Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Percutane Contrast echocardiografie geleide Intramyocardial injectie en cel levering in een grote preklinische Model

11K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56699

⸱

21 januari 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Cardiovascular and Metabolic Research, School of Biological Sciences, University of Reading, 2Departamento de Medicina y Cirugía Animal, Facultad de Veterinaria, Universidad de Murcia, 3Institute of Virology and Immunology (IVI), 4Departamento de Anatomía y Anatomía Comparada, Facultad de Veterinaria, Universidad de Murcia, 5Unidad de Trasplante Hematopoyético y Terapia Celular, Departamento de Hematología, Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca, IMIB, Universidad de Murcia

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Nieuwe therapeutische strategieën in cardiale regeneratieve geneeskunde vereisen uitgebreide en gedetailleerde studies in grote preklinische diermodellen voordat zij kunnen worden beschouwd voor gebruik bij de mens. We laten hier zien een percutane contrast echocardiografie geleide intramyocardial injectietechniek bij konijnen, die is waardevol voor de hypothese testen van de werkzaamheid van dergelijke nieuwe therapieën.

Samenvatting

Cel en genetische therapie zijn spannende en veelbelovende strategieën met het oog op cardiale regeneratie in de omgeving van hartfalen met verminderd ejectie fractie (HFrEF). Voordat ze kunnen worden beschouwd voor gebruik en ten uitvoer gelegd bij de mens, zijn uitgebreide Preklinische studies verplicht in grote diermodellen te evalueren van de veiligheid, werkzaamheid, en het lot van de injectate (b.v., stamcellen) eenmaal in het myocardium overgeleverd. Kleine knaagdieren modellen bieden voordelen (bijvoorbeeld, kosteneffectiviteit, inschikkelijkheid voor genetische manipulatie); echter, gezien de inherente beperkingen van deze modellen, de bevindingen in dit zelden vertalen naar de kliniek. Omgekeerd, grote dierlijke modellen zoals konijnen, hebben voordelen (bijvoorbeeld, soortgelijke cardiale electrofysiologie t.o.v. mensen en andere grote dieren), met behoud van een goede kosteneffectieve balans. Hier, we laten zien hoe u kunt uitvoeren een percutane contrast echocardiografie geleide intramyocardial injectie (IMI) techniek, die minimaal invasieve, veilig, goed getolereerd, zeer effectief zijn in de beoogde levering van injectates en, met inbegrip van cellen, op verschillende locaties binnen het myocardium van een konijn-model. Voor de uitvoering van deze techniek, hebben wij ook geprofiteerd van een algemeen beschikbare klinische echocardiografie systeem. Na de invoering in de praktijk het protocol hier beschreven, een onderzoeker met fundamentele echografie kennis zal worden bevoegd zijn op de prestaties van deze veelzijdige en minimaal invasieve techniek voor routinematig gebruik in experimenten, gericht op de hypothese testen van de mogelijkheden van cardiale regeneratieve therapeutics in het konijn-model. Zodra competentie is bereikt, kan de hele procedure kan worden uitgevoerd binnen 25 minuten na het konijn te verdoven.

Inleiding

Cel en gen-therapieën zijn spannend en ooit het uitwerken van strategieën voor het regenereren/repareren van de gewonde myocard in HFrEF. Een paar studies vergeleken de effectiviteit (b.v., cel retentie tarief) van de verschillende routes van cel levering, die consequent is gebleken dat de superioriteit van IMI over intracoronary of intraveneuze routes1,2 , 3 , 4 , 5. het is dus niet verwonderlijk dat een groot aantal studies over translationeel modellen van stamcel therapie van de gewonde myocard, leveren de injectate via het IIM uitgevoerd onder directe weergave in een open borst procedure6,7 . Deze benadering heeft echter verschillende beperkingen, met inbegrip van het invasieve karakter van de procedure, die het risico van peri-procedurele sterfte (vaak onder-gerapporteerd)8 draagt. Daarnaast elimineert een IMI onder direct zicht niet de mogelijkheid voor onbedoelde injectie in de ventriculaire holte. In de klinische praktijk kan een IMI tijdens open borst chirurgie een geschikte methode voor therapeutische cel levering, bijvoorbeeld, tijdens de coronaire bypassoperatie graft (CABG); echter, deze aanpak mogelijk niet geschikt is voor de levering van de cel in global cardiomyopathie van niet-ischemische herkomst (b.v.HFrEF ondergeschikt aan anthracycline-geïnduceerde cardiomyopathie (AICM)).

