Methodenartikel

Preconditionering de luchtwegen van muizen met bleomycine verhoogt de efficiëntie van Orthotopic long kanker cel Engraftment

DOI:

10.3791/56650

⸱

28 juni 2018

 ,  , 
1Department of Pathology, Yale University School of Medicine, 2Department of Medical Oncology, Yale University School of Medicine

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beschrijven we een methode om engraftment van de orthotopic van longkanker kankercellen in de longen lymfkliertest aanzienlijk te verbeteren door preconditionering van de luchtwegen met blessure. Deze benadering kan ook worden toegepast om te studeren stromale interacties binnen de longen communicatie, gemetastaseerde verspreiding, long kanker co morbiditeit en efficiënter genereren patiënt afgeleid xenografts.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Longkanker is een dodelijke behandeling vuurvaste ziekte die biologisch heterogeen is. Om te begrijpen en effectief behandelen het volledige klinische spectrum van thoracale maligniteiten, zijn extra dierlijke modellen die diverse menselijke long kanker subtypen en stadia kunnen recapituleren nodig. Allograft of xenograft modellen zijn veelzijdig en inschakelen van de kwantificering van tumorigene capaciteit in vivo, met behulp van kwaadaardige cellen van lymfkliertest of menselijke oorsprong. Echter zijn eerder beschreven methoden voor long kanker cel engraftment uitgevoerd in niet-fysiologische sites, zoals de flank van muizen, te wijten aan de inefficiëntie van orthotopic transplantatie van cellen in de longen. In deze studie beschrijven we een methode ter verbetering van orthotopic long kanker cel engraftment door preconditionering de luchtwegen van muizen met de fibrose inducerend agent bleomycine. Als een experiment van proof-of-concept, wij deze aanpak om het engraft van tumorcellen van het Long adenocarcinoom subtype, verkregen uit de muis of menselijke bronnen, in verschillende muizenstammen toegepast. We laten zien dat het verwonden van de luchtwegen met bleomycine vóór tumor cel injectie de engraftment van tumorcellen van 0-17 verhoogt % tot 71-100%. Deze methode verbeterde aanzienlijk, Long tumor incidentie en verdere uitgroei met behulp van verschillende modellen en muis stammen. Daarnaast verspreiden werk Long kankercellen uit de longen in relevante verre organen. Dus, wij bieden een protocol dat kan worden gebruikt om te stellen en onderhouden van nieuwe modellen van de orthotopic van longkanker met beperking van de hoeveelheid cellen of biospecimen en kwantitatief beoordelen de tumorigene capaciteit van Long kankercellen in fysiologisch relevante instellingen .

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Longkanker is de belangrijkste oorzaak van kanker gerelateerde sterfgevallen wereldwijd1. Patiënten met longkanker bezwijken uiteindelijk van metastase tot verre organen, met name aan het centraal zenuwstelsel, lever, bijnieren en botten2,3,4. Thoracale maligniteiten zijn traditioneel ingedeeld als kleincellige longkanker (SCLC) of niet-kleincellige longkanker kanker (NKCLK)5. NKCLK is de meest vaak gediagnosticeerd maligniteit en kan worden onderverdeeld in verschillende histologische subtypes, met inbegrip van adenocarcinoom van de Long (LUAD) en Long plaveiselcelcarcinoom (LUSC)6. Genomic analyse van gereseceerd menselijke primaire longkankerziekten is gebleken dat de tumoren binnen een bepaalde histotype ook divers moleculaire verstoringen, verder bij te dragen aan hun uiteenlopende klinische progressie en verstorende patiënt prognose kunnen uitdrukken. De opmerkelijke heterogeniteit van de longkankerziekten vormt een aanzienlijke uitdaging voor het rationele ontwerp preklinisch onderzoek en uitvoering van effectieve therapeutische strategieën. Daarom is er een noodzaak om uit te breiden van het repertoire van hanteerbare experimentele long kanker modellen te bestuderen van de verschillende cellulaire oorsprong, moleculaire subtypen en stadia van deze ziekte.

Verschillende benaderingen met behulp van dierlijke modellen zijn tewerkgesteld long kanker om te studeren in vivo, elk met hun eigen voor- en nadelen, afhankelijk van de biologische vragen van belang. Genetisch gemodificeerde Muismodellen (GEMMs) kunnen richten op specifieke genetische wijzigingen in een bepaalde voorlopercellen celtype, resulterend in tumoren die vooruitgang binnen een immunocompetent host7. Terwijl zeer krachtig en klinisch relevante, kunnen de latency, variabiliteit, en/of Long tumor morbiditeit geassocieerd met GEMMs verbiedend met bepaalde kwantitatieve metingen en de detectie van late stadium metastase in verre organen8. Een complementaire benadering is het gebruik van allograft modellen, waarbij Long kankercellen, hetzij rechtstreeks uit een muis tumor verkregen of afgeleid eerst als het gevestigde cellijnen in cultuur, opnieuw binnengebracht in syngeneic hosts worden. Naar analogie, zijn long kanker xenografts gevestigd van menselijke cellijnen of patiënt afgeleide tumor monsters. Menselijke cel lijn xenografts of patiënt afgeleide xenografts (PDXs) zijn over het algemeen gehandhaafd bij immuungecompromitteerde muizen en daarom beletten volledig immuun-surveillance9. Ondanks dit nadeel bieden zij een laan voor het doorgeven van de beperking van de hoeveelheid menselijke biospecimens en studie fundamentele in vivo eigenschappen van menselijke kankercellen, die voor meer complexe genomic afwijkingen dan GEMM tumoren coderen.

