Methodenartikel

Het opbouwen van een High-throughput Screening Platform te beoordelen van de heterogeniteit van de HER2-gen Amplification in kanker van de borst

DOI:

10.3791/56686

⸱

5 december 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Pathology, Fondazione IRCCS Ca' Granda, Ospedale Maggiore Policlinico, 2School of Medicine, University of Milan, 3School of Biology, University of Pavia, 4Division of Breast Surgery, Fondazione IRCCS Ca' Granda - Ospedale Maggiore Policlinico, 5Division of Medical Oncology, Fondazione IRCCS Ca' Granda - Ospedale Maggiore Policlinico, 6Department of Biomedical, Surgical, and Dental Sciences, University of Milan

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Heterogene verdeling van de HER2-positieve cellen kan worden waargenomen in een subset van kanker van de borst en genereert klinische dilemma's. Hier introduceren we een betrouwbare en voordelige protocol definiëren, meten en vergelijken van HER2 intra-tumor genetische heterogeniteit in een groot aantal ongelijkmatig verwerkte borstkankers.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gerichte therapieën tegen de menselijke epidermale groeifactor receptor 2 (HER2) hebben de uitkomst van patiënten met kanker van de borst van de HER2-positieve radicaal veranderd. Een minderheid van de gevallen wordt echter een heterogene verdeling van de HER2-positieve cellen, die grote klinische uitdagingen genereert weergegeven. Tot op heden hebben geen betrouwbare en gestandaardiseerde protocollen voor de karakterisering en de kwantificering van de heterogene gen HER2 versterking in grote cohorten voorgesteld. Hier presenteren we een high-throughput methodologie om te beoordelen gelijktijdig de HER2-status over verschillende topografische gebieden van meerdere kanker van de borst. In het bijzonder, illustreren we de procedure laboratorium voor de bouw van verbeterde weefsel microarrays (TMAs) integratie van een gerichte toewijzing van de tumoren. Alle parameters van de TMA zijn speciaal geoptimaliseerd voor het zilver in situ hybridisatie (SISH) van formaline-vaste paraffine-ingebedde (FFPE) borstweefsels. Analyse van Immunohistochemical van de prognostische en voorspellende biomarkers (dat wil zeggen, ER, PR, Ki67 en HER2) moet worden uitgevoerd met gebruikmaking van geautomatiseerde procedures. Een aangepaste SISH protocol is geïmplementeerd zodat een moleculaire analyse van hoge kwaliteit over meerdere weefsels die onderging verschillende procedures voor fixatie, verwerking en opslag. In deze studie bieden wij een bewijs-van-principe dat specifieke opeenvolgingen van DNA gelokaliseerde gelijktijdig op topografische vlakken van meerdere en ongelijkmatig verwerkte borstkankers met behulp van een efficiënte en kosteneffectieve methode zou kunnen zijn.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HER2 is een oncogen dat overexpressie en versterkt in 15-30% van alle invasieve borst kanker1,2. HER2 overexpressie is afgeleid door de aanwezigheid van > 10% cellen met sterke membraan immunohistochemische (IHC) kleuring (3 +), terwijl de versterking van het gen kan worden beoordeeld wanneer de verhouding van de HER2/centromeer ≥2 is ofwel dat het exemplaaraantal gene ≥6, op te tellen bij minste 20 cellen door in situ hybridisatie (ISH)3.

Intra-tumor genetische heterogeniteit is wijd beschreven in kanker van de borst, wordt een potentieel negatieve bijdrage aan de evaluatie van biomarkers en behandelingen reactie4. Volgens het College van Amerikaanse pathologen (GLB), HER2 heterogeniteit bestaat als HER2 wordt versterkt > 5% en < 50% van het infiltreren van tumor cellen5. Helaas, de werkelijke incidentie van HER2 ruimtelijke heterogeniteit in kanker van de borst blijft een onderwerp van controverse tussen de pathologen, met sommige auteurs onderhouden dat het is een uiterst zeldzaam evenement en anderen suggereren dat tot 40% van de gevallen zijn HER2-heterogene1,5,6,7,8,9,10. Ondanks de biologische mechanismen die ten grondslag liggen aan deze voorwaarde zijn niet nog volledig opgehelderd, de prognostische en klinische effecten van intra-tumor HER2 heterogeniteit zijn cruciaal voor borst kanker patiënten11.