Er is geen twijfel dat de ischemische hartziekte (IHD) is de meest voorkomende oorzaak van HFrEF (~ 66%)9,10; echter niet-ischemische cardiomyopathie, met inbegrip van AICM, geldt nog steeds een aanzienlijk deel van de patiënten met HFrEF (33%)9 . Inderdaad, de recente vooruitgang in klinische oncologie hebben geresulteerd in meer dan 10 miljoen overlevenden van kanker in de VS alleen al11, met schattingen van een vergelijkbaar aantal in Europa, consistent met een algemene trend naar betere overleving van kankerpatiënten12 ,,13. Dus, het verkennen van de voordelen van nieuwe therapieën, zoals stamcel transplantatie voor niet-ischemische cardiomyopathie, evenals de trialing van een doeltreffende en minimaal invasieve route van levering van de cel van de stam is van het allergrootste belang, gezien het toenemende aantal patiënten beïnvloed door cardiotoxicity ondergeschikt aan geneesmiddelen tegen kanker.

Van de nota impliceert hypothese testen studies met stamcel therapie gericht op het herstellen/regenereren de gewonde myocard vaak het gebruik van kleine knaagdieren (b.v., muizen en ratten). Deze modellen vereisen vaak dure hoogfrequente ultrasone systemen voor evaluatie van myocardiale functie, meestal uitgerust met lineaire matrix omvormers hebben sommige inherente bijbehorende beperkingen (bv, galm)14. Andere modellen zoals konijnen, dat een grote preklinische model, echter sommige voordelen voor hypothese testen van stamcellen therapieën in HFrEF. Dus, in tegenstelling tot de ratten en muizen, konijnen houden een Ca+ 2 vervoerssysteem en cellulaire electrofysiologie die lijkt op die van de mens en andere grote dieren (bijvoorbeeld, honden en varkens)15,16,17 ,18,19. Een ander voordeel, is hun inschikkelijkheid voor cardiale echografie beeldvorming met behulp van relatief goedkoop en overal verkrijgbaar klinische echocardiografie systemen uitgerust met relatief hoge frequentie fase matrix omvormers, bijvoorbeeld, 12 MHz, zoals die veelvuldig worden gebruikt bij Neonatale en pediatrische cardiologie. Deze systemen kunnen uitstekende echocardiographic beeldbewerking met state of the art technologie en zij profiteren van de superioriteit van harmonic imaging20. Bovendien uitgebreide hypothese testen van het potentieel van cardiale regeneratieve therapie (b.v., stamcel therapie), hun veiligheid, werkzaamheid, cardiomyogenic potentieel, alsmede evaluatie van het lot van de injectate eenmaal afgeleverd in de myocard, is verplicht, voordat ze voor menselijk gebruik kunnen worden beschouwd, en ze vereisen het gebruik van grote preklinische diermodellen, zoals het konijn17,19. Hier beschrijven we een minimaal invasieve techniek voor cel levering via percutane contrast-echocardiografie begeleide IMI een klinische echocardiografie-systeem, dat is gericht op stamcel transplantatie gebaseerde therapie voor niet-ischemische cardiomyopathie20 . Ook beschrijven we de voordelen van de Oost-Indische inkt (InI, ook bekend als China inkt) als een echografie contrast agent en in situ tracer van de injectate in het hart van het konijn.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De experimenten die hierin worden beschreven werden goedgekeurd door de ethische commissie van het onderzoek van de Universiteit van Murcia, Spanje, en werden uitgevoerd overeenkomstig richtlijn 2010/63/EG van de EuropeseCommissie. De stappen die beschreven werden uitgevoerd onder operationele standaardprotocollen die deel uitmaakten van het werkplan en niet uitsluitend met het oog op het filmen van de begeleidende video op dit papier zijn uitgevoerd.

1. bereiding van de cellen en zoogdieren expressie Vector

Opmerking: Hier, kort beschrijven we een protocol voor de voorbereiding en de transfectie van een cellijn (menselijke embryonale nier 293 (HEK-293)); specifieke protocollen van de juiste cel voor het celtype van belang moet echter geoptimaliseerde (bijvoorbeeldstamcellen).

