Immuno-belichting fluorescerende etikettering van microtubuli en Centrosomal eiwitten in Ex Vivo intestinale weefsel en 3D In Vitro intestinale Organoids

Summary

Presenteren wij protocollen voor isolatie van intestinale 3D structuren uit weefsel in vivo en in vitro kelder matrix ingesloten organoids, en detail verschillende fixatie en kleuring van protocollen die zijn geoptimaliseerd voor immuno-labeling van microtubuli, centrosomal en regulates eiwitten zo goed zoals markeringen met inbegrip van de stamcel proteïne Lgr5 cel.

Abstract

De komst van 3D in vitro organoids die na te de in vivo weefsel architectuur en de voedselproductie bootsen is sterk vooruitgegaan de mogelijkheid te bestuderen van biologische kernvragen in cel en ontwikkelingsbiologie. Bovendien belooft organoids samen met de recente technische vooruitgang in gen bewerken en virale gen levering medisch onderzoek en de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen voor de behandeling van ziekten te bevorderen. Organoids gekweekt in vitro in kelder matrix krachtige modelsystemen verschaffen voor de studie van het gedrag en de functie van verschillende eiwitten en zijn geschikt voor wonen-imaging van TL-gelabelde proteïnen. Echter, tot oprichting van de expressie en de localisatie van de endogene eiwitten in weefsel ex vivo en in vitro organoids is belangrijk om te controleren of het gedrag van de tagged eiwitten. Te dien einde hebben we ontwikkeld en weefsel afzondering, fixatie en immuno-labeling protocollen voor lokalisatie van microtubuli, centrosomal en bijbehorende eiwitten in de intestinale weefsel ex vivo en in vitro intestinale organoids bewerkt. Het doel was voor de fixeerspray voor het behoud van de 3D-architectuur van het organoids/weefsel terwijl ook het behoud van antilichaam antigenicity en het inschakelen van goede doordringing en Goedkeuringvande fixeer en antilichamen. Blootstelling aan koude depolymerizes alles behalve stabiel microtubuli, en dit was een belangrijke factor bij het wijzigen van de verschillende protocollen. We vonden dat verhoging van de ethyleendiamminetetra (EDTA) zuurconcentratie van 3 mM tot 30 mM gaf efficiënte detachement van villi en crypten in de dunne darm, terwijl 3 mM EDTA volstond voor Colon crypten. Het ontwikkelde formaldehyde/methanol fixatie protocol gaf zeer goede structurele behoud ook behoud van antigenicity voor effectieve etikettering van microtubuli, actine en de einde-bindende (EB) eiwitten. Het werkte ook voor de centrosomal proteïne ninein hoewel het methanol-protocol consistenter gewerkt. We verder vastgesteld dat fixatie en immuno-labeling van microtubuli en bijbehorende proteïnen kunnen worden bereikt met organoids van geïsoleerd of resterende binnen de kelder-matrix.

Introduction

Vorming van epitheel met apico-basale polariteit is een fundamentele proces in ontwikkeling en houdt een drastische reorganisatie van de microtubuli en centrosomal eiwitten. Een radiale microtubulus-matrix die afkomstig zijn van een centraal gelegen centrosomal microtubulus organiseren center (MTOC) is prominent in de vele dierlijke cellen en dit is zeer geschikt voor relatief platte cellen. In tegenstelling, assembleren in kolomvorm epitheliale cellen, zoals die van de darm, niet-radial transcellulair microtubulus matrices die de vorm en de gespecialiseerde functies van deze cellen beter te ondersteunen. Deze dramatische reorganisatie van de microtubuli wordt bereikt door de centrosoom overgang op de apex en apicaal niet-centrosomal MTOCs (n-MTOCs) vormen, wordt verantwoordelijk voor het bevestigingspunt voor de transcellulair microtubuli^{1,2 , 3 , 4 , 5}.

Veel van onze kennis van epitheliale differentiatie en de bijbehorende microtubulus reorganisatie kwam uit de onderzoeken van 2D in vitro cel lagen, die niet de in vivo weefsel architectuur weergeven. Ontwikkeling van 3D in vitro organoid culturen, gepionierd door Clevers en medewerkers⁶, vormt een grote technologische vooruitgang zoals ze in vivo architectuur en ontwikkeling nabootsen. Een hiërarchie van epitheliale differentiatie is duidelijk in de darm; stamcellen aan de onderkant van de crypten geven aanleiding tot onvolwassen transit sturen cellen vermenigvuldigen en geleidelijk onderscheiden als ze van de crypte op de kleine intestinale villosités of Colon oppervlak migreren, waar ze volledig worden gedifferentieerd voorafgaand aan wordt schuur in de lumen-⁷. Nog belangrijker is, wordt dit gerepliceerd in de intestinale organoids waar cellen uit de cel van de stam niche zelftappende cysten die vervolgens genereren crypt-achtige toppen met stamcellen aan de onderkant en de differentiatie geleidelijk op weg naar de regio van de cyste, vermenigvuldigen die villosités-achtige⁸wordt. De intestinale organoid vertegenwoordigt daarom een krachtig model niet alleen microtubulus en reorganisatie van de centrosomal tijdens de epitheliale differentiatie maar talrijke andere proteïnen, evenals het verstrekken van een ideaal platform voor screening van drugs en voedsel te studeren verbindingen van potentieel therapeutische voordelen^9,10.

Organoids zijn geschikt voor wonen-imaging van TL-gelabelde proteïnen en beide knock-in en knock-out organoids kan worden gegenereerd met behulp van CRISPR/Cas9 gene^11,12te bewerken. Het is echter belangrijk, vooral om te controleren of het gedrag van de tagged eiwitten tot oprichting van de expressie en de lokalisatie van de endogene eiwitten worden bestudeerd. Immuno-labeling 3D organoids gegroeid in kelder matrix of ex vivo geïsoleerde weefsel is complexer dan cellen gekweekt in cultuur gerechten in 2D. Het protocol fixatie moet voor het behoud van de gevoelige 3D architectuur van organoids terwijl nog het bewaren van antilichaam antigenicity (dat wil zeggen, de epitopes voor het binden van antistoffen). Bijvoorbeeld, 4% paraformaldehyde (PFA) wordt vaak gebruikt als een hechtmiddel maar terwijl het een relatief snelle handelen fixatief en goede morfologische behoud geeft, in onze ervaring het vaak leidt tot verlies van antigenicity en is niet geschikt voor veel centrosomal antilichamen. Het vermogen van de fixeer en antilichamen te dringen 3D structuren en weefsel moet ook worden overwogen. Te dien einde, we hebben gewijzigd en ontwikkelde protocollen voor weefsel isolatie en indirecte immuno-etikettering van 3D in vitro organoids en ex vivo geïsoleerd intestinale weefsel. We beschrijven hoe isoleren van kleine intestinale crypten en villi en Colon weefsel, en omvatten een protocol voor het isoleren van 3D organoids als alternatief vaststelling en immuno-labeling binnen de kelder-matrix. Presenteren we drie alternatieve fixatie protocollen voor immuno-labeling van microtubuli en centrosomal eiwitten, zoals ninein, en microtubulus plus-end tracering eiwitten (+ TIPs), zoals de EB eiwitten en CLIP-170 (Zie ook de referenties^{8, 13}). We bespreken ook de voors en tegens van elk protocol is gekoppeld.

