Dit protocol beschrijft een nieuwe methode voor het onderzoeken van een vorm van chemische neurostimulatie van wholemount rat netvlies in vitro met de neurotransmitter glutamaat. Chemische neurostimulatie is een veelbelovend alternatief voor de conventionele elektrische neurostimulatie van retinale neuronen voor de behandeling van onomkeerbare blindheid veroorzaakt door fotoreceptor degeneratieve ziekten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Methodologie voor biomimetische chemische neuromodulatie van Rat netvlies met de Neurotransmitter glutamaat In Vitro
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Fotoreceptor degeneratieve ziekten veroorzaken onherstelbare blindheid door het progressieve verlies van fotoreceptor cellen in het netvlies. Netvlies prothesen zijn een opkomende behandeling voor fotoreceptor degeneratieve ziekten die herstellen visie willen door kunstmatig de overlevende retinale neuronen in de hoop tot begrijpelijke visuele perceptie bij patiënten te stimuleren. Huidige retinale prothesen hebben bewezen succes in het herstellen van beperkte visie aan patiënten met behulp van een matrix van elektroden aan elektrisch stimuleren van het netvlies, maar geconfronteerd met aanzienlijke fysieke barrières in het herstellen van hoge gezichtsscherpte, natuurlijke visie aan patiënten. Chemische neurostimulatie met behulp van inheemse neurotransmitters is een biomimetische alternatief voor elektrische stimulatie en kon negeren de fundamentele beperkingen retinale prothesen met behulp van elektrische neurostimulatie is gekoppeld. In het bijzonder heeft chemische neurostimulatie het potentieel om te herstellen meer natuurlijke visie met vergelijkbaar of beter visual acuities patiënten door het injecteren van zeer kleine hoeveelheden van neurotransmitters, de dezelfde natuurlijke agenten van communicatie gebruikt door retinale chemische synapses, bij veel fijnere resolutie dan de huidige elektrische prothesen. Echter, als een relatief onontgonnen stimulatie paradigma, er is geen gangbaar protocol voor de verwezenlijking van chemische stimulatie van het netvlies in vitro. Het doel van dit werk is een kader te bieden gedetailleerde voor het uitvoeren van chemische stimulatie van het netvlies voor onderzoekers die willen studeren het potentieel van chemische neuromodulatie van het netvlies of soortgelijke zenuwweefsel in vitro. In dit werk, beschrijven we de experimentele opzet en methodologie voor het opwekken van retinale ganglion cel (regering van Cambodja) spike reacties vergelijkbaar met visuele lichte reacties bij wild-type en wholemount fotoreceptor-verworden rat netvlies door het injecteren van volumes van gecontroleerde de neurotransmitter glutamaat in de subretinal ruimte met behulp van glas micropipetten en een aangepaste multipoort microfluidic apparaat. Deze methodologie en protocol zijn algemeen genoeg om te worden aangepast voor neuromodulatie met behulp van andere neurotransmitters of zelfs andere zenuwweefsel.
Inleiding
Fotoreceptor degeneratieve ziekten, zoals retinitis pigmentosa en leeftijdsgebonden maculadegeneratie, zijn belangrijkste overneembare oorzaken van verlies van de visie en zijn momenteel ongeneeslijke1,2. Hoewel deze ziekten ontstaan uit een aantal specifieke genetische mutaties, worden fotoreceptor degeneratieve ziekten gekenmerkt als een groep door het progressieve verlies van de fotoreceptor cellen in het netvlies, waardoor uiteindelijk blindheid. Het verlies van researchdieren triggers wijdverspreid in het netvlies het remodelleren maar overleven retinale neuronen, met inbegrip van de bipolaire cellen en RGCs, blijven intact en relatief functioneel zelfs in gevorderde stadia van fotoreceptor degeneratie3 ,4,5,6,7.
De mechanismen en de pathologie van deze ziekten zijn goed gekarakteriseerd3,4,5,6,7 , maar een effectieve behandeling blijft ongrijpbaar. In de afgelopen drie decennia, hebben de onderzoekers wereldwijd een scala aan therapeutische behandelingen voor het herstel van de visie aan de betrokkenen met fotoreceptor degeneratieve ziekten met inbegrip van gene therapie8, stamcel behandeling9, onderzocht netvlies transplantatie10, en kunstmatige stimulatie11,12 van de overlevende retinale neuronen. Van deze zijn de meest klinisch beschikbare netvlies prothesen, die kunstmatige neurostimulatie-apparaten die een matrix van elektroden elektrisch bipolaire cellen of de RGCs stimuleren in specifieke patronen met het doel van oudsher hebben gebruikt het creëren van kunstmatige visuele waarnemingen in patiënten11. Huidige generatie elektrische prothesen, zoals de Argus II13 en Alpha-IMS14 apparaten, klinische goedkeuring hebben bereikt en voorbereidende studies hebben aangegeven dat ze verbeteren van de levenskwaliteit voor patiënten door het herstel van kunnen een maatregel van visie met behulp van zowel Epiretinaal (voorkant van de retina) en subretinal (achterkant van het netvlies) geïmplanteerd apparaten15,16. Onderzoeksgroepen over de hele wereld zijn bezig met het bevorderen van de retinale prothesen buiten de successen van deze eerste generatie apparaten17,18,19,20 , maar hebben te kampen moeilijkheden ontwerpen een elektrische prothese kunnen herstellen van hoge gezichtsscherpte visie onder het niveau van juridische blindheid aan patiënten. Recente studies hebben aangetoond dat het bereiken van hogere ruimtelijke resolutie dan de huidige generatie gegevensgestuurd elektrische gebaseerde prothesen is uitdagend vanwege deze beperking tot gratis injectie, die noodzaakt het gebruik van grote elektroden veilig stimuleren netvlies neuronen ten koste van ruimtelijke resolutie, dwz gezichtsscherpte11,21. Bovendien elektrische stimulatie is verder beperkt omdat het meestal alle nabijgelegen cellen stimuleert en daarom onnatuurlijk en verwarrend waarnemingen bij patiënten lokt, vooral omdat er een inherent onnatuurlijke stimulatie paradigma21. De vroege successen van elektrische stimulatie hebben echter aangetoond dat kunstmatige neurostimulatie kunnen een effectieve behandeling voor fotoreceptor degeneratieve ziekten. Dit doet veronderstellen dat een nog doeltreffender behandeling haalbaar wellicht door het stimuleren van het netvlies met neurotransmitter chemicaliën, de natuurlijke agentia communicatiemiddel op chemische synapsen. Het doel van de methode die in dit document gepresenteerd is aan de therapeutische haalbaarheid onderzoeken van chemische stimulatie, die tot doel heeft na te bootsen de natuurlijke systeem van synaptic communicatie tussen retinale neuronen, als een alternatief voor elektrische stimulatie van biomimetische voor een retinale prothese.
