Methodenartikel

Auditieve Brainstem Response en buitenste Haarcel geheel-cel Patch klem opname bij postnatale ratten

DOI:

10.3791/56678

⸱

24 mei 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, School of Basic Medical Sciences, Southern Medical University, 2School of Basic Medical Sciences, Guizhou Medical University, 3Department of Laboratory Medicines, Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Region, Southern Medical University, 4Experiment Teaching Center, School of Basic Medical Sciences, Southern Medical University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol wordt beschreven methoden om vast te leggen van de auditieve brainstem response van postnatale rat pups. Om te onderzoeken de functionele ontwikkeling van buitenste haarcellen, is de experimentele procedure van geheel-cel patch klem opnemen in geïsoleerde buitenste haarcellen stapsgewijze beschreven.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De buitenste Haarcel is één van de twee soorten zintuiglijke haarcellen in het slakkenhuis van zoogdieren. Ze veranderen de lengte van hun cellen met de receptor potentieel aan het vergroten van de zwakke trilling van low-level geluidssignaal. De morfologie en elektrofysiologische eigenschap van de buitenste haarcellen (OHCs) ontwikkelen in vroege postnatale leeftijden. De rijping van buitenste Haarcel kan bijdragen aan de ontwikkeling van het auditieve systeem. Het proces van OHCs ontwikkeling is echter niet goed bestudeerd. Dit is deels vanwege de moeilijkheid om het meten van hun functie door een elektrofysiologische aanpak. Met als doel het ontwikkelen van een eenvoudige methode om de bovengenoemde kwestie, beschrijven hier we een stapsgewijze protocol om te bestuderen van de functie van OHCs in acuut gedissocieerde slakkenhuis van postnatale ratten. Met deze methode kunnen we evalueren de cochleair reactie op zuivere Toon stimuli en onderzoeken of het niveau van expressie en functie van de motor eiwit-prestin in OHCs. Deze methode kan ook worden gebruikt om te onderzoeken van de binnenste haarcellen (IHCs).

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Twee afzonderlijke functies van cochleair zintuiglijke haarcellen zijn essentieel voor zoogdieren hoorzitting: mechanoelectric transductie (BMO) en electromotility1,2. Door BMO kanalen bevindt zich in de haar bundel, IHCs (IHCs) en OHCs converteren geluid trillingen in membraan potentiële wijzigingen, alsmede de elektrische signalen van bezenuwde spiraalvormige ganglion neuronen. OHCs wijzigen van de lengte van hun cellen met de membraanpotentiaal en versterken de trillingen van laag niveau geluid. Deze activiteit genoemd electromotility is afgeleid van de prestin van de motor eiwit gelegen in de laterale wand van OHCs3.

In vele soorten, met inbegrip van knaagdieren, is het gehoor onvolwassen in vroege postnatale epoch4,5. Geen actiepotentiaal in reactie op sound '-signalen kunnen worden opgespoord in de auditieve cortex vóór de hoorzitting begin6,7. Ontwikkeling van de morfologie en functie van het slakkenhuis is veel onderzocht in gerbil, muis en rat4,5,8. De mechanotransduction en de electromotility van haarcellen worden ook ontwikkeld in de vroege leven epoch5.

Om te evalueren van de gevoeligheid van de hoorzitting van ratten op verschillende postnatale leeftijden, hebben we een methode voor auditieve brainstem response (ABR) opname in rat pups ontwikkeld. Geheel-cel patch klem is een ideale technologie te onderzoeken van de OHCs electrophysiologically. Echter, vergeleken met de patch klem uitgevoerd in neuronen en andere epitheliale cellen, het lage tarief van geheel-cel afdichting beperkt het onderzoek van electromotility van geïsoleerde OHCs.

Hier beschrijven we een procedure voor het onderzoek naar de OHCs morfologisch en electrophysiologically in acuut gedissocieerde slakkenhuis van postnatale ratten. Deze methode kan worden aangepast voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen die binnenste Haarcel ontwikkeling en functie regelen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle experimentele protocollen met betrekking tot dierlijke onderwerpen werden goedgekeurd door de ethische commissie van het dier van de zuidelijke medische universiteit.