Protocol

Alle methoden die hier beschreven werden uitgevoerd volgens de Universiteit van East Anglia institutionele licentie richtlijnen.

1. isolatie van intestinale weefsel

1. Isolatie van Colon crypten voor immuno-labeling (Zie Figuur 1schematische)
   1. Euthanaseren van de muis (met behulp van CO₂ verstikking) en verwijderen van de dikke darm (begint bij het caecum en extraheren van caudally) met schaar en pincet¹⁴ontleden.
   2. Spoelen van de inhoud van de dikke darm met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met behulp van een glazen pipet met rubber lamp. PBS: natriumchloride (8,0 g/L), kaliumchloride (0,2 g/L), Dinatrium waterstof fosfaat (1,15 g/L) en kalium Natriumdiwaterstoffosfaat fosfaat (0,2 g/L), met een pH 7,3.
   3. Met behulp van een metalen staaf (2,4 mm diameter) of het einde van een glazen pipet, houdt één uiteinde van de Colon buis terwijl het weefsel voorzichtig te glijden over de staaf/pipet dus everting het Colon weefsel zodat het epithelium nu aan de buitenkant is.
      Opmerking: Als dit niet mogelijk is dan geopend de dikke darm met schaar en snijd in stukken van 5 mm.
   4. De everted colon of stukken overbrengen in een conische tube van 50 mL, met 40 mL PBS.
   5. Omkeren van de buis meerdere malen te verder de intestinale inhoud verwijderen, slijm, enz.
   6. Overdracht van de dikke darm/stukken aan 40 mL 3 mM EDTA in PBS en Incubeer bij kamertemperatuur (RT) gedurende 15 minuten.
      Opmerking: Verdun de 0,5 M EDTA pH 8,0 materieel met PBS.
   7. Schud om te verwijderen het slijm en de dikke darm/stukken overbrengen in een conische tube van 50 mL, met vers 40 mL 3 mM EDTA in PBS. Incubeer gedurende 35 min op RT.
   8. De dikke darm/stukken overbrengen in 10 mL PBS in een conische tube van 50 mL en schud krachtig voor 30 s vrij te geven van de crypten (crypt breuk).
   9. Verwijderen van de dikke darm/stukken uit de buis en leg terug in 3 mM EDTA, in het geval verdere isolatie vereist is. Centrifugeer het resterende gedeelte van de crypte bij 300 x g gedurende 5 min.
   10. Verwijderen van 5 mL van het supernatans en resuspendeer de pellet crypte in het resterende volume van 5 mL.
   11. Onder een stereomicroscoop met zoom (50-100 X vergroting) om te controleren op de aanwezigheid van Colon crypten observeren.
       Opmerking: Als er geen huidige crypten vervolgens Incubeer de dikke darm/stukken in 3 mM EDTA in PBS voor een andere 30 min en herhaal stap 1.1.8 - 1.1.11.
   12. Centrifugeer de crypte breuk bij 300 x g gedurende 5 min.
   13. Verwijder alle bovendrijvende substantie voor het verkrijgen van een crypte pellet en onmiddellijk overgaan tot fixatie (sectie 3).
2. Isolatie van kleine intestinale crypten en villi voor immuno-labeling (Figuur 2)
   1. Muis (met behulp van CO₂ verstikking) euthanaseren en verwijderen van de dunne darm (proximale twaalfvingerige darm aan terminal ileum) met het ontleden van schaar en pincet¹⁴.
      Opmerking: als u wilt bekijken verschillende secties van de dunne darm dan in dit stadium scheiden en afzonderlijk behandelen. Zie Figuur 1 en tabel 1 voor een stroomschema en tijdsinstellingen.
   2. Spoelen van de inhoud van de dunne darm met PBS met behulp van een glazen pipet met rubber lamp.
   3. Opengesneden de dunne darm met ontleden schaar en de plaats in 15 mL PBS in een petrischaal.
   4. Voorzichtig wassen de darm in PBS luminal om inhoud te verwijderen terwijl het niet schadelijk de mucosal oppervlakte. Het weefsel overbrengen in een verse petrischaal en herhaalt u PBS wassen.
   5. De darm in 3-5 mm stukjes gesneden en overbrengen naar een 100 mm petrischaal met 15 mL 30 mM EDTA in PBS en incubeer voor 5 min op RT. alternatief in 3 mM EDTA in PBS Incubeer gedurende 30 min.
   6. Deel 1 (Villi isolatie): Breng de intestinale stukken in 10 mL PBS in een conische tube van 50 mL, schud krachtig gedurende 10 s, en giet in een petrischaal van 100 mm. Controleer de breuk voor geïsoleerde villi onder een stereomicroscoop. In dit stadium, meestal villi aanwezig moeten zijn, maar dit kan variëren tussen isolatie.
      Opmerking: Om te voorkomen dat geïsoleerde villi/crypten vast te houden aan het plastic, de petrischaaltjes en de collectie buizen moeten vooraf gecoat met foetale boviene Serum (FBS). Giet FBS in gerechten en/of buizen en onmiddellijk verwijderen. Zie tabel 1 voor timing gidsen voor elke fractie.
   7. Overboeken van de intestinale stukken terug naar 30 mM EDTA in PBS en incubeer gedurende 5 min. Tijdens deze incubatie, breuk 1 te verzamelen in een conische tube van 15 mL (voorgelakt met FBS) en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min.
   8. Deel 2: Intestinale stukken overbrengen in een conische tube van 50 mL, met 10 mL PBS, schud krachtig gedurende 20 s, en vervolgens giet in een petrischaal van 100 mm. Controleer de breuk onder de Microscoop. In dit stadium een gemengde cultuur van villi en crypten zijn meestal presenteren (figuur 2A).
   9. Overboeken van intestinale stukken terug naar 30 mM EDTA in PBS en incubeer gedurende een verdere 5 min. Tijdens deze incubatie, pellet breuk 2 in een 15 mL conische buis (voorgelakt met FBS) bij 300 x g voor 5 min. bovendrijvende vloeistof verwijderen uit breuken 1 en 2 zonder de pellet te verstoren en direct overgaan tot fixatie (stap 3).
   10. Deel 3 (Crypt isolatie): Breng de intestinale stukken in 10 mL PBS in tube 50 mL, schud gedurende 20 s, en giet in een petrischaal van 100 mm. Selectievakje breuk onder de Microscoop. In dit stadium, de breuk van een zal bevatten overwegend crypten (figuur 2B).
   11. Deel 4: Breng de intestinale stukken in 10 mL PBS, schud gedurende 20 s, en giet in een petrischaal van 100 mm. Selectievakje breuk onder de Microscoop. In dit stadium moeten alleen crypten aanwezig zijn.
   12. Deel 5: Breng de intestinale stukken in 10 mL PBS, schud gedurende 20 s, en giet in een petrischaal van 100 mm. Selectievakje breuk onder de Microscoop. Meestal, in dit stadium worden weinig crypten geëxtraheerd. Als meer dan een paar crypten zijn uitgepakt, gaat u verder met een 6^th -Fractie.
       Opmerking: Als een zuivere crypt-bevolking is gewenst (bijvoorbeeld voor organoid generatie), gebruikt u een 70 µm cel zeef te verwijderen elke intact villi uit de crypt-verrijkt.
   13. Verzamelen breuken 3-5 in aparte 15 mL conische buizen en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min.
   14. Controleren van de pellets van breuken 3 - 5 en verwijder het supernatant zonder verstoring van de pellets, en onmiddellijk overgaan tot fixatie (sectie 3).