Vertaling van het concept van therapeutische chemische stimulatie tot een chemische retinale prothese is gebaseerd op chemisch activeren doel retinale neuronen met kleine hoeveelheden van inheemse neurotransmitters, zoals glutamaat, uitgebracht door middel van een microfluidic apparaat bestaande uit een groot scala aan microports in reactie op visuele stimulatie. Op deze manier zou een chemische retinale prothese in wezen een biomimetische kunstmatige fotoreceptor laag waarmee fotonen natuurlijk het bereiken van het netvlies naar chemische signalen worden omgezet. Aangezien deze chemische signalen dezelfde neurotransmitters gebruikt gebruiken in normale netvlies signalering en de overlevende retinale neuronen van een ontaarde netvlies door de dezelfde synaptic trajecten gebruikt door normaal gezichtsvermogen trajecten, de resulterende visuele stimuleren perceptie bereikt door middel van een chemische retinale prothese zou meer natuurlijke en begrijpelijke t.o.v. een opgeroepen door middel van een elektrische prothese. Bovendien, aangezien de microports via welke neurotransmitters worden uitgebracht kan worden gemaakt zeer kleine en gekleed in hoge dichtheid, in tegenstelling tot de elektroden, een potentiële chemische prothetische zou kunnen bereiken meer focale stimulatie en hogere ruimtelijke resolutie dan een elektrische prothese. Dus, op basis van deze potentiële voordelen, een chemische retinale prothese biedt een zeer veelbelovend alternatief voor elektrische prothesen.
Chemische stimulatie van het netvlies, echter is relatief weinig onderzocht tot voor kort. Terwijl elektrische stimulatie van het netvlies goed decennia van werk door middel van klinische studies13,2322, in vitroen in vivo23,24 gekenmerkt ,14, studies over chemische stimulatie geweest beperkt uitsluitend tot een paar in vitro werken25,26,27,28. Iezzi en Finlayson26 en Inayat et al. 27 aangetoond Epiretinaal chemische stimulatie van het netvlies in vitro met behulp van een enkele indicatorelektrode en een multielectrode matrix (MEA), respectievelijk, de glutamaat opgeroepen reacties van retinale neuronen opnemen. Meer recentelijk Rountree et al. 28 aangetoond de differentiële stimulatie van de OFF and ON retinale trajecten met behulp van glutamaat uit de subretinal kant en een MEA opnemen van de neuronale reacties van meerdere sites op het netvlies.Hoewel deze werken de haalbaarheid van chemische stimulatie preliminair opgericht hebben, verdere studies zijn essentieel voor de onderzoeken veel aspecten van deze aanpak die verder gaan dan gericht tot nu toe25,26,27 , 28, en fine-tunen van de therapeutische stimulatie parameters in zowel in vitro als in vivo dierlijke modellen voor het vertalen van dit concept naar een chemische retinale prothese zoals hierboven besproken. Echter op dit moment is er geen vastgelegde methode voor het uitvoeren van chemische stimulatie van het netvlies in de literatuur en de methoden die worden gebruikt in de eerdere werken niet zijn beschreven in zo gedetailleerd als essentieel voor Dr. studies zou zijn. De reden voor deze methoden papier daarom een duidelijk afgebakende kader te bieden voor het uitvoeren van in vitro chemische stimulatie van het netvlies voor deze onderzoekers ook geïnteresseerd bij het repliceren van onze vorige studies27, 28 of verder bevorderen dit ontluikende concept van chemische neurostimulatie.
Hier tonen we een methode voor het uitvoeren van in vitro chemische stimulatie van het netvlies neuronen in wholemount netvlies van wild-type ratten en een fotoreceptor gedegenereerd rat model dat nauw samen van de Nabootsers van de progressie van fotoreceptor degeneratieve aandoeningen bij de mens. De grondgedachte achter deze stimulatie-methode in in vitro modellen ontwikkelen is om te evalueren van de therapeutische bereiken van verschillende parameters van de stimulatie en bestuderen van de neurale reactie kenmerken dat zou onmogelijk of moeilijk te observeren in in vivo modellen, vooral tijdens de eerste studies gericht op een beoordeling van de haalbaarheid van deze aanpak. In deze procedure tonen we zowel één site en gelijktijdige multi-site chemische stimulaties van netvlies door het leveren van kleine hoeveelheden van 1 mM glutamaat in de buurt van de retinale neuronen doel via verkrijgbare één poort glas micropipetten en een op maat micromachined Multi-port microfluidic apparaat, respectievelijk. Terwijl zowel één site en meerdere sites stimulaties de fundamentele doelstelling bereiken van het onderzoek naar de therapeutische haalbaarheid van chemische neuromodulatie, dient elk een specifiek doel met een uniek voordeel. De stimulatie van één site, die kan worden bereikt met verkrijgbare vooraf getrokken glas micropipetten, kan worden gebruikt voor het injecteren van chemicaliën direct in de ondergrond van het netvlies op één site en dient om te onderzoeken of de regering van Cambodja waarneembare spike tarief reacties die vergelijkbaar met visueel evoked lichte reacties zijn kunnen focally worden ontlokte onder de injectieplaats. Aan de andere kant, multi-site stimulatie, waarvoor een speciaal gefabriceerde multipoort microfluidic apparaat, kan worden gebruikt voor het injecteren van chemicaliën ruimtelijk op meerdere locaties over het oppervlak van het netvlies en dient om te onderzoeken hoe goed glutamaat-opgeroepen RCG reactie patronen komen overeen met de glutamaat injectie patronen in patroon stimulatie studies.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierproeven zijn uitgevoerd met inachtneming van de richtsnoeren door de National Research Council gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren. Dierlijke protocollen van de manipulatie en euthanasie werden herzien en goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Universiteit van Illinois te Chicago.
