Nieuwe therapeutische strategieën in cardiale regeneratieve geneeskunde vereisen uitgebreide en gedetailleerde studies in grote preklinische diermodellen voordat zij kunnen worden beschouwd voor gebruik bij de mens. We laten hier zien een percutane contrast echocardiografie geleide intramyocardial injectietechniek bij konijnen, die is waardevol voor de hypothese testen van de werkzaamheid van dergelijke nieuwe therapieën.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Percutane Contrast echocardiografie geleide Intramyocardial injectie en cel levering in een grote preklinische Model
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Cel en genetische therapie zijn spannende en veelbelovende strategieën met het oog op cardiale regeneratie in de omgeving van hartfalen met verminderd ejectie fractie (HFrEF). Voordat ze kunnen worden beschouwd voor gebruik en ten uitvoer gelegd bij de mens, zijn uitgebreide Preklinische studies verplicht in grote diermodellen te evalueren van de veiligheid, werkzaamheid, en het lot van de injectate (b.v., stamcellen) eenmaal in het myocardium overgeleverd. Kleine knaagdieren modellen bieden voordelen (bijvoorbeeld, kosteneffectiviteit, inschikkelijkheid voor genetische manipulatie); echter, gezien de inherente beperkingen van deze modellen, de bevindingen in dit zelden vertalen naar de kliniek. Omgekeerd, grote dierlijke modellen zoals konijnen, hebben voordelen (bijvoorbeeld, soortgelijke cardiale electrofysiologie t.o.v. mensen en andere grote dieren), met behoud van een goede kosteneffectieve balans. Hier, we laten zien hoe u kunt uitvoeren een percutane contrast echocardiografie geleide intramyocardial injectie (IMI) techniek, die minimaal invasieve, veilig, goed getolereerd, zeer effectief zijn in de beoogde levering van injectates en, met inbegrip van cellen, op verschillende locaties binnen het myocardium van een konijn-model. Voor de uitvoering van deze techniek, hebben wij ook geprofiteerd van een algemeen beschikbare klinische echocardiografie systeem. Na de invoering in de praktijk het protocol hier beschreven, een onderzoeker met fundamentele echografie kennis zal worden bevoegd zijn op de prestaties van deze veelzijdige en minimaal invasieve techniek voor routinematig gebruik in experimenten, gericht op de hypothese testen van de mogelijkheden van cardiale regeneratieve therapeutics in het konijn-model. Zodra competentie is bereikt, kan de hele procedure kan worden uitgevoerd binnen 25 minuten na het konijn te verdoven.
Inleiding
Cel en gen-therapieën zijn spannend en ooit het uitwerken van strategieën voor het regenereren/repareren van de gewonde myocard in HFrEF. Een paar studies vergeleken de effectiviteit (b.v., cel retentie tarief) van de verschillende routes van cel levering, die consequent is gebleken dat de superioriteit van IMI over intracoronary of intraveneuze routes1,2 , 3 , 4 , 5. het is dus niet verwonderlijk dat een groot aantal studies over translationeel modellen van stamcel therapie van de gewonde myocard,....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De experimenten die hierin worden beschreven werden goedgekeurd door de ethische commissie van het onderzoek van de Universiteit van Murcia, Spanje, en werden uitgevoerd overeenkomstig richtlijn 2010/63/EG van de EuropeseCommissie. De stappen die beschreven werden uitgevoerd onder operationele standaardprotocollen die deel uitmaakten van het werkplan en niet uitsluitend met het oog op het filmen van de begeleidende video op dit papier zijn uitgevoerd.
1. bereiding van de cellen en zoogdieren expressie Vector
Opmerking: Hier, kort beschrijven we een protocol voor de voorbereiding en de transfectie van een cellijn (m....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Percutane Contrast echocardiografie geleide IMI met InI:
Hierboven beschreven met behulp van het protocol, en zodra de optimale positionering van de punt van de naald werd bevestigd door echocardiografie en de injectie gestart, transmurale hyperechogenicity werd waargenomen tijdens de levering van InI (10% v/v in PBS) (figuur 2E) , ook zo kort na het IMI aan de target-regio (
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het primaire doel was het ontwikkelen van een minimaal invasieve techniek die worden voor de levering van stamcellen in het myocardium van konijnen (een groot formaat preklinische diermodel)17,18, gebruikt kan terwijl profiteren van het gebruik van een relatief goedkoop imaging systeem beschikbaar in veel klinische en onderzoekscentra. Hier laten we zien dat met behulp van een systeem van klinische echocardiografie, en geholpen door InI, een algemeen beschikbare .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs bedanken Sheila Monfort, Brenda Martínez, Carlos Micó, Alberto Muñoz en Manuel Molina voor uitstekende ondersteuning geboden bij het verzamelen van gegevens en Carlos Bueno voor het verstrekken van de EGFP(+) HEK-293-cellen. Dit werk werd gedeeltelijk door ondersteund: Fundación Séneca, Agencia de Ciencia y Tecnología, Región de Murcia, Spanje (JT) (verlenen van nummer: 11935/PI/09); Red de Terapia Celular, ISCIII-Sub. Gral. Redes, VI PN de ik + D + ik 2008-2011 (verlenen neen. RD12/0019/0001) (JMM), mede gefinancierd met de structuurfondsen van de Europese Unie (EFRO) (JMM); en, de Universiteit van Reading, Verenigd Koninkrijk (AG, GB) (centrale financieri....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| HD11 XE Ultrasound System | Philips | 10670267 | Echocardiografiesysteem. |
| S12-4 | Philips | B01YgG | 4-12 MHz fase-array transducer |
| Ultrasound Transmision Gel (Aquasone) | Parket laboratories Inc | N 01-08 | |
| Vasovet 24G | Braun | REF 381212 | over-the-needle catheter |
| Omnifix-F 1 ml spuit | Braun | 9161406V | |
| Imalgene (Ketamine) | Merial | RN 9767 | Diergeneeskundig recept is noodzakelijk |
| Domtor (Medetomidine) | Esteve | CN 570686.3 | Diergeneeskundig recept is noodzakelijk |
| Verwarmingskussen | |||
| Faber-Castel TG1 | Faber-Castel | 16 33 99 | India (China) Ink |
| Holter Syneflash | Ela medical | SF0003044S | 24 uur Holter ECG systeem. |
| Electrodes Blue Sensor® | Ambu (NUMED) | VLC-00-S | Holter ECG elektroden. |
| Microtome | Leica Biosystems | RM2155 | |
| Microscope | Olimpus | CO11 | |
| ABC Vector Elite | Vector Laboratories | PK-6200 | Avidin Biotin Complex Kit. |
| Chicken anti-GFP antibody | Invitrogen | A10262 | Primair antilichaam. |
| Biotinylated goat-anti-chicken IgG Antibody | Vector Laboratories | BA-9010 | Secundair Antilichaam. |
| 3,30-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | DAKO (Agilent) | S3000 | |
| Fluorescentie Microscoop | Carl Zeiss MicroImaging | Zeiss AX10 Axioskop | |
| Holter ECG | Elamedical | Syneflash SF0003044S | |
| Dulbecco’s aangepast Eagle medium (DMEM) | Fisher Scientific | 11965084 | |
| 10% foetaal calf serum (FCS) | Fisher Scientific | 11573397 | |
| 0.05% Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | 25300054 | |
| Lipofectamine 2000 (Lipid transfectie reagens) | Fisher Scientific | 11668019 | |
| Reduced serum medium (Opti-MEM) | Fisher Scientific | 31985070 | |
| Hygromycin B | Calbiochem (MERCK) | 400051 | |
| Xyleen (histologisch) | Fisher Scientific | X3S-4 | |
| Hydrogen Peroxide Solution (H2O2) | Sigma | H1009 | |
| Pronase | Fisher Scientific | 53-702-250KU |
Referenties
- Hou, D., et al. Radiolabeled cell distribution after intramyocardial, intracoronary, and interstitial retrograde coronary venous delivery: implications for current clinical trials. Circulation. 112, I150-I156 (2005).
- Freyman, T., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