2.Isolatie van intestinale Organoids uit kelder Matrix koepels in 24-Wells-platen

Opmerking: De vorming van organoids binnen kelder matrix koepels geweest¹²elders beschreven.

1. Jas putjes met kelder matrix koepel volgens de instructies van de fabrikant.
2. Wash wells met kelder matrix koepels met 500 µL van PBS.
3. Koude 250 µL van oplossing (4 ° C) van de gegevensterugwinning van de cel toevoegen aan elk putje (Zie Tabel van materialen).
   Opmerking: De oplossing van de gegevensterugwinning koude cel zal depolymerize alles behalve stabiel microtubuli.
4. Schraap de kelder matrix koepels met behulp van een P1000 micropipet en zorgvuldig Pipetteer op en neer in de put te verbreken en verwijderen van de kelder matrix van kunststof.
5. Verzamelen het supernatant in 1,5 mL lage bindende microcentrifuge buizen.
6. Omkeren van de tube van de lage bindende 1,5 mL meerdere malen en controleren onder de Microscoop of de organoids zijn geïsoleerd en zijn vrij bewegen en niet in de bosjes. Houd de buis onder een stereomicroscoop en weergave onder vergroting van de laag (50 X).
7. De organoids pellet door centrifugeren bij 1.000 x g gedurende 5 min op RT.
8. Het reagens herstel verwijderen en onmiddellijk overgaan tot fixatie (stap 3).

3. fixatie van geïsoleerde intestinale weefsel en Organoids

1. Methanol fixatie
   1. Resuspendeer de geïsoleerde intestinale crypt/villosités breuk in 10 mL en organoids in 1 mL methanol bij-20 ° C.
   2. Incubeer de crypten/villi/organoids bij-20 ° C in een vriezer gedurende 15 minuten en het omkeren van de sproeibuis(-buizen) elke 5 min.
   3. De crypten/villi/organoids pellet door centrifugeren bij 1.000 x g gedurende 5 min.
   4. Verwijder van de methanol en voeg wassen oplossing (1 mL voor organoids en 10 mL voor geïsoleerde crypt/villosités breuken). De wassen oplossing kan ofwel bestaat uit PBS met 1% serum of PBS met 0,1% wasmiddel en 1% serum.
      Opmerking: Gebruik een serum van dezelfde soort als die van de secundaire antilichamen. Bijvoorbeeld, als de secundaire antilichamen in geiten voortkomen vervolgens gebruiken geit serum.
   5. Onmiddellijk, centrifugeer de crypten/villi/organoids bij 1.000 x g gedurende 5 min naar pellet.
   6. Verwijder de oplossing wassen en resuspendeer de crypten/villi/organoids in verse wassen oplossing.
   7. Plaats op een buis rotator met de snelheid naar 20 rpm. Wassen van de cellen voor een totaal van 1 h, pillering de crypten/villi/organoids door middel van centrifugeren (1.000 x g gedurende 5 minuten) elke 15 min en vervangen de wash-oplossing.
      Opmerking: Als een buis rotator niet beschikbaar is dan omkeren de buizen handmatig elke 5 min om resuspendeer de geïsoleerde culturen.
2. Formaldehyde/methanol fixatie
   Opmerking: Omgaan met de fixatives en formaldehyde in een zuurkast.
   1. Resuspendeer de geïsoleerde crypten/villi 10 ml of organoids in 1 mL van-20 ° C kleefpoeders oplossing (9.2 mL methanol met 800 µL van formaldehyde oplossing).
   2. Los van de crypten/villi/organoids bij-20 ° C in een vriezer gedurende 15 minuten en omkeren van de buis om 5 min.
   3. De crypten/villi/organoids pellet door centrifugeren bij 1.000 x g gedurende 5 min.
   4. Verwijder de formaldehyde/methanol en wassen oplossing (1 mL of 10 mL voor geïsoleerde crypten/villosités breuken voor organoids) toevoegen. De wassen oplossing kan ofwel bestaat uit PBS met 1% geit serum of PBS met 0,1% wasmiddel en 1% serum.
   5. Centrifugeer bij 1.000 x g gedurende 5 min naar de crypten/villi/organoids pellet.
   6. Verwijder de oplossing wassen en resuspendeer in verse wassen oplossing.
   7. Plaats op een buis rotator met de snelheid naar 20 rpm. Wassen van de cellen voor een totaal van 1 h, pillering de crypten/villi/organoids door middel van centrifugeren (1.000 x g gedurende 5 minuten) elke 15 min en vervangen de wash-oplossing.
3. PFA fixatie
   Let op: PFA poeder en oplossingen moeten worden behandeld in een zuurkast.
   Opmerking: In de meeste gevallen 4% PFA in PBS wordt gebruikt maar afhankelijk van behoud van antilichaam antigenicity, lagere concentraties kunnen worden gebruikt.
   1. Resuspendeer de geïsoleerde Ingehuld crypten/villi in 10 mL 4% PFA Incubeer bij RT gedurende 1 h en de geïsoleerde Ingehuld organoids in 1 mL 4% PFA en incubeer gedurende 30 min. In beide gevallen omkeren de sproeibuis(-buizen) elke 10 min.
   2. De crypten/villi/organoids pellet door centrifugeren bij 1.000 x g gedurende 5 min.
   3. Verwijder de PFA en voeg van wassen oplossing (1 mL voor organoids en 10 mL voor geïsoleerde crypten/villi). De wassen-oplossing bestaat uit PBS met 0,1% wasmiddel en 1% serum.
   4. Centrifugeer bij 1.000 x g gedurende 5 min naar de crypten/villi/organoids pellet.
   5. Verwijder de oplossing wassen en resuspendeer in verse wassen oplossing.
   6. Plaats op een buis rotator met snelheid naar 20 rpm. Wassen van de cellen voor een totaal van 1 h, pillering de crypten/villi/organoids door middel van centrifugeren (1.000 x g gedurende 5 minuten) elke 15 min en vervangen de wash-oplossing.
      Opmerking: Als een buis rotator niet beschikbaar is dan omkeren buizen handmatig elke 5 min om resuspendeer de geïsoleerde culturen.
   7. Herwinning van het antigeen (een optionele stap aanbevolen voor fixatie van de PFA)
      1. De crypten/villi/organoids pellet door centrifugeren bij 1.000 x g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant.
      2. Voeg 1-10 mL 10 mM Natriumcitraat pH 6.0 (vooraf opgewarmd tot 80 ° C) en Incubeer bij 80 ° C gedurende 20 minuten.
      3. De crypten/villi/organoids pellet door centrifugeren bij 1.000 x g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant.
      4. Voeg 1-10 mL vers 10 mM Natriumcitraat pH 6.0 (vooraf opgewarmd tot 80 ° C) en Incubeer bij RT gedurende 20 min.
      5. De crypten/villi/organoids pellet door centrifugeren bij 1.000 x g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant.
      6. 1-10 mL PBS, met 1% serum wassen en herhaal een verder 3 keer pillering de crypten/villi/organoids door middel van centrifugeren (1.000 x g gedurende 5 minuten) voordat u verse wassen oplossing toevoegt.