1. dierlijke modellen
- Wild-type Long-Evans ratten
- Het aanschaffen van een 24-32 dag oude wild-type lange Evans Hooded rat van beide geslachten verhoogd met een standaard 12 h dag/nacht ritme.
- De rat donker aanpassen door deze te plaatsen in een volledig donkere kamer voor 1 uur vóór het begin van experiment.
- S334ter-3 ratten
- De transgene albino homozygoot S334ter-3 rat lijn overschrijden (of seks), uitdrukken van twee kopieën van het gen mutant rhodopsine, met een gepigmenteerde wild-type Long-Evans rat tot gepigmenteerde heterozygoot S334ter-3 ratten die fotoreceptor degeneratie vertonen qua progressie naar menselijke retinitis pigmentosa29,30.
- Heterozygoot nakomelingen met standaard 12 h dag/nacht ritme te verhogen en het gebruik van ratten van beide geslachten voor experimenten van de volgende leeftijden overeenkomt met de volgendefasen fotoreceptor degeneratie: vroege fase degeneratie: 14-20 dagen oud; Midden fase degeneratie: 21-27 dagen oud; Late fase degeneratie: 28-35 dagen oud; Volledig blind: > 50 dagen oud.
- De rat donker aanpassen door deze te plaatsen in een volledig donkere kamer voor 1 uur vóór het begin van experiment.
2. voorbereiding van Ames middelgrote oplossing en perfusie systeem
Figuur 1: schematische van experimentele opzet. Schematische voorstelling van de experimentele opstelling voor chemische stimulatie met behulp van een glas micropipet (A) en een aangepaste multipoort microfluidic apparaat (B). Het netvlies is geplaatst op een pMEA en voortdurend geperfundeerd met vers zuurstofrijk Ames middellange oplossing van zowel de boven- en onderkant via de pMEA perforaties. Signalen van de neurale reactie opgepikt door de elektroden van de pMEA zijn gevoed door de MEA versterker in een data-acquisitie-computer. Visuele en chemische stimulatie worden uitgevoerd met behulp van een groene LED en een 8-kanaals druk injector, respectievelijk, en beide prikkels worden getriggerd door een speciale stimulans computer, die ook gebruikt wordt om de positie van de pipet via een precisie 3-as micromanipulator. Een omgekeerde Microscoop wordt gebruikt voor het observeren van het netvlies tijdens een experiment. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: experimentele opzet. (A) foto van de volledige experimentele opstelling toont de relatieve posities van alle onderdelen. Het MEA versterker systeem wordt geplaatst op de top van een omgekeerde Microscoop, die wordt gebruikt om visueel inspecteren het netvlies en digitaal beeld de apparaat-netvlies interface door middel van de bijgevoegde high-speed camera tijdens het experiment. Boven- en onderkant perfusie zijn onafhankelijk gecontroleerd met behulp van een solenoïde-gecontroleerde perfusie-systeem. Injectie, positie controle en impedantie metingen worden uitgevoerd met behulp van een druk injector, micromanipulator en patch klem versterker (oranje vak; weergegeven in meer detail in B), respectievelijk. De micropipet of het apparaat is ingevoegd in een patch klem headstage voor impedantie metingen en gemonteerd op een gantry (aangegeven met groene vakje; weergegeven in meer detail in C) ter vergemakkelijking van plaatsbepaling met behulp van een micromanipulator. (B) een close-up van de meet- en regeltechniek instrumenten gebruikt in het experiment: de 8-kanaals druk injector, micromanipulator controlesysteem, patch klem versterker voor impedantie meting en de zuiging vaartuig voor perfusie eliminatie. (C) een close-up van de injectie systeem gantry weergegeven van een apparaat met meerdere poorten geïnterfacet met de pipet houder, patch klem headstage en micromanipulator. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: perfusie setup. (A) foto van de bovenkant van de versterker van de MEA toont de locatie van de bovenste perfusie en zuig evenals de groene LED gebruikt voor visuele lichte stimulatie. (B) een close-up van de pMEA perfusie kamer ter illustratie van de exacte locaties van de bovenste perfusie en zuig de pMEA en de referentie-elektrode voor het meten van de impedantie. (C) een gekleurd van de bodemplaat van de perfusie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Opmerking: Zie Figuur 1en Figuur 2 Figuur 3
- Afmeten van 900 mL-geïoniseerd water op kamertemperatuur (~ 21 ° C) en plaats in 1 L container.
- Perfuse het water met 100% CO2 met een borrelende mechanisme.
- Voeg 8.8 g van gepoederde Ames' medium om water in 1 L container.
- Spoel de middellange container Ames met een paar mL-geïoniseerd water verwijderen van alle sporen van gepoederde Ames' medium en toevoegen aan 1 L container.
- Voeg 25.3 mL natriumbicarbonaat oplossing (7.5% w/v31) toe aan 1 L container.
- Voeg extra water om de oplossing tot een eindvolume van 1 L.
- Blijven zoogdierlevercellen het water met CO2 voor ongeveer 5 min.
- Stop CO2 perfusie en beginnen zoogdierlevercellen oplossing met een gasmengsel van medisch-rang van 95% O2 en 5% CO2 gedurende minstens 30 min of totdat de pH op 7.4 stabiliseert.
Opmerking: Voor de toepassing van dit protocol, het Ames-medium wordt bewaard bij kamertemperatuur (~ 21 ° C) gedurende het gehele experiment om te voorkomen dat CO2 of O2 explosieve, die de regels van de perfusie met luchtbellen kunnen occlude. - Schoonmaken van de onder- en bovenkant perfusie-buizen door vullen met 70% ethanol en daarna beide lijnen 3 keer met-geïoniseerd water wassen. De bottom line met-geïoniseerd water en de bovenste regel met lucht vullen.
