Dit gedetailleerde protocol beschrijft transcraniale stimulatie de plaatsing van de elektroden op het bot temporale te onderzoeken van de effecten op korte en lange termijn van de elektrische stimulatie transcranial in ratten vrij te verplaatsen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Chronische Transcraniële elektrische stimulatie en Intracortical opname in ratten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Elektrische stimulatie transcranial (TES) is een krachtige en relatief eenvoudige benadering te diffuus hersenactiviteit beïnvloeden willekeurig of in een kringloopsysteem gebeurtenis manier. Hoewel veel studies zijn gericht op de mogelijke voordelen en bijwerkingen van TES in gezonde en pathologische hersenen, zijn er nog vele fundamentele open vragen met betrekking tot het werkingsmechanisme van de stimulatie. Daarom is er een duidelijke behoefte aan een robuuste en reproduceerbare methode voor het testen van de acute en de chronische effecten van TES bij knaagdieren. TES kan worden gecombineerd met regelmatige gedrags, elektrofysiologische en beeldvormende technieken te onderzoeken van de neuronale netwerken in vivo. De inplanting van Transcraniële stimulatie elektroden legt geen extra beperkingen op de proefopzet terwijl het biedt een veelzijdige, flexibele tool om te manipuleren van de hersenactiviteit. Hier voorzien wij een gedetailleerde, stapsgewijze protocol implantaat transcraniale stimulatie elektroden om hersenactiviteit beïnvloeden in een stoffelijk beperkte wijze maandenlang te fabriceren.
Inleiding
Transcraniële elektrische stimulatie (TES) is een waardevolle methodologische benadering hersenactiviteit beïnvloeden in een stoffelijk beperkte manier. Afhankelijk van de grootte en plaatsing van de elektroden van de stimulatie, TES kan invloed hebben op de volumes van de grote hersenen en later neuronale populaties diffuus1,2,3. Transcraniële gelijkstroom stimulatie is al medisch goedgekeurd voor de behandeling van depressieve stoornis4,5, en de vele studies focus op vertoon van de cognitieve effecten van Transcraniële stimulatie in mens6 , 7. Bovendien, veelbelovende resultaten gerapporteerd met betrekking tot het potentieel van TES beheersing van epileptische aanvallen8,9.
Ondanks de intensieve onderzoek zijn er nog veel open vragen met betrekking tot het gedetailleerde mechanisme van actie, mogelijke bijwerkingen en de lange termijn uitkomst van de toepassing van deze methode10,11,12. Daarom is het uitermate belangrijk om een robuuste, reproduceerbare protocol bij het onderzoeken van de gevolgen van TES in diermodellen. Gezien het feit dat vele aandoeningen (bijvoorbeeld, depressie, epilepsie en schizofrenie) kunnen alleen bij wakker dieren uitgebreid worden onderzocht, en de aard van deze medische aandoeningen vereisen meestal langdurige behandeling, bieden we een protocol voor chronische implantatie van Transcraniële elektroden bij ratten. De methode die hier gepresenteerd kan worden gebruikt voor behavioral studies of kan worden gecombineerd met implantatie van elektroden opname (d.w.z.draden, siliconen sondes, juxtacellular-elektroden) of met chronische craniale windows voor elektrofysiologische experimenten en beeldvorming studies, respectievelijk. Afhankelijk van de proefopzet kunnen de timing van de prikkels willekeurige of gebeurtenis naar specifieke gedragsmatige signalen of naar elektrofysiologische kenmerken van de bijzondere hersenen staten (vangsten, theta oscillaties)8, 11 , 13.
Het is belangrijk te vermelden dat in tegenstelling tot de momenteel gebruikte menselijke aanpak, die gebruik maakt van een belichaming van elektroden op de huid geplaatst, hier laten we zien een methode die gebruikmaakt van onderhuidse implantatie recht over het oppervlak van de temporale-bone wordt sinds ratten nauwelijks tolereren iets geplaatst op hun huid die gemakkelijk toegankelijk is via hun poten.