4. blokkeren stap

1. Maken de blokkerende oplossing: Voeg 10% secundair antilichaam soorten serum in PBS (optioneel: 0,1% wasmiddel toevoegen).
2. De crypten/villi/organoids pellet door middel van centrifugeren (1.000 x g gedurende 5 minuten) en verwijder de bovendrijvende substantie.
3. Voeg 5-10 mL van de blokkerende oplossing afhankelijk van aantal monsters (zie hieronder nota). In dit stadium door de crypten/villi/organoids oplossing in afzonderlijke buizen (1,5 mL lage bindende microcentrifuge buizen met elke buis met 0,2 - 1 mL) voor de kleuring met de verschillende antilichamen te splitsen.
   Opmerking: Elke geïsoleerde crypten/villi fractie krijgt tussen de 5-10 monsters die kunnen worden gebruikt voor verschillende labeling combinaties afhankelijk van de grootte van de pellet. In het ideale geval is een pellet grootte tussen 2 tot 4 mm vereist voor elk monster.

Verschillende fracties kunnen worden gecombineerd in dit stadium als crypten en villi kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd (Figuur 2).

Incubeer in het blokkeren van de oplossing bij RT op een rotator van de buis gedurende 1 uur.

5. primair antilichaam-incubatie

1. Verdun de primaire antilichamen (Zie Tabel van materialen) in PBS met 10% serum en 0,1% wasmiddel. Tussen 100-200 µL is primair antilichaam oplossing vereist per microcentrifuge buis monster.
2. Verwijder de blokkerende oplossing door middel van centrifugeren (1.000 x g gedurende 5 minuten).
3. Resuspendeer de pellet crypten/villi/organoid in het primair antilichaam-oplossing en Incubeer bij 4 ° C's nachts met behulp van een buis rotator (20 RPM) te houden van de crypten/villi/organoids in suspensie.
4. Volgende dag: de monsters terug naar de RT te brengen voor 1 h op buis rotator (20 rpm).
5. Pellet van het monster door middel van centrifugeren (1.000 x g gedurende 5 minuten) en verwijder de primair antilichaam-oplossing.
6. Voeg 1 mL oplossing te wassen en resuspendeer de crypt/villosités/organoid-pellets.
7. Onmiddellijk verwijderen van de oplossing door middel van centrifugeren (1.000 x g gedurende 5 minuten).
8. Voeg 1 mL verse wassen oplossing en draaien de cellen op een buis rotator (20 rpm) voor 2 uur. De wash-oplossing door centrifugatie om 30 min zoals in stap 5.7 wijzigen

6. secundair antilichaam-incubatie

1. Verdun de secundaire antilichamen (Zie Tabel van materialen) in PBS met 10% serum en 0,1% wasmiddel. Ongeveer 200 µL van secundair antilichaam oplossing is vereist per microcentrifuge buis monster.
   Opmerking: Zeer cross-geabsorbeerd antilichamen moeten worden gebruikt ter vermindering van de reactiviteit van secundaire antilichamen in muis crypt/villosités/organoid.
2. Centrifugeer bij 1.000 x g gedurende 5 min naar de crypten/villi/organoids pellet en resuspendeer de pellets in 200 µL van secundair antilichaam oplossing.
3. Draai de buizen op een buis rotator (20 rpm) op RT gedurende 1 uur.
4. Centrifugeer bij 1.000 x g gedurende 5 min naar de crypten/villi/organoids pellet en verwijder het supernatant (niet-gebonden secundaire antilichamen).
5. Resuspendeer de pellet in oplossing van wassen en onmiddellijk Centrifugeer bij 1.000 x g gedurende 5 min naar de crypten/villi/organoids pellet.
6. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 1 mL verse wassen oplossing.
7. Spin op een buis rotator (20 rpm) op RT voor 1.5-2 h, veranderen de wash-oplossing elke 20-30 min zoals eerder is beschreven in stappen 6.3-6,6.

7. nucleaire vlek

1. Verdun de nucleaire vlek in wassen oplossing (volgens de fabrikant protocol), zoals DAPI of Hoechst. Bijvoorbeeld: DAPI stockoplossing (20 mg/mL) is verdund 1:10, 000. De stockoplossing kan worden gehouden in aliquots bij-20 ° C.
2. Centrifugeer bij 1.000 x g voor 5 min de crypten/villi/organoids pellet te wassen oplossing verwijderen.
3. Resuspendeer de pellet in nucleaire counterstain oplossing.
4. Spin op een buis rotator (20 rpm) op RT gedurende 10 minuten.
5. Centrifugeer bij 1.000 x g voor 5 min de crypten/villi/organoids pellet, de nucleaire vlek-oplossing verwijderen en resuspendeer de pellet in oplossing van wassen.
6. Spin op een buis rotator (20 rpm) op RT voor 30-60 min, veranderen de wash-oplossing elke 10 min.

8. montage geïsoleerd crypten, Villi en Organoids

1. Centrifugeer bij 1.000 x g voor 5 min de crypten/villi/organoids pellet en verwijderen van alle de wash-oplossing.
   Opmerking: Als de pellet verspreidt, dan Centrifugeer nogmaals.
2. Voeg 2 druppels harde instelling media met antifade agent aan de pellet te monteren.
3. Knip het einde van een P200-micropipet en zorgvuldig resuspendeer de pellet in de montage-media. Vermijd het genereren van bubbels.
   Opmerking: De geïsoleerde organoid culturen zijn zeer kleverig; Zorg ervoor dat resuspendeer volledig.
4. Gebruik de micropipet om te dragen van het mengsel van crypten/villi/organoids in de montage media oplossing, en afzien in een lijn langs het midden van een microscoopglaasje.
   Opmerking: De lijn mag niet langer zijn dan de cover-glas die moet worden gebruikt. Controleer met behulp van een stereomicroscoop of de crypten/villi/organoids zijn goed verspreid over de dia en niet samengeklonterd.
5. Zorgvuldig plaats een cover-glas over de bovenkant; Vermijd het genereren van bubbels.
6. Breng het glasplaatje in een dia boek en op te slaan in een koelkast 's nachts voor de montage media om in te stellen voordat de analyseren op een confocal microscoop.
   Opmerking: Voor muis-antilichamen tegen vlekken in muis weefsel, gebruik de commerciële immunofluorescentie kit (Zie Tabel van materialen). De blokkerende stap (afdeling 4) vervangen door een blok van 10 min met eiwit blokkerende oplossing gevolgd door een 1 uur incubatie met de blokkerende reagens dat bij de kit wordt meegeleverd. Voeg vervolgens een 1 uur incubatie met fluorescentie signaal versterker reagens bij stap 5.8 (in het midden van wassen). Gebruik vervolgens de kit reagens in fluorescerende dilutant (andere secundaire antilichamen kunnen ook worden gebruikt in combinatie met dit reagens). Incubeer zoals hierboven en u verder vanaf stap 6 met de rest van het protocol.