3. Wholemount retinale voorbereiding
Figuur 4: voorbereiding van de dissectie en wholemount van netvlies. (A) foto van een intact oogschelp ontleend aan een dier fotoreceptor-verworden. (B) gekleurd van het netvlies met longitudinale bezuinigingen om het plat uit. (C) na het afvlakken van het netvlies, het op een netraster is geplaatst met de fotoreceptor kant contact opnemen met de Maas en afgevlakt in lucht (buiten perfusie medium) zodat er geen plooien of gekrulde randen. (D) de mesh en netvlies zijn snel overgebracht naar de pMEA met de ganglion cel kant contact opnemen met de elektroden en onmiddellijk geperfundeerd met zuurstofrijk Ames medium. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: geperforeerde multielectrode matrix. (A) foto van de geperforeerde multielectrode matrix die in het protocol worden gebruikt. Het netvlies is geplaatst op de elektrodenserie (aangegeven door de rode rechthoek, die wordt weergegeven in meer detail in B) binnen de pMEA kamer om continue perfusie met zuurstofrijk Ames medium. (B) een gekleurd van de elektrode-matrix zelf de rangschikking van perforaties tussen de elektroden te illustreren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Opmerking: Zie Figuur 4 en Figuur 5
- Met behulp van een handheld rode LED zaklamp euthanaseren dier via kooldioxide verstikking gevolgd door cervicale dislocatie of een ander gekozen methode, volgens IACUC protocollen te zorgen voor dim rode verlichting.
- Enucleate van beide ogen met behulp van een juwelier #5 pincet en plaats enucleated ogen in een petrischaal van 60 mm diameter met ongeveer 3-4 mL verse, zuurstofrijk Ames middellange oplossing.
- Terwijl het oog via een dissectie stereomicroscoop met boven- en onderkant miniaturisten observeren met rood filter scherm bedekt, maken een kleine snede in het hoornvlies gezicht met behulp van een scalpel of een paar scherpe schaar.
- Knippen van deze kleine incisie aan de rand van het hoornvlies en vervolgens uitbreiden de cut in een ze gedeelte rond de hele rand van het hoornvlies. Verwijder het nu vrijstaand hoornvlies samen met de lens, doorschijnend waterige en glasvocht tarotspel.
- Zachtjes Houd de oogschelp met één paar pincet en zorgvuldig maken twee kleine incisies aan weerszijden van de oogschelp. Gebruik vervolgens twee paar pincet te zachtjes trekken uit elkaar de oogschelp op elk van de insnijdingen en scheiden van het netvlies van de sclera. Langzaam til het hele netvlies van de sclera en oogschelp. Snijd de oogzenuw, als het nog is aangesloten.
- Longitudinale bezuinigen op het netvlies te krijgen de helft of kwartaal secties met behulp van schaar, en dan voorzichtig het verspreiden van één retinale sectie op een nylon gaas (100 µm draad diameter met 350 µm openen) met de ganglion cellen (concave zijde van netvlies) naar uit de buurt van de Maas.
- Plaats de Maas en het netvlies op een geperforeerde multielectrode matrix (pMEA) met de ganglion cellen in contact met het oppervlak pMEA. Voorzichtig plaats dan een raster van de gewogen segment op de top van de Maas naar het netvlies op zijn plaats houden.
4. MEA en Data Acquisition Setup
Figuur 6: geluidsniveaus van pMEA. (A) representatieve opname van een subset van pMEA elektroden exposeren hoge permanente ruis. Deze ruis is meestal te wijten aan een gebrek aan goed contact tussen de pMEA contact pads en de pinnen van de MEA versterker als gevolg van normale slijtage van de dunne geperforeerde polyimide laag over de pMEA, vooral bij de contact pads. De andere mogelijke bron van geluidshinder is meestal oplossing uitgelekt op de pMEA versterker contact pads. Aanhoudende geluid ontstaat door slechte pin contact en/of gelekte oplossing op het contact pads kunnen meestal worden gecorrigeerd door een verschuiving van het standpunt van de pMEA binnen de versterker beter contact en schoonmaken en drogen van de pads, respectievelijk te verkrijgen. Als lawaai niet worden opgeheven door reiniging of verschuiven de pMEA positie, moet de pMEA volledig worden vervangen. (B) vertegenwoordiger opname van geluidsniveaus van een subset van pMEA elektroden van een schone pMEA met goed contact tussen de pMEA en versterker. Meestal is het gemiddelde geluidsniveau binnen ±16 µV. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Opmerking: Zie Figuur 6
- Onder dim rode verlichting, pMEA plaats in MEA versterker en versterker klinken sluiten.
- Als de merktekens niet al aanwezig zijn op de pMEA kamer ring, etch twee 'X'-gevormde merken regelafstand ongeveer 5 mm uit elkaar in een gebied gemakkelijk zichtbaar van boven met de boom-stand gemonteerde Microscoop.
- Plaats het bovenste perfusie stopcontact binnen de pMEA kamer en inschakelen van de bovenste perfusie klep aan het bereiken van een perfusie-snelheid van ongeveer 3 mL per minuut. De bovenste aanzuigopening plaats op het niveau van de gewenste perfusaat (~ 5 mm diep) en ervoor zorgen dat het werkt.
- Open de gegevens acquisitie software op de computer van de overname gegevens en klik op de 'play'-knop om te beginnen met het ontvangen van gegevens. Ervoor zorgen dat alle pMEA kanalen ruisvrije en opname neurale signalen.
- Door te kijken naar een live digitale beeld van het gezichtsveld van de omgekeerde Microscoop op een monitor, Let op de onderkant van de pMEA voor het bewijs dat de oplossing is stroomt door de bodemplaat van de perfusie.
5. glutamaat stimulatie voorbereiding
Figuur 7: glazen micropipet en MPS microfluidic apparaat. (A) een pipet houder vóór het invoegen van een micropipet of apparaat. De zilver/zilverchloride-elektrode (50 µm diameter) is het elektrisch gekoppeld aan de adapter op het einde van de interface met de patch klem headstage. (B) een foto van de glazen micropipet geïnterfacet met de houder van de pipet toont de locatie van de druk-poort gebruikt voor het initiëren van pneumatische injecties. (C) een aangepaste multipoort microfluidic apparaat (1 cm 1 cm 0.134 cm) gekoppeld aan een aangepaste 3D-gedrukte meubilair en geïnterfacet met de houder van de pipet door een roestvrij stalen buis. Het apparaat, die werd vervaardigd in twee lagen, heeft acht microports (diameter 14 µm) in de onderste laag (340 µm dik) en acht op de chip stuwmeren (diameter 1,6 mm) voor het opslaan van glutamaat in de bovenste laag (1 mm dik). Elk van de acht microports in de onderste laag van het apparaat onafhankelijk is verbonden met een reservoir van de op de chip in de bovenste laag via een in-plane microchannel, en elke op-Spaander reservoir op zijn beurt is aangesloten op een poort van de druk van de injector 8-kanaals druk via een flexibele buis dat onafhankelijke aandrijving van de microports voor patroon multisite injecties. (D) een close-up van het apparaat met meerdere poorten gehouden door pincet voordat u de buizen interface armatuur toont de rangschikking van de acht onafhankelijk-adresseerbare op de chip reservoirs en buizen inhammen. (E) een gekleurd van de onderkant van het apparaat weergegeven: van de acht 14 µm-diameter microports in een 3 x 3-configuratie met 200 µm afstand aan te passen aan de elektroden van de pMEA gerangschikt. De acht buiten microports worden gebruikt voor multisite injecties, terwijl de centrale poort uitsluitend voor de uitlijning tijdens de fabricage van het apparaat gebruikt werd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Opmerking: Zie Figuur 7.
