Preconditionering de luchtwegen van muizen met bleomycine verhoogt de efficiëntie van Orthotopic long kanker cel Engraftment

Summary

Beschrijven we een methode om engraftment van de orthotopic van longkanker kankercellen in de longen lymfkliertest aanzienlijk te verbeteren door preconditionering van de luchtwegen met blessure. Deze benadering kan ook worden toegepast om te studeren stromale interacties binnen de longen communicatie, gemetastaseerde verspreiding, long kanker co morbiditeit en efficiënter genereren patiënt afgeleid xenografts.

Abstract

Longkanker is een dodelijke behandeling vuurvaste ziekte die biologisch heterogeen is. Om te begrijpen en effectief behandelen het volledige klinische spectrum van thoracale maligniteiten, zijn extra dierlijke modellen die diverse menselijke long kanker subtypen en stadia kunnen recapituleren nodig. Allograft of xenograft modellen zijn veelzijdig en inschakelen van de kwantificering van tumorigene capaciteit in vivo, met behulp van kwaadaardige cellen van lymfkliertest of menselijke oorsprong. Echter zijn eerder beschreven methoden voor long kanker cel engraftment uitgevoerd in niet-fysiologische sites, zoals de flank van muizen, te wijten aan de inefficiëntie van orthotopic transplantatie van cellen in de longen. In deze studie beschrijven we een methode ter verbetering van orthotopic long kanker cel engraftment door preconditionering de luchtwegen van muizen met de fibrose inducerend agent bleomycine. Als een experiment van proof-of-concept, wij deze aanpak om het engraft van tumorcellen van het Long adenocarcinoom subtype, verkregen uit de muis of menselijke bronnen, in verschillende muizenstammen toegepast. We laten zien dat het verwonden van de luchtwegen met bleomycine vóór tumor cel injectie de engraftment van tumorcellen van 0-17 verhoogt % tot 71-100%. Deze methode verbeterde aanzienlijk, Long tumor incidentie en verdere uitgroei met behulp van verschillende modellen en muis stammen. Daarnaast verspreiden werk Long kankercellen uit de longen in relevante verre organen. Dus, wij bieden een protocol dat kan worden gebruikt om te stellen en onderhouden van nieuwe modellen van de orthotopic van longkanker met beperking van de hoeveelheid cellen of biospecimen en kwantitatief beoordelen de tumorigene capaciteit van Long kankercellen in fysiologisch relevante instellingen .

Introduction

Longkanker is de belangrijkste oorzaak van kanker gerelateerde sterfgevallen wereldwijd¹. Patiënten met longkanker bezwijken uiteindelijk van metastase tot verre organen, met name aan het centraal zenuwstelsel, lever, bijnieren en botten^2,3,4. Thoracale maligniteiten zijn traditioneel ingedeeld als kleincellige longkanker (SCLC) of niet-kleincellige longkanker kanker (NKCLK)⁵. NKCLK is de meest vaak gediagnosticeerd maligniteit en kan worden onderverdeeld in verschillende histologische subtypes, met inbegrip van adenocarcinoom v....

Protocol

Alle experimenten werden uitgevoerd volgens protocollen die zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) aan de Yale University.

1. instellen / voorbereiding van de reagentia.

1. Bleomycine
   Let op: Gebaseerd op het wereldwijd geharmoniseerde systeem (GHS) van de indeling en etikettering van chemische stoffen, is Bleomycine geclassificeerd als een gevaar voor de gezondheid van GHS08.
   1. Bleomycine in een chemische kap voor te bereiden. Resuspendeer 15 U in 5 mL steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
   2. Aliquot 100-200 µL van de oplossing in glazen flesjes en b....

Results

Het vergroten van de efficiëntie van LUAD kanker cel engraftment in de longen van muizen, ontwikkelden we een protocol dat eerst vooraf de voorwaarden van de luchtwegen met behulp van bleomycine gevolgd door orthotopic tumor cel injectie (Figuur 1). We hebben bevestigd dat zelfs indien toegediend in immuungecompromitteerde athymic muizen, bleomycine voorbijgaande fibrose geïnduceerd door dag 14 blijkens door verlies van airway architectuur en verhoogde collag.......

Discussion

Opvallende klinische parallellen zijn gedocumenteerd tussen longkanker en andere chronische ziekten van de Long-³⁶. Met name patiënten met idiopathische longfibrose (IPF) hebben een verhoogde voorliefde voor ontwikkelende longkanker, en deze vereniging is onafhankelijk van roken geschiedenis^37,38. IPF wordt gekenmerkt door progressieve vernietiging van Long architectuur en verminderde ademhalingsfunctie door afzetting van ECM

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bleomycin	Sigma	B5507-15UN	CAUTION Health hazard GHS08
Exel Catheter 24G	Fisher	1484121	Remove needle. For intratracheal injection
Ketamine (Ketaset inl 100 mg/mL C3N 10 mL)	Butler Schein	56344	To anesthetize mice
Xylazine	Butler Schein	33198	To anesthetize mice
Ketoprofen, 5,000 mg	Cayman Chemical	10006661	Analgesic
Puralube Veterinary Ophthalmic Ointment	BUTLER ANIMAL HEALTH COMPANY LLC	8897	To prevent eye dryness while under anesthesia
D-Luciferin powder	Perkin Elmer Health Sciences Inc	122799	For luminescent imaging. Reconstitute powder with PBS for a working concentration of 15mg/mL. Protect from Light
Rodent Intubation stand	Braintree Scientific	RIS-100	Recommended stand for intratracheal injection
MI-150 ILLUMINATOR 150W MI-150	DOLAN-JENNER INDUSTRIES	MI-150 / EEG2823M	To illuminate and visualize trachea
Graefe Forceps, 2.75 (7 cm) long serrat	Roboz	RS-5111	For intratracheal injection
Syringe Luer-Lok Sterile 5ml	BD / Fisher	309646
Satiny Smooth by Conair Dual Foil Wet/Dry Rechargeable Shaver	Conair	-	To shave mice
Bonn Scissors, 3.5" straight 15 mm sharp/sharp sure cut blades	Roboz	RS-5840SC
15 mL conical tube	BD / Fisher	352097
1.5 mL centrifuge tubes	USA SCIENTIFIC INC	1615-5500
Vial Scintillation 7 mL Borosilicate Glass GPI	Fisher	701350
Filter pipette tips (200 μL)	USA SCIENTIFIC INC	1120-8710
Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	14190-144
0.25% Trypsin-EDTA	Life Technologies	25200-056
DMEM high glucose	Life Technologies	11965-092
RPMI Medium 1640	Life Technologies	11875-093
Fetal bovine serum USDA	Life Technologies	10437-028
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	15140-122
Amphotericin B	Sigma	A2942-20ML
Trypan Blue Stain 0.4%	Life Technologies	15250-061
Countess Automated Cell Counter	Life Technologies	AMQAX1000
Flask T/C 75cm sq canted neck, blue cap	Fisher / Corning	353135
IVIS Spectrum Xenogen Bioluminiscence	Perkin Elmer Health Sciences Inc	124262	For in vivo bioluminescence imaging
Living image software	Perkin Elmer Health Sciences Inc	128113	For in vivo bioluminescence analysis
XGI-8 Gas Anesthesia System	Perkin Elmer Health Sciences Inc	118918	For Isoflurane anesthesia
BD Ultra-Fine II Short Needle Insulin Syringe 1 cc. 31 G x 8 mm (5/16 in)	BD / Fisher	BD328418	For retro-orbital luciferin injection
Syringe 1ml	BD / Fisher	14-823-434	For intraperitoneal injections
26 G x 1/2 in. needle	BD / Fisher	305111	For intraperitoneal injections
4% Paraformaldehyde	VWR	43368-9M	CAUTION Health hazard GHS07, GHS08. For fixing tissue
Pipet-Lite Pipette, Unv. SL-200XLS+	METTLER-TOLEDO INTERNATIONAL	17014411
Mayer's Hematoxylin	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	517-28-2
Eosin Y stain 0.25% (w/v) in 57%	Fisher	67-63-0
Masson Trichrome Stain Kit	IMEB Inc	K7228	For masson trichrome stain to visualize collagen
Superfrost plus glass slides	Fisher	1255015
6 well plate	Corning	C3516
Universal Mycoplasma Detection Kit	ATCC	30-1012K
OCT Embedding compound	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	62550-12	For embedding tissue for frozen sections
Leica CM3050 S Research Cryostat	Leica	CM3050 S	To section tissue for staining analysis
Keyence All-in One Fluorescence Microscope	Keyence	BZ-X700
ImageJ	US National Institutes of Health	IJ1.46	http://rsbweb.nih.gov/ij/ download.html
Prism 7.0 for Mac OS X	GraphPad Software, Inc.	-
Athymic (Crl:NU(NCr)-Foxn1nu) mice	Charles River	NIH-553
NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) mice	Jackson Laboratories	5557
B6129SF1/J mice	Jackson Laboratories	101043
NIH-H2030 cells	ATCC	CRL-5914
368T1	generously provided by Monte Winslow (Standford University)	-
PC9 cells	Nguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62	-
H2030 BrM3 cells	Nguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62	-