9. fixatie en Immuno-labeling van Organoids binnen kelder Matrix

Opmerking: Organoids bestemd voor fixatie en immuno-labeling terwijl de resterende binnen de kelder matrix werden gegenereerd in kelder matrix koepels op de top van ronde glazen coverslips in een 24-well plaat (één koepel per putje). De organoid kelder matrix koepels waren verwerkt binnen de 24-well plaat door de toevoeging en verwijdering van de verschillende oplossingen.

1. Verwijder het medium uit putten en voeg de fixeerspray; laat gedurende 1 h.
2. Verwijder de fixeer en wassen in PBS met 1% serum en 0,1% wasmiddel voor 2 h, verandert elke 30 min.
3. De wash-oplossing verwijderen en blokkeren in PBS met 10% serum en 0,1% wasmiddel voor 1 h.
4. Verdun de antilichamen in PBS met 1% serum of PBS met 1% serum en 0,1% wasmiddel.
5. De blokkerende oplossing verwijderen en toevoegen van 100-200 μl primair antilichaam (Zie Tabel van materialen) oplossing aan elk putje.
   Opmerking: het is belangrijk dat het verwijderen van alle de blokkerende oplossing om niet antilichamen verder verdund.
6. Plaats van de plaat in de koelkast en na een nacht bebroeden bij 4 ° C
7. Vervolgens verlaat bij RT voor 1-2 h.
8. Verwijder de antilichaam-oplossing en wassen voor 2-3 h wijzigen de wash oplossing iedere 20 min.
9. Alle wassen oplossing verwijderen en toevoegen van 100-200 μl secundaire antilichamen verdunde (Zie Tabel van materialen) in PBS met 1% serum; Incubeer gedurende 1 h op RT.
10. Verwijder de secundair antilichaam oplossing en wassen voor 2 h, veranderen iedere 20 min.
11. De wash-oplossing verwijderen en toevoegen van DAPI oplossing; laat gedurende 10 minuten op RT. gebruik DAPI stockoplossing (20 mg/mL) verdund om 1:10, 000.

De stockoplossing kan worden gehouden in aliquots bij-20 ° C.

Verwijder de DAPI oplossing en wassen voor 40 min, wijzigen van elke 10 min.

Met pincet, verwijder het dekglaasje glas aan met de koepel van de matrix kelder en plaats op een dia met de kelder matrix koepel naar boven; Voeg een paar druppels van de montage van de media en zet dan een glas dekglaasje aan bovenop.

Plaats de glas-dia in een dia-boek en laat in koelkast 's nachts voor de montage media om in te stellen.

Results

Isolatie van intestinale weefsel voor immuno-labeling
De protocollen van de isolatie beschreven weefsel voor de dikke darm en dunne darm werden geoptimaliseerd voor behoud en immuno-labeling van microtubuli en geassocieerde eiwitten, maar niet voor de levensvatbaarheid van de cellen van de stam en organoid generatie (Figuur 1 en tabel 1 ). Het doel was om het genereren van de crypte en villosités facties die als waren schoon (verstoken van slijm en ander weefsel) mogelijk, terwijl het minimaliseren van de blootstelling aan EDTA en koude structuur behouden en voorkomen dat depolymerization van microtubuli met ijs koud oplossingen, die ertoe bewegen depolymerization van alles behalve stabiel microtubuli. Figuur 2 ziet u voorbeelden van beelden van de fracties 2 en 3 van geïsoleerde kleine intestinale weefsel, met 2 van de Fractie met een mengsel van zowel villi en crypten (figuur 2A, B), terwijl deel 3 bevat voornamelijk crypten (figuur 2C D).

Fixatie en immuno-labeling van geïsoleerde intestinale weefsel
De afzonderlijke of gecombineerde breuken werden vervolgens verwerkt voor fixatie en immuno-aangeduid door middel van een reeks van maatregelen zoals fixatie, wasmiddel, blokkeren, antilichaam en oplossingen, wassen voordat de definitieve villi/crypten opnieuw wordt verbroken pellet in montage media, overbrengen op dia's en omvatten met glas coverslips. De crypten en villi werden vervolgens beeld op een confocal microscoop.

Goede bewaring en etikettering van microtubuli en actine in zowel villi en crypten werd bereikt door het volgende: een combinatie van formaldehyde/methanol fixatie op-20 ° C, herhaald wassen in PBS met 0,1% wasmiddel en 1% serum en blokkeren in PBS met 0,1% wasmiddel en 10% serum, gevolgd door overnight incubatie op 4 ° C in primaire antilichamen en vervolgens 2 h in de secundaire antilichamen bij kamertemperatuur (Figuur 3). Formaldehyde/methanol fixatie is ook goed gewerkt voor labeling + TIPs zoals de EBs en CLIP-170 in geïsoleerde crypten en villi (Figuur 4). EB3 ophopingen eind plus-van microtubuli (bekend als kometen) waren duidelijk in de cryptes (figuur 4A), terwijl de vereniging langs de tralie van stabiele microtubuli kan worden gezien in de villi monsters (figuur 4C). Duidelijke lokalisatie van CLIP-170 en p150^gelaste (subeenheid van dynactin) bleek duidelijk in de apicale n-MTOCs in geïsoleerde villi (figuur 4B). Fixatie met het protocol van formaldehyde/methanol werkte niet consequent voor ninein lokalisatie in geïsoleerde intestinale weefsel met behulp van onze Pep3 antilichaam tegen muis ninein. Echter methanol fixatie op-20 ° C, gevolgd door het dezelfde wassen en blokkeren van oplossingen voor formaldehyde/methanol gaf zeer goede lokalisatie van ninein binnen de geïsoleerde crypten en villi (Figuur 5; verwijzing⁸). Interessant, terwijl ninein geconcentreerd op de apicale centrosomes is bleek sommige ophoping van onderaan cel in sommige cellen in geïsoleerde crypten (Figuur 5). Of dit te wijten aan niet-specifieke etikettering of een gevolg van het uitstellen van de procedure van de isolatie is moet fixatie (en dus op het gebied van behoud) verder onderzoek. Methanol-vaste (-20 ° C) secties van de cryostaat van villi (Zie figuur 3bi in⁸) bleek echter ook ninein bij de cel basis in sommige cellen die suggereren dat ninein ook kan associëren met een basale bevolking van microtubuli.

Fixatie en immuno-labeling van organoids geïsoleerd uit kelder matrix
Kleine intestinale organoids werden gegenereerd en gegroeid in kelder matrix voor drie weken of langer (figuur 6A; verwijzing^6,15). Een koud (4 ° C) de oplossing van de gegevensterugwinning van de cel werd gebruikt voor het isoleren van organoids uit de kelder-matrix. De oplossing van de matrix depolymerized kelder met organoids werd overgedragen aan buizen en gecentrifugeerd voorafgaand aan de fixatie en immuno-labeling. Dit zeer schoon preparaten geproduceerd en goede toegang tot de organoids voor de verschillende oplossingen. De gedifferentieerde cellen binnen de organoid villosités domeinen bevatten stabiele apico-basale microtubuli; deze label goed in de meeste gevallen (figuur 6B, C) en EB1 ook langs het microtubulus lattice (Figuur 6 sexies; verwijzing¹³) kon worden gezien. De oplossing van de gegevensterugwinning koude cel kan echter resulteren in depolymerization van de dynamische microtubuli, die bleek in sommige monsters door het ontbreken van EB1 kometen (die binden aan het plus-einde van groeiende microtubuli) binnen de domeinen van de basale crypt (figuur 6F ). In andere monsters, werden astral (dynamische) microtubuli bewaard (figuur 6D). Organoid isolatie voorafgaand aan de fixatie en immuno-labeling werkte ook voor regulates eiwitten, ninein, CLIP-170 en cel markers, zoals mucin voor goblet cellen en chromogranin A voor enteroendocrine cellen.