In overeenstemming met de beginselen van vervanging, vermindering en verfijning, het chronische karakter van implantatie helpt deze methode bij het verminderen van het aantal dieren, aangezien elk dier kan worden aangeworven in verschillende experimentele omstandigheden voor maanden, waardoor het gebruik van minder dieren om verschillende hypothesen te toetsen.
In de huidige studie, wij bieden een gedetailleerde, stapsgewijze protocol van Transcraniële stimulatie elektrode productie (figuur 1A-B) en de chronische inplanting van deze elektroden tonen over de temporale botten van een zes-maand-oude mannelijke Long-Evans rat.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle methoden die hier worden beschreven zijn in overeenstemming met de richtlijnen van de Raad van de Europese Gemeenschappen (86/609/EEG ECC) en zijn goedgekeurd door het ethisch comité voor onderzoek van het dier bij de Albert Szent-Györgyi medische en farmaceutische Center van de Universiteit van Szeged (XIV/218/2016).
1. fabricage van de stimulatie-elektroden
- Zodat een stimulatie verwijderen elektrode, knip zes 10 cm lange stukken van miniatuur hook-up draden, 2 cm van de bekleding aan de ene kant, en 1 cm aan de andere kant.
- Draai twee kabels samen en soldeer ze aan de kortere geschilde kant.
- Verwerven van een strook van drie tape verpakking van een geïntegreerde schakeling met SOT-353 geval.
- Steek de getwiste draden door de drie gaten van het pakket. Het langer gepelde segment van de draden moet worden in de holten van het pakket. Plaats de kabels zodat het einde van de isolatie in overeenstemming met de rand van de gaten is.
- De tandheelkundige cement zetten in de gaten om de draden vast te stellen.
Let op: De tandheelkundige cement moet dicht genoeg zijn om te voorkomen dat het lekken in de holte van het pakket. - Zodra het cement is verhard (minimum 10 min), draait u het pakket en zetten een dun laagje lijm in het gat om te vormen van een waterdichte afdichting richting de poreuze cement. Vermijd de gepelde draden te lijmen.
- Draai de kabels samen aan de kortere geschilde kant en soldeer hen (figuur 1A).
- Pak het langer gepelde segment van de draden met het topje van fijne pincet, rol ze rond, en wikkel ze in de holten (figuur 1B). Snij overtollige kabel, indien nodig.
2. de fabricage van de opname-elektroden
- Om een opname te maken triplet elektrode (Figuur 1 c-D), Knip een stukje één cm lange van roestvast stalen buis met behulp van de high-speed rotary zag. Verwijderen van de vin van de einden van de tube met een scherpe naald en zorg ervoor dat de buis schoon puin en volledig permeabel.
Opmerking: Gebruik geen Tang, aangezien zij de buis zal verstoren. - Buig een vergulde bestuur spacer pin met een minimale lengte van 3 cm tot het vormen van een J-vormige houder. Het lange been van de 'J' vorm knippen en soldeer het samen om het terug te krijgen van de oorspronkelijke shape te maken van een afneembare pakking tussen het lang lineaire deel, die zal worden gehouden door de stereotaxic apparaat, en de vorm van 'U', die zal houden van de elektrode, en dienen als een verankerende punt . De buis en het kortere been van de houder van de 'J' aan elkaar worden gelijmd. Lijm sommige extra 1 cm lange balken, indien nodig, voor stabiliteit.
- 3 stuks van 2,5 cm lange elektrode draden met roestvrij staal, ultrafijn schaar te knippen. Zorg ervoor dat er een helder en scherp gesneden, en de isolatie intact aan de circulaire oppervlakte van de elektrode draad is. Zorg ook ervoor dat de gesneden tip niet als gevolg van de uitgeoefende kracht gebogen is. Buig 1 of 2 mm aan de ene kant van elk van de draden onder verschillende hoeken (bijvoorbeeld, een linker rechte, een 45 ° en een rechte hoek) om hen te onderscheiden.