Een nuttige eigenschap van allografts en xenografts is dat ze vatbaar voor traditionele beperkende cel verdunning testen, werkzaam te kwantificeren van de frequentie van de tumor cellen (TICs) binnen een kwaadaardige cel bevolking10initiëren. In deze experimenten, een bepaald aantal cellen worden subcutaan ingespoten in de flank van de dieren en de frequentie van de TICs kan worden geschat op basis van de tumor te nemen koers. Subcutane tumoren kunnen echter meer hypoxische11 en kunnen niet zeer belangrijke fysiologische beperkingen van de Long tumor communicatie model. Intratracheale levering van epitheliale stam of voorlopercellen in de longen van muizen is een methode om te studeren pulmonaire regeneratie en airway stamcel biologie12. Het tarief van de engraftment van deze techniek kan echter relatief laag, tenzij de longen eerst aan fysiologische vormen van schade, zoals virale infectie13,14 onderworpen zijn. Ondersteuning van inflammatoire stromale cellen en/of de verstoring van het membraan van de kelder Long kan in de cel van de stam van de relevante niches in de distale airways15eigendomsvoorbehoud getransplanteerde cellen verbeteren. Fibrose inducerende agenten kan ook vooraf een voorwaarde van de longen te verbeteren engraftment van geïnduceerde pluripotente cellen16 en17van de mesenchymale stamcellen. Of soortgelijke beschermingsvormen airway letsel kunnen invloed hebben op het engraftment tarief, hebben tumor-initiërende capaciteit, en uitgroei van Long kankercellen nog systematisch worden beoordeeld.

In deze studie beschrijven we een methode te vergroten van de doelmatigheid van orthotopic long kanker cel engraftment, door preconditionering de longen van muizen met blessure. LUAD ontstaat in de distale airways met een grote subset van deze kankers ontwikkelen een fibrotische stroma18 die vaak met slechte prognose19 correleert. Bleomycine, een natuurlijke nonribosomal hybride peptide-polyketide, is uitgebreid om te induceren van longfibrose in muizen20gebruikt. Airway instillation van bleomycine bevordert eerst epitheliale uitputtingsslag in de longblaasjes en rekrutering van ontstekingscellen, met inbegrip van macrofagen, neutrofiele granulocyten en monocyten21. Dit wordt gevolgd door de weefsel remodeling in de distale airways, kelder membraan reorganisatie22,23 en24afzetting extracellulaire matrix (ECM). De effecten van een enkele Bleomycine injectie zijn voorbijgaande, met fibrosis oplossen na 30 dagen in de meeste studies25. Met behulp van zowel allograft en xenograft modellen, we getest als preconditionering de luchtwegen van muizen met bleomycine aanzienlijk van de te nemen koers van LUAD cellen in de longen verhogen kan.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle experimenten werden uitgevoerd volgens protocollen die zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) aan de Yale University.

1. instellen / voorbereiding van de reagentia.

  1. Bleomycine
    Let op: Gebaseerd op het wereldwijd geharmoniseerde systeem (GHS) van de indeling en etikettering van chemische stoffen, is Bleomycine geclassificeerd als een gevaar voor de gezondheid van GHS08.
    1. Bleomycine in een chemische kap voor te bereiden. Resuspendeer 15 U in 5 mL steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
    2. Aliquot 100-200 µL van de oplossing in glazen flesjes en bevriezen ze bij-20 ° C voor toekomstig gebruik. Goed het label van de buizen met de datum van resuspensie. Gebruik binnen 6 maanden vanaf deze datum.
      Opmerking: Elke muis stam heeft een andere gevoeligheid voor bleomycine26. Testen van verschillende doses van bleomycine voor elke muis stam wordt aanbevolen. De stammen van de muis en de bijbehorende doses van bleomycine gebruikt in representatieve experimenten zijn vermeld in tabel 1.
  2. Muizen
    1. Koop muizen die nodig zijn voor het experiment en laat muizen 7 dagen acclimatiseren vóór injectie. Infusies in een bioveiligheid kap uitvoeren. Breng dieren gehuisvest in een compatibele kamer van niet-BSL2 naar een BSL2 kamer met behulp van standaardprocedures institutionele vóór bleomycine infusie. Injecteren muizen op de leeftijd van 6-8 weken.
      Let op: Injecteren muizen na institutionele richtsnoeren voor gevaarlijke agentia, bioveiligheidsniveau 2 (BSL2) en IACUC goedkeuring.
      Opmerking: Muizen gekocht voor de representatieve experimenten staan in de Tabel van materialen. Alleen mannelijke muizen zijn gebruikt.
  3. Long kanker cellijnen
    1. Cultuur gewenst cellijnen in hun respectieve media. Uitvoeren voordat injecties, short tandem repeat DNA profielen of genetische testen om ervoor te zorgen de juiste cel identificatie. Om te vergemakkelijken in vivo en ex vivo imaging, cellijnen besmetten met een lentivirus uiten de thymidinekinase, de groen fluorescente proteïne (GFP) en de luciferase fusion verslaggever27en verslaggever positieve cellen sorteren fluorescentie cell sorting (FACS) voorafgaand aan de engraftment geactiveerd. Test lijnen voor mycoplasma elke 6 maanden.
      1. Cultuur H2030 menselijke kanker cellijn zoals aanbevolen door de fabrikant Roswell Park Memorial Instituut medium (RPMI) met 10% foetale runderserum (FBS), penicilline-streptomycine en amfotericine-B.
      2. Cultuur 368T1 lymfkliertest cellijn (afgeleid van een KrasG12D; p53- / - muis) Dulbecco van bewerkt Eagle's medium (DMEM) met 10% FBS, penicilline-streptomycine en amfotericine-B.
      3. Cultuur PC9 menselijke kanker cellijn met behulp van RPMI met 10% FBS, penicilline-streptomycine en amfotericine-B.