Onlangs, helder-veld moleculaire technieken, zoals chromogenic ISH (CISH) en zilveren ISH (SISH), opgedoken als betrouwbare methoden voor het detecteren van HER2 heterogeniteit in FFPE weefsels, met een aantal voordelen ten opzichte van TL ISH (vis)12. Helaas blijft de bulk analyse van individuele gevallen onpraktisch in groot-cohort onderzoeken. Verschillende groepen hebben gesuggereerd dat de combinatie van histochemie, IHC en ISH met TMA technologieën een waardevolle strategie in de studie van biologie van kanker13,14,15,16 vertegenwoordigen kan. Met deze wijd goedgekeurde methode kunnen weefselmonsters van verschillende patiënten worden geanalyseerd gelijktijdig, minimaliseren van de weefsels en reagentia werkzaam en daardoor de bevordering van de uniforme analyse van een groot aantal gevallen14. Er zijn echter geen protocollen beschikbaar voor de gelijktijdige hoog-productie moleculaire karakterisering van meerdere weefselmonsters die onderging verschillende verwerking in termen van reagentia, fixatie tijden en conserveringsmethoden werknemer, bijvoorbeeld als archivering blokken.

Gezien de prognostische en klinische implicaties van HER2 tot ruimtelijke heterogeniteit in borstkanker, ontwikkelden we een geïntegreerde moleculaire platform om te beoordelen in grote reeks ongelijkmatig verwerkte gevallen. Hier, schilderen we de laboratorium-strategieën om te genereren en analyseren van de intra-tumor heterogeniteit van versterking van de HER2 in high yield TMAs van borstkanker door middel van SISH. Het volgende protocol is ontwikkeld voor tumoren meten van > 5 mm (> pT1b volgens het TNM-2017)17. Voor kleinere letsels, is het aan te raden de analyses uitvoeren met full-face seriële secties. Onze procedure zorgt voor de gelijktijdige IHC en SISH analyse van maximaal 30 kanker van de borst, met een gemiddelde van 6 vlakken (bereik 4-8) voor elk geval. Over het geheel genomen zal 180 weefsel kernen van 1 mm in diameter, met 500 µm tussen de kernen, en 2 mm tussen het raster en de randen worden gegenereerd voor elk TMA-blok.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd goedgekeurd door de institutionele evaluatie Boards uit IRCCS Ca' Granda Foundation, Policlinico ziekenhuis, Milan, Italië.

1. de selectie van patiënten en weefsel Specimens

  1. Ophalen van de archivering slides van alle gevallen te worden geanalyseerd, met inbegrip van alle beschikbare haematoxyline en eosine (H & E) en IHC dia's uit de oorspronkelijke diagnose en, indien aanwezig, een H & E van niet-neoplastische borstweefsel (b.v., chirurgische marge) evenementen .
  2. Uitvoeren van case Beoordelingen.
    Opmerking: Voor deze taak, ten minste twee pathologen met ervaring in borst pathologie moeten de diagnostische dia's bespreken en oplossen collegially. Een conventionele Microscoop of hulpmiddelen van de telepathology (de laatste in de multicentrische studie gunst) gebruiken. Indien van toepassing, sluit u alle disharmonische gevallen.
    1. Histologische opnieuw declassificatie van alle gevallen volgens de nieuwste editie van de World Health Organization (WHO) classificatie van tumoren van de borst18uitvoeren
    2. Zorg ervoor dat het normale weefsel voor elk geval, indien aanwezig in het archief klinische monsters, ten minste één niet-neoplastische terminal ductaal-lobulair eenheid omvat.
    3. Identificeren van neoplastische overal die aantonen dat heterogene cytologische, architecturale, of IHC functies met een helder-veld Microscoop (gezamenlijk worden uitgevoerd door een patholoog en de technician(s) die de TMAs zal bouwen).
  3. De discrete topografische gebieden markeren met een viltstift op het glasplaatje of met het juiste gereedschap op een digitale dia software (figuur 1A).
  4. Op basis van de geselecteerde dia's, het ophalen van de overeenkomstige FFPE blokken uit de archieven.
    Opmerking: Voor het optimaliseren van de TMA bouw, voorkomen van uitputting van het weefsel, en het behoud van de TMA punch structurele integriteit, gevallen met < 1 mm dik resterende weefsel dienen te worden uitgesloten.