- Vullen van de buis met de draden, kies een juiste afstand tussen de elektroden voor het experiment (bijvoorbeeldvoor corticale lokale veld potentiële (LFP) en huidige bron dichtheid (CSD) registratie, de aanbevolen uitsteeksel van de uiteinden van de draden van de opening van de buis: 4,5 mm, 4.1 mm en 3.7 mm, respectievelijk). Opmerking welke draad correspondeert met welke diepte voor het handhaven van een goede Kanaalvolgorde.
- Zodra de draden rechts naast elkaar uitlijnen en parallel met de buis, om het vaststellen van de elektrode draden, plaats een enkele druppel vloeibare lijm aan beide uiteinden van de buis met een scherpe naald. Zorg ervoor dat de lijm in de buis als gevolg van de capillaire werking, maar niet naar de sites van de opname aan de uitstekende uiteinden stroomt.
- Voorbereiden van een elektrode-interfacekaart met een goede microconnector die compatibel is met het registratiesysteem worden gebruikt.
- De niet-opname, gebogen uiteinden van de draden in de gaten van de elektrode-interfacekaart die overeenkomt met de gewenste opname kanaal introduceren. Als alle draden in positie, duw de gouden pinnen in de gaten met een pincet.
Opmerking: Gold pins kunnen worden vastgesteld in plaats met behulp van tandheelkundige cement, maar in de meeste gevallen het is stabiel genoeg zelfs zonder deze stap van de veiligheid.
3. anesthesie
- Plaats het dier in een verzegelde verdoving inductie kamer en vul het met 4-5% van Isofluraan in 2 L/min medische lucht.
- Wanneer de rat ligfiets is, verwijderen van het dier uit de zaal en plaats deze in een stereotaxic frame met een juiste ventilatie neus stuk.
- Isofluraan niveau instellen tot 2%, hoewel het tarief van luchtstroom hetzelfde blijven moet. Controleer het niveau van de verdoving. Als er een gebrek aan de poot terugtrekking reflex in reactie op het knijpen, blijven, anders verhoging van de diepte van de verdoving.
- Controleren en onderhouden van de rat lichaamstemperatuur 37 ± 0,5 ° C met een warmbloedig controlesysteem. Breng een druppel van paraffine zalf op de ogen ter voorkoming van uitdroging van het hoornvlies. Herhaal deze procedure tijdens de operatie meerdere malen, indien nodig.
- Subcutaan injecteren 0,3 mg/kg atropine Voorkom slijmvorming in de luchtwegen. Herhaal dit om de vier uren bij langere operaties. Ademhaling controleren en aanpassen van vaporisator, indien nodig.
4. de implantatie van de stimulatie en de opname elektroden
Opmerking: Autoclaaf alle noodzakelijke chirurgische instrumenten en volg zorgvuldig de algemene regels van asepsis en antisepsis tijdens de hele procedure. Raak niet-steriele gebieden buiten het chirurgische gebied. Dompel de elektroden in ethyl alcohol (70%) voor 30 min vóór implantatie.
- De meeste van het haar uit de hoofdhuid met een haartrimmer verwijderen. Toepassen van ontharende room op de hoofdhuid, verspreid het gelijkmatig over het oppervlak en wacht een paar minuten. Gebruik een spatel om de crème en de resterende haren voorzichtig te verwijderen. Spoel de huid met water, daarna met ontsmettingsmiddel.
- 1-2% Lidocaïne injecteren (een totale dosis van 7 mg/kg niet overschrijden) subcutaan tot de huid gevoelloos. Een druppel van dierenarts zalf voor de ogen (bijvoorbeeld, paraffine) van toepassing.