Fixatie en immuno-labeling van organoids binnen kelder matrix
Figuur 7 toont een organoid in het stadium van de cyste (A-C) en in een vroeg stadium van de ontwikkeling van de crypte (D), zowel vaste in formaldehyde/methanol en immuno-label voor microtubuli en ninein. Goede microtubulus behoud en etikettering, alsmede labeling voor ninein in de apicale n-MTOCs zijn duidelijk. Figuur 8A, B toont een crypte domein binnen een dag 6 organoid vast met het methanol-protocol en het label voor microtubuli en EB1. Goede behoud van microtubuli en EB1 kometen bleek suggereren behoud van dynamische microtubuli.

Organoids waren ook vaste en immuno-label terwijl de resterende binnen de kelder-matrix. De nadelen van deze procedure kunnen worden arme penetratie van fixeer en overlapping van antilichamen in de kelder-matrix (Figuur 8), hoewel in beide gevallen minder vaak wanneer 0,1% wasmiddel werd opgenomen in het fixeer en/of wassen oplossingen. Bovendien, 4% PFA niet behouden de kelder matrix goed maar veroorzaakt te ontbinden, hoewel dit minder dus met 1 was % PFA.Methanol fixatie, aan de andere kant, geïnduceerde soms organoid ineenstorting.

Labelen met sommige antistoffen zoals tegen de stamcel marker Lgr5 en Paneth cel markering bewezen CD24 mislukt met de 4%-PFA, methanol of formaldehyde/methanol-protocollen. Leidt echter tot vaststelling van de organoids binnen de kelder-matrix met 1% PFA in PBS met 0,1% wasmiddel bij kamertemperatuur tot labeling voor zowel Lgr5 als CD24 (Figuur 9).

Figuur 1: isolatie van kleine intestinale villi en crypten. Stroomdiagram van de belangrijkste stappen in kleine intestinale villosités en crypte isolatie voorafgaand aan de fixatie en immuno-labeling. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2: geïsoleerd villi en crypten van muis dunne darm. Helderveld Microscoop beelden van intestinale breuken met villi (grote pijlen) en cryptes (kleine pijlen). (A, B) Deel 2 bevat een mengsel van villi en crypten en behoud van de morfologie van de villosités en de crypte is duidelijk in B. (C, D) Fractie 3 toont isolatie van de crypten en villi en intact crypten, met inbegrip van een gespleten crypte in Contbreken. Schaal bars = 500 μm (A, C); 100 μm (B, D). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3: geïsoleerd kleine intestinale villosités en crypte vaste in formaldehyde/methanol en immuno-gelabeld voor microtubuli en actine. (A) schema van het epitheel van het villosités en de crypte met verschillende soorten cellen aangegeven. De gemarkeerde vakken geven de representatieve gebieden beeld in B en C. (B, C) Confocale optische secties door deel van een villosités (B) en basale crypte (C) geïsoleerd uit de dunne darm met behulp van 30 mM EDTA en vaste in formaldehyde/methanol, gewassen in PBS met 1% geit serum en 0,1% wasmiddel, geblokkeerd in PBS bevattende 10% geit serum en 0,1% wasmiddel, en gelabeld voor microtubuli met rat monoklonaal anti-tubuline antilichaam (groen) en actine met konijn polyclonal anti-β-actine antilichaam (rood). Goed bewaard gebleven apico-basale microtubulus bundels zijn evident in zowel de villosités en de crypte cellen en actine kan gezien worden geconcentreerd in de apicale regio geconfronteerd met de lumen (pijl). Schaal bars = 5 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4: Geïsoleerd kleine intestinale crypte en villi vaste in formaldehyde/methanol en immuno-label voor de microtubuli, EB3 p150^gelasteen CLIP-170. Confocale optische secties van de crypte en villi regio's geïsoleerd uit de dunne darm met behulp van 30 mM EDTA en bevestigd in formaldehyde/methanol, gewassen in PBS met 10% geit serum en 0,1% wasmiddel, geblokkeerd in PBS met 10% geit serum en 0,1% wasmiddel, en Immuno-label. (A) Crypt gelabeld met konijn α-tubuline polyclonal antilichaam (rood) en rat monoclonal EB3KT36 antilichaam (groen) en gekleurd voor DNA met DAPI (blauw) met apico-basale microtubuli en EB3 kometen. De omgekeerde enkellijns afbeelding toont duidelijk EB3 kometen in de cellen van de basale crypt suggereren goede behoud van dynamische en stabiele microtubuli. (B) villosités epitheliale cellen aangeduid met konijn polyclonal antilichaam van CLIP-170 (rood, zie ook verwijst naar¹⁶) en muis monoclonal p150^gelaste antilichaam (groen) toont apicale co lokalisatie. Omgekeerde enkellijns beelden worden hieronder weergegeven. (C) villosités cellen gelabeld met konijn α-tubuline polyclonal antilichaam (rood) en rat monoclonal EB3-KT36 antilichaam (groen) en gekleurd voor DNA met DAPI (blauw) toont apico-basale microtubuli met EB3 langs het lattice. De vereniging EB3 rooster is gemarkeerd in het vergrote beeld terwijl het omgekeerde enkellijns beeld zowel EB3 kometen en lattice vereniging suggereert. Schaal bars = 5 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 5: geïsoleerde dubbele punt crypt opgelost in methanol, immuno-label voor ninein en E-cadherine, en gekleurd met DAPI. Confocale optische sectie van de basale en doorvoer-sturen een crypte provincie geïsoleerd van de dikke darm met behulp van 3 mM EDTA opgelost in methanol, gewassen in PBS met 1% geit serum en 0,1% wasmiddel, en geblokkeerd in PBS met 10% geit serum en 0,1% wasmiddel. De crypte was gelabeld met konijn ninein polyclonal antilichamen (Pep3, zie ook verwijzing⁸, rood) en muis monoklonaal antilichaam van E-cadherine (groen) en gekleurd met DAPI (blauw). De omgekeerde enkellijns afbeelding toont ninein alleen. De afbeelding toont een goed bewaarde crypte met E-cadherine onthullen de omtrek van de afzonderlijke cellen en ninein geconcentreerd op de apicale centrosomes. Het suggereert dat goede doordringing van fixeer en antilichamen, en het behoud van de antigenicity. Schaal bar = 5 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 6: Organoid ontwikkeling, fixatie en immuno-labeling van geïsoleerd organoids. (A) fase contrast weergegeven: verschillende stadia van ontwikkeling van de organoid van de cel aggregaten te cyste met bud initiatie en volledig beelden gevormd organoids met crypte en villosités domeinen.(B--F) Confocale optische secties via organoids geïsoleerd uit kelder matrix met behulp van de oplossing van de gegevensterugwinning van de cel bij 4 ° C (10 min) gevolgd door formaldehyde/methanol fixatie, wassen in PBS met 10% geit serum en 0,1% wasmiddel, blokkeren in PBS met 10% geit serum en 0,1% wasmiddel en immuno-labeling voor microtubuli, β-catenine en EB1. (B) Organoid cyste gelabeld voor microtubuli (blauw) en β-catenine (rood) onthullen goede microtubulus behoud en etikettering in de meeste cellen. (C) verschillende apico-basale microtubuli zijn duidelijk in deze uitgebreide epitheliale cellen uit een organoid cyste. (D) delen van cellen die zijn gelabeld voor microtubuli tonen spindels met inbegrip van astral (dynamische) microtubuli (pijl). (E, F) Villosités domein (E) en de crypte domein (F) organoid regio's tonen enkele EB1 labeling langs de tralie van stabiele microtubuli, vooral in de villosités, terwijl weinige EB1 kometen zijn gezien zelfs binnen de basale crypte suggereren dat dynamische microtubuli zijn niet bewaard gebleven. Schaal bars = 20 μm (A); 2 μm (D); 5 μm (B, C, E-F). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 7: Organoids vaste binnen de matrix van de kelder in formaldehyde/methanol en immuno-gelabeld voor microtubuli en ninein. Confocale optische gedeelten van organoids vast in formaldehyde/methanol, gewassen en geblokkeerd in PBS met 10% geit serum en 0,1% wasmiddel, en met het label terwijl de resterende in de kelder-matrix. (A-C) Organoid cyste gelabeld voor microtubulus (groen) en ninein (Pep3; verwijzing⁸, rood) en gekleurd met DAPI (blauw) toont de samengevoegde afbeelding in A en omgekeerd enkellijns beelden voor microtubuli (B) en ninein (C). De afbeeldingen tonen apico-basale microtubuli en apicaal ninein localisatie, zeer goede structurele behoud van de organoid en de penetratie van antilichamen suggereren, alsmede het ruimen van niet-afhankelijke antistoffen. (D, E) Organoid met ontwikkelen van crypt vast en zoals hierboven aangeduid en opnieuw weergegeven: uitstekende structurele behoud, labelen en ruimen van antilichamen. Verschillende apico-basale microtubuli en apicaal n-MTOC ninein lokalisatie is duidelijk en gemarkeerd in het vergrote beeld (E) van de boxed Gewest in D. Schaal bars = 10 μm (A-D); 5 μm (E). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 8: Organoids vaste binnen de matrix van de kelder in methanol en immuno-gelabeld voor microtubuli en EB1. Confocale optische gedeelten van organoids opgelost in methanol, gewassen en geblokkeerd in PBS met 10% geit serum en 0,1% wasmiddel, en aangeduid, terwijl de resterende in de kelder-matrix. (A) cyste domein van een volledig ontwikkelde organoid aangeduid met konijn polyklonale α-tubuline (rood) en muis van monoclonal antilichamen van de EB1 (groen) toont apico-basale microtubuli, spindels (pijl) in twee verdelen cellen en afzonderlijke EB1 kometen. Sommige overlapping van niet-afhankelijke EB1 antilichamen is duidelijk. Echter, goede structurele behoud en etikettering van microtubuli en EB1 wordt waargenomen. De aanwezigheid van EB1 kometen suggereert dat dynamische microtubuli bewaard zijn gebleven (A, omkeren). (B) omgekeerde beeld van organoid cyste regio tonen α-tubuline antilichaam labelen met aanzienlijke antilichamen gevangen in de omliggende kelder matrix (pijl). Schaal bars = 5 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 9: Organoids vast binnen de matrix van de kelder in 1% PFA en immuno-label voor Lgr5 en CD24. Confocale optische gedeelten van organoids vast binnen de matrix van de kelder in 1% PFA in PBS met 0,1% wasmiddel, gewassen in PBS met 1% geit serum en 0,1% wasmiddel, en gelabeld met antilichamen tegen Lgr5 en CD24. (A, B) Stamcel niche binnen een domein van de crypte tonen Paneth cellen positief voor CD24 (rood). De confocal en fase contrast beelden zijn samengevoegd in A. B toont het labelen van één kanaal van CD24. (C) stamcel regio binnen een domein van de crypte weergegeven: een cel van de stam van Lrg5 positief. Schaal bars = 10 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Tabel 1: tijdlijn van kleine intestinale crypte en villi afzondering en fixatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