1. Prepareer oplossingen experimenten

  1. Voorbereiden van de verdoving (Zie Tabel van materialen): 1,5% pentobarbital natrium opgelost in ddH2O.
  2. Bereid de dissectie-oplossing (Zie Tabel van materialen): Los een tas van Leiboviz van L-15 poeder in 1 L van ddH2O. Adjust pH ten slotte op 7.3 met 1 M NaOH. Osmolariteit naar 300-330 mOsm aanpassen met behulp van een osmometer en 10 mM HEPES vóór gebruik.
  3. Ontbinden van 2 mg/mL collagenase IV (Zie Tabel van materialen) in dissectie oplossing bereid in stap 1.2.
  4. Bereiden van de oplossingen van immunokleuring (Zie Tabel van materialen): Los de 4% paraformaldehyde in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
    Let op: Paraformaldehyde is giftig; Draag passende bescherming.
  5. Verdun de 0,3% permeabiliteit agent in PBS. Verdun het serum 10% normale geit in PBS als de buffer met blokkerend. Verdun de prestin antilichaam 1:200 in de blokkeerbuffer. Verdun de 1:600 van de Alexa488-geconjugeerde antilichaam in blokkeerbuffer. Verdun de Phalloidin-Tetramethylrhodamine-B-isothiocyanaat 1:200 in PBS.
  6. Bereid de extracellulaire oplossing (Zie Tabel van materialen): voorbereiden van de Leiboviz L-15 medium zoals hierboven (stap 1.2) beschreven.
  7. Bereid de intracellulaire oplossing (Zie Tabel van materialen).

2. ABR opname

Opmerking: ABR opname heeft al eerder in detail beschreven in onze eerdere studie9.

  1. Anesthetize Sprague-Dawley (SD) ratten (1-14 dag oud pups en 2 - maand oude volwassenen, beide geslachten) met een enkele injectie van 1,5% natrium pentobarbital (22 mg/kg voor pups en 30 mg/kg voor volwassenen, intraperitoneaal (i.p.)).
  2. Plaats de narcose dier in een POLYETHYLEENSCHUIM mal te immobiliseren lichaam van het dier. Plaats het dier op de tafel van een anti-trillingen in een kamer met geluid-verzachtende. Houd het dier de lichaamstemperatuur bij 37,5 ° C met een verwarming pad.
  3. Veeg het hoofd gebied met ethanol 70% (vol/vol). Met behulp van een fijne schaar, maken de insnijding van een 1-2 mm ventrolateral de externe pinna de referentie-elektrode of de grond te plaatsen. Een onderhuidse naald elektrode (opname elektrode) is gelegen op het hoekpunt van de schedel (figuur 1A).
  4. Met behulp van de functiegenerator, genereren gekalibreerde Toon uitbarstingen (1 ms stijging/daling, 3 ms plateau) van verschillende frequenties (2, 4, 8, 16, 24 en 32 kHz) en intensiteiten (daalde van 85 tot 10 dB SPL in stap 5 dB). Variëren de frequentie en amplitude handmatig of met behulp van een computer. Leveren goede stimuli via een elektrostatische luidspreker gelegen 10 cm weg richting het hoofd van het dier.
  5. Filteren (100-1000 Hz), versterken en gemiddelde (256 keer) het geluid elicited potentieel met behulp van een multi-functioneel processor om de ABR's. De ABR sporen wordt gecontroleerd online en opgeslagen voor off line analyse. Het duurt ongeveer 40 minuten te voltooien de ABR opnemen van het ene dier.
    Opmerking: Meestal drie tot zeven toppen (Golf ik aan Golf VII) met latencies minder dan 15 ms kan worden geïdentificeerd (figuur 1B). De ABR drempel wordt gedefinieerd als het minimum geluidsniveau welke Golf I en II kunnen worden gedetecteerd.
  6. Voordat de dieren wakker uit narcose (met een intraperitoneale injectie van 0.3 mL 1,5% natrium pentobarbital) euthanaseren.

3. het orgaan van Corti (OC) dissectie

  1. Anesthetize rat pups. Voor ratten minder dan 6 dagen oud (< P6), houd het dier in een schotel van 100 mm cultuur en dekking van de schotel met ijs gedurende 10 minuten. Voor ratten > P6, anesthetize het dier met een enkele injectie van 1,5% natrium pentobarbital (22 mg/kg, i.p.). Decapitate de rat pups na narcose.
  2. Steriliseren het hoofd door te besproeien met 70% (vol/vol) ethanol.
  3. Open de schedel langs de Sagittaal middellijn met een schaar; Verwijder de hersenen om het binnenoor bloot te stellen.
  4. Breng het binnenoor in een 35-mm petrischaal gevuld met 3 mL ijskoud L-15 (figuur 2A).
  5. Gebruik onder de Microscoop dissectie, fijne pincet te verwijderen van de benige capsule van het slakkenhuis (figuur 2B).
  6. Uitpakken van de OC en bijbehorende stria vascularis (SV) van de modiolus.
  7. Door te houden het basale gedeelte van de SV met pincet, scheiden de OC vanaf de SV volledig tot rust te komen langzaam van base-naar-apex (figuur 2C).
  8. De OC gelijkmatig in drieën gesneden met behulp van fijn schaar (figuur 2D).