- Maak een grondige en een lange (~ 2 cm) Sagittaal incisie in de schouderstreek met een scalpel, vanaf het voorhoofd naar de nek. Ontleden van de weefsels, met inbegrip van het beenvlies van de schedel, en vervolgens met behulp van een beitel of tand pincet Reinig het gebied tussen de cristae van de twee botten van de temporale. Houd de schedel blootgesteld door het intrekken van de ontleed huid met behulp van vier bulldogs.
- Voorzichtig plaats van fijne pincet tussen de steile rand van het bot van de temporale en de spieren en scheiden. Ziften bewegingen bloot zo veel van het grote oppervlak van het bot van de temporale mogelijk te maken, bij voorkeur van de rand van het achterhoofdsbeen op het vlak van de coronale hechtingen, zonder beschadiging van de spieren te maken.
- Plaats de oprolmechanismen bitemporally te houden van de botten van de temporale blootgesteld.
- Spoel het oppervlak van de schedel met 1-2 mL 3% H2O2, daarna wassen met 1-2 mL water.
- Het oppervlak van de temporale botten zeer zorgvuldig drogen, dweilen van het vocht met oogbeschadigingen en/of stokken. Test als de elektroden van de stimulatie op het oppervlak van de schoongemaakte verticale schedel past (de bovenste rand van de stimulatie elektrode moet in overeenstemming met de rand van de crista van de temporale-bone). De bulldogs en de oprolmechanismen opnieuw aanpassen of vorm van de stimulatie-elektroden met een schaar, indien nodig.
- Vul de holtes van de stimulatie gel-elektroden met electroconductive en een dun laagje lijm op de rand van de elektroden gezet.
- Plaats van de elektrode stimulatie op het droge oppervlak van de temporale-bone met een nauwkeurige beweging en het stevig op zijn plaats houden gedurende 1 minuut met een fijne pincet. Zorg ervoor dat er geen vocht in contact met de lijm is. MOP omhoog met oogbeschadigingen en/of stokken, indien nodig.
Let op: In het geval dat eventuele instabiliteit van de elektrode wordt ervaren, verwijderen. Na het schoonmaken van het bot, herhaalt u deze stap met een nieuwe stimulatie-elektrode. - Put tandheelkundige cement over de randen van de stimulatie-elektrode, terwijl er voortdurend de lekkende vocht van de weefsels met oogbeschadigingen en/of stokken is opgedroogd. Betrekking hebben op de hele stimulatie elektrode met cement.
- Nadat de cement volledig gehard is, herhaal deze stappen aan de contralaterale zijde.
- Sommige boorgaten overal de schedel voor verankering schroeven. Rijden van miniatuur schroeven in de gaten en zet tandheelkundige cement over hen. Gebruik een kleinere diameter van ~ 10% boor hoofd ten opzichte van de diameter van de schroef.
- Afhankelijk van het doel van de experimenten, soldeer een connector aan de uiteinden van de kabels, plaats het op het oppervlak en bedek met cement, of blijven implanteren van de opname elektroden en optische vezels, of een cranial venster voor te bereiden over de schedel. In dit laatste geval, soldeer de connectors en hen te verankeren aan de construct pas op het einde. Implant in het geval van de behoefte van langdurig gelijktijdige TES en LFP opnamen, de bovengenoemde elektrode drieling in plaats van enkele draden.
Opmerking: Deze instelling maakt het mogelijk voor de verwijdering van gemeenschappelijke modus stimulatie artefacten8. Zie voor de details van de opname van de elektrode implantatie, eerdere protocollen14,15. - Wassen van de blootgestelde weefsels overvloedig met een ontsmettingsmiddel. 1-2% Lidocaïne injecteren (een totale dosis van 7 mg/kg niet overschrijden) subcutaan.
- Debride randen van de wond en hen te sluiten met eenvoudige onderbroken hechtingen rondom de connector/implantaat. Desinfecteer de wond met Povidon-jodium.