Isolatie van intestinale weefsel
Isolatie van kleine intestinale crypten en villi en Colon crypten gaat bloot van de mucosal oppervlakte, behandeling met EDTA oplossing cel contactpersonen, fractionering (schudden) en centrifugeren los te maken. Het protocol van de isolatie gepresenteerde intestinale villi/crypt is gewijzigd van Belshaw et al. en Whitehead et al. ^{17 , 18}

Bloot van de mucosal oppervlakte
We hebben geëxperimenteerd met een aantal benaderingen voor het blootstellen van de mucosal oppervlakte van het darmkanaal in de ontwikkeling van deze procedure. Een klassieke benadering wil evert (draai binnenstebuiten) de buis, meestal in segmenten ongeveer 100 mm lang, met behulp van een metalen staaf die is gevangen in een vouw van het weefsel op de ene kant en vervolgens de resterende buis gleed over de buis¹⁹. Muis weefsel, een metalen staaf (2,4 mm doorsnede) met afgeronde uiteinden is ideaal voor is. Deze aanpak heeft het voordeel van de mucosal oppervlakte betere toegang tot de PBS en EDTA uit te breiden. In eerste instantie gebruikten deze aanpak we maar verplaatst naar de buis snijden in korte lengtes (ongeveer 5 cm) en elke sectie met het ontleden van schaar, zoals dit gemakkelijker blijkt openen. Deze aanpak is geschikt als slechts een paar darmen vereist zijn; maar als meer dieren moesten worden gebruikt in een experiment dan een speciaal gebouwde apparaat voor snijden open de tube lengterichting, zoals beschreven door Yoneda et al. ¹⁴ zou efficiënter zijn.

Detachement van villi en crypten van de spier laag
Aanvankelijk gebruikten wij 3 mM EDTA in PBS en relatief lange incubatie tijden van maximaal 60 min los van de mucosal oppervlakte van de onderliggende weefsel^17,18te maken. Bij deze concentratie van EDTA vonden wij dat een incubatietijd van 30 min was voldoende crypten van muis dubbelpunt los te maken. Echter voor de dunne darm crypt/villosités isolatie we geprobeerd met behulp van meer geconcentreerde EDTA voor een kortere tijd, die bleek te zijn een efficiënte aanpak. Alle latere werk werd uitgevoerd met weefsel geëxtraheerd met behulp van de 30 mM EDTA techniek relevante breuken voor villi of crypten genereren. Voor crypten, we normaal gebundeld met breuken 3-5 vóór de vaststelling, maar het is belangrijk om te controleren of dit de juiste breuken zijn, zoals de tijdsinstellingen van een aantal factoren zoals de positie langs het darmkanaal, leeftijd van muis, ontsteking, vorige dieet afhangen zal , etc. ook hoe lang het weefsel moet worden geschud na de EDTA behandeling effectief kan verschillen onder verschillende omstandigheden. Het resultaat is geïsoleerde weefsel breuken met een mengsel van villi en crypten of voornamelijk villi of crypten (Figuur 2). Aangezien er geen villi in de dikke darm, de crypte extractie kan haalbaar in één stap door schudden van het weefsel in de buis voor 30 s. Deze fracties kunnen dan worden vastgesteld en verwerkt voor immuno-labeling.