- Bereid glutamaat-oplossing door het mengen van voorraad glutamaat solutionwith zuurstof Ames middellange oplossing om te verkrijgen van een steekproef van 0,5 mL met een concentratie van de werken van 1 mM glutamaat.
- Steek voorzichtig een micropipet vooraf getrokken 10 µm-diameter of de Inox staafjes diam. aangesloten op de seriële microfluidic-apparaat in de houder van een norm Pipetteer met een diameter van 50 µm zilver/zilverchloride draad elektrode.
Opmerking: Als de impedantie detectie niet beschikbaar is, de zilver/zilverchloride draad elektrode kan achterwege blijven. - Interface van de pipet houder met de patch-clamp-headstage en verbind luer aansluiting van de poort van de druk van de houder van de pipet op kanaal 1 van de druk injectiesysteem, als met behulp van een micropipet van glas of sluit de gegevenspoort luer druk van elk van de 8 injectie poorten met kanalen 1-8 van de druk injectiesysteem, gebruikt het apparaat met meerdere poorten.
- Handmatig zet de druk injectiesysteem en op kanaal 1 (of de kanalen 1-8, indien van toepassing). Ervoor zorgen dat het systeem aan sfeer ontlucht en de druk van de injectie ingesteld op 0,1 psi.
- Inschakelen van micromanipulator en het kalibreren door te drukken op de knop 'Kalibreer' op de domeincontroller van de manipulator. Plaats de micromanipulator zodat het uiteinde van de micropipet (of de onderzijde van het apparaat, indien van toepassing) ongeveer 30 mm boven de MEA-versterker is.
- Vul een kleine petrischaal met glutamaat oplossing (1 mM glutamaat in standaard Ames medium) en plaats deze onder de micromanipulator. Lagere micropipet tip (of het apparaat) in de oplossing en de vulling door de 'Opvulling'-knop op de druk injectiesysteem (zuigdruk van-13 in H2O) te drukken totdat er ongeveer 20 mm van oplossing zichtbaar in het glas-micropipet is of de apparaat met meerdere poorten buis.
- Als het apparaat met meerdere poorten gebruikt, veranderen van kanaal 1 van de injector van de druk af en herhaal het protocol voor 2-8 kanalen. Til de micropipet tip of apparaat uit oplossing, verwijderen van de petrischaal en de micromanipulator boven de pMEA kamer plaats.
- Met een stereomicroscoop boom-stand gemonteerd, sluiten de micropipet tip of de hoeken van het apparaat bij de referentiemerktekens geëtst in de pMEA kamer ring. Opslaan van de manipulator posities in de controlesoftware met behulp van de knoppen 'Winkel referentie A' en 'Winkel referentie B' (of simpelweg de opmerking van de manipulator coördinaten handmatig) om het coördinatensysteem van de manipulator met de elektroden pMEA in kaart.
- Met behulp van de software van de controle van de manipulator, selecteer een doel pMEA elektrode met robuuste spontane activiteit en klik op de knop 'Verplaatsen naar kanaal' als u wilt uitlijnen de glas micropipettewith de doel-elektrode.
6. interface met Retina
- Impedantie meting beschikbaar is, patch klem versterker inschakelen als de impedantie visualisatie software starten door te klikken op de knop 'Start' om te visualiseren de impedantie van de zilver/zilverchloride-elektrode in de houder van de pipet. Met inachtneming van de real-time impedantie signalen, langzaam lager de micropipet of het apparaat totdat zij contacten het netvlies oppervlak zoals aangegeven door een snelle toename van de impedantie signaal (Zie Figuur 8). Opslaan of maken nota van het standpunt van het netvlies oppervlak.
- Als impedantie meting niet beschikbaar is, detecteren contact met het netvlies oppervlak door middel van visuele waarneming, hoewel dit minder nauwkeurig zal zijn. Verlaag de pipet of het apparaat totdat zij zichtbaar de oppervlaktelaag van de Ames middellange oplossing in de zaal MEA contacten.
- Dan, met inachtneming van de bovenkant van het netvlies met een omgekeerde Microscoop, langzaam lager de pipet of het apparaat totdat de oppervlaktelaag van het netvlies zichtbaar vervormd is, waarmee wordt aangegeven dat er contact is geboekt met het netvlies oppervlak. Opslaan of maken nota van het standpunt van het netvlies oppervlak.
- Voor stimulatie van de ondergrond, het verlagen van de pipet een verdere 40 µm (voor S334ter-3 netvlies) of 70 µm (voor wild-type netvlies).
- Uitvoeren van een paar korte duur (10-30 ms) injecties met behulp van de druk injectie (0.1 psi) systeem om te bepalen als de cellen in de buurt van de micropipet tip of apparaat microports openstaan voor glutamaat stimulatie door het observeren van de neurale signalen met data-acquisitie software.
Opmerking: Succesvolle injecties zal ontlokken een duidelijk zichtbaar piek tarief burst of spike remming (Zie Figuur 9). Als geen antwoord wordt waargenomen, verplaatsen de micropipet of het apparaat op een andere elektrode.