- Carprofene van 5 mg/kg subcutaan injecteren. Herhaal dit indien nodig.
Opmerking: Elke andere analgetica kunnen worden gebruikt overeenkomen met de eisen die de lokale ethische toestemming van bestuur. - Opschorting van verdoving, laat de earbars en neusstuk en zet het dier in een kooi postoperatieve herstel te herwinnen bewustzijn.
- Zorg ervoor dat het dier onder nauw toezicht tijdens de eerste postoperatieve uren. Blijven volgen het implantaat gebied periodiek.
Opmerking: Het dier mag niet worden overgelaten zonder toezicht totdat het voldoende bewustzijn te handhaven sternale lighouding heeft herwonnen. Huis het dier individueel tot volledig herstel van de procedure.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De inplanting van chronische stimulering elektroden (figuur 1B) kan worden gecombineerd met extra implantatie van elektroden (Figuur 1 c-D) opnemen. Dergelijke instellingen zijn geschikt om op aanvraag opname en stimulatie systemen te bemoeien met de activiteiten van de specifieke hersenen te vormen. Hier presenteren we de resultaten van de vertegenwoordiger van een kringloopsysteem epilepsie brandontdekkings- en...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De meest kritische stap van dit protocol is het lijmen van het elektrode-pakket op het oppervlak van bot. In geval van onjuiste afdichting, een kloof ontstaat tussen de elektroden en het bot, en secundaire littekenweefsel kan groeien in deze leemte, die de kwaliteit van stimulatie vermindert. Het oppervlak van bot moet volledig droog zijn tijdens de stappen van de steken op de verpakking, en in het geval van ervaren instabiliteit van de elektroden, het moet worden verwijderd en vervangen door een nieuw pakket te krijgen ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Antal Berényi is de eigenaar en oprichter van Amplipex Ltd, een bedrijf dat productie van grootschalige multiplexing biosignal versterkers. Gábor Kozák en Tamás Földi hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gesteund door de EU-FP7-ERC-2013-Starting grant (No.337075), het 'Momentum'-programma van de Hongaarse Academie van Wetenschappen (LP2013-62), en de GINOP-2.3.2-15-2016-00018 grant. Wij danken Máté Kozák voor het documenteren van de stimulatie en opname van elektroden en Mihály Vöröslakos voor de vruchtbare discussies tijdens protocol ontwerp.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Cyanoacrylate vloeistof | Henkel | Loctite 401 | |
| Cyanoacrylate gel | Henkel | Loctite 454 | |
| Draad voor stimulatie-elektroden | Phoenix Wire Inc. | 36744MHW - PTFE Microminiature Hook-Up Wire | |
| Bordspatie | E-tec Interconnect | SP1-020-S378/01-55 | |
| Connector | E-tec Interconnect | P2510I-02 | |
| Tape-verpakking voor stimulatie-elektroden | Nexperia | 74HC1G00GW | Tape-verpakking van elke geïntegreerde schakeling met SOT-353-behuizing kan worden gebruikt |
| Gripcement industrieel graad | Caulk Dentsply | 675571 (poeder) 675572 (oplosmiddel) | |
| Elektrogeleidend gel | Rextra | ECG Gel | |
| Opname-elektrodedraad | California Fine Wire Co. | .002 (50 micron) Tungsten 99.95% (CFW Materiaal #: 100-211), HMl-Natuurlijk, gesneden tot 3,0 inch stukken, Rond, Gesneden lengte stuk draad | |
| Ultrafijne schaar | Hammacher Instrumente | Roestvrij HSB 544-09 | |
| Roestvrijstalen buis | Vita Needle Company | 29 RW, 304SS Buizen, T.I.G. Gelast en Plug | |
| Snelle draaischijfzaag | Dremel | Model # 395 | |
| Draaischijfhouder | Dremel | Model # 220 | |
| Draaischijfsnijwiel | Dremel | Model # 409 | |
| Oculairsticks | Lohmann-Rauscher | Pro-ophta Ocular Sticks | |
| Natte desinfectiemiddel | Egis | Betadine | |
| Droge desinfectiemiddel | Wagner Pharma | Reseptyl-ureum | |
| Boormachine | NSK-Nakanishi United Kingdom | Vmax35RV Pack | |
| Ankerschroeven | Antrin Miniature Specialties, Inc. | 000-120x1/16 SL BIND MS SS |
Referenties
- Ozen, S., et al. Transcranial electric stimulation entrains cortical neuronal populations in rats. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (34), 11476-11485 (2010).