Isolatie van intestinale organoids uit kelder matrix
Isolatie van organoids uit kelder matrix koepels kan worden bereikt met behulp van de oplossing van de gegevensterugwinning van de cel. De oplossing werkt door het depolymerizing van de matrix gegeleerde kelder maar de temperatuur moet worden van 2-8 ° C. Een nota van voorzichtigheid is dat dynamische microtubuli niet worden beschermd. Dus, voor immuno-labeling van dynamische microtubuli en + TIPs zoals de EBs-cel, herstel uit kelder matrix voorafgaand aan de fixatie wordt niet aanbevolen. Toch, allermeest naar de microtubuli in de onderscheidende organoid cellen zijn relatief stabiel en deze werden bewaard (Figuur 6). Het werkte ook goed voor immuno-labeling van centrosomal en regulates eiwitten, alsmede cel-markeringen.

Fixatie protocollen
Formaldehyde (vers gemaakt van PFA) is een relatief snelle-acteren fixatief die omkeerbare vormt cross-links en 4% PFA werkt goed, bijvoorbeeld in de microtubuli immuno-labeling en gamma-tubuline en kleuring actine-filamenten met Phalloidin. Meer PFA oplossingen zoals 1% goed gewerkt voor immuno-labeling, bijvoorbeeld met de stamcel markeringen Lgr5 en Paneth cel markering CD24 binnen de crypte stamcel niche, terwijl hogere concentraties van PFA niet werkte verdund.

De toevoeging van Glutaaraldehyde geeft beter behoud van microtubuli en de zogenaamde PHEMO fixatie die uit een mengsel van 3.7% PFA, Glutaaraldehyde 0,05% en 0,5% wasmiddel in PHEMO buffer (68 mM buizen, 25 mM HEPES, 15 mM EGTA en 3 mM MgCl2)^{2 bestaat} geeft uitstekende behoud van microtubuli zonder afbreuk te doen aan de antigenicity. Het werkt ook goed voor immuno-labeling gamma-tubuline, β-catenine, en E-cadherine en kleuring actine-filamenten met phalloidin. Echter in 3D weefsel en organoid culturen, de PHEMO fixatie inconsistente resultaten geproduceerd en was daarom niet gebruikt.

Methanol is een coagulant fixatief dat geeft relatief goede doordringing en heeft de neiging om antigenicity te behouden. Fixatie met 100% methanol (-20 ° C) introduceert enkele krimp geeft gematigde morfologie behoud en werkt voor de microtubuli, + TIPs, en vele centrosomal antilichamen, met inbegrip van ninein in 2D celculturen. Echter, sommige organoids samengevouwen wanneer using zulks werkwijze fixatie. Daarnaast penetratie van antilichamen door hele crypten, villi of organoids was aanvankelijk een probleem maar de toevoeging van 0,1% wasmiddel wassen oplossing en langdurige wassen betere resultaten bereikt.

Een combinatie van formaldehyde en methanol had eerder gebruikt door Rogers et al. ²⁰ tot immuno-label EB1 in Drosophila. Een fixatie-protocol gebaseerd op een mengsel van formaldehyde en methanol is daarom ontwikkeld voor intestinale weefsel en organoids op basis van 3% formaldehyde en 97% methanol gekoeld worden tot-20 ° C, maar het weglaten van de 5 mM natriumcarbonaat uit het mengsel dat werd gebruikt door Rogers et al. ²⁰ voorts monsters werden vastgesteld in de diepvries bij-20 ° C. Dit werkte met name goed voor immuno-labeling + TIPs, zoals CLIP-170 en de EBs, maar bewees ook uitstekend geschikt voor de vaststelling en immuno-labeling microtubuli en actine binnen weefsel en 3D organoids. Zeer goede structurele behoud bleek en antigenicity werd bewaard voor verschillende cytoskeletal en bijbehorende eiwitten evenals centrosomal eiwitten zoals gamma-tubuline en ninein, hoewel labeling voor ninein steeds meer met methanol gewerkt fixatie.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma	D8537-500ML	washing and PFA
Cell Recovery Solution	Corning	354253	isolate organoids
lobind microcentrifuge tubes	Eppendorf	30108116	prevent cells sticking
0.5 M EDTA solution, pH 8.0	Sigma	03690-100ML	Crypt isolation
70 μm cell strainer	Fisher Scientific	11517532	Isolate crypts from villi
Triton X-100	Sigma	T8787	detergent
goat serum	Sigma	G6767	blocking agent
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma		used as non-stick agent
Paraformaldehyde, 4% in PBS	Alfa Aesar	J61899	fixative
Formaldehyde solution (36.5–38% in H2O)	Sigma	F8775	used as fixative
Methanol 99.9% Analytical grade	Fisher	M/4000/17	used as fixative
MaxFluor Mouse on Mouse Immunofluorescence Detection Kit	Maxvision Biosciences	MF01-S	commercial immunofluorescence kit; to reduce non-specific labelling
Rotator SB2 or SB3	Stuart		microcentrifuge tube rotator
Sodium citrate			antigen retrieval
Hydromount	National Diagnostics	HS-106	mountant
DABCO - 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane	Sigma	D27802	anti-fade agent
Permanent Positive Charged, Pre-Washed, 90 Degree Ground Edges	Clarity	N/C366	slides
Glass coverslip - thickness no. 1, 22 x 50 mm	Clarity	NQS13/2250	coverslips
Matrigel	Corning	356231	Basement matrix for 3D organoid culture
50 mL conical tubes	Sarstedt	62.547.254	for processing tissue/organoids
15 mL conical tubes	Sarstedt	62.554.502	for processing tissue/organoids
1.5 mL LoBind tubes	Eppendorf	30108051	for isolated organoids
Mouse monoclonal anti-E-cadherin antibody	BD Biosciences	610181	primary antibody 1:500
Rat monoclonal anti-tubulin YL1/2 antibody	Abcam	ab6160	primary antibody 1:100
Rabbit alpha-tubulin antibody	Abcam	ab15246	primary antibody 1:100
Rabbit anti-beta-actin antibody	Abcam	ab8227	primary antibody 1:100
Rat monoclonal anti-p150Glued antibody	BD Bioscience	610473/4	primary antibody 1:100
Rat monoclonal EB3KT36 antibody	Abcam	ab53360	primary antibody 1:200
Mouse monoclonal EB1 antibody	BD Bioscience	610535	primary antibody 1:200
Rabbit anti-Lgr5 antibody	Abgent	AP2745d	primary antibody 1:100
Dylight anti-rat 488	Jackson	112545167	seconday antibody 1:400
Dylight anti-mouse 488	Jackson	ST115545166	seconday antibody 1:400
Dylight anti-rabbit 647	Jackson	111605144	seconday antibody 1:400