Dit protocol wordt beschreven methoden om vast te leggen van de auditieve brainstem response van postnatale rat pups. Om te onderzoeken de functionele ontwikkeling van buitenste haarcellen, is de experimentele procedure van geheel-cel patch klem opnemen in geïsoleerde buitenste haarcellen stapsgewijze beschreven.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Auditieve Brainstem Response en buitenste Haarcel geheel-cel Patch klem opname bij postnatale ratten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De buitenste Haarcel is één van de twee soorten zintuiglijke haarcellen in het slakkenhuis van zoogdieren. Ze veranderen de lengte van hun cellen met de receptor potentieel aan het vergroten van de zwakke trilling van low-level geluidssignaal. De morfologie en elektrofysiologische eigenschap van de buitenste haarcellen (OHCs) ontwikkelen in vroege postnatale leeftijden. De rijping van buitenste Haarcel kan bijdragen aan de ontwikkeling van het auditieve systeem. Het proces van OHCs ontwikkeling is echter niet goed bestudeerd. Dit is deels vanwege de moeilijkheid om het meten van hun functie door een elektrofysiologische aanpak. Met als doel het ontwikkelen van een eenvoudige methode om de bovengenoemde kwestie, beschrijven hier we een stapsgewijze protocol om te bestuderen van de functie van OHCs in acuut gedissocieerde slakkenhuis van postnatale ratten. Met deze methode kunnen we evalueren de cochleair reactie op zuivere Toon stimuli en onderzoeken of het niveau van expressie en functie van de motor eiwit-prestin in OHCs. Deze methode kan ook worden gebruikt om te onderzoeken van de binnenste haarcellen (IHCs).
Inleiding
Twee afzonderlijke functies van cochleair zintuiglijke haarcellen zijn essentieel voor zoogdieren hoorzitting: mechanoelectric transductie (BMO) en electromotility1,2. Door BMO kanalen bevindt zich in de haar bundel, IHCs (IHCs) en OHCs converteren geluid trillingen in membraan potentiële wijzigingen, alsmede de elektrische signalen van bezenuwde spiraalvormige ganglion neuronen. OHCs wijzigen van de lengte van hun cellen met de membraanpotentiaal en versterken de trillingen van laag niveau geluid. Deze activiteit genoemd electromotility is afgeleid van de prestin van de motor eiwit gelegen in de laterale wand....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimentele protocollen met betrekking tot dierlijke onderwerpen werden goedgekeurd door de ethische commissie van het dier van de zuidelijke medische universiteit.
1. Prepareer oplossingen experimenten
- Voorbereiden van de verdoving (Zie Tabel van materialen): 1,5% pentobarbital natrium opgelost in ddH2O.
- Bereid de dissectie-oplossing (Zie Tabel van materialen): Los een tas van Leiboviz van L-15 poeder in 1 L van ddH2O. Adjust pH ten slotte op 7.3 met 1 M NaOH. Osmolariteit naar 300-330 mOsm aanpassen met behulp van een osmometer en 10 mM HEPES vóór gebruik.<....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
ABR kunt ontlokte worden uit narcose rat pups ouder dan postnatale dag 7 (P7) met behulp van zuivere toon uitbarstingen (figuur 1A). Zoals blijkt uit figuur 1B, verkregen de ABR golfvormen rat pups bleek slechts drie tot vier verschillende golven met een kleine amplitude. Meestal werden tot zeven pieken waargenomen in de ABR-golfvormen van volwassen dieren (figuur 1B).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Bij ratten jonger dan dag 11, kon geen actiepotentiaal in reactie op geluid stimulatie worden waargenomen in de auditieve cortex6,7. Daarom, postnatale dag 11 wordt beschreven als "hoorzitting begin"10. De ontwikkeling van gehoor voordat hoorzitting begin was niet goed nog onderzocht. Met de soortgelijke methode voor volwassen ABR opname, we laten zien dat de ABR's kunnen worden ontlokte door zuivere Toon burst van rat pups jonger dan P11 .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gesteund door subsidies van het 973 programma (2014CB943002) en de nationale Natural Science Foundation van China (11534013, 31500841).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Verdoving | |||
| Pentobarbital natrium | Sigma | P3761 | 1,5% in water |
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
| Dissectieoplossing | |||
| Leiboviz's L-15 Medium | Life Technologies | 41300-039 | 1 verpakking in 1 L water |
| Collageenase IV | Sigma | C5138 | 2 mg/mL in L-15 |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
| Immunostaineloplossingen | |||
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | PH 7,3 |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4% in PBS |
| Triton X-100 | Amresco | ZS-0694 | 0,3% in PBS |
| Normaal geitenserum | Thermo Fisher Scientific | 10000C | 10% in PBS |
| prestin antilichaam | Santa Cruz | SC-22694 | dil 1:200 |
| Alexa Fluor 488-geconjugeerd antilichaam | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | dil 1:600 |
| Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma | P1951 | dil 1:200 |
| DAPI | Solarbio | C0060 | dil 1:20 |
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
| Extracellulaire oplossing | |||
| Leiboviz's L-15 Medium | Life Technologies | 41300-039 | 1 verpakking in 1 L water |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
| Intracellulaire oplossing | |||
| CsCl | Sigma | 7647-17-8 | 140 mM |
| MgCl2 | Sigma | 7791-18-6 | 2 mM |
| EGTA | Sigma | 67-42-5 | 10 mM |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
| Apparatuur | |||
| Osmometer | Gonotec | OSMOMAT 3000 basic | |
| Pincet | WPI | 14095 | Tweezers dumont |
| Micropipettrekker | Sutter Instrument | MODLE-P97 | |
| Micro Forge | Narishigen | MF-830 | |
| Mini Operating System | Sutter Instrument | MP-285 | |
| MultiClamp | Axon | 700B | |
| Laag-ruis dataverzameling systeem | Axon | 1440A | |
| ES1 luidspreker | Tucker-Davis Technologies | ||
| TDT system 3 | Tucker-Davis Technologies | ||
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
| Software | |||
| SigGenRP-software | Tucker-Davis Technologies | ||
| BioSigRP-software | Tucker-Davis Technologies | ||
| jClamp | Scientific Solutions | ||
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
| Dier | |||
| SD-rat | Experimental Animal Center of Southern Medical University |
Referenties
- He, D. Z., Zheng, J., Kalinec, F., Sacchi Kakehata, S. S. antos-, J, Tuning in to the amazing outer hair cell: membrane wizardry with a twist and shout. J Membr Biol. 209, 119-134 (2006).
- Dallos, P. Cochlear amplification, outer hair cells and prestin. Curr Opin N....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