2. ontwerp en bouw van TMAs gebaseerd op de techniek Kononen

  1. Maken en openen van een nieuwe spreadsheet-bestand waarin de records van de verschillende gebieden van elk geval. Neemt u de volgende gegevens op afzonderlijke kolommen, zoals wordt geïllustreerd in tabel 1: geval ID, blok ID, gebieds-ID, weefseltype (bijvoorbeeldnormale weefsel, invasieve component histotype, in situ component histotype), topografie (bijvoorbeeld, de kern van de tumor, invasieve voorzijde), morfologie (b.v., nucleaire rang, architectuur, tussen, cytologische functies), biomarkers status (d.w.z., oestrogeen receptor (ER), progesteron receptor (PR), Ki67 en HER2), en alle andere IHC functies beschikbaar.
    1. Sla het document.
  2. Maak een TMA-project.
    1. Installeer en open de TMA designer software.
    2. Definiëren van de TMA-ontvanger scripttags: toegang via het menu Bestand > Nieuw > blok of met behulp van CTRL + B.
    3. Klik in het eerste veld te vullen of druk op de Tab-toets, en typ de afmetingen van het blok van de paraffine in: breedte 35 (mm), hoogte 20 (mm). Type "2" als de "marge" (dat wil zeggen, afstand van paraffine rand in mm) (figuur 1B). Sla de gegevens door te klikken op de juiste knop. De nieuwe sjabloon van geadresseerden blok wordt nu opgeslagen en klaar om te worden gebruikt in nieuwe weefsel matrix sjablonen.
    4. Maak een weefsel matrix project: toegang tot het menu Bestand > Nieuw > weefsel Array of met behulp van CTRL + T.
    5. Vul in naam van de matrix weefsel, opmerkingen en auteur, klik op "volgende". Klik op het pictogram 'import', kies het sjabloonbestand van geadresseerden blok eerder hebt gemaakt en klik op "next."
    6. 1 mm als de plek grootte kiezen door te klikken op de ronde knop. Kies 500 µm als plek afstand die de ruimte tussen twee centra van naburige plaatsen. Klik op het calculatorpictogram voor het berekenen van het totale aantal vlekken gemaakt, die 231 moet. Klik op "volgende".
    7. Definieer de plek nummering modus door eenmaal op te klikken. Klik op de knop "definiëren" om rasters en sub rasters te maken. Verwijderen van de central line (lijn 6) en de kolommen 8 en 15. 3 plaatsen van lijn 1 voor oriëntatie te handhaven. De laatste kaart dienen te gelden voor een totaal van 183 plekken, zoals wordt weergegeven in Figuur 2.
    8. De lijst met weefseltypes (HLA) definiëren: toegang via het menu Bestand > Nieuw > lijst weefseltypes (HLA) of met behulp van CTRL + L.
    9. Plaats de beschrijvingen van de weefsel eerder gedefinieerd. Druk op pijl-omlaag of klik op de + knop een regel toe te voegen.
    10. Definiëren van het project: toegang via het menu Bestand > Nieuw > Booster project of met behulp van CTRL + P.
    11. Vul in naam van het weefsel matrix, opmerkingen en auteur, klik op "volgende". Het werkbladbestand, lijst van weefseltypes (HLA) en het weefsel matrix model eerder gemaakt door te klikken op de juiste pictogrammen te importeren.
    12. Klik op 'Alles selecteren' en geef het aantal plekken voor elk weefseltype; Klik op de "match"-knop om de instellingen toe te passen. Er verschijnt een tabel met het totale aantal cores dat zal worden bemonsterd en overgedragen aan geadresseerden blokken in dit project. Sla het project op en sluit het programma.
  3. Bereiden de acceptor scripttags (figuur 1B).
    1. Vul gereinigd metalen mallen met elastische paraffine bij 65 ° C.
    2. Laat de paraffineblokken afkoelen bij kamertemperatuur 's nachts binnenkant van de metalen mallen.
    3. Het uittreksel van de paraffineblokken van de metalen mallen. Als scheuren optreden, het negeren van het blok en herhaalt u stappen 2.3.1-2.3.3.
  4. Construeer de TMA met behulp van een automatische of semi-automatische arrayer-19.
    1. Het ophalen van alle geselecteerde FFPE blokken en de desbetreffende secties van de H & E met aantekeningen.
    2. Schakel de arrayer en plaats de acceptor scripttags op de arrayer carrousel.
    3. De arrayer control station-software niet openen, klik op "Nieuwe weefsel Array", en laden van het project eerder gemaakt (Figuur 1 c).
    4. Klik op "Doorgaan" en selecteer de positie van de donor vak(ken) in het menu.
    5. Definiëren van de startpositie op elke ontvangende blok: gebruik de pijltjestoetsen te bewegen van het laserlicht en lijnen met de rand van de linksboven op de paraffine van het ontvangende blok.
    6. Klik op "volgende" en herhaal voor de verticale uitlijning.
    7. Klik op "volgende" om automatisch een gat te maken in de eerder gedefinieerde coördinaat van de ontvanger (acceptor) blok.
    8. Leeg de punch.
    9. Plaats het blok van de donor voor bemonstering en een kern van weefsel te verwijderen uit het eerder geannoteerde gebied van belang.
    10. Steek de donor weefsel kern in het gat in het blok van de ontvanger (acceptor).
    11. De donor blok uit de arrayer verwijderen.
    12. Herhaal de stappen 2.4.5-2.4.11 om de TMA is voltooid.
  5. De kant van het weefsel van het nieuw gegenereerde TMA blok zetten een steriele lege dia en plaats ze in de oven lab bij 45 ° C gedurende 5 min.
  6. Druk zachtjes op het blok op de dia voor 5 s tot het afvlakken van de kernen van weefsel. Herhaal deze stappen eenmaal (voor 2 keer in totaal).
  7. Verwijder het blok van de TMA samen met de dia uit de oven, spiegelen ze en voorzichtig losmaken van het blok van de dia's.
  8. Dekking van het oppervlak van TMA weefsel met een dun laagje van elastische paraffine bij 65 ° C.
  9. Laat de TMA-blok bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
  10. Overdracht van de TMA-blok bij 4 ° C gedurende 24 uur.
    Opmerking: Het TMA blok kan worden achtergelaten bij 4 ° C tot uitputting.