4. immunofluorescentie kleuring

  1. Met behulp van een 200 µL pipette uiteinde, overdracht van de segmenten van OC (stap 3.8) op een glasplaatje en repareren met 100 µL van 4% paraformaldehyde gedurende ten minste 4 uur bij 4 ° C.
    Let op: Paraformaldehyde is giftig; Draag passende bescherming.
  2. Het wassen van het weefsel door verdringt de paraformaldehyde met 100 µL van verse PBS. Het wassen van het weefsel drie keer, gedurende 10 min.
  3. Het weefsel met 0,3% permeabiliteit agent in PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur incuberen.
  4. Negeren van de permeabiliteit agent in PBS en wassen van het weefsel driemaal met PBS.
  5. Blok met 10% serum van de normale geit in PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  6. Incubeer met anti-prestin-C-terminus antilichaam (1:200) in het blokkeren van de oplossing gedurende 2 uur bij kamertemperatuur of bij 4 ° C's nachts.
  7. Spoel driemaal met PBS voor 5 min.
  8. Incubeer met Alexa488-geconjugeerde secundaire antilichamen (1:600) in blokkerende oplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker.
  9. Spoel driemaal met PBS gedurende 5 min. in het donker.
  10. Incubeer met rhodamine-phalloidin (1:200) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
  11. Spoel driemaal met PBS gedurende 5 min. in het donker.
  12. Monteren op een glasplaatje met montage medium (dat DAPI). Afbeelding met confocale microscopie met behulp van 405 nm, 488 nm, en 594 nm lasers. De kracht van de laser vastgesteldop 0,1-0,5 mW en de scan snelheid op 0.5 frame/s.

5. Patch klem opname van geïsoleerde OHCs

  1. Gebruik de pipet trekker en micro-vervalser om patch pipettes met een diameter van tip 2-3 µm. Back-fill de pipetten met intracellulaire oplossing. Meestal was het aanvankelijke verzet van patch Pipetteer 2.5-3.5 MΩ in Bad oplossing.
  2. Pipetteer een stuk van de OC (uit stap 3.8) in een 35 mm petrischaal met behulp van een 200 µL Pipetteer tip. Het verteren van het weefsel met 100 µL van enzymatische spijsvertering medium (collagenase IV, Zie Tabel van materialen) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Verplaats de enzymatische spijsvertering medium met 100 µL van L-15. Snijd het weefsel in kleine stukjes met behulp van een micro scalpel te isoleren van de haarcellen.
  4. Na de zachte pipetteren, breng de cellen in een zelfgemaakte kleine kunststof kamer (diameter ~ 1,5 cm) gevuld met enzym-gratis Bad oplossing (~ 1,5 mL, Zie Tabel van materialen).
  5. Plaats de zaal op het toneel van een omgekeerde Microscoop. De gezonde-verschijnende eenzame OHCs vinden.
  6. Laad de patch pipet in de hoofd fase van een 700B versterker. Verplaatsen van de patch pipet zorgvuldig door een micromanipulator en plaats het rond de onderkant van het buitenste Haarcel (figuur 3A).
  7. Geheel-cel patch klem de Kopklep door het afdichten van de laterale wand van de cel lichaam. Lichte afzuigen totdat het celmembraan is gescheurd. Vastgesteldop hetbedrijf potentiële-70 mV. Cellen met toegang weerstand varieerden van 10 tot 17 MΩ en membraan weerstand varieerde van 100 tot 500 MΩ, en worden beschouwd als een succesvolle configuratie van geheel-cel.
  8. Met behulp van computer control, toepassing hyperpolarizing en depolarizing van de spanning (250 ms duur en variërend van −140 tot +94 mV in 13 stappen van de mV) naar de cel te ontlokken geheel-cel stromingen.
  9. Versterken van de gehele-cel stromingen, (hoek frequentie van 5 kHz) filteren met een 700B versterker. De gegevens door een 1440A converter en het petto voor off line analyse converteren.
  10. Het meten van de capaciteit van de membraan van OHCs met een twee sinusvormige spanning stimulans protocol gecontroleerd door een klem van de Patchsoftware. Instellen van de stimuleren spanningsbereik van-140 tot 110 mV. Opslaan van de gegevens voor off line analyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ABR kunt ontlokte worden uit narcose rat pups ouder dan postnatale dag 7 (P7) met behulp van zuivere toon uitbarstingen (figuur 1A). Zoals blijkt uit figuur 1B, verkregen de ABR golfvormen rat pups bleek slechts drie tot vier verschillende golven met een kleine amplitude. Meestal werden tot zeven pieken waargenomen in de ABR-golfvormen van volwassen dieren (figuur 1B).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bij ratten jonger dan dag 11, kon geen actiepotentiaal in reactie op geluid stimulatie worden waargenomen in de auditieve cortex6,7. Daarom, postnatale dag 11 wordt beschreven als "hoorzitting begin"10. De ontwikkeling van gehoor voordat hoorzitting begin was niet goed nog onderzocht. Met de soortgelijke methode voor volwassen ABR opname, we laten zien dat de ABR's kunnen worden ontlokte door zuivere Toon burst van rat pups jonger dan P11 ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gesteund door subsidies van het 973 programma (2014CB943002) en de nationale Natural Science Foundation van China (11534013, 31500841).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Verdoving
Pentobarbital natriumSigmaP37611,5% in water
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Dissectieoplossing
Leiboviz's L-15 MediumLife Technologies41300-0391 verpakking in 1 L water
Collageenase IVSigmaC51382 mg/mL in L-15
HEPESSigma7365-45-910 mM
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Immunostaineloplossingen
PBSThermo Fisher Scientific10010023PH 7,3
ParaformaldehydeSigma1581274% in PBS
Triton X-100AmrescoZS-06940,3% in PBS
Normaal geitenserumThermo Fisher Scientific10000C10% in PBS
prestin antilichaamSanta CruzSC-22694dil 1:200
Alexa Fluor 488-geconjugeerd antilichaamThermo Fisher ScientificA-11055dil 1:600
Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanateSigmaP1951dil 1:200
DAPISolarbioC0060dil 1:20
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Extracellulaire oplossing
Leiboviz's L-15 MediumLife Technologies41300-0391 verpakking in 1 L water
HEPESSigma7365-45-910 mM
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Intracellulaire oplossing
CsClSigma7647-17-8140 mM
MgCl2Sigma7791-18-62 mM
EGTASigma67-42-510 mM
HEPESSigma7365-45-910 mM
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Apparatuur
OsmometerGonotecOSMOMAT 3000 basic
PincetWPI14095Tweezers dumont
MicropipettrekkerSutter InstrumentMODLE-P97
Micro ForgeNarishigenMF-830
Mini Operating SystemSutter InstrumentMP-285
MultiClampAxon700B
Laag-ruis dataverzameling systeemAxon1440A
ES1 luidsprekerTucker-Davis Technologies
TDT system 3Tucker-Davis Technologies
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Software
SigGenRP-softwareTucker-Davis Technologies
BioSigRP-softwareTucker-Davis Technologies
jClampScientific Solutions
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Dier
SD-ratExperimental Animal Center of Southern Medical University