2. bleomycine behandeling

  1. Wilt u muizen intratracheally injecteren met bleomycine 14 dagen vóór de tumor cel engraftment.
  2. Ontdooi bleomycine voorraad op ijs 2 h vóór injectie.
  3. Eenmaal ontdooid, Verdun bleomycine bij de gewenste werken concentratie (0,02 U/50 µL of 0,005 U/50 µL) en houd het op ijs.
    Opmerking: Concentratie van bleomycine hangt af van de stam van de muis gebruikt voor de experimenten (tabel 1). Titratie van bleomycine in muizen moet worden uitgevoerd om te bepalen van de optimale dosis.
  4. Bereiden van verdoving door verder verdunnen van ketamine en xylazine om een eindconcentratie van 10 mg/mL en 1 mg/mL, respectievelijk, elke muis met behulp van een 1 mL spuit en 27 G naald, anesthetize door het injecteren van intraperitoneally ketamine/xylazine oplossing bij 100/10 mg/kg respectievelijk.
  5. Volgen van de ademhaling van muizen en een snuifje teen in dienst. Juiste afstomping bevestigen wanneer de muis reageert niet tot teen snuifje. Dierenarts zalf toepassen op ogen om te voorkomen dat droogte terwijl onder verdoving.
  6. Plaats 1 muis tegelijk op een intubatie platform door opknoping haar voortanden met zijn rug tegen het platform.
  7. Verlichten van de bovenste borst met behulp van een glasvezel illuminator met visualisatie van de luchtpijp. Open de mond van de muis en trek de tong zachtjes met een steriele platte Tang.
  8. Het gebruik van een intraveneuze katheter zonder de naald te voorkomen blokkeren van de ademhaling. Standpunt de katheter over het witte licht uitgezonden van de opening van de luchtpijp.
  9. Plaats de katheter in de luchtpijp tot de bovenkant van de katheter de voortanden bereikt. Bevestig goede plaatsing van de katheter in de luchtpijp door het visualiseren van het witte licht schijnt door de opening van de katheter in de mond.
  10. Met behulp van een precisiepipet, afzien 50 µL van bleomycine of voertuig (PBS) rechtstreeks in de katheter om ervoor te zorgen dat het gehele volume wordt geïnhaleerd. Voer deze stap onder steriele omstandigheden.
  11. Als de katheter is correct ingevoegd, zal de muis onmiddellijk de inhoud van de katheter inhaleren. Wacht een paar seconden totdat het gehele volume naar beneden van de katheter reist. Dan verwijderen van de katheter uit de luchtpijp en gooi in 10% bleekwater oplossing.
    Opmerking: De gemiddelde tijd per muis stappen 2.7-2.11 is ongeveer 5 min.
  12. Als de muis de vloeistof niet inademen is, zorgvuldig controleren van ademhaling en pas de positie van de katheter. Als de muis ademhaling stopt, onmiddellijk verwijderen van de katheter en laat de muis om te hervatten ademhaling normaal vóór het opnieuw invoegen van de katheter.
  13. Plaats de ingespoten muis op een IACUC goedgekeurd verwarming pad op hun rug op een vlakke ondergrond voor herstel. De hele procedure duurt 10 min per muis. Een dier dat injectie aan het gezelschap van andere dieren tot volledig hersteld heeft ondergaan niet terugkeren.
  14. Plaats een "Gevaarlijke chemische in gebruik" kaart op de kooi voor 24 h.

3. toezicht op muizen na intubatie

  1. Controleren de muizen voor respiratoire nood onmiddellijk na intubatie en vervolgens elke 15 min tot muizen wakker uit de narcose. Laat geen muizen zonder toezicht totdat ze hebben herwonnen voldoende bewustzijn te handhaven sternale ligcomfort.
  2. Injecteren ketoprofen (5 mg/kg) intraperitoneally ter verzachting van de pijn.
  3. Controleer de muizen 24u post intubatie en 3 keer per week voor symptomen van de ziekte.
  4. Een register bijhouden van de datum van de procedure, identificatie van de dieren, type procedure, soort verdoving, en post-operatieve toezicht waarnemingen met tijden.
  5. Controleren van de muizen voor gewichtsverlies, respiratoire nood, gedrags afwijkingen en een body condition score < 2 (segmentatie van wervelkolom duidelijk/dorsale bekken beenderen zijn voelbaar) bi-wekelijkse na injectie van bleomycine.
  6. Euthanaseren muizen onder Ademhalings nood of muizen die 15% verlies van lichaamsgewicht door CO2 of ketamine/xylazine gevolgd door cervicale dislocatie hebben ervaren. Bevestig euthanasie door palpatie voor respiratoire activiteit uitvoeren.

4. engraftment van longkanker adenocarcinoom cellijnen.

Opmerking: Voer engraftment van cellen 14 dagen na de injectie van bleomycine (stap 2.1).