Figuur 8: meting van de impedantie. (A) een schematische voorstelling van de impedantie meettechniek. Met behulp van de patch-clamp-versterker, wordt de impedantie van de micropipet continu gecontroleerd als het langzaam wordt verlaagd naar het netvlies oppervlak. Als het micropipet hoger dan het netvlies is, resulteert de relatief hoge Ionische geleidbaarheid van Ames medium in een lage impedantie-lezing. Als de micropipet maakt contact met het netvlies oppervlak, de Ionische geleidbaarheid door middel van de zilver/zilverchloride draad ook wordt verminderd, waardoor een snelle stijging in gemeten impedantie. (B) een perceel weer te geven van de impedantie wijziging opgenomen vlak voor en na het contact van het uiteinde van de pipet met het netvlies oppervlak. De impedantie van de gemeten relatief laag is wanneer de micropipet-tip in oplossing vlak voor contact (aangegeven door de oranje regio aan de linkerkant). Zodra het contact wordt gemaakt (aangegeven door de rode pijlpunt en de groene streek op rechts), verhoogt de impedantie snel als gevolg van verminderde Ionische geleidbaarheid bij contact met het netvlies weefsel. In de praktijk, is het netvlies oppervlak geregistreerd als de hoogte overeenkomt met het begin van de steile stijging van de gemeten impedantie (de locatie van de rode pijlpunt). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 9: elektrode opnames van neurale activiteit tijdens beeldende, spontane, en glutamaat injectie opnames. (A) representatieve opnames van negen pMEA elektroden tonen de hoogdoorlaat elektrode gegevens gefilterd tijdens visuele lichte stimulatie met een groene LED waar elke rechthoek de neurale worden gegevens weergegeven uit een unieke elektrode. Elke elektrode opname ziet u gegevens die zijn verzameld in de eerste seconde na het inschakelen van de groene LED (timing komt te staan met oranje pijlpunten in ieder waarnemingspunt) met een gemeenschappelijk spanning schaal weergegeven in de linker y-axes. Spikes werden geïdentificeerd met behulp van een spanning van de drempel van-18 µV (horizontale rode lijn in ieder waarnemingspunt elektrode) en worden vertegenwoordigd door de zwarte sporen over de groene elektrode-gegevens. Visuele stimulatie veroorzaakt een uitbarsting van spikes (excitatie) in alle elektroden behalve de middenboven een, dat in het bezit van een remmende antwoord aan het licht. (B) een soortgelijk plot voor de elektroden weergegeven: spontane neurale activiteit zonder visuele of injectie stimulatie. Hoewel kleinere uitbarstingen aanwezig waren, waren de patronen van pieken zeer afwijken opgenomen in reactie op visuele stimulatie. (C) vertegenwoordiger opnames uit de dezelfde subset van elektroden opgenomen onmiddellijk na een injectie van glutamaat op de centrale elektrode (timing oranje pijlpunten in ieder waarnemingspunt aangeduid). De geïnjecteerde glutamaat ontlokte een uitbarsting van pieken in de centrale elektrode die erg vergelijkbaar met de uitbarstingen van de visueel-opgeroepen spike was. Alle andere elektroden waren niet beïnvloed door de glutamaat-injectie, waaruit blijkt hoe de mooie ruimtelijke resolutie van de techniek van chemische stimulatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
7. Start retinale opname en stimulans programma
- De groene LED richting de bovenkant van het netvlies te oriënteren. Beginnen met opnemen met behulp van de software van de overname van de gegevens op de computer van de toegewijde opname door de bestandsnaam te typen en te klikken op de "record" knop.
- Zodra het opnemen is begonnen, open het controleprogramma van de stimulus en laden van het standaardbestand stimulans door te klikken op de knop "Read Stimulus File". Klik vervolgens op de knop "Uitvoeren Stimulus File" tot het standaardbestand voor de stimulans die bestaat uit het protocol van stimuli en data acquisitie beschreven in de opmerking verderop.
Opmerking: (i) 30 proeven van 2 s ON en 2 s uit volledige veld flash (5 lm/m2 intensiteit) met behulp van de groene LED. (ii) 120 s van gegevens zonder gebruik te maken van de groene LED aan het opnemen van de spontane activiteit van het netvlies over een soortgelijke tijdschaal. (iii) 1 of meer sets van glutamaat injecties bestaande uit 30 proeven van glutamaat injecties op 0.1 psi met 10-30 ms injectie tijden (ongeveer 100-300 pL per injectie) en 3 s interpulse duur. Selecteer in het geval van multi-site injecties, 2 of meer havens te injecteren gelijktijdig.
Figuur 10: Peristimulus histogrammen van beeldende, spontane, en glutamaat reacties. (A) vertegenwoordiger peristimulus histogrammen (30 ms binwidth) van de gegevens van de piek van de subset van elektroden in figuur 9A, gemiddeld over 20 proeven van visuele lichte stimulatie. Een gemeenschappelijk piek tarief schaal werd toegepast op alle elektroden en is aangegeven op de linker y-axes. De zwarte lijn in ieder waarnemingspunt elektrode geeft het gemiddelde spike voor alle spikes opgenomen tijdens de eerste seconde na het inschakelen van de groene LED. Zoals kan worden gezien, veroorzaakt visuele stimulatie een voorbijgaande excitatory piek tarief antwoord op alle elektroden behalve de middenboven elektrode, die had een voorbijgaande remmende antwoord aan het licht. (B) de gemiddelde spontane piek tarief antwoorden opgenomen op de elektroden zonder enige visuele of chemische stimulatie. Zonder stimulatie zijn de piek tarieven voor elke elektrode relatief constant. (C) de gemiddelde piek tarief antwoorden opgenomen op de elektroden in reactie op de injectie van een glutamaat op een locatie boven de centrale elektrode. De alleen voorbijgaande reactie duidelijk is de excitatory reactie op de elektrode direct onder de injectieplaats. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Dit protocol kan worden gebruikt voor chemisch stimuleren zowel normale, wild-type netvlies evenals fotoreceptor verworden netvlies, ondanks de aanzienlijke cellulaire remodelleren veroorzaakt door het verlies van de researchdieren. Voordat beginnen experimenten met beide fotoreceptor gedegenereerd of wild-type netvlies, opname- en stimulatie-apparatuur (Figuur 1 en Figuur 2) moet worden klaargemaakt en de pMEA (