- Ali, M. M., Sellers, K. K., Frohlich, F. Transcranial alternating current stimulation modulates large-scale cortical network activity by network resonance. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (27), 11262-11275 (2013).
- Helfrich, R. F., et al. Entrainment of brain oscillations by transcranial alternating current stimulation. Current biology : CB. 24 (3), 333-339 (2014).
- Bikson, M., et al. Transcranial direct current stimulation for major depression: a general system for quantifying transcranial electrotherapy dosage. Current treatment options in neurology. 10 (5), 377-385 (2008).
- Lefaucheur, J. P., et al. Evidence-based guidelines on the therapeutic use of transcranial direct current stimulation (tDCS). Clinical neurophysiology : official journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 128 (1), 56-92 (2017).
- Kuo, M. F., Nitsche, M. A. Effects of transcranial electrical stimulation on cognition. Clinical EEG and neuroscience. 43 (3), 192-199 (2012).
- Sandrini, M., Fertonani, A., Cohen, L. G., Miniussi, C. Double dissociation of working memory load effects induced by bilateral parietal modulation. Neuropsychologia. 50 (3), 396-402 (2012).
- Berenyi, A., Belluscio, M., Mao, D., Buzsaki, G. Closed-loop control of epilepsy by transcranial electrical stimulation. Science. 337 (6095), New York, N.Y. 735-737 (2012).
- Kozak, G., Berenyi, A. Sustained efficacy of closed loop electrical stimulation for long-term treatment of absence epilepsy in rats. Scientific reports. 7 (1), 6300(2017).
- Fertonani, A., Ferrari, C., Miniussi, C. What do you feel if I apply transcranial electric stimulation? Safety, sensations and secondary induced effects. Clinical neurophysiology : official journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 126 (11), 2181-2188 (2015).
- Marshall, L., Binder, S. Contribution of transcranial oscillatory stimulation to research on neural networks: an emphasis on hippocampo-neocortical rhythms. Frontiers in human neuroscience. 7, 614(2013).
- Reato, D., Rahman, A., Bikson, M., Parra, L. C. Effects of weak transcranial alternating current stimulation on brain activity-a review of known mechanisms from animal studies. Frontiers in human neuroscience. 7, 687(2013).
- Thut, G., Miniussi, C. New insights into rhythmic brain activity from TMS-EEG studies. Trends in cognitive sciences. 13 (4), 182-189 (2009).
- Gage, G. J., et al. Surgical implantation of chronic neural electrodes for recording single unit activity and electrocorticographic signals. Journal of visualized experiments : JoVE. (60), (2012).
- Vandecasteele, M., et al. Large-scale recording of neurons by movable silicon probes in behaving rodents. Journal of visualized experiments : JoVE. (61), e3568(2012).
- Zayachkivsky, A., Lehmkuhle, M. J., Dudek, F. E. Long-term Continuous EEG Monitoring in Small Rodent Models of Human Disease Using the Epoch Wireless Transmitter System. Journal of visualized experiments : JoVE. (101), e52554(2015).
- Ung, K., Arenkiel, B. R. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of visualized experiments : JoVE. (68), e50004(2012).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. Journal of visualized experiments : JoVE. (12), (2008).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