  1. Cellen om te groeien in 75 cm2 flacons ongestoord voor 3 dagen vóór de dag van injectie met bijbehorende media zoals in stap 1.3 toestaan.
    Opmerking: Moet ze 80% heuvels op de dag van injectie (die correspondeert met 2-3 x 106 in elke kolf afhankelijk van de cellijn).
  2. Wassen van de cellen groeien op 75 cm2 flacons met 5 mL PBS bij kamertemperatuur.
  3. PBS gecombineerd en voeg 1,5 mL trypsine aan de cellen en Incubeer de cellen bij 37 ° C, totdat de cellen los (meestal 2-5 min).
    Opmerking: We raden controleren elke 2 min voor mobiele-detachement van de plastic door eenvoudige visualisatie van de bodem van de kolf of onder een lichte Microscoop. 5 min van incubatie met trypsine niet overschrijden.
  4. Trypsine te neutraliseren door toevoeging van 4 mL medium met 10% FBS (dezelfde media als stap 4.1). Verzamelen van de cellen in een tube van 15 mL en Centrifugeer het bij 200 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
  5. De media gecombineerd en resuspendeer de pellet cel in 5 mL PBS te wassen van de cellen. Centrifugeer de cellen bij 200 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur te pellet cellen. Herhaal dit 1 keer.
  6. De PBS gecombineerd en resuspendeer de pellet in PBS 1,5 mL per fles.
  7. Meng 50 µL van het mengsel van de cel met 50 µL van trypan blauw en cellen met behulp van een cel teller/Hemocytometer kamer28tellen.
  8. Celsuspensie bereid door verdunning van de cellen in PBS te injecteren 1 x 105 cellen (of andere vermelde bedrag) in 50 µL per muis. Houden van de cellen op ijs vóór injectie.
    Opmerking: Bereiden minstens twee keer meer cellen voor injectie te vermijden van celsuspensie opraakt.
  9. Bereiden van verdoving door verder verdunnen van ketamine en xylazine om een eindconcentratie van 10 mg/mL en 1 mg/mL, respectievelijk, elke muis met behulp van een 1 mL spuit en 27 G naald, anesthetize door het injecteren van intraperitoneally ketamine/xylazine oplossing bij 100/10 mg/kg respectievelijk.
  10. Volgen van de ademhaling van muizen en een snuifje teen in dienst. Juiste afstomping bevestigen wanneer de muis reageert niet tot teen snuifje. Dierenarts zalf toepassen op ogen om te voorkomen dat droogte terwijl onder verdoving.
  11. Plaats 1 muis tegelijk op een intubatie platform door opknoping haar voortanden met zijn rug tegen het platform.
  12. Verlichten van de bovenste borst met behulp van een glasvezel illuminator met visualisatie van de luchtpijp.
  13. Resuspendeer de cellen voorzichtig met behulp van een precisiepipet van p200 om ervoor te zorgen dat ze geen klontjes uitmaken. Open de mond van de muis en trek de tong zachtjes met een steriele platte Tang.
  14. Gebruik een intraveneuze katheter met de naald verwijderd om te voorkomen dat het blokkeren van de ademhaling. Standpunt de katheter over het witte licht uitgezonden van de opening van de luchtpijp.
  15. Plaats de katheter in de luchtpijp tot de bovenkant van de katheter de voortanden bereikt. Bevestig goede plaatsing van de katheter in de luchtpijp door het visualiseren van het witte licht schijnt door de opening van de katheter in de mond.
  16. Met behulp van een precisiepipet, afzien 50 µL van cellen rechtstreeks in de katheter om ervoor te zorgen dat het gehele volume wordt geïnhaleerd. Voer deze stap onder steriele omstandigheden.
    Opmerking: Als de katheter is correct ingevoegd, de muis zal onmiddellijk inhaleren de inhoud van de katheter.
  17. Wacht een paar seconden totdat het gehele volume naar beneden van de katheter reist, en vervolgens de katheter uit de luchtpijp verwijderen en gooi in 10% bleekwater oplossing.
  18. Als de muis de vloeistof niet inademen is, zorgvuldig controleren van ademhaling en pas de positie van de katheter. Als de muis ademhaling stopt, onmiddellijk verwijderen van de katheter en laat de muis om te hervatten ademhaling normaal vóór het opnieuw invoegen van de katheter.
    Opmerking: De gemiddelde tijd per muis stappen 4.11-4.18 is ongeveer 5 min.
  19. Plaats de ingespoten muis op een IACUC goedgekeurd verwarming pad op hun rug op een vlakke ondergrond voor herstel.
    Opmerking: De hele procedure duurt 10 min per muis. Een dier dat injectie aan het gezelschap van andere dieren tot volledig hersteld heeft ondergaan niet terugkeren.
  20. De hele rib gebied beide ventrally scheren en dorsally van B6129SF1/J en andere stammen van de muis met donker haar met behulp van een elektrisch scheerapparaat voorafgaand aan de beeldvorming.
  21. 2-3 min na injectie van de cel, injecteren 100 µL van luciferine retro-orbitally (15 mg/mL) met behulp van een naald van insuline. Het oog gebruikt voor injectie elke imaging-sessie worden afgewisseld.
  22. Na ten minste 2 minuten, maximaal 5 muizen in een dierlijke bioluminescentie imager in de dorsale lighouding positie plaatsen en het verwerven van een ventrale foto met behulp van luminescentie instellingen29.
  23. Pas de instellingen voor resolutie en gevoeligheid voor het meten van de luminescentie van een bepaalde cellijn onder het control panel. Voor de meeste toepassingen starten met 3 min (of "Auto" als verzadigd), weggooien = Medium (4), F/Stop = 1, gezichtsveld = D, onderwerp hoogte = 1,50.
    Opmerking: Als de injectie geslaagd is, luminescentie signaal wordt gevonden in het gebied van de bovenste borst, in één Long of beide longen.
  24. Muizen op sternale lighouding positie spiegelen en het verwerven van een dorsale foto als hierboven.
    Opmerking: Als cel injectie is niet goed uitgevoerd, kunnen cellen cluster bij de ingang van de luchtpijp of in de nek.
  25. Injecteren van ketoprofen 5 mg/kg intraperitoneally om pijn te verlichten.
  26. Muizen teruggaan naar hun kooi en plaats een kaart "BSL-2 Agent in gebruik" op de kooi.
  27. Monitor muizen voor respiratoire nood onmiddellijk na intubatie, en vervolgens elke 15 min tot muizen wakker uit de narcose. Laat geen muizen zonder toezicht totdat ze hebben herwonnen voldoende bewustzijn te handhaven sternale ligcomfort.
  28. Onderzoeken de muizen 24u post intubatie en drie keer per week voor symptomen van de ziekte.
  29. Bijhouden in het logboek van de datum van de procedure, de identificatie van dieren, de soort procedure, soort verdoving en postoperatieve bewaking observaties en tijden.
  30. Controleren van muizen voor gewichtsverlies, respiratoire nood, gedrags afwijkingen en een body condition score < 2 (segmentatie van wervelkolom duidelijk/dorsale bekken beenderen zijn voelbaar) bi-wekelijkse na inoculatie van bleomycine.
    Opmerking: Muizen met longkanker tumoren kunnen vertonen irritatie van de luchtwegen, gewichtsverlies, cachexia en/of dood.
  31. Euthanaseren muizen onder Ademhalings nood of muizen die 15% verlies van lichaamsgewicht door CO2 of ketamine/xylazine gevolgd door cervicale dislocatie als het verzamelen van weefsels hebben ervaren. Bevestig euthanasie door palpatie voor respiratoire activiteit uitvoeren.