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De methode die hier gepresenteerd demonstreert een unieke neurale stimulatie paradigma, waarin retinale neuronen chemisch worden gestimuleerd door het injecteren van inheemse neurotransmitter chemische stoffen in de ondergrond van het netvlies in vitro. Deze techniek van chemische stimulatie biedt verschillende ten opzichte van de conventionele elektrische stimulatie techniek, met inbegrip van selectiviteit en hoge focal specificiteit van doel neuronen. Het protocol bovenstaande gegevens hoe klein volume pneumat...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Het werk gepresenteerd in het papier werd gesteund door de National Science Foundation, opkomende grenzen in onderzoek en innovatie (NSF-Emergency First Response Instructor) programma verlenen nummer 0938072. De inhoud van dit document zijn uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigen niet noodzakelijk de officiële standpunten van de NSF. De auteurs wil ook Dr. Samsoon Inayat bedanken voor zijn werk ontwerpen en testen van de eerste experimentele opstelling voor chemische stimulatie en Mr. Ashwin Raghunathan voor zijn werk ontwerpen, fabriceren en het evalueren van de MPS microfluidic apparaat dat wordt gebruikt in Deze studie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Microelectrode array, perforated layout | Multi Channel Systems, GmbH | 60pMEA200/30iR-Ti-pr | http://www.multichannelsystems.com/products/microelectrode-arrays/60pmea20030ir-ti |
| MEA amplifier | Multi Channel Systems, GmbH | MEA1060-Inv | http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv |
| Bottom perfusion groundplate for pMEA | Multi Channel Systems, GmbH | MEA1060-Inv-(BC)-PGP | http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv-bc-pgp |
| 3-axis Motorized Micromanipulator | Sutter Instruments, Novato, CA | MP-285 | https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mp285.html |
| Micromanipulator Control System | Sutter Instruments, Novato, CA | MPC-200 | https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mpc200.html |
| Gantry style micromanipulator stand with linear slide | Sutter Instruments, Novato, CA | MT-75/LS | https://www.sutter.com/STAGES/mt75.html |
| 8-channel Programmable Multichannel Pressure Injector | OEM: MicroData Instrument, S. Plainfield, NJ Vendor: Harvard Apparatus UK | PM-8000 or PM-8 | OEM: http://www.microdatamdi.com/pm8000.htm Vendor: https://www.harvardapparatus.co.uk/webapp/wcs/stores/servlet/product_11555_10001_39808_-1 _HAUK_ProductDetail |
| Axopatch 200A Integrating Patch Clamp Amplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | Axopatch 200A | Axopatch 200A is vervangen door een nieuwer model Axopatch 200B: https://www.moleculardevices.com/systems/axon-conventional-patch-clamp/axopatch-200b-amplifier |
| Patch clamp headstage | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | CV 201A | http://mdc.custhelp.com/app/answers/detail/a_id/16554/~/axopatch-200a%3A-selection-cv-headstage |
| Vacuum waste kit | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | VMK | http://alascience.com/product/vacuum-waste-kit/ |
| Pipette holder | Warner Instruments, Hamden, CT | QSW-A10P | https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=915 |
| Pre-pulled 10 μm tip diameter glass micropipettes | World Precision Instruments, Sarasota, FL | TIP10TW1 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/make-selection-pre-pulled-glass-pipettes-plain/ |
| Zoom stereomicroscope | Nikon, Tokyo, Japan | SMZ-745T | https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ745 |
| Microscope boom stand with dual linear ball bearing arm | Old School Industries, Inc., Dacono, CO | OS1010H-16BB | http://www.osi-incorp.com/productdisplay/dual-linear-ball-bearing-arm |
| Zoom Stereo Microscope with C-LEDS Hybrid LED Stand | Nikon, Tokyo, Japan | SMZ-445 | https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ445 |
| Inverted microscope system | Nikon, Tokyo, Japan | Eclipse Ti-E | https://www.nikoninstruments.com/Products/Inverted-Microscopes/Eclipse-Ti-E |
| Ames medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1420 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a1420 |
| L-Glutamic Acid (Glutamate) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G5667 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/100291 |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S8761 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8761 |
| 60 mm Petri dish (10 mm tall) | Fischer Scientific, Waltham, MA | FB0875713A | 60 mm clear petri dish; https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875713a |
| Jewelers #5 Forceps | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 555227F | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/555227f-jewelers-5-forceps-11cm-straight-titanium/ |
| Standard Scalpel Blad #24 | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 500247 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500247-standard-scalpel-blade-24/ |
| Scalpel Handle #4 | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 500237 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500237-scalpel-handle-4-14cm/ |
| Vannas Tubingen Dissection Scissors | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 503378 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/503378-vannas-tubingen-scissors-8cm-straight-german-steel/ |
| Nylon mesh kit | Warner Instruments, Hamden, CT | NYL/MESH | https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=1173 |
| Harp slice grid | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | HSG-5AD | http://alascience.com/product/standard-harp-slice-grids/ |
| Ag/AgCl reference electrode pellet | Multi Channel Systems, GmbH | P1060 | http://www.multichannelsystems.com/products/p1060 |
| 4 Channel Valve Controlled Gravity Perfusion System | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | VC3-4xG | http://alascience.com/product/4-channel-valve-controlled-gravity-perfusion-system/ |
| Zyla 5.5 sCMOS microscope camera | Andor Technology, Belfast, UK | Zyla 5.5 sCMOS | http://www.andor.com/scientific-cameras/neo-and-zyla-scmos-cameras/zyla-55-scmos |
| Silver wire (50 μm diameter) | Fischer Scientific, Waltham, MA | AA44461G5 | https://www.fishersci.com/shop/products/silver-wire-0-05mm-0-002-in-dia-annealed-99-99-metals-basis-3/aa44461g5 |
| Tygon microbore tubing (1.6 mm diameter) | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | EW-06419-01 | https://www.coleparmer.com/i/tygon-microbore-tubing-0-020-x-0-060-od-100-ft-roll/064 |
Referenties
- Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. Br J Ophthalmol. , (2011).
- Fritsche, L. G., Fariss, R. N., Stambolian, D., Abecasis, G. R., Curcio, C. A., Swaroop, A. Age-Related Macular Degeneration: Genetics and Biology Coming Together. Annu Rev Genomics Hum Genet. 15, 151-171 (2014).
- Marc, R. E., et al. Neural reprogramming in retinal degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 3364-3371 (2007).
- Jones, B. W., Kondo, M., Terasaki, H., Lin, Y., McCall, M., Marc, R. E. Retinal remodeling. Jpn J Ophthalmol. 56, 289-306 (2012).
- Soto, F., Kerschensteiner, D. Synaptic remodeling of neuronal circuits in early retinal degeneration. Front Cell Neurosci. 9, (2015).