3. histochemische en immunohistochemische Analyses

  1. TMA secties gesneden.
    1. Leg de TMA acceptor scripttags met de paraffine-zijde naar beneden op een oppervlak van-10 ° C gedurende 10 minuten te koelen de paraffine.
    2. Vul een floating bad met ultrazuiver water en warmte ingesteld op 38 ° C.
    3. Plaats een nieuw mes op rotary microtome en invoegen van het blok in de microtoom chuck, zodat de wax blok wordt geconfronteerd met het mes en wordt uitgelijnd in het verticale vlak.
    4. Aanpak van het blok zorgvuldig met het mes en snijd een paar dunne secties zodat de positionering klopt; Pas indien nodig.
    5. Snijd 3 µm dik secties.
    6. Pak de secties met pincet en drijven hen op het wateroppervlak bad.
    7. Kies de gedeelten uit het waterbad op regelmatige en IHC/ISH glas dia's.
    8. Plaats van de dia's op een rek en bewaar ze in de oven op 45 ° C's nachts.
      Opmerking: Zodra voorbereid, de TMA-secties moeten worden gekleurd binnen de 24u.
  2. Histochemische kleuring (H & E) uit te voeren met behulp van een autostainer.
    1. De dia's invoegen in de autostainer rek en plaats ze op 60 ° C gedurende 10 minuten.
    2. Open de lade van de belasting van de autostainer en plaats die het rek met de TMA dia's in een van de stations laden met een standaard H & E clip naar buiten gericht.
    3. Zodra de lade wordt gesloten, de clip zal automatisch worden herkend door het systeem en het volgende protocol zal beginnen: oven station bij 37 ° C (6 min), xyleen (2 min), xyleen (2 min), ethanol 100% (2 min), ethanol 100% (2 min), ethanol 95% (2 min), ethanol 95% (2 min) , gedistilleerd water (4 min), Carazzi de Haematoxyline (9 min), lagedruk stromend water (2 min), eosine 1% (1 min), lagedruk stromend water (2 min), ethanol 95% (20 s), ethanol 95% (20 s), ethanol 95% (20 s), ethanol 95% (20 s), ethanol 100% (15 s), ethanol 100% (15 s) , xyleen (30 s), xyleen (30 s).
    4. Uitladen van de rekken van de lade en monteer de dia met een cover slip.
      1. Verzamelen van een daling van zware montering met een pipet en zet het op een buitenste rand van de dia deksel.
      2. Plaats van de natte kant van de cover slip op de dia en laat de mount drogen voor 30 min.
  3. Uitvoeren van IHC kleuring voor ER, PR, Ki67 en HER2 met behulp van een geautomatiseerde immunostainer.
    Opmerking: Voordat u begint een kleuring run, opstarten van het systeem, controleren de verbruiksartikelen reagens flessen (Tabel van materialen) en afval containers.
    1. Plaats de TMA dia's te analyseren op 60 ° C gedurende 10 minuten.
    2. Immunostainer instrument en software te starten.
    3. Op de Home-weergave, klikt u op de knop van de protocollen en klik op Maak/wijzig protocollen.
    4. Selecteer de standaard DAB (3, 3'-diaminobenzidine) IHC procedure voor het wijzigen van de basismalplaatje.
    5. "Deparaffinization" in de keuzelijst te markeren en stel de Medium temperatuur bij 72 ° C.
    6. Vlag van de cc1 ontmaskeren oplossing, stelt u de temperatuur van het Medium bij 95 ° C, en de incubatietijd op 36 min.
    7. Het primaire antilichaam vak markeren, de ID van de ER inline dispenser (de instrument software herkent de dispenser op de reagens carrousel) invoegen en de incubatietijd vastgesteldop 16 min.
    8. Vlag van het Counterstaining vak, selecteert u de Haematoxyline ik, en stel de incubatietijd op 12 min.
    9. Klik op de knop "Opslaan als" en de naam van het protocol.
    10. Herhaal de stappen 3.3.3-3.3.9 voor de resterende antilichamen met behulp van de volgende primaire antilichamen incubatie tijden: PR 16 min, Ki67 16 min en HER2 12 min. gebruik vooraf verdunde kant-en-klare (RTU) antilichamen.
    11. Op de Home-weergave, klikt u op de knop etiketten maken.
    12. Klik op de knop van de protocollen en voeg de ER, PR, Ki67 en HER2 protocollen voor elk van de TMA te analyseren.
    13. Klik op de knop sluiten /Print.
    14. Zoals de labelsjabloon wordt weergegeven, voert u de TMA-id's voor de label.
    15. Klik op de knop Afdrukken om de etiketten afdrukken en deze vervolgens toepassen op de TMA dia's.
    16. Klik op het pictogram van het instrument en stel de modus voor het opstarten van het instrument als "Ready".
    17. Open de kap dat betrekking heeft op de reagentia carrousel, plaats het detectiesysteem en primaire antilichamen, sluit de motorkap.
    18. Klik op de knop aan de voorzijde op een dia-lade openen, laden de TMA-dia's, en sluit de lade door te klikken op dezelfde knop.
    19. De opstartmodus van het instrument als "Running" instellen en volg de instructies.
    20. Aan het einde van de uitvoering, unload de TMA dia's door te drukken op de Open alle lades met dia's voltooid knop op het instrument Slide Control en spoel warm ze in zeepsop om te verwijderen van alle resterende reagentia.
    21. Wassen van de dia's onder lagedruk koud stromend water, uitdrogen van de TMA-dia's, en een glas dekglaasje aan toepassen op elke dia.
  4. IHC analyses of ER, PR, HER2 uit te voeren na de Amerikaanse maatschappij van klinische oncologie (ASCO) / dop van de richtsnoeren, en van Ki67 volgens de aanbevelingen van de internationale Ki67 in borstkanker werkgroep (tabel 2).
    Opmerking: Deze analyse moet worden uitgevoerd afzonderlijk in de vlekken discrete weefsel door een patholoog met een ervaring in borst pathologie.
    1. De expressie ER positief bent van ≥ 1% van de tumor celkernen op immunoreactive20,21,22,23te beoordelen.
    2. De expressie van de PR als positief bent van ≥ 1% van de tumor celkernen op immunoreactive20,21,22,23te beoordelen.
    3. Beoordelen van de HER2-expressie als: a) score 3 + als ze membraan kleuring die volledig en intens, b) score 2 + als ze membraan kleuring is onvolledig en/of zwakke/matig en binnen > 10% van de invasieve tumorcellen of volledige en ze membraan kleuring is intens en binnen ≤ 10% van de invasieve tumorcellen, c) score 1 + indien onvolledig membraan kleuring zwakke/nauwelijks merkbaar is en binnen > 10% van de invasieve tumorcellen, d) negatief als ontbreekt niet geen vlekken of membraan kleuring is onvolledig en zwakke/nauwelijks waarneembare en binnen ≤ 10 procent van de invasieve tumor cellen3,24.
    4. Beoordelen van de Ki67-index, zoals het percentage cellen met nucleaire kleuring in ten minste 1.000 neoplastische cellen willekeurig geselecteerd meer dan 10 high-power velden (400 X vergroting)25.

4. SISH analyse van HER2

  1. Gesneden TMA secties (Herhaal stap 3.1).
  2. Uitvoeren van SISH voor HER2 met behulp van een geautomatiseerde immunostainer.
    1. Plaats de TMA dia's te analyseren op 60 ° C gedurende 10 minuten.
    2. Immunostainer instrument en software te starten.
    3. Op de Home-weergave, klikt u op de knop van de protocollen en klik op Maak/wijzig protocollen.
    4. Selecteer de "U Dual ISH CKT" procedure voor het wijzigen van de basismalplaatje.
    5. Vlag van "Drogen" in de keuzelijst en de temperatuur instellen op 63 ° C gedurende 20 minuten.
    6. Vlag van "Cel Conditioning" in de keuzelijst, vervolgens "cel Conditioning CC2", en de temperatuur tijdens de 86 ° C en incubatie op 4 min ingesteld.
    7. Vlag CC2 milde (cyclus 1), Standard (cyclus 2) en uitgebreid (cyclus 3) voor 8 minuten en 12 min 8 min, respectievelijk.
    8. Vlag van "ISH-Protease 3" in de keuzelijst en de incubatietijd vastgesteldop 16 min.
    9. Selecteer de sondes, HER2DNP en CHR17DIG en de incubatietijd vastgesteldop 6 h.
    10. Het wassen vastgesteldop 76 ° C gedurende 8 minuten.
    11. De incubatietijd van de SISH-multimer (SIL ISH DNP HRP) op 32 min instellen
    12. De incubatietijd van zilveren chromogeen (SIL ISH DNP CHRC) vastgesteldop 4 min.
    13. De rode multimer (rode ISH graven AP) incubatietijd vastgesteldop 24 min.
    14. De incubatietijd van rode chromogeen (rode ISH graven FR) vastgesteld op 8 min.
    15. Vlag "Counterstaining" in de keuzelijst, selecteer "HAEMATOXYLINE II" en de incubatietijd vastgesteldop 8 min.
    16. Vlag "na Counterstaining" in de keuzelijst, selecteer "BLAUWSEL reagens", en de incubatietijd vastgesteldop 4 min.
    17. Herhaal de stappen van 3.3.11-3.3.15 (Selecteer bewerkt U Dual ISH CKT protocol).
    18. Open de kap dat betrekking heeft op de reagentia carrousel, plaats het wassen en het ISH detectiesystemen en vervolgens sluit de motorkap.
    19. Herhaal de stappen van de 3.3.18-3.3.21.
  3. SISH analyses uit te voeren voor HER2: de versterking van de gen HER2 als positief beoordelen als de HER2/CEP17 ratio ≥2.0 met een gemiddelde HER2 kopie nummer ≥4.0 signalen per cel is, en negatief als de HER2/CEP17 ratio is < 2.0 met een gemiddelde HER2 kopiëren nummer < 4.0 signalen/cel3,24.
    Opmerking: Gelijkaardig aan IHC, deze analyse moet worden uitgevoerd afzonderlijk in de vlekken discrete weefsel door een patholoog met ervaring in borst pathologie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Globaal, 444 invasieve borst kanker in 15 TMAs specifiek geoptimaliseerd voor ISH analyses zijn opgenomen. Onder de 2,664 plekken bemonsterd, 2,651 (99,5%) waren van de vertegenwoordiger van de eerder geselecteerde gebieden en daarom vatbaar voor latere analyses. Intra-tumor heterogeniteit werd bepaald door middel van IHC en SIH, met een nadruk op de heterogene distributies van HER2-positieve klonen in de topografische vlakken van de tumoren. Tabel 3 toont de biologische ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschikken hier over de laboratorium-strategieën uit te voeren SISH analyses van het HER2 -gen en de bijbehorende centromeer in high yield TMAs van ongelijkmatig verwerkte borstkankers gedetailleerde. Deze methode is rendabel en in de meeste laboratoria voor de studie van HER2 gene amplificatie heterogeniteit in grote cohorten van borst kanker ontvangen formulier pathologie archieven kan worden uitgevoerd.

Vanwege het klinische belang van HER2 in borstkanker en de uitdagin...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs er geen conflicten optreden van belangen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Surgipath ParaplastLeica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU39601006Weefsel inbeddingsmedium, smeltpunt 56 °C
Eosin Y  1% water solutionBio Optica, Milan, Italy, EU510002Eosin gelig, wateroplosbaar
Carazzi’s hematoxylinBio Optica, Milan, Italy, EU506012Alum hematoxyline rijpt met behulp van kaliumjodaat
Diamond qualityLaboindustria, Arzergrande, Italy, EU3353326x76 mm microscoopglazen
Leica CV MountLeica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU14046430011Monteermedium, zonder monomeren, gebaseerd op polymeren van butylmethacrylaat in xyleen
FLEX IHC microscoopglazenAgilent Technologies (Dako),  Santa Clara, CA, USAK8020Gecoate microscoopglazen voor het hechten van FFPE voor gebruik in IHC
BenchMark ULTRAVentana medical system, Tucson, AZ, USAN750-BMKU-FSGlazend systeem
CONFIRM anti-Estrogen Receptor (ER) (SP1) Rabbit Monoclonal Primary AntibodyVentana medical system, Tucson, AZ, USA790-4324Primaire antistof, gebruiksklaar
CONFIRM anti-Progesterone Receptor (PR) (1E2) Rabbit Monoclonal Primary AntibodyVentana medical system, Tucson, AZ, USA790-2223Primaire antistof, gebruiksklaar
CONFIRM anti-Ki-67 (30-9) Rabbit Monoclonal Primary AntibodyVentana medical system, Tucson, AZ, USA790-4286Primaire antistof, gebruiksklaar
PATHWAY HER2 (4B5) Rabbit Monoclonal Primary AntibodyVentana medical system, Tucson, AZ, USA790-4493Primaire antistof, gebruiksklaar
ultraView Universal DAB Detection KitVentana medical system, Tucson, AZ, USA760-500Indirect, biotin-vrij systeem voor het detecteren van muis IgG, muis IgM en konijn primaire antilichamen
INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe CocktailVentana medical system, Tucson, AZ, USA780-4422INFORM HER2 Dual ISH-assay - Dual color in situ hybridisatie FDA goedgekeurde geautomatiseerde test voor het bepalen van HER2-genstatus bij borstkankerpatiënten 
ultraView Silver ISH DNP Detection KitVentana medical system, Tucson, AZ, USA800-098
ultraView Red ISH DIG Detection KitVentana medical system, Tucson, AZ, USA800-505
ISH Protease 3Ventana medical system, Tucson, AZ, USA780-4149Wordt gebruikt in het ISH-proces om eiwitten te verwijderen die de doel-DNA-sequenties van belang omringen
HematoxylinVentana medical system, Tucson, AZ, USA760-2021Gemodificeerd Gill's hematoxyline counterstain reagens
Hematoxylin II CounterstainingVentana medical system, Tucson, AZ, USA790-2208Gemodificeerd Meyer's hematoxyline counterstain reagens
Bluing reagentVentana medical system, Tucson, AZ, USA760-2037Waterige oplossing van gebufferde lithiumcarbonaat voor het blauwen van hematoxylinen geverfde secties op glazen plaatjes
HybReadyVentana medical system, Tucson, AZ, USA780-4409Formamide-gebaseerde buffer voor ISH-assays
EZ Prep (10x)Ventana medical system, Tucson, AZ, USA950-102Concentraat oplossing voor het verwijderen van paraffine uit weefselmonsters tijdens IHC- en ISH-reacties, en om te verdunnen 1:10.
SSC Buffer (10X)Ventana medical system, Tucson, AZ, USA950-110Natriumchloride natriumcitraat buffer oplossing wordt gebruikt voor strengheidswassen en om slides tussen kleuringsstappen te spoelen en een stabiele waterige omgeving te bieden voor de in situ hybridisatiereacties. Verdun 1:5.
ULTRA LCSVentana medical system, Tucson, AZ, USA650-210Voorverdunde (gebruiksklare) dekglas oplossing die wordt gebruikt als barrière tussen de waterige reagentia en de lucht om verdamping in de IHC en ISH reacties te voorkomen
Reaction Buffer (10x)Ventana medical system, Tucson, AZ, USA950-300Tris gebaseerde bufferoplossing (pH 7,6 & plusmn; 0,2) om slides te spoelen tussen kleuringsstappen tijdens IHC en ISH. Verdun 1:10.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2)Ventana medical system, Tucson, AZ, USA950-223Voorbereidingsstappen bij de verwerking van weefselmonsters tijdens IHC en ISH. Klaar voor gebruik.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC1)Ventana medical system, Tucson, AZ, USA950-224
ultraView Silver Wash IIVentana medical system, Tucson, AZ, USA780-003Gebruiksklare oplossing om slides te spoelen tussen IHC en ISH kleuringsstappen
MicrotomeLeica Biosystems, Wetzlar, Germany, EURM 2255Geautomatiseerde draaiende microtoom
MultistainerLeica Biosystems, Wetzlar, Germany, EUST 5020Werkstation voor geautomatiseerd kleuren en dekglasbevestiging
Minicore 1Alphelys, Plaisir, France, EU00-MICO-1Semi-automatische arrayer voor TMA constructie met TMA Designer 2 embedded software
Aperio ScanScope CS2Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EUK080254Beeldopnameapparaat - digitaal pathologiescanner
Tissue-Tek III Uni-CassetteSakura Finetek Europe B.V4135Cassette
Tissue-Tek Paraform Standard Base MoldSakura Finetek Europe B.V7055Roestvrijstalen basis metalen mal

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Allison, K. H., Dintzis, S. M., Schmidt, R. A. Frequency of HER2 heterogeneity by fluorescence in situ hybridization according to CAP expert panel recommendations: time for a new look at how to report heterogeneity. Am J Clin Pathol. 136 (6), 864-871 (2011).
  2. Montemurro, F., Scaltriti, M. Biomarkers of drugs targeting HER-family signalling in cancer. J Pathol. 232 (2), 219-229 (2014).
  3. Wolff, A. C., et al. Recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer: American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists clinical practice guideline update. J Clin Oncol. 31 (31), 3997-4013 (2013).
  4. Ng, C. K., Pemberton, H. N., Reis-Filho, J. S. Breast cancer intratumor genetic heterogeneity: causes and implications. Expert Rev Anticancer Ther. 12 (8), 1021-1032 (2012).
  5. Vance, G. H., et al. Genetic heterogeneity in HER2 testing in breast cancer: panel summary and guidelines. Arch Pathol Lab Med. 133 (4), 611-612 (2009).
  6. Murthy, S. S., et al. Assessment of HER2/Neu status by fluorescence in situ hybridization in immunohistochemistry-equivocal cases of invasive ductal carcinoma and aberrant signal patterns: a study at a tertiary cancer center. Indian J Pathol Microbiol. 54 (3), 532-538 (2011).
  7. Ohlschlegel, C., Zahel, K., Kradolfer, D., Hell, M., Jochum, W. HER2 genetic heterogeneity in breast carcinoma. J Clin Pathol. 64 (12), 1112-1116 (2011).
  8. Chang, M. C., Malowany, J. I., Mazurkiewicz, J., Wood, M. 'Genetic heterogeneity' in HER2/neu testing by fluorescence in situ hybridization: a study of 2,522 cases. Mod Pathol. 25 (5), 683-688 (2012).
  9. Bartlett, A. I., et al. Heterogeneous HER2 gene amplification: impact on patient outcome and a clinically relevant definition. Am J Clin Pathol. 136 (2), 266-274 (2011).
  10. Seol, H., et al. Intratumoral heterogeneity of HER2 gene amplification in breast cancer: its clinicopathological significance. Mod Pathol. 25 (7), 938-948 (2012).
  11. Hanna, W. M., et al. HER2 in situ hybridization in breast cancer: clinical implications of polysomy 17 and genetic heterogeneity. Mod Pathol. 27 (1), 4-18 (2014).
  12. Sanguedolce, F., Bufo, P. HER2 assessment by silver in situ hybridization: where are we now? Expert Rev Mol Diagn. 15 (3), 385-398 (2015).
  13. Fusco, N., et al. The Contrasting Role of p16Ink4A Patterns of Expression in Neuroendocrine and Non-Neuroendocrine Lung Tumors: A Comprehensive Analysis with Clinicopathologic and Molecular Correlations. PLoS One. 10 (12), e0144923(2015).
  14. Albanghali, M., et al. Construction of tissue microarrays from core needle biopsies - a systematic literature review. Histopathology. 68 (3), 323-332 (2016).
  15. Navani, S. Manual evaluation of tissue microarrays in a high-throughput research project: The contribution of Indian surgical pathology to the Human Protein Atlas (HPA) project. Proteomics. 16 (8), 1266-1270 (2016).
  16. Fusco, N., et al. HER2 in gastric cancer: a digital image analysis in pre-neoplastic, primary and metastatic lesions. Mod Pathol. 26 (6), 816-824 (2013).
  17. Amin, M. B., et al. AJCC Cancer Staging Manual. , Eight, Springer International Publishing. (2017).
  18. Lakhani, S. R., Ellis, I. O., Schnitt, S. J., Tan, P. H., van de Vijver, M. J. WHO Classification of Tumours of the Breast. , 4th, IARC press. (2012).
  19. Kononen, J., et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med. 4 (7), 844-847 (1998).
  20. Fusco, N., et al. Resolving quandaries: basaloid adenoid cystic carcinoma or breast cylindroma? The role of massively parallel sequencing. Histopathology. 68 (2), 262-271 (2016).
  21. Fusco, N., et al. Genetic events in the progression of adenoid cystic carcinoma of the breast to high-grade triple-negative breast cancer. Mod Pathol. 29 (11), 1292-1305 (2016).
  22. Fusco, N., et al. Recurrent NAB2-STAT6 gene fusions and oestrogen receptor-α expression in pulmonary adenofibromas. Histopathology. 70 (6), 906-917 (2017).
  23. Hammond, M. E., et al. American Society of Clinical Oncology/College Of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer. J Clin Oncol. 28 (16), 2784-2795 (2010).
  24. Fusco, N., Bosari, S. HER2 aberrations and heterogeneity in cancers of the digestive system: Implications for pathologists and gastroenterologists. World J Gastroenterol. 22 (35), 7926-7937 (2016).
  25. Dowsett, M., et al. Assessment of Ki67 in breast cancer: recommendations from the International Ki67 in Breast Cancer working group. J Natl Cancer Inst. 103 (22), 1656-1664 (2011).
  26. Dekker, T. J., et al. Determining sensitivity and specificity of HER2 testing in breast cancer using a tissue micro-array approach. Breast Cancer Res. 14 (3), R93(2012).
  27. De Sio, G., et al. A MALDI-Mass Spectrometry Imaging method applicable to different formalin-fixed paraffin-embedded human tissues. Mol Biosyst. 11 (6), 1507-1514 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Heterogeniteit van borstkankersilver in situ hybridisatieconstructie van tissue microarraysgefixeerd in formaline en ingebed in paraffineimmunohistochemische analyseHER2 chromosoomenumeratietopografische gebiedskaartingautomatische immunostainer

Gerelateerde artikelen