5. de bewaking van de tumorgroei door bioluminescentie Imaging

  1. Beeldvorming van de muizen op dag 3 na engraftment en wekelijkse daarna herhalen
  2. Anesthetize muizen door het injecteren van ketamine/xylazine (zoals beschreven in stappen 2.4-2.5) of geïnhaleerde Isofluraan (2%). Volgen van de ademhaling van muizen en een snuifje teen te bevestigen goede afstomping tewerkstellen. Dierenarts zalf toepassen op ogen om te voorkomen dat droogte terwijl onder verdoving.
  3. De hele rib gebied beide ventrally scheren en dorsally van B6129SF1/J en andere stammen van de muis met donker haar met behulp van een elektrisch scheerapparaat voorafgaand aan de beeldvorming.
  4. Zodra de muizen onder verdoving zijn, injecteren 100 µL van luciferine retro-orbitally (15 mg/mL) met behulp van een naald van insuline. Wacht 2 min. plaatsvervanger het oog gebruikt voor injectie elke imaging-sessie.
  5. Plaats van muizen in de imager en verwerven dorsale en ventrale beelden zoals beschreven in stappen 4,22-4.24.
  6. Plaats de muizen terug in de kooi achter imaging, op hun rug op een vlakke ondergrond voor herstel.
    Opmerking: De hele procedure duurt 5 min per groep van 5 muizen. Laat geen muizen zonder toezicht totdat ze hebben herwonnen voldoende bewustzijn te handhaven sternale ligcomfort.
  7. Het analyseren van de beelden met behulp van de imager/bioluminescentie analysesoftware.
    1. Selecteer de juiste beelden en laden van hen als een groep in de Bioluminescentie analysesoftware.
    2. Klik op ROI tool | plein toe te voegen een vierkante regio van belang (ROI). Plaats de ROI over de borst gebied, die betrekking hebben op het imago van de gehele Long. Herhaal dit voor elke afbeelding van de muis.
    3. Klik met de rechtermuisknop en selecteer kopiëren alle ROI functie de dezelfde ROI toepassen op alle afbeeldingen in de groep te positioneren in de borst van de muizen, zowel ventrale en dorsale weergaven.
    4. Selecteer in de linker bovenhoek van het afbeeldingsvenster, de fotonen -functie. Klik op de maatregel controle paneel functie voor het meten van de ROI. Kopieer en plak de uitvoertabel met totale flux (fotonen/s) in een software van de keuze om de gegevens verder te analyseren.
    5. Normaliseren de dagwaarde van de ROI van elke muis op de ROI waarde gemeten op dag 0.

6. de weefsels isolatie en verwerking.