- Trenholm, S., Awatramani, G. B. Origins of spontaneous activity in the degenerating retina. Front Cell Neurosci. 9, (2015).
- Euler, T., Schubert, T. Multiple Independent Oscillatory Networks in the Degenerating Retina. Front Cell Neurosci. 9, (2015).
- Boye, S. E., Boye, S. L., Lewin, A. S., Hauswirth, W. W. A Comprehensive Review of Retinal Gene Therapy. Mol Ther. 21, 509-519 (2013).
- Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: follow-up of two open-label phase 1/2 studies. The Lancet. 385, 509-516 (2015).
- Reh, T. A. Photoreceptor Transplantation in Late Stage Retinal Degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57, (2016).
- Zrenner, E. Fighting blindness with microelectronics. Sci Transl Med. 5, (2013).
- Humayun, M. S., de Juan, E. Jr, Dagnelie, G. The Bionic Eye: A Quarter Century of Retinal Prosthesis Research and Development. Ophthalmol. 123, S89-S97 (2016).
- Cruz, L., et al. The Argus II epiretinal prosthesis system allows letter and word reading and long-term function in patients with profound vision loss. Br J Ophthalmol. 97, 632-636 (2013).
- Zrenner, E., et al. Subretinal electronic chips allow blind patients to read letters and combine them to words. P R Soc B. 278, 1489-1497 (2011).
- Stronks, H. C., Dagnelie, G. The functional performance of the Argus II retinal prosthesis. Expert Rev Med Devices. 11, 23-30 (2014).
- Stingl, K., et al. Artificial vision with wirelessly powered subretinal electronic implant alpha-IMS. P R Soc B. 280, (2013).
- Rizzo, J. F. Update on retinal prosthetic research: the Boston Retinal Implant Project. J Neuroophthalmol. 31, 160-168 (2011).
- Ayton, L. N., et al. First-in-Human Trial of a Novel Suprachoroidal Retinal Prosthesis. PLoS ONE. 9, e115239(2014).
- Chuang, A. T., Margo, C. E., Greenberg, P. B. Retinal implants: a systematic review. Br J Ophthalmol. 98, 852-856 (2014).
- Cai, C., Twyford, P., Fried, S. The response of retinal neurons to high-frequency stimulation. J Neural Eng. 10, 036009(2013).
- Eiber, C. D., Lovell, N. H., Suaning, G. J. Attaining higher resolution visual prosthetics: a review of the factors and limitations. J Neural Eng. 10, 011002(2013).
- Humayun, M., Propst, R., de Juan, E., McCormick, K., Hickingbotham, D. Bipolar surface electrical stimulation of the vertebrate retina. Arch Ophthalmol. 112, 110-116 (1994).
- Zrenner, E., et al. Can subretinal microphotodiodes successfully replace degenerated photoreceptors? Vision Res. 39, 2555-2567 (1999).
- Majji, A. B., Humayun, M. S., Weiland, J. D., Suzuki, S., D'Anna, S. A., de Juan, E. Long-Term Histological and Electrophysiological Results of an Inactive Epiretinal Electrode Array Implantation in Dogs. Invest Ophthalmol Vis Sci. 40, 2073-2081 (1999).
- Peterman, M. C., Noolandi, J., Blumenkranz, M. S., Fishman, H. A. Localized chemical release from an artificial synapse chip. PNAS. 101, 9951-9954 (2004).
- Finlayson, P. G., Iezzi, R. Glutamate stimulation of retinal ganglion cells in normal and s334ter-4 rat retinas: a candidate for a neurotransmitter-based retinal prosthesis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 3619-3628 (2010).
- Inayat, S., Rountree, C. M., Troy, J. B., Saggere, L. Chemical stimulation of rat retinal neurons: feasibility of an epiretinal neurotransmitter-based prosthesis. J Neural Eng. 12, 016010(2015).
- Rountree, C. M., Inayat, S., Troy, J. B., Saggere, L. Differential stimulation of the retina with subretinally injected exogenous neurotransmitter: A biomimetic alternative to electrical stimulation. Sci Rep. 6, 38505(2016).
- Ray, A., Sun, G. J., Chan, L., Grzywacz, N. M., Weiland, J., Lee, E. -J. Morphological alterations in retinal neurons in the S334ter-line3 transgenic rat. Cell Tissue Res. 339, 481-491 (2010).
- Martinez-Navarrete, G., Seiler, M. J., Aramant, R. B., Fernandez-Sanchez, L., Pinilla, I., Cuenca, N. Retinal degeneration in two lines of transgenic S334ter rats. Exp Eye Res. 92, 227-237 (2011).
- Sigma Aldrich. Sigma Aldrich Ames Medium Product Information Sheet. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Product_Information_Sheet/1/a1420pis.pdf (2017).
- Reinhard, K., et al. Step-By-Step instructions for retina recordings with perforated multi electrode arrays. PLoS ONE. 9, e106148(2014).
- Izumi, Y., Kirby, C. O., Benz, A. M., Olney, J. W., Zorumski, C. F. Müller cell swelling, glutamate uptake, and excitotoxic neurodegeneration in the isolated rat retina. Glia. 25, 379-389 (1999).
- Tunnicliff, G. Glutamate uptake by chick retina. Biochem J. 150, 297-299 (1975).
- Schwartz, E. A., Tachibana, M. Electrophysiology of glutamate and sodium co-transport in a glial cell of the salamander retina. J Physiol (Lond). 426, 43-80 (1990).
- Muller, A., Maurin, L., Bonne, C. Free radicals and glutamate uptake in the retina. Gen Pharmacol- Vasc S. 30, 315-318 (1998).
- Dhingra, N. K., Kao, Y. -H., Sterling, P., Smith, R. G. Contrast threshold of a brisk-transient ganglion cell in vitro. J of Neurophysiol. 89, 2360-2369 (2003).
- Ahlers, M. T., Ammermüller, J. A system for precise temperature control of isolated nervous tissue under optical access: Application to multi-electrode recordings. J of Neurosci Methods. 219, 83-91 (2013).
- Feke, G. T., Tagawa, H., Deupree, D. M., Goger, D. G., Sebag, J., Weiter, J. J. Blood flow in the normal human retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 30, 58-65 (1989).
- The Retina. Neuroscience. Purves, D., et al. , 2nd edition, Sinauer Associates. (2001).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