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. He, D. Z., Zheng, J., Kalinec, F., Sacchi Kakehata, S. S. antos-, J, Tuning in to the amazing outer hair cell: membrane wizardry with a twist and shout. J Membr Biol. 209, 119-134 (2006).
  2. Dallos, P. Cochlear amplification, outer hair cells and prestin. Curr Opin Neurobiol. 18, 370-376 (2008).
  3. Zheng, J., et al. Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells. Nature. 405, 149-155 (2000).
  4. Abe, T., et al. Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse. J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).
  5. Waguespack, J., Salles, F. T., Kachar, B., Ricci, A. J. Stepwise morphological and functional maturation of mechanotransduction in rat outer hair cells. J Neurosci. 27, 13890-13902 (2007).
  6. Zhang, L. I., Bao, S., Merzenich, M. M. Persistent and specific influences of early acoustic environments on primary auditory cortex. Nat Neurosci. 4, 1123(2001).
  7. De, V. -S. E., Chang, E. F., Bao, S., Merzenich, M. M. Critical period window for spectral tuning defined in the primary auditory cortex (A1) in the rat. J Neurosci. 27, 180-189 (2007).
  8. He, D. Z., Evans, B. N., Dallos, P. First appearance and development of electromotility in neonatal gerbil outer hair cells. Hearing Res. 78, 77-90 (1994).
  9. Hang, J., et al. Synchronized Progression of Prestin Expression and Auditory Brainstem Response during Postnatal Development in Rats. Neural Plast. , 4545826(2016).
  10. Ehret, G. Development of absolute auditory thresholds in the house mouse (Mus musculus). J Am Audiol Soc. 1, 179-184 (1976).
  11. Møller, A. R. Hearing:anatomy, physiology, and disorders of the auditory system. , Academic Press. Dallas. (2006).
  12. He, D. Z., Zheng, J., Edge, R., Dallos, P. Isolation of cochlear inner hair cells. Hearing Res. 145, 156-160 (2000).
  13. Tang, J., Pecka, J. L., Tan, X., Beisel, K. W., He, D. Z. Z. Engineered Pendrin Protein, an Anion Transporter and Molecular Motor. J Biological Chem. 286, 31014-31021 (2011).
  14. Fu, M., et al. The Effects of Urethane on Rat Outer Hair Cells. Neural Plast. 2016, 1-11 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Cochleaire haarcellenprestine expressieconfocale microscopieweefseldigestieisolatie van haarcellenelektrofysiologische registratie

Gerelateerde artikelen