm droog voor een extra 2 h of 's nachts bij kamertemperatuur.
    4. Maakt 12 mL decollete oplossing met trifluoracetic zuur (TFA):ethanedithiol:water:triisopropylsilane op 94:2.5:2.5:1 vol % in een chemische zuurkast. Swirl de splitsingsproducten oplossing om ervoor te zorgen dat het gelijkmatig is gemengd.
      Let op: Omdat triisopropylsilane en ethanedithiol zijn lucht-gevoelig, argon purge voorraad flesjes van triisopropylsilane en ethanedithiol voor 1 min vóór persoonsgebonden terug.
    5. Plaats de synthese vaartuig (SV) op een arm shaker door klemmen in de buurt van de onderste helft van de SV. Breng peptide-hars aan de SV met 2 mL decollete oplossing totdat alle van de peptide-harsen worden overgebracht.
    6. Wassen van de zijkanten van de AVP met 3 mL decollete. Sluit de dop van de AVP en schudden bij 300 oscillaties/min gedurende 4 uur.
    7. Weeg een centrifugebuis lege 50 mL. Het opnemen van de massa.
    8. Na 4 uur, drain de gekloofd peptide-oplossing van de SV in de centrifugebuis 50 mL. Spoel de SV verschillende malen met de resterende splitsingsproducten-oplossing.
    9. Verdampen gekloofd peptide oplossing met stikstof tot er minder dan 4 mL resterende in de centrifugebuis.
    10. Voeg 36 mL ijskoud ether aan de peptide-gekloofd oplossing.
    11. Vortex is de oplossing tot het volledig witte of gele. Centrifugeer bij 3000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C en de bovendrijvende vloeistof decanteren.
    12. Voeg toe 40 mL ijskoud ether aan de buis. Vortex en bewerk opnieuw ultrasone trillingen ten. Herhaal het proces van centrifugeren. Giet het supernatant.
    13. Droog de ruwe PA pellet met stikstof gas zuiveren tot de ether zichtbaar is verdampt.
    14. Voeg 20 mL tweemaal gedestilleerd water, vortex, en bewerk ultrasone trillingen ten totdat de peptide volledig is opgelost in de oplossing.
    15. Bevriezen van de oplossing en lyophilize tot droge.
    16. Zodra de peptide is opgedroogd, weeg de massa van de centrifugebuis met de ruwe peptide. Los van de ruwe peptide in 5 mg/mL water.
    17. Los op 25 mg ruwe MCP-1 peptide in 5 mL tweemaal gedestilleerd water om een totale concentratie van 5 mg/mL. Zuiveren van de ruwe MCP-1 peptide door krachtige vloeibare chromatografie (HPLC) met behulp van 0,1% TFA in water (oplosmiddel A) en 0,1% TFA in acetonitril (oplosmiddel B) als mobiele fasen in een C8 omgekeerde-phase kolom. De 5 mL van de peptide injecteren de HPLC.
      Opmerking: De eerste mobiele fase bestond uit 100% oplosmiddel A bij een debiet van 9.0 mL/min. afname oplosmiddel A langzaam tot 30% in 27 min en houd deze op deze compositie voor 3 min. terugkeer het verloop moet 100% oplosmiddel een meer dan 3 min en wachtruimte tegelijk deze compositie voor 1 min te geven een totale run-time van 34 min. houden de kolomtemperatuur op 55 ° C. Gebruik van een positief ion bronmodus voor de analyse. Formic acid kan worden gebruikt in plaats van TFA, als TFA te zuur voor de HPLC-kolom is. Het wordt aanbevolen dat de organische oplosmiddelen samenstelling oprit snelheid mag niet hoger zijn dan 2%/min voor betere scheiding.
    18. Analyseren van elke fractie met behulp van spectrometrie van de massa van de desorptiekinetiek/ionisatie (MALDI) laser matrix-bijgewoonde voor de verwachte product m/z op 2,890.
      Opmerking: Los α-cyano-4-hydroxycinnamic zuur bij 1 mg/mL in acetonitril/water (50:50 vol %) als de matrix-oplossing. Ter plaatse 0,75 µL van matrix oplossing op de MALDI-bord, gevolgd door 0,75 µL van elke fractie. De analyse met behulp van een positieve reflecterende ion-modus op een massale bereik van 500-5.000 Da uitvoeren.
    19. Product breuken combineren, afblazen acetonitril, bevriezen en lyophilize gezuiverde peptiden tot droog.
  2. Voorbereiding voor MCP-1 PA
    1. Een 1.1 molaire overmaat van 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] DSPE-PEG (2000)-maleimide naar peptide in aparte Scintillatie flesjes te bereiden. Ontbinden van beide verbindingen in tweemaal gedestilleerd water te maken ~ 15 mg/mL. Bewerk ultrasone trillingen ten gedurende 15 minuten of totdat de beide oplossingen zijn volledig duidelijk.
      Opmerking: DSPE-PEG (2000)-Cy5 wordt gesynthetiseerd met behulp van hetzelfde protocol met DSPE-PEG (2000)-amine en N-hydroxysuccinimide (NHS) ester-matiemaatschappij Cy5, met uitzondering van stap 1.2.3, waar de pH van de oplossing wordt aangepast tot 8,5.
    2. DSPE-PEG (2000)-maleimide oplossing aan de peptide-oplossing toevoegen. Vortex en bewerk ultrasone trillingen ten.
    3. Er 1 bij optellen M NaOH dropwise (1 µL) tegelijk, totdat de pH van de oplossing 7 is.
    4. Stikstof purge oplossing voor 5 min. Roer de oplossing om 's nachts.
    5. Bevriezen van de oplossing en lyophilize tot droge.
    6. Zodra het ruwe product is opgedroogd, Los de solid in 5 mg/mL water.
    7. Zuiveren met HPLC zoals hierboven beschreven.
      Opmerking: Unconjugated peptide en DSPE-PEG(2000) moet elueren tussen 15-30% organische concentratie (vol %), terwijl DSPE-PEG (2000)-MCP-1 conjugaat moet elueren tussen 40-50% organische concentratie.
    8. Analyseren van elke fractie met behulp van de Spectrometrie van de massa van de MALDI voor de overeenkomstige m/z. DSPE-PEG (2000)-MCP-1 een globale m/z-piek op 5,760 moet.
      Opmerking: 2,5-dihydroxybenzoic zuur het best gebruiken als de matrix voor DSPE-PEG (2000)-MCP-1 met MALDI.
  3. Vergadering van MCP-1 PAMs
    1. Los 1,75 mg MCP-1 PAs met 3 mL methanol in een 1-dram-flesje. Bewerk ultrasone trillingen ten totdat de MCP-1 PA volledig is opgelost.
      Opmerking: Cy5 amfifielen kunnen worden opgenomen in een molaire verhouding van 10:90 MCP-1 PA voor beeldbewerkingstoepassingen.
    2. Verdampen de methanol onder stikstof in een cirkelmotie terwijl de resterende methanol spoelen van de kant van de flacon totdat een uniforme film wordt gevormd bij de bodem van de ampul. Vacuüm droog de film's nachts.
    3. De film met 3 mL water of fosfaat buffer hydrate zoutoplossing (PBS) om een 100 µM-oplossing van MCP-1 PAMs te maken. Zachtjes vortex en bewerk ultrasone trillingen ten de oplossing tot duidelijk. Incubeer bij 80 ° C gedurende 30 minuten.
      Opmerking: De verhoogde temperatuur is aangetoond dat de zelf-assemblage proces versnellen en kunt het peptide onderdeel te vormen van de meest stabiele secundaire structuur, terwijl het verlagen van de kritische micel concentratie (CMC)42,43.
    4. De resulterende dispersie tot kamertemperatuur afkoelen.

2. karakterisering van MCP-1 PAMs

  1. Dynamische lichtverstrooiing (DLS) en zeta potentiële
    1. Plaats 100 µM MCP-1 PAM of gecodeerde PAM in een cuvet volgens de instructies van de Distributielijsten of zeta potentieel instrument.
      Opmerking: DLS en zeta potentiële cuvettes kunnen verschillen op basis van de instructies van het instrument.
    2. Equilibreer het instrument tot kamertemperatuur. Meet de grootte en oppervlakte last van de PAM.
  2. Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)
    1. Voeg 7 µL van 50 µM MCP-1 PAM of gecodeerde PAM op een raster TEM geschorst binnen een zelfsluitend pincetten voor 5 min. Wick weg de druppel met een delicate taak doekje.
    2. Voeg 7 µL van het water voor het wassen van het raster. Pit weg de druppel.
    3. Voeg 7 µL van 1 wt % phosphotungstic zuur voor 2 min. Wick weg de druppel. Herhaal stap 2.2.2.
    4. Droog het TEM-raster vóór TEM analyse.
  3. Circulair dichroïsme (CD) spectroscopie
    1. Zet de stikstof voor 5-10 min voorafgaand aan het gebruik van het instrument.
    2. 300 µL van blanco (water of PBS) in cuvette plaatsen.
    3. Meten van spectra op 190-265 nm, 0,2 mm-weglengte met een 1 s integratie tijd, en een 1 nm bandbreedte bij kamertemperatuur. Verzamelen 3 wordt gerepliceerd.
    4. Maatregel 100 µM MCP-1 peptide, MCP-1 PAM, krabbelde peptide en krabbelde PAM onder dezelfde voorwaarde in stap 2.3.3 beschreven. Aftrekken van de blanco.
    5. Grootte van de gegevens met behulp van een lineaire interpolatie van polylysine basis spectra.
    6. Uitschakelen van het instrument. Wacht 10 minuten vóór het uitschakelen van de stikstof.

3. in Vitro analyse van MCP-1 PAMs

  1. In vitro biocompatibiliteit
    1. Cultuur en uitbreiden van de WEHI 274.1 lymfkliertest monocyten in Dulbecco van bewerkt Eagle Medium aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS), 1% penicilline-streptomycine en 0.05 mM 2-mercaptoethanol in 37 ° C minder dan 5% CO,2 naar passage 5.
      Opmerking: WEHI 274.1 zijn schorsing cellen. Wanneer kweken, moet de media worden aangevuld om 2-3 dagen.
    2. Pipetteer monocyten in de media in een centrifugebuis steriele 50 mL. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
    3. De oude media gecombineerd en resuspendeer in 10 mL verse media in de centrifugebuis. Meng langzaam tot cellen zijn gelijkmatig verdeeld in de media. Telt de cellen met behulp van trypan blauw kleuring en een hemocytometer.
    4. Verdun cellen zodanig dat er 4.000 monocyten per 90 µL van media per putje. Voeg 90 µL van cellen in wells van een 96-wells-plaat. Incubeer gedurende 24 uur.
      Opmerking: Vermijd het gebruik van de putjes op de buitenste rand van de plaat om te voorkomen dat verschillen in de verdamping en thermische veranderingen in de plaat. Vul de exterieur putten met 100 µL PBS.
    5. Ontbinden 0,15 µmol MCP-1 peptide, MCP-1 PAM, gecodeerde peptide of vervormd-PAM in 150 µL PBS in afzonderlijke, gesteriliseerde microcentrifuge buizen. Uitvoeren van seriële verdunning zodat 65 µL van 1, 10 en 100 µM van elk monster.
    6. Voeg 10 µL PBS voor elke concentratie in putten met WEHI 274.1 (total volume: 100 µL per goed, 6 lijnen, 96 totale wells). Incubeer gedurende 72 uur.
    7. Voeg 10 µL (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) (MTS) in elk putje. Incubeer gedurende 1 uur.
    8. Analyseren van de extinctie met behulp van een afleesapparaat op 490 nm of op basis van instructies van de fabrikant.
  2. In vitro micel bindende
    1. Zaad 500.000 monocyten in elk putje van de plaat van een 6-well in 2 mL zuiver media met 100 µM Cy5-geëtiketteerden MCP-1 PAM (10:90 molaire ratio van DSPE-PEG (2000)-Cy5 en MCP-1 PA). Incubeer gedurende 1 uur.
    2. WEHI 274.1 verzamelen door centrifugeren bij 300 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. De media gecombineerd.
    3. Resuspendeer en wassen van de cellen in 2 mL PBS. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. De PBS gecombineerd. Herhaal het wasproces met 2 mL PBS. De PBS gecombineerd.
    4. Voeg toe 2 mL koude 4% paraformaldehyde de cellen vast te stellen. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
    5. Pipetteer de vaste cellen op een steriele glazen dekglaasje aan binnen putjes van de plaat van een 6-well. Centrifugeer bij 400 x g gedurende 5 min.
    6. Verwijder de paraformaldehyde. Wassen en spoel met 2 mL PBS eens. Resuspendeer met 1 mL PB
      Opmerking: Wanneer spoelen, niet te verstoren de cellen op het dekglaasje aan.
    7. 10 µL van 90% glycerol in PBS op een dia plaatsen Gebruik een naald en pincet te halen van het dekglaasje aan. Droog de rand van het dekglaasje aan. Voorzichtig Schakel het dekglaasje aan op een dia naar beneden.
    8. Zachtjes verzegel de rand van het dekglaasje aan met duidelijke nagellak. Plaats in de koelkast totdat klaar voor imaging.
    9. Gebruik een confocale laser scanning microscoop (CLSM) geïnstalleerd met lasers voor Cy5 op λexcitatie = 650 nm.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Voorbereiding voor MCP-1 PAM
Het motief van de CCR2-bindende (residuen 13-35) van het MCP-1 eiwit [YNFTNRKISVQRLASYRRITSSK] of gecodeerde peptide [YNSLVFRIRNSTQRKYRASIST] werd gewijzigd door het toevoegen van een cysteine residu op de N-terminus. De peptide MCP-1 werd gesynthetiseerd door een Fmoc-gemedieerde solid-phase methode met behulp van een geautomatiseerde peptide synthesizer. De ruwe peptide werd gezuiverd door omgekeerde-fase HPLC op een C8 kolom bij 50 ° C m...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

MCP-1 PAMs zijn een veelbelovende moleculaire beeldvorming platform, bestaande uit een hydrofiele targeting peptide en hydrofobe staart die de zelf samengestelde aard van de nanoparticle drijft. Deze micel monocyt-targeting kan bereid worden door eenvoudige synthese en zuivering stappen van het MCP-1 peptide en DSPE-PEG (2000)-MCP-1. PAMs hebben vele gunstige kenmerken voor in vivo moleculaire beeldvorming zoals hun zelf-assemblage onder milde voorwaarden, intrinsieke biologische afbreekbaarheid en structurele e...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs wil erkennen de financiële steun van de University of Southern California, de National Heart, Lung, en Blood Institute (NHLBI), R00HL124279, Eli en jongevrouw brede Innovation Award en de L.K. Whittier Stichting Non-kanker Translationeel onderzoek Award toegekend aan EJC. De auteurs bedanken het centrum voor elektronenmicroscopie en belichten, Center of Excellence in NanoBiophysics Center of Excellence voor moleculaire karakterisering en Translational Imaging Center aan de University of Southern California voor bijstand in instrumentale opstellingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1,2-ethanedithiolVWRE0032voor peptide synthese
10 mL wegwerpbare serologische pipettenVWR89130-898voor celkweek
15 mL centrifugebuizen, polypropyleenVWR89401-566voor verschillende toepassingen
2,5-dihydroxybenzoëzuur, 99%Fisher ScientificAC165200050voor MALDI
25 mL wegwerpbare serologische pipettenVWR89130-900voor celkweek
2-Mercaptoethanol, 50 mMThermoFisher Scientific31350010voor celkweek
5 mL wegwerpbare serologische pipettenVWR89130-896voor celkweek
50 mL centrifugebuizenVWR89039-658voor verschillende toepassingen
75 cm2 kweekflesFisher Scientific13-680-65voor celkweek
75 mL reactievaatjeProtein Technologies3000005voor peptide synthese
96-wells celkweekplaatVWR40101-346voor MTS assay
Acetonitril, HPLC-kwaliteitFisher ScientificA998SK-4voor HPLC-zuivering
Borosilicaatglas, 1 dramVWR66011-041voor PAM-synthese
Borosilicaatglas pipet, lange tipsVWR14673-043voor verschillende toepassingen
Dekglas, 0,16-0,19 mm, 22 x 22 mmFisher Scientific12-542Bvoor confocale microscopie
Cy5 amineAbcamab146463voor peptide conjugatie
Di-ethylether, ACS-kwaliteitFisher ScientificE138-1voor peptide precipitatie
Weggewerpbare spuiten, 20 mLFisher Scientific14-817-54voor HPLC-zuivering
Dubbele neubauer getelde hemocytometersVWR63510-13voor celtelling
DSPE-PEG(2000) amineAvanti880128Pvoor peptide conjugatie
DSPE-PEG(2000) maleimideAvanti880126Pvoor peptide conjugatie
DSPE-PEG(2000)-NHS ester NanocsPG2-DSNS-10Kvoor conjugatie met Cy5
Dulbecco's gemodificeerd adelaarsmedium-hoge glucoseSigma AldrichD5796-500MLvoor celkweek
Foetaal bovien serum, gekwalificeerd, hitte-geïnactiveerdThermoFisher Scientific10438026voor celkweek
Fmoc-L-Ala-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Avoor peptide synthese
Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-RBFvoor peptide synthese
Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-NTvoor peptide synthese
Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-CTvoor peptide synthese
Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-QTvoor peptide synthese
Fmoc-L-Ile-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Ivoor peptide synthese
Fmoc-L-Leu-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Lvoor peptide synthese
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-KBCvoor peptide synthese
Fmoc-L-Phe-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Fvoor peptide synthese
Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-SBvoor peptide synthese
Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-TBvoor peptide synthese
Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-YBvoor peptide synthese
Fmoc-L-Val-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Vvoor peptide synthese
Fmoc-Lys(Boc)-wanghars, 100-200 meshNovabiochem856013voor peptide synthese
Mierenzuur, optima LC/MS-kwaliteitFisher ScientificA117-50voor HPLC-zuivering
GlycerolVWRM152-1Lvoor confocale microscopie
HandtellingtellerFisher ScientificS90189voor celtelling
Magneetscheerstaven, eivormigVWR58949-006voor peptide conjugatie
Methanol, ACS gecertificeerdFisher ScientificA412-4voor PAM-synthese
MTS celproliferatie colorimetrische assay kitVWR10191-104voor MTS assay
N,N-Dimethylformamide, sequencing-kwaliteitFisher ScientificBP1160-4voor peptide synthese
N-MethylmorpholineProtein TechnologiesS-1L-NMMvoor peptide synthese
ParaformaldehydeFisher ScientificAC416780250voor het fixeren van cellen
PBS, pH 7.4ThermoFisher Scientific10010049voor verschillende toepassingen
Penicilline/streptomycine, 10.000 U/mLThermoFisher Scientific15140122voor celkweek
Peptidesynthesevat, 25 mL Fisher ScientificCG186011voor peptide synthese
Fosforwolfraamzuur Fisher ScientificA248-25voor TEM
PiperidineSpectrumP1146-2.5LTGLvoor peptide synthese
Glad glazen microscoopglaasje 75 x 25 mmFisher Scientific12-550-A3voor confocale microscopie
Reagensbekkens, steriele VWR95128093voor celkweek
Zelfsluitende pincetTedPella5

Referenties

  1. Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e60 (2016).
  2. Falk, E. Pathogenesis of atherosclerosis. J. Am. Coll. Cardiol. 47 (8, Suppl. C), C7-C12 (2006).
  3. Rahmani, M., Cruz, R. P., Granville, D. J., McManus, B. M. Allograft Vasculopathy Versus Atherosclerosis. Circ. Res. 99 (8), 801-815 (2006).
  4. Luis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407 (6801), 233-241 (2000).
  5. Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature (London, U. K). 473 (7347), 317-325 (2011).
  6. Boring, L., Gosling, J., Cleary, M., Charo, I. F. Decreased lesion formation in CCR2-/- mice reveals a role for chemokines in the initiation of atherosclerosis. Nature (London). 394 (6696), 894-897 (1998).
  7. Szmitko, P. E., et al. New Markers of Inflammation and Endothelial Cell Activation. Circulation. 108 (16), 1917-1923 (2003).
  8. Deshmane, S. L., Kremlev, S., Amini, S., Sawaya, B. E. Monocyte Chemoattractant Protein-1 (MCP-1): An Overview. J. Interferon Cytokine Res. 29 (6), 313-326 (2009).
  9. Chung, E. J., et al. Monocyte-Targeting Supramolecular Micellar Assemblies: A Molecular Diagnostic Tool for Atherosclerosis. Adv. Healthcare Mater. 4 (3), 367-376 (2015).
  10. Chung, E. J. Targeting and therapeutic peptides in nanomedicine for atherosclerosis. Exp Biol Med (Maywood). 241 (9), 891-898 (2016).
  11. Sanz, J., Fayad, Z. A. Imaging of atherosclerotic cardiovascular disease. Nature (London, U. K.). 451 (7181), 953-957 (2008).
  12. Tarkin, J. M., et al. Imaging Atherosclerosis. Circ. Res. 118 (4), 750-769 (2016).
  13. Hennerici, M., Baezner, H., Daffertshofer, M. Ultrasound and arterial wall disease. Cerebrovasc Dis. 17 Suppl 1, 19-33 (2004).
  14. Nissen, S. E. Application of intravascular ultrasound to characterize coronary artery disease and assess the progression or regression of atherosclerosis. Am J Cardiol. 89 (4A), 24B-31B (2002).
  15. Khalil, M. M., Tremoleda, J. L., Bayomy, T. B., Gsell, W. Molecular SPECT Imaging: An Overview. Int J Mol Imaging. 2011, 796025(2011).
  16. Lerakis, S., et al. Imaging of the vulnerable plaque: noninvasive and invasive techniques. Am J Med Sci. 336 (4), 342-348 (2008).
  17. Sun, Z. H., Rashmizal, H., Xu, L. Molecular imaging of plaques in coronary arteries with PET and SPECT. J Geriatr Cardiol. 11 (3), 259-273 (2014).
  18. Godin, B., et al. Emerging applications of nanomedicine for the diagnosis and treatment of cardiovascular diseases. Trends Pharmacol. Sci. 31 (5), 199-205 (2010).
  19. Branco de Barros, A. L., Tsourkas, A., Saboury, B., Cardoso, V. N., Alavi, A. Emerging role of radiolabeled nanoparticles as an effective diagnostic technique. EJNMMI Res. 2 (1), 31-39 (2012).
  20. Jayagopal, A., Linton, M. F., Fazio, S., Haselton, F. R. Insights into atherosclerosis using nanotechnology. Curr. Atheroscler. Rep. 12 (3), 209-215 (2010).
  21. Khodabandehlou, K., Masehi-Lano, J. J., Poon, C., Wang, J., Chung, E. J. Targeting cell adhesion molecules with nanoparticles using in vivo and flow-based in vitro models of atherosclerosis. Exp Biol Med (Maywood). 242 (8), 799-812 (2017).
  22. Trent, A., Marullo, R., Lin, B., Black, M., Tirrell, M. Structural properties of soluble peptide amphiphile micelles. Soft Matter. 7 (20), 9572-9582 (2011).
  23. Hartgerink, J. D., Beniash, E., Stupp, S. I. Peptide-amphiphile nanofibers: A versatile scaffold for the preparation of self-assembling materials. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (8), 5133-5138 (2002).
  24. Missirlis, D., et al. Effect of the Peptide Secondary Structure on the Peptide Amphiphile Supramolecular Structure and Interactions. Langmuir. 27 (10), 6163-6170 (2011).
  25. Zhong, L., Johnson, W. C. Environment affects amino acid preference for secondary structure. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89 (10), 4462-4465 (1992).
  26. Shimada, T., Lee, S., Bates, F. S., Hotta, A., Tirrell, M. Wormlike Micelle Formation in Peptide-Lipid Conjugates Driven by Secondary Structure Transformation of the Headgroups. J. Phys. Chem. B. 113 (42), 13711-13714 (2009).
  27. Missirlis, D., et al. Linker Chemistry Determines Secondary Structure of p5314-29 in Peptide Amphiphile Micelles. Bioconjugate Chem. 21 (3), 465-475 (2010).
  28. Elbert, D. L., Hubbell, J. A. Surface treatments of polymers for biocompatibility. Annu. Rev. Mater. Sci. 26, 365-394 (1996).
  29. Xue, Y., O'Mara, M. L., Surawski, P. P. T., Trau, M., Mark, A. E. Effect of Poly(ethylene glycol) (PEG) Spacers on the Conformational Properties of Small Peptides: A Molecular Dynamics Study. Langmuir. 27 (1), 296-303 (2011).
  30. Canalle, L. A., Loewik, D. W. P. M., van Hest, J. C. M. Polypeptide-polymer bioconjugates. Chem. Soc. Rev. 39 (1), 329-353 (2010).
  31. Hamley, I. W. PEG-Peptide Conjugates. Biomacromolecules. 15 (5), 1543-1559 (2014).
  32. Acar, H., et al. Self-assembling peptide-based building blocks in medical applications. Adv. Drug Delivery Rev. , (2016).
  33. Busseron, E., Ruff, Y., Moulin, E., Giuseppone, N. Supramolecular self-assemblies as functional nanomaterials. Nanoscale. 5 (16), 7098-7140 (2013).
  34. Barrett, J. C., et al. Modular Peptide Amphiphile Micelles Improving an Antibody-Mediated Immune Response to Group A Streptococcus. ACS Biomater. Sci. Eng. 3 (2), 144-152 (2017).
  35. Toughrai, S., et al. Reduction-Sensitive Amphiphilic Triblock Copolymers Self-Assemble Into Stimuli-Responsive Micelles for Drug Delivery. Macromol. Biosci. 15 (4), 481-489 (2015).
  36. Swirski, F. K., et al. Monocyte accumulation in mouse atherogenesis is progressive and proportional to extent of disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (27), 10340-10345 (2006).
  37. Kashiwagi, M., et al. Association of monocyte subsets with vulnerability characteristics of coronary plaques as assessed by 64-slice multidetector computed tomography in patients with stable angina pectoris. Atherosclerosis (Amsterdam, Neth). 212 (1), 171-176 (2010).
  38. Chung, E. J., Tirrell, M. Recent Advances in Targeted, Self-Assembling Nanoparticles to Address Vascular Damage Due to Atherosclerosis. Adv. Healthcare Mater. 4 (16), 2408-2422 (2015).
  39. Cassetta, L., Pollard, J. W. Cancer immunosurveillance: role of patrolling monocytes. Cell Res. 26 (1), 3-4 (2016).
  40. Williams, C. B., Yeh, E. S., Soloff, A. C. Tumor-associated macrophages: unwitting accomplices in breast cancer malignancy. NPJ Breast Cancer. 2, (2016).
  41. Richards, D. M., Hettinger, J., Feuerer, M. Monocytes and Macrophages in Cancer: Development and Functions. Cancer Microenviron. 6 (2), 179-191 (2013).
  42. Schick, M. J. Effect of temperature on the critical micelle concentration of nonionic detergents. Thermodynamics of micelle formation. J. Phys. Chem. 67 (9), 1796-1799 (1963).
  43. Marullo, R., Kastantin, M., Drews, L. B., Tirrell, M. Peptide contour length determines equilibrium secondary structure in protein-analogous micelles. Biopolymers. 99 (9), 573-581 (2013).
  44. Hilbich, C., Kisters-Woike, B., Reed, J., Masters, C. L., Beyreuther, K. Substitutions of hydrophobic amino acids reduce the amyloidogenicity of Alzheimer's disease βA4 peptides. J. Mol. Biol. 228 (2), 460-473 (1992).
  45. Trevino, S. R., Scholtz, J. M., Pace, C. N. Amino Acid Contribution to Protein Solubility: Asp, Glu, and Ser Contribute more Favorably than the other Hydrophilic Amino Acids in RNase Sa. J. Mol. Biol. 366 (2), 449-460 (2007).
  46. Kim, S. W., Shi, Y. Z., Kim, J. Y., Park, K. N., Cheng, J. X. Overcoming the barriers in micellar drug delivery: Loading efficiency, in vivo stability, and micelle-cell interaction. Expert Opin Drug Delivery. 7 (1), 49-62 (2010).
  47. Rangel-Yagui, C. O., Pessoa, A. Jr, Tavares, L. C. Micellar solubilization of drugs. J. Pharm. Pharm. Sci. 8 (2), 147-163 (2005).
  48. Batrakova, E., et al. Fundamental relationships between the composition of pluronic block copolymers and their hypersensitization effect in MDR cancer cells. Pharm. Res. 16 (9), 1373-1379 (1999).
  49. Chen, L. J., Lin, S. Y., Huang, C. C. Effect of Hydrophobic Chain Length of Surfactants on Enthalpy-Entropy Compensation of Micellization. J. Phys. Chem. B. 102 (22), 4350-4356 (1998).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Beeldvorming van atheroscleroseMCP 1 peptideHPLC zuiveringdynamische lichtverstrooiingconfocale microscopiebeoordeling van biocompatibiliteitsynthese van nanodeeltjesthioetherbinding
Synthese van monocyt-targeting Peptide Amfifiel micellen voor beeldvorming van atherosclerose
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.