  1. Anesthetize muizen door het injecteren van ketamine/xylazine (zoals beschreven in stappen 2.4-2.5 of door geïnhaleerde Isofluraan (2%). Volgen van de ademhaling van muizen en een snuifje teen in dienst. Juiste afstomping bevestigen wanneer de muis reageert niet tot teen snuifje. Dierenarts zalf toepassen op ogen om te voorkomen dat droogte terwijl onder verdoving.
  2. Retro-orbitally 100 µL van luciferine injecteren (15 mg/mL) met behulp van een naald van insuline. 2 min wachten.
  3. Afbeelding muizen na stappen 4,22-4.24 van dit protocol.
  4. Injecteren in het andere oog uit stap 6.2 luciferine retro-orbitally met behulp van een naald van de insuline voorafgaand aan de euthanasie een andere 100 µL.
  5. De muizen euthanaseren door intraperitoneale injectie van ketamine/xylazine (zie stap 2.4 voor details) gevolgd door cervicale dislocatie als muizen onder diepe verdoving overeenkomstig richtsnoeren van IACUC zijn. Bevestig euthanasie door palpatie voor respiratoire activiteit uitvoeren.
  6. Met behulp van steriele chirurgische schaar maken een huid incisie onder het borstbeen. De spier laag langs het diafragma met behulp van Tang en chirurgische scharen open en bloot de borstholte door doorsnijden de ribbenkast op een van de laterale zijden het vermijden van het interne thoracale slagaders.
  7. Perfuse van de muis door een kleine snede in de juiste atrium van het hart en 5 mL PBS via het linkerventrikel te injecteren. De kleur van longweefsel gaat van rood naar bleke roze-wit als de bloedverspreiding naar behoren wordt gedaan.
  8. De longen van de borstholte zorgvuldig accijnzen door grijpen de slokdarm of het hart met een tang. Zachtjes trekken van het weefsel en het gebruik van chirurgische schaar te zorgvuldig snijden aansluitende weefsel vermijden aanprikken van het longweefsel. Behoud de luchtpijp zoveel mogelijk voor de inflatie van de luchtwegen van de longen in een later stadium.
  9. Wassen van de longen door dompelen en wervelende het weefsel 3 keer in een 6 goed bord gevuld met 3 mL PBS te verwijderen overtollige bloed.
  10. Plaats van de longen op het deksel van een 6 goed plaat, en plaats de deksel met het weefsel in de bioluminescente imager en verwerven een verlichte afbeelding30.
    Opmerking: We raden de volgende instellingen uit de "overname control panel" selecteren "gezichtsveld = A" en "onderwerp hoogte = 0,75 cm" en vervolgens "Auto blootstelling" vermijden wordend verzadigde afbeeldingen.
  11. Accijnzen en beeld van andere organen, zoals in stap 6,9-6.10, waar de uitzaaiing zijn geïdentificeerd door luminescentie, zoals hersenen, lever, bijnier, bot, lymfklieren, nieren of milt31gedaan.
  12. Perfuse de Long met 1 mL 4% paraformaldehyde door het invoegen van de naald in de luchtpijp van de muis. De longen zal opblazen als goed perfused.
    Let op: 4% paraformaldehyde is een giftige, een gezondheid gevaren van GHS07 en GHS08.
  13. Breng de longen in een met 5 mL 4% paraformaldehyde conische 15 mL.
  14. Het oplossen van de longen of andere weefsels door het weefsel met 4% paraformaldehyde's nachts bij 4 ° C in een schudden apparaat bij 30-50 rpm aan het broeden.
  15. Longen (of andere weefsels) insluiten in paraffine of snijden van de optimale temperatuur samengestelde afhankelijk van de toepassing-32.
    Opmerking: Paraffine is de voorkeursmethode voor het behoud van de structuur van de longen en voor Masson Trichrome en Haematoxyline-eosine-kleuring.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het vergroten van de efficiëntie van LUAD kanker cel engraftment in de longen van muizen, ontwikkelden we een protocol dat eerst vooraf de voorwaarden van de luchtwegen met behulp van bleomycine gevolgd door orthotopic tumor cel injectie (Figuur 1). We hebben bevestigd dat zelfs indien toegediend in immuungecompromitteerde athymic muizen, bleomycine voorbijgaande fibrose geïnduceerd door dag 14 blijkens door verlies van airway architectuur en verhoogde collag...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opvallende klinische parallellen zijn gedocumenteerd tussen longkanker en andere chronische ziekten van de Long-36. Met name patiënten met idiopathische longfibrose (IPF) hebben een verhoogde voorliefde voor ontwikkelende longkanker, en deze vereniging is onafhankelijk van roken geschiedenis37,38. IPF wordt gekenmerkt door progressieve vernietiging van Long architectuur en verminderde ademhalingsfunctie door afzetting van ECM

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd gefinancierd door subsidies van het National Cancer Institute (R01CA166376 en R01CA191489 te D.X. Nguyen) en het ministerie van defensie (W81XWH-16-1-0227 te D.X. Nguyen).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
BleomycinSigmaB5507-15UNCAUTION Health hazard GHS08
Exel Catheter 24GFisher1484121Verwijder de naald. Voor intratracheale injectie
Ketamine (Ketaset inl 100 mg/mL C3N 10 mL)Butler Schein56344Om muizen te anesthetiseren
XylazineButler Schein33198Om muizen te anesthetiseren
Ketoprofen, 5,000 mgCayman Chemical10006661Analgetisch
Puralube Veterinary Ophthalmic OintmentBUTLER ANIMAL HEALTH COMPANY LLC8897Om droge ogen onder anesthesie te voorkomen
D-Luciferin poederPerkin Elmer Health Sciences Inc122799Voor luminescente beeldvorming. Herstel het poeder met PBS voor een werkconcentratie van 15mg/mL. Bescherm tegen licht
Rodent Intubation standBraintree ScientificRIS-100Aanbevolen stand voor intratracheale injectie
MI-150 ILLUMINATOR 150W MI-150DOLAN-JENNER INDUSTRIESMI-150 / EEG2823MOm de luchtpijp te verlichten en visualiseren
Graefe Forceps, 2.75 (7 cm) long serratRobozRS-5111Voor intratracheale injectie
Syringe Luer-Lok Sterile 5mlBD / Fisher309646
Satiny Smooth by Conair Dual Foil Wet/Dry Rechargeable ShaverConair-Om muizen te scheren
Bonn Scissors, 3.5" straight 15 mm sharp/sharp sure cut bladesRobozRS-5840SC
15 mL conische buisBD / Fisher352097
1.5 mL centrifugebuizenUSA SCIENTIFIC INC1615-5500
Vial Scintillatie 7 mL Borosilicaatglas GPIFisher701350
Filter pipette tips (200 μL)USA SCIENTIFIC INC1120-8710
Fosfaat gebufferde zoutoplossingLife Technologies14190-144
0.25% Trypsin-EDTALife Technologies25200-056
DMEM hoge glucoseLife Technologies11965-092
RPMI Medium 1640Life Technologies11875-093
Fetaal bovien serum USDALife Technologies10437-028
Penicilline-StreptomycineLife Technologies15140-122
Amphotericin BSigmaA2942-20ML
Trypan Blauwe Kleurstof 0,4%Life Technologies15250-061
Countess Geautomatiseerde CeltellerLife TechnologiesAMQAX1000
Flask T/C 75cm vierkante hals, blauwe dopFisher / Corning353135
IVIS Spectrum Xenogen BioluminescentiePerkin Elmer Health Sciences Inc124262Voor in vivo bioluminescentie beeldvorming
Living Image softwarePerkin Elmer Health Sciences Inc128113Voor in vivo bioluminescentie analyse
XGI-8 Gas Anesthesie SysteemPerkin Elmer Health Sciences Inc118918Voor Isofluraan anesthesie
BD Ultra-Fine II Korte Naald Insuline Spuit 1 cc. 31 G x 8 mm (5/16 in)BD / FisherBD328418Voor retro-orbitale luciferine injectie
Spuit 1mlBD / Fisher14-823-434Voor intraperitoneale injecties
26 G x 1/2 in. naaldBD / Fisher305111Voor intraperitoneale injecties
4% ParaformaldehydeVWR43368-9MCAUTION Health hazard GHS07, GHS08. Voor het fixeren van weefsel
Pipet-Lite Pipet, Unv. SL-200XLS+METTLER-TOLEDO INTERNATIONAL17014411
Mayer's HematoxylineELECTRON MICROSCOPY SCIENCES517-28-2
Eosin Y kleurstof 0,25% (w/v) in 57%Fisher67-63-0
Masson Trichrome Stain KitIMEB IncK7228Voor Masson trichrome kleurstof om collageen te visualiseren
Superfrost plus glasplatenFisher1255015
6 welpenplaatCorningC3516
Universele Mycoplasma Detectie KitATCC30-1012K
OCT InbeddingscompoundELECTRON MICROSCOPY SCIENCES62550-12Voor het inbedden van weefsel voor bevroren secties
Leica CM3050 S Research CryostatLeicaCM3050 SOm weefsel te snijden voor bekleuringsanalyse
Keyence All-in One Fluorescerende MicroscoopKeyenceBZ-X700
ImageJUS National Institutes of HealthIJ1.46http://rsbweb.nih.gov/ij/ download.html
Prism 7.0 voor Mac OS XGraphPad Software, Inc.-
Athymic (Crl:NU(NCr)-Foxn1nu) muizenCharles RiverNIH-553
NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) muizenJackson Laboratories5557
B6129SF1/J muizenJackson Laboratories101043
NIH-H2030 cellenATCCCRL-5914
368T1vriendelijk verstrekt door Monte Winslow (Standford University)-
PC9 cellenNguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62-
H2030 BrM3 cellenNguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62-

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2015. CA-Cancer J Clin. 65, 5-29 (2015).
  2. Gaspar, L. E. Brain metastases in lung cancer. Expert Rev Anticanc. 4, 259-270 (2004).
  3. Hess, K. R., et al. Metastatic patterns in adenocarcinoma. Cancer. 106, 1624-1633 (2006).
  4. Hoffman, P. C., Mauer, A. M., Vokes, E. E. Lung cancer. Lancet. 355, 479-485 (2000).
  5. Travis, W. D. Pathology of lung cancer. Clin Chest Med. 23 (1), 65-81 (2002).
  6. Chen, Z., Fillmore, C. M., Hammerman, P. S., Kim, C. F., Wong, K. K. Non-small-cell lung cancers: a heterogeneous set of diseases. Nat Rev Cancer. 14, 535-546 (2014).
  7. Kim, C. F., et al. Mouse models of human non-small-cell lung cancer: raising the bar. Cold Spring Harb Sym. 70, 241-250 (2005).
  8. Meuwissen, R., Berns, A. Mouse models for human lung cancer. Gene Dev. 19, 643-664 (2005).
  9. Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response. Nature. 501, 346-354 (2013).
  10. Nguyen, L. V., Vanner, R., Dirks, P., Eaves, C. J. Cancer stem cells: an evolving concept. Nat Rev Cancer. 12, 133-143 (2012).
  11. Minchinton, A. I., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumours. Nat Rev Cancer. 6, 583-592 (2006).
  12. Leblond, A. L., et al. Developing cell therapy techniques for respiratory disease: intratracheal delivery of genetically engineered stem cells in a murine model of airway injury. Hum Gene Ther. 20, 1329-1343 (2009).
  13. Vaughan, A. E., et al. Lineage-negative progenitors mobilize to regenerate lung epithelium after major injury. Nature. 517, 621-625 (2015).
  14. Zuo, W., et al. p63(+)Krt5(+) distal airway stem cells are essential for lung regeneration. Nature. 517, 616-620 (2015).
  15. Mahoney, J. E., Kim, C. F. Tracing the potential of lung progenitors. Nat Biotechnol. 33, 152-154 (2015).
  16. Wang, D., Morales, J. E., Calame, D. G., Alcorn, J. L., Wetsel, R. A. Transplantation of human embryonic stem cell-derived alveolar epithelial type II cells abrogates acute lung injury in mice. Mol Ther. 18, 625-634 (2010).
  17. Ortiz, L. A., et al. Mesenchymal stem cell engraftment in lung is enhanced in response to bleomycin exposure and ameliorates its fibrotic effects. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 8407-8411 (2003).
  18. Suzuki, K., et al. Prognostic significance of the size of central fibrosis in peripheral adenocarcinoma of the lung. Ann Thorac Surg. 69, 893-897 (2000).
  19. Cancer Genome Atlas Research, N. Comprehensive molecular profiling of lung adenocarcinoma. Nature. 511, 543-550 (2014).
  20. Scotton, C. J., Chambers, R. C. Bleomycin revisited: towards a more representative model of IPF? Am J Physiol-Lung C. 299, L439-L441 (2010).
  21. Hay, J., Shahzeidi, S., Laurent, G. Mechanisms of bleomycin-induced lung damage. Arch Toxicol. 65, 81-94 (1991).
  22. Vaccaro, C. A., Brody, J. S., Snider, G. L. Alveolar wall basement membranes in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Am Rev Respir Dis. 132, 905-912 (1985).
  23. Venkatesan, N., Ebihara, T., Roughley, P. J., Ludwig, M. S. Alterations in large and small proteoglycans in bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats. Am J Resp Crit Care. 161, 2066-2073 (2000).
  24. Moore, B. B., Hogaboam, C. M. Murine models of pulmonary fibrosis. Am J Physiol-Lung C. 294, L152-L160 (2008).
  25. Izbicki, G., Segel, M. J., Christensen, T. G., Conner, M. W., Breuer, R. Time course of bleomycin-induced lung fibrosis. Int J Exp Pathol. 83, 111-119 (2002).
  26. Schrier, D. J., Phan, S. H., McGarry, B. M. The effects of the nude (nu/nu) mutation on bleomycin-induced pulmonary fibrosis. A biochemical evaluation. Am Rev Respir Dis. 127, 614-617 (1983).
  27. Ponomarev, V., et al. A novel triple-modality reporter gene for whole-body fluorescent, bioluminescent, and nuclear noninvasive imaging. Eur J Nucl Med Mol I. 31, 740-751 (2004).
  28. Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell. J. Vis. Exp. , (2016).
  29. Tseng, J. C., Kung, A. L. Quantitative bioluminescence imaging of mouse tumor models. Cold Spring Harbor protocols. , pdb prot078261 (2015).
  30. Byrne, F. L., McCarroll, J. A., Kavallaris, M. Analyses of Tumor Burden In Vivo and Metastasis Ex Vivo Using Luciferase-Expressing Cancer Cells in an Orthotopic Mouse Model of Neuroblastoma. Methods Mol Biol. 1372, 61-77 (2016).
  31. Parkinson, C. M., et al. Diagnostic necropsy and selected tissue and sample collection in rats and mice. J. Vis. Exp. , (2011).
  32. Tammela, T., et al. A Wnt-producing niche drives proliferative potential and progression in lung adenocarcinoma. Nature. 545, 355-359 (2017).
  33. DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nat Protoc. 4, 1064-1072 (2009).
  34. Byrne, A. T., et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nat Rev Cancer. 17, 254-268 (2017).
  35. Nguyen, D. X., et al. WNT/TCF signaling through LEF1 and HOXB9 mediates lung adenocarcinoma metastasis. Cell. 138, 51-62 (2009).
  36. Raghu, G., Nyberg, F., Morgan, G. The epidemiology of interstitial lung disease and its association with lung cancer. Brit J Cancer. 91, Suppl 2. S3-S10 (2004).
  37. Hubbard, R., Venn, A., Lewis, S., Britton, J. Lung cancer and cryptogenic fibrosing alveolitis. A population-based cohort study. Am J Resp Crit Care. 161, 5-8 (2000).
  38. Nagai, A., Chiyotani, A., Nakadate, T., Konno, K. Lung cancer in patients with idiopathic pulmonary fibrosis. Tohoku J Exp Med. 167, 231-237 (1992).
  39. Rock, J. R., et al. Multiple stromal populations contribute to pulmonary fibrosis without evidence for epithelial to mesenchymal transition. Proc Natl Acad Sci USA. 108, E1475-E1483 (2011).
  40. Saito, Y., et al. Survival after surgery for pathologic stage IA non-small cell lung cancer associated with idiopathic pulmonary fibrosis. Ann Thorac Surg. 92, 1812-1817 (2011).
  41. Stevens, L. E., et al. Extracellular Matrix Receptor Expression in Subtypes of Lung Adenocarcinoma Potentiates Outgrowth of Micrometastases. Cancer Res. 77, 1905-1917 (2017).
  42. Harrison, J. H., Lazo, J. S. High dose continuous infusion of bleomycin in mice: a new model for drug-induced pulmonary fibrosis. J Pharmacol Exp Ther. 243, 1185-1194 (1987).
  43. Shcherbo, D., et al. Bright far-red fluorescent protein for whole-body imaging. Nature Methods. 4, 741-746 (2007).
  44. Aso, Y., Yoneda, K., Kikkawa, Y. Morphologic and biochemical study of pulmonary changes induced by bleomycin in mice. Lab Invest. 35, 558-568 (1976).
  45. Kim, C. F., et al. Identification of bronchioalveolar stem cells in normal lung and lung. Cell. 121, 823-835 (2005).
  46. Fichtner, I., et al. Establishment of patient-derived non-small cell lung cancer xenografts as models for the identification of predictive biomarkers. Clin Cancer Res. 14, 6456-6468 (2008).
  47. Zhang, X. C., et al. Establishment of patient-derived non-small cell lung cancer xenograft models with genetic aberrations within EGFR, KRAS and FGFR1: useful tools for preclinical studies of targeted therapies. J Transl Med. 11, 168(2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Bleomycine preconditioneringtumorcel engraftmentlongadenocarcinoommodelintratracheale injectiebioluminescentie imagingvariabiliteit van muizenstammendetectie van metastaseninductie van fibrosexenograft tumormodellen

Gerelateerde artikelen