  1. Handhaven HEK-293 cellen in hoge glucose Dulbecco gewijzigd van Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal kalfsserum (FCS), 1% natrium pyruvaat, 2 mM Glutamine, penicilline/streptomycine 1%, en geïncubeerd bij 37 ° C in een bevochtigde sfeer met 5% CO2 . Zodra de cellen zijn sub confluente, gesplitst in een verhouding van 1:3.
  2. Start de cellen splitsen door aspirating van de media, dan wassen eenmaal met steriele fosfaat zoutoplossing (PBS gebufferde), verwijderen van overtollige PBS en vervolgens met 2,5 mL 0,5 x trypsine-ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) (5 min, 37 ° C) incuberen.
    1. Toevoegen van een volume van DMEM media (aangevuld zoals hierboven beschreven) zet de reactie stop, en vervolgens het loskoppelen van de cellen door langzaam en zachtjes zuigen op en neer met een elektronische pipet.
  3. Breng de celsuspensie naar een passende container (bijvoorbeeld, 15-50 mL conische centrifugebuis). Centrifugeer in een schommel emmer (100 x g), verwijder het supernatant en wassen van de pellet tweemaal met steriel PBS.
  4. Resuspendeer de pellet in verse DMEM media en zaad bij een dichtheid van de gewenste cel (bijvoorbeeld, 1 x 106 cellen in een maatkolf van 75 cm2 ) in verse cultuur kolven of grote gerechten volgens lokale laboratoriumpraktijken.
    1. Vervang bestaande media met verse media om de 2 dagen.
      Opmerking: De expressie vector was afgeleid van pIRES1hyg en gebruikt volgens de instructies van de fabrikant als eerder beschreven21. p(EGFP) IRES1hyg werd gegenereerd door het subcloning EGFP cDNA zoals een BamHI + kennisgevingen van pEGFP-N1 in de BamHI invoegen + kennisgevingen verteerd pIRES1hyg21.
  5. 1 dag vóór de transfectie, cellen zaad HEK-293 bij een dichtheid van 0,5 x 105 cellen/cm2 in 12 - of 24-well weefselkweek platen.
  6. Bereiden op de dag van de transfectie, DNA-lipide transfectie reagens complexen in aparte 1,5 mL microcentrifuge buizen (1 buis per putje).
    1. Beginnen met het toevoegen van 250 µL van verminderde serum medium in elk buisje en voeg vervolgens 4 µg DNA (meng zachtjes).
    2. Daarna, voeg 250 µL van een eerder bereid mix van 10 µL lipide transfectiereagens en 250 µL van verminderde serum medium, aan elke buis (weer voorzichtig mengen).
    3. Ten slotte gaan met transfections, door het HEK-293 cellen met DNA lipide transfectie reagens complexen voor 4 uur, aan het broeden vervangen met DMEM medium aangevuld zoals hierboven (stap 1.1) beschreven en incubeer gedurende een ander 48 h. uitvoeren drug selectie van stal transfectants met 100 µg/mL hygromycin B.
  7. Loskoppelen van HEK-293 cellen met trypsine zoals hierboven (stap 1.2) beschreven. Na het wassen van de cellen in steriele PBS, resuspendeer in een geschikt vehiculum (bijvoorbeeld10% v/v in PBS InI), tot een concentratie van de laatste cel van 5 x 106/mL.

2. voorbereiding van het konijn

Opmerking: De plaatsing van het konijn en de transducer voor IMI is niet optimaal morfologie en functie van het hart van het dier te evalueren. Het is dus aan te raden om een volledig echocardiographic onderzoek20 vóór de IMI (zie hieronder), en op latere tijdstippen uit te voeren, zoals gedefinieerd door de proefopzet. Dit zal streven naar het evalueren van de basislijn anatomische en functionele kenmerken van het hart in het dier die worden ontvangen van een injectie en ook het evalueren van de effecten van IMI in de functie van het hart.

  1. Het uitvoeren van dit onderzoek in een geblindeerde mode en naar aanleiding van de richtsnoeren van de Commissie van de echocardiografie van de American College of Veterinary interne geneeskunde en de Amerikaanse maatschappij van echocardiografie/Europese vereniging voor cardiovasculaire Imaging 22 , 23 , 24.
  2. Het verkrijgen van de tracering van een gelijktijdige 1-voorsprong elektrocardiogram (ECG) gedurende de gehele echocardiographic studie.
  3. Het konijn met ketamine anesthetize 10 mg/kg, gecombineerd met medetomidine 200 µg/kg, intramusculaire injectie (I.M.).
  4. Controleer of het niveau van de narcose na 10-20 minuten na toediening van de verdoving.
  5. De haren van de borst breed met behulp van een haartrimmer verwijderen (bijvoorbeeldonder de hals naar de sub xiphoid regio) (figuur 1A).
  6. Scheren van extra gebieden voor 1-2 cm2 in het binnenvlak van de rechter voorpoot (mediocubital regio) en beide hind ledematen (mediotibial regio) (figuur 1B).
  7. Zelfklevende elektroden van de ECG op de geschoren gebieden van de ledematen synchroon volgen het hartritme tijdens de procedure (Figuur 1 c) plaatsen.
  8. Plaats het dier in de liggende positie van de decubitus op een thermische deken, met de benen gestrekt met behulp van chirurgische tape gekoppeld aan de tabel (Figuur 1 c).
    1. Zorg ervoor dat de oren naar achteren zijn gebogen achter de hoofd/rug van het konijn, en op een positie die lager is dan de voorpoten, omdat dit helpt bij het handhaven van de juiste positionering van de thorax van het dier tijdens de gehele procedure.
  9. Laat het dier te ademen spontaan terwijl beheren van zuurstof door gezichtsmasker gedurende de hele procedure (100%, 2-3 L/min).

figure-protocol-1
Figuur 1. Voorbereiding van het konijn voor IMI. (A) Clip van haar van de thorax; (B) knippen haar van ledematen; (C) Bevestig elektroden en de positie van het konijn met benen gestrekt op een thermische deken. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

3. percutane Contrast echocardiografie geleide IMI techniek in het konijn

  1. Reinig en Desinfecteer de huid van de borstkas met een oplossing op basis van chloorhexidine.
    1. Gebruik een aseptische techniek gedurende de hele procedure, overeenkomstig de huidige beste praktijken.
    2. Waar mogelijk, en als redelijkerwijs mogelijk is, een volledig steriel procedure, met inbegrip van, maar niet beperkt tot, het gebruik van steriel materiaal zoals jassen, handschoenen, chirurgische wond gordijnen, steriele omhoog het kleden van materiaal voor de tabel, evenals een steriele echografie uitvoeren transducer dekking en steriele ultrageluid-gel. Dit zal verminderen tot een minimum te beperken het risico dat ziekteverwekkers aan het dier IMI ontvangen, en is gebruikelijk in de klinische setting (b.v.tijdens cardiale punctie).
      Opmerking: Het wordt aanbevolen om altijd in overeenstemming met de lokale en nationale regelgeving van dierlijk onderzoek voor de lokale instelling en land van de praktijk.
  2. Echografie transmissie gel van toepassing op de borst en/of op de transducer en met de transducer koord om de nek van de experimentator, uitvoeren van een scan van het snelle venster van het hart van het dier, die vaak nuttig voor het visualiseren van anatomie en te plannen voor de IMI.
  3. De transducer handmatig plaatsen op de 4th-6th intercostale ruimte, 2-3 cm afstand van de lijn van de juiste parasternal met een invalshoek van ~ 90 ° ten opzichte van de rechterkant van de thoracale muur (figuur 2A).
  4. Pas de locatie van de transducer ten opzichte van de intercostale ruimte zowel als zijn anteroposterior en dorsoventral hoek te optimaliseren van een gemodificeerde korte axis Bekijk op het niveau van de papillaire spieren. Identificeren in deze weergave de rechterventrikel (RV), linker ventrikel (LV), hart septum (IVS), achterste muur (PW), evenals anterolateral (AL) en posteromedial (PM) papillaire spieren (figuur 2B).
    1. Hebben een breed gezichtsveld door de diepte met behulp van het desbetreffende besturingselement op het systeem (bijvoorbeeld, knop, dial) aanzienlijk te verhogen.
    2. Bijzondere aandacht besteden aan het verkrijgen van een symmetrische afbeelding in deze weergave, evenals de juiste differentiatie van endocardial en epicardial contouren en, indien nodig, aanpassen door besturingselementen voor afbeelding optimalisatie (bijvoorbeeldwinst).
  5. Zodra de optimale echocardiographic weergave is verkregen (figuur 2B), behouden deze positie in de rest van de procedure, terwijl een tweede exploitant de IMI (zie hieronder voert).
    1. Terwijl het houden van de transducer, Vermijd verhullen de transducer oriëntatie mark, die moet altijd worden naar voren, waardoor de uitlijning met de naald in opeenvolgende stappen (figuur 2A, C).
  6. Plaats de naald dicht bij de huid van de linker hemithorax in een symmetrische mirroring positie ten opzichte van de transducer met een 24-G naald gekoppeld aan een spuit van 1 mL. Vervolgens handmatig uitlijnen de naald met de transducer oriëntatie mark onder een hoek van ~ 90° (figuur 2C), en langzaam verder de naald door de huid en in de borstholte.
    Opmerking: De plaatsingskosten percutane naald in deze positie en oriëntatie vergemakkelijkt de visualisatie van de naald in het vlak van de lichtbundel van de echografie (figuur 2D, E), waardoor real-time monitoring en, zo nodig, aanpassing van de locatie van de naald ten opzichte van de regio van de doelstelling van het myocardium (Figuur 2 G, H).
  7. Met het puntje op de doelvestiging, langzaam leveren de injectate (maximaal 0,25 mL per injectieplaats) binnen 10-30 s (figuur 2E), terwijl langzaam en voorzichtig de naald intrekken tijdens de injectie te vergroten van de omvang van het myocardium behandeld.
    1. Gebruik van InI 10% (v/v) verdund in PBS voor normalisatie van de techniek, en als een tracer in situ terwijl het verwerven van competentie, evenals over het bevestigen van de succesvolle targeting van alle vier IMI sites binnen het myocardium door bruto pathologie en histopathologisch onderzoek (Zie Vertegenwoordiger resultaten). Zodra competentie is bereikt, kon InI worden vervangen door een geschikte commerciële echografie contrast agent indien gewenst.
      Opmerking: Levering van 10% (v/v) InI verdund in PBS met of zonder cellen in de resultaten van het myocard in Transmurale hyperechogenicity (d.w.z., heldere weergave van de echo) op de doelsite van injectie (figuur 2E, F). Voorbijgaande vertraging of een versnelling van de hartslag, gekoppeld aan voortijdige ventriculaire contracties (b.v., geïsoleerd, coupletten en drieling) worden vaak waargenomen zelfs vanaf het eerste contact van de naald met de Epicard, evenals tijdens en/of kort na de IMI. Echter geen levensbedreigende ritmestoornissen zijn ontwikkeld, en acute bijwerkingen zijn zelden waargenomen met behulp van maximaal 0,25 mL (1.25 x 106 cellen) van injectate per IMI injectieplaats (Zie Vertegenwoordiger resultaten en discussie).
  8. Subtiele veranderingen in de invalshoek van de naald zonodig te voltooien injecties van 0,25 mL aan elk van de vier doelstelling IMI sites (drie in de linker ventriculaire vrije muur (LVFW) en één in het IVS) uitvoeren.
  9. Na het voltooien van de percutane contrast echocardiografie geleide IMI procedure gaat evalueren (bijvoorbeelddoor middel van seriële ECG traceren en/of 24-uurs Holter-ECG) hartritme en seriële venster echocardiographic scans om te controleren of het ontbreken van uitvoeren complicaties, totdat het dier is volledig hersteld van de verdoving, en alleen dan overdracht naar een lichte cyclus kamer.
    1. Hier, gebruiken we 24-uurs Holter-ECG om te controleren van de effecten van IMI met InI op hartritme gedurende 24 uur. Voor dit vergeleken we een groep van 6 konijnen met normale fenotype (normale groep) en een groep van 6 konijnen waarvoor intraveneuze toediening van Doxorubicine (een cardiotoxische anthracycline drug, meestal gebruikt voor de behandeling van kanker; DOX groep) bij een dosis van 2 mg/kg/week voor 8 weken, en vervolgens beide cohorten ontvangen IMI met InI.

figure-protocol-2
Figuur 2 . Percutane contrast echocardiografie geleide intramyocardial injectie in het konijn. (A) plaatsing van de transducer in de juiste hemithorax onder een hoek van ~ 90 °. (B) representatieve foto van een parasternal korte as (PSSX) van het hart op het niveau van de papillaire spieren in het konijn. (C) uitlijning van de naald onder een hoek van ~ 90 ° ten opzichte van de transducer oriëntatie mark. (D) de locatie van de naald op de doelsite in een weergave van de PSSX van het hart (merk op dat de naald gemakkelijk is gevisualiseerd in het vlak van de lichtbundel echografie). (E en F) demonstratie van hyperechogenicity op de doelsite op intramyocardial injectie met Oost-Indische inkt (pijlpunten markeren de Transmurale hyperechogenicity). (G) toevallige locatie van de naald in de zaal LV (pijlpunten markeren de schacht van de naald). (H) Repositioning van de naald tegen de vrije muur van LV (pijlpunten markeren de schacht van de naald). RV = rechterventrikel; LV = linkerventrikel; IVS = hart septum; PW = achterste muur; AL = anterolateral papillaire spier; PM = posteromedial papillaire spier. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

4. post IMI Analyses

  1. Histopathologische analyses van hart weefselmonsters van konijnen uit te voeren.
    1. Weefsel gedurende 24 uur in 10% formaldehyde, gevolgd door uitdroging met toenemende ethanol concentraties als volgt corrigeren:
      • 1 x in 70% (60 min)
      • 1 x in 95% ethanol/5% methanol (60 min)
      • 1 x in 100% (60 min)
      • 1 x in 100% (90 min)
      • 1 x in 100% (120 min)
      Opmerking: Alle van de bovenstaande incubations worden uitgevoerd bij kamertemperatuur (RT). Vervolgens substituut tweemaal met 100% xyleen (1 h, RT), en ten slotte inbedden in paraffine in twee stappen (60 min, 58 ° C)25.
    2. 4-5 µm weefselsecties met een microtoom25uitvoeren. Secties op dia's koppelen.
    3. Uitvoeren van kleuring met Haematoxyline-eosine en Masson van trichrome methoden25,26,27.
  2. Voer in weefselsecties van getransplanteerde harten, immunohistochemistry te sporen EGFP(+) HEK-293 cellen (bijvoorbeeldmet behulp van de avidin-Biotine complexe (ABC) methode), kort:
    1. -Was 4-5 µm dik hart secties in 100% xyleen (10 min, bij RT). Hydrateren van weefsel door te wassen met afnemende ethanol concentratie oplossingen (2 x in 100% (2 min) 2 x 95% (2 min) 1 x in 70% (2 min), 1 x in 50% (2 min); 1 x in de 30% (2 min); 1 x ddH2O (2 min)) op RT.
    2. Remming van endogene peroxidase uitvoeren die betrekking hebben op de secties met 100 µL van 3% H2O2 verdund in methanol (bereid met 5 mL van de stockoplossing 30% H2O2en toevoegen methanol omhoog tot een totaal volume van 50 mL)) Incubeer 30 min, RT), en vervolgens wassen door onderdompeling met Tris gebufferde zoutoplossing (TBS; pH 7,6).
    3. Uitvoeren van antigeen ontmaskering via enzymatische behandeling, door het bestuderen van de secties met 100 µL van 0,1% Pronase (bereid met 0,01 g Pronase verdund in 10 mL TBS) (Incubeer 12 min, RT), daarna wassen met TBS (5 min, RT).
    4. Incubeer in het blokkeren van de oplossing (normale geit serum 10% in TBS) met behulp van 100 µL per dia (30 min, RT), en wassen met TBS (5 min, RT).
    5. Incubeer met kip anti-groen TL proteïne (GFP) als primair antilichaam (1:500 in TBS) (1 h, 30 ° C), en wassen met TBS (5 min, RT).
    6. Incubeer met secundair antilichaam biotinyleerd geit-anti-kip IgG (1:250 in TBS) (1 h, 30 ° C), en daarna wassen met TBS (5 min, RT).
    7. Incubeer met avidin-Biotine complex (20 min, 30 ° C) en vervolgens een label met behulp van 3,30-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) (RT, 5-10 min).
    8. Ten slotte, uitdrogen door wassen in toenemende ethanol concentraties (1 x in de 30% (2 min) 1 x in 50% (2 min) 1 x in 70% (2 min); 2 x 95% (2 min); 2 x in 100% (2 min)) op RT, counterstain secties met behulp van de methode Haematoxyline-eosine25, en dan mount cover dia's. Positieve, negatieve en isotype besturingselementen bevatten.
      Opmerking: Het korte protocol dat hierboven beschreven is niet bedoeld voor algemene immunohistochemistry gebruik; optimalisatie voor het weefsel van de rente en voorwaarden is noodzakelijk.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Percutane Contrast echocardiografie geleide IMI met InI:

Hierboven beschreven met behulp van het protocol, en zodra de optimale positionering van de punt van de naald werd bevestigd door echocardiografie en de injectie gestart, transmurale hyperechogenicity werd waargenomen tijdens de levering van InI (10% v/v in PBS) (figuur 2E) , ook zo kort na het IMI aan de target-regio (

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het primaire doel was het ontwikkelen van een minimaal invasieve techniek die worden voor de levering van stamcellen in het myocardium van konijnen (een groot formaat preklinische diermodel)17,18, gebruikt kan terwijl profiteren van het gebruik van een relatief goedkoop imaging systeem beschikbaar in veel klinische en onderzoekscentra. Hier laten we zien dat met behulp van een systeem van klinische echocardiografie, en geholpen door InI, een algemeen beschikbare ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs bedanken Sheila Monfort, Brenda Martínez, Carlos Micó, Alberto Muñoz en Manuel Molina voor uitstekende ondersteuning geboden bij het verzamelen van gegevens en Carlos Bueno voor het verstrekken van de EGFP(+) HEK-293-cellen. Dit werk werd gedeeltelijk door ondersteund: Fundación Séneca, Agencia de Ciencia y Tecnología, Región de Murcia, Spanje (JT) (verlenen van nummer: 11935/PI/09); Red de Terapia Celular, ISCIII-Sub. Gral. Redes, VI PN de ik + D + ik 2008-2011 (verlenen neen. RD12/0019/0001) (JMM), mede gefinancierd met de structuurfondsen van de Europese Unie (EFRO) (JMM); en, de Universiteit van Reading, Verenigd Koninkrijk (AG, GB) (centrale financiering). De financiers had geen rol in de studie ontwerp, gegevensverzameling en analyse, besloten tot bekendmaking of voorbereiding van het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
HD11 XE Ultrasound SystemPhilips10670267Echocardiografiesysteem.
S12-4PhilipsB01YgG4-12 MHz fase-array transducer
Ultrasound Transmision Gel (Aquasone)Parket laboratories IncN 01-08
Vasovet 24GBraunREF 381212 over-the-needle catheter
Omnifix-F 1 ml spuitBraun9161406V
Imalgene (Ketamine)MerialRN 9767Diergeneeskundig recept is noodzakelijk
Domtor (Medetomidine)EsteveCN 570686.3Diergeneeskundig recept is noodzakelijk
Verwarmingskussen
Faber-Castel TG1Faber-Castel16 33 99India (China) Ink
Holter SyneflashEla medicalSF0003044S24 uur Holter ECG systeem.
Electrodes Blue Sensor®Ambu (NUMED)VLC-00-SHolter ECG elektroden.
MicrotomeLeica BiosystemsRM2155
MicroscopeOlimpusCO11
ABC Vector EliteVector LaboratoriesPK-6200Avidin Biotin Complex Kit.
Chicken anti-GFP antibodyInvitrogenA10262Primair antilichaam.
Biotinylated goat-anti-chicken IgG AntibodyVector LaboratoriesBA-9010Secundair Antilichaam.
3,30-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)DAKO (Agilent)S3000
Fluorescentie MicroscoopCarl Zeiss
MicroImaging		Zeiss AX10 Axioskop
Holter ECGElamedicalSyneflash SF0003044S
Dulbecco’s aangepast Eagle medium (DMEM) Fisher Scientific11965084
10% foetaal calf serum (FCS)Fisher Scientific11573397
0.05% Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Fisher Scientific25300054
Lipofectamine 2000 (Lipid transfectie reagens)Fisher Scientific11668019
Reduced serum medium (Opti-MEM)Fisher Scientific31985070
Hygromycin BCalbiochem (MERCK)400051
Xyleen (histologisch)Fisher ScientificX3S-4
Hydrogen Peroxide Solution (H2O2)SigmaH1009
PronaseFisher Scientific53-702-250KU

Referenties

  1. Hou, D., et al. Radiolabeled cell distribution after intramyocardial, intracoronary, and interstitial retrograde coronary venous delivery: implications for current clinical trials. Circulation. 112, I150-I156 (2005).
  2. Freyman, T., et al. A quantitative, randomized study evaluating three methods of mesenchymal stem cell delivery following myocardial infarction. Eur Heart J. 27, 1114-1122 (2006).
  3. Perin, E. C., et al. Comparison of intracoronary and transendocardial delivery of allogeneic mesenchymal cells in a canine model of acute myocardial infarction. J Mol Cell Cardiol. 44, 486-495 (2008).
  4. Dib, N., Khawaja, H., Varner, S., McCarthy, M., Campbell, A. Cell therapy for cardiovascular disease: a comparison of methods of delivery. J Cardiovasc Transl Res. 4, 177-181 (2011).
  5. Li, S. H., et al. Tracking cardiac engraftment and distribution of implanted bone marrow cells: Comparing intra-aortic, intravenous, and intramyocardial delivery. J Thorac Cardiovasc Surg. 137, e1221 1225-1233 (2009).
  6. Shiba, Y., et al. Human ES-cell-derived cardiomyocytes electrically couple and suppress arrhythmias in injured hearts. Nature. 489, 322-325 (2012).
  7. Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510, 273-277 (2014).
  8. Lu, C., et al. Autologous bone marrow cell transplantation improves left ventricular function in rabbit hearts with cardiomyopathy via myocardial regeneration-unrelated mechanisms. Heart vessels. 21, 180-187 (2006).
  9. McMurray, J. J., et al. ESC guidelines for the diagnosis and treatment of acute and chronic heart failure 2012: The Task Force for the Diagnosis and Treatment of Acute and Chronic Heart Failure 2012 of the European Society of Cardiology. Developed in collaboration with the Heart Failure Association (HFA) of the ESC . Eur J Heart Fail. 14, 803-869 (2012).
  10. Sueta, C. A. The life cycle of the heart failure patient. Curr Cardiol Rev. 11, 2-3 (2015).
  11. Carver, J. R., et al. American Society of Clinical Oncology clinical evidence review on the ongoing care of adult cancer survivors: cardiac and pulmonary late effects. J Clin Oncol. 25, 3991-4008 (2007).
  12. Verdecchia, A., et al. Recent cancer survival in Europe: a 2000-02 period analysis of EUROCARE-4 data. Lancet Oncol. 8, 784-796 (2007).
  13. De Angelis, R., et al. Cancer survival in Europe 1999-2007 by country and age: results of EUROCARE--5-a population-based study. Lancet Oncol. 15, 23-34 (2014).
  14. Abu-Zidan, F. M., Hefny, A. F., Corr, P. Clinical ultrasound physics. J Emerg Trauma Shock. 4, 501-503 (2011).
  15. Del, M. F., Mynett, J. R., Sugden, P. H., Poole-Wilson, P. A., Harding, S. E. Subcellular mechanism of the species difference in the contractile response of ventricular myocytes to endothelin-1. Cardioscience. 4, 185-191 (1993).
  16. Pogwizd, S. M., Bers, D. M. Rabbit models of heart disease. Drug Discov Today Dis Mod. 5, 185-193 (2008).
  17. Gandolfi, F., et al. Large animal models for cardiac stem cell therapies. Theriogenology. 75, 1416-1425 (2011).
  18. Harding, J., Roberts, R. M., Mirochnitchenko, O. Large animal models for stem cell therapy. Stem Cell Res Ther. 4, 23(2013).
  19. Chong, J. J., Murry, C. E. Cardiac regeneration using pluripotent stem cells--progression to large animal models. Stem Cell Res. 13, 654-665 (2014).
  20. Talavera, J., et al. An Upgrade on the Rabbit Model of Anthracycline-Induced Cardiomyopathy: Shorter Protocol, Reduced Mortality, and Higher Incidence of Overt Dilated Cardiomyopathy. BioMed Res Int. 2015, 465342(2015).
  21. Bueno, C., et al. Human adult periodontal ligament-derived cells integrate and differentiate after implantation into the adult mammalian brain. Cell Transplant. 22, 2017-2028 (2013).
  22. Sahn, D. J., DeMaria, A., Kisslo, J., Weyman, A. Recommendations regarding quantitation in M-mode echocardiography: results of a survey of echocardiographic measurements. Circulation. 58, 1072-1083 (1978).
  23. Thomas, W. P., et al. Recommendations for standards in transthoracic two-dimensional echocardiography in the dog and cat. Echocardiography Committee of the Specialty of Cardiology, American College of Veterinary Internal Medicine. J Vet Intern Med. 7, 247-252 (1993).
  24. Lang, R. M., et al. Recommendations for cardiac chamber quantