Ruimtelijke en temporele controle van T cel activatie met behulp van een Photoactivatable-Agonist

Summary

Dit protocol beschrijft een imaging gebaseerde methode om te activeren met behulp van photoactivatable peptide-MHC, waardoor nauwkeurige Spatio controle van T cel activatie van T-lymfocyten.

Abstract

T-lymfocyten zich bezighouden met het snelle, gepolariseerde signalering, die zich voordoen binnen enkele minuten na activering van de TCR. Dit induceert de vorming van de immunologische SYNAPS, een stereotiepe cel-cel-knooppunt dat regelt van T cel activatie en gerichte doelen effector reacties. Deze processen effectief studeren, is een imaging aanpak die is aangepast voor het vastleggen van snelle, gepolariseerde antwoorden nodig. Dit protocol beschrijft een dergelijk systeem, dat gebaseerd is op een photoactivatable peptide-major histocompatibility complex (pMHC) dat is niet-stimulerend totdat het wordt blootgesteld aan ultraviolet licht. Gerichte decaging van dit reagens tijdens videomicroscopy experimenten kan nauwkeurige Spatio controle van TCR activering en hoge resolutie controle van latere cellulaire reacties door de totale interne reflectie (TIRF) imaging. Deze aanpak is ook compatibel met genetische en farmacologische perturbation strategieën. Dit zorgt voor de vergadering van welomschreven moleculaire trajecten die link TCR signalering tot de vorming van de gepolariseerde cytoskeletal structuren die ten grondslag liggen aan de immunologische synaps.

Introduction

T-lymfocyten (T-cellen) spelen een centrale rol in de cellulaire immuniteit door de erkenning van de antigene peptiden in het kader van het celoppervlak MHC weergegeven. Antigeen erkenning, dat is bemiddeld door de TCR, drijft de differentiatie van naïeve T cellen en bevordert de levering van de cytolytische en communicatieve antwoorden van effector populaties. TCR betrokkenheid induceert ook dramatische veranderingen in cellulaire architectuur. Binnen enkele minuten de T-cellen gloms op de kant van de antigeen-presenteren cel (APC), vormen een gepolariseerde interface genoemd de immunologische synapse (IS)^1,2....

Protocol

1. bereiding van stimulerend glazen oppervlakken

1. Jas acht-well chambered dekglaasje met biotinyleerd poly-L-lysine (Bio-PLL) verdund 1:500 in gedestilleerd, gedeïoniseerd water (ddH₂van O). Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT).
2. Wassen met H₂O.
3. Droog voor 2 h op RT.
4. Blok Bio-PLL gecoate oppervlakken met een blokkeerbuffer (HEPES-gebufferde zoutoplossing [10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl], met 2% BSA) voor 30 min op RT.
   1. Los 5 mg poly-L-lysine hydrobromide in 1 mL 10 mM NaPO₄, pH 8,5.
   2. Voeg 125 μmol (0.55 mg) van de NHS-Biotine (uit een voorraad van 100 mg/mL in D....

Results

De photoactivation en imaging aanpak zorgt voor observatie en facile kwantificering van snelle, gepolariseerde signalering antwoorden. Ter illustratie van de mogelijkheden, gereproduceerd hier is een experiment dat onderzoekt de spatio correlatie tussen TCR-geïnduceerde DAG accumulatie en centrosoom heroriëntatie. 5C. Waren retrovirally getransduceerde C7 T cel ontploffing met twee fluorescerende verslaggevers: een DAG biosensor met de tandem C1 domeinen van proteïne kinase C-θ gekoppeld .......

Discussion

In de afgelopen jaren heeft licht ontpopt als een uitstekend hulpmiddel voor spatiotemporally gecontroleerde activering van cellulaire processen. Verschillende methoden zijn ontwikkeld, elk met de bijbehorende voordelen en nadelen. Het systeem hier beschreven, die is gebaseerd op de decaging van geïmmobiliseerdet, extracellulaire ligand, is bij uitstek geschikt voor de analyse van snelle, subcellular, gepolariseerde signalering reacties. Deze aanpak is vereffend te onderzoeken IS vorming in T cellen zoals hierboven besch.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass	Thermofischer Scientific	155361
Poly-L-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P2636	Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine
EZ-Link NHS-Biotin	Thermofischer Scientific	20217	Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine
Streptavidin	Thermofischer Scientific	434301
BirA-500: BirA biotin-protein ligase standard reaction kit	Avidity	BirA500	Will be used to biotinylate proteins
Biotinylated Hb I-EK			For protein folding, see reference 6. For biotinylation, use BirA kit
Biotinylated NPE-MCC I-EK	Anaspec		Custom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) can be purchased from Anaspec
Biotinylated αH2-Kk antibody	BD Biosciences	553591
Biotinylated NPE-OVA H2-Kb	Anaspec		Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) can be purchased from Anaspec
Biotinylated KAVY H2-Db	Anaspec		Custom synthesized protein (KAVYDFATL) can be purchased from Anaspec
Biotinylated ICAM1			For protein folding, see reference in protocol. For biotinylation, use BirA kit
Hand held UV lamp	UVP	UVGL-25	Lamp is held < 1 cm from the sample.  30 s of 365 light is sufficient for detectable decaging, 20 min for quantitative decaging.
Olympus IX-81 OMAC TIRF system.	Olympus		Additional information about the imaging system can be found in Figure 6
Mosaic digital diaphragm	Andor
Slidebook software	Intelligent Imaging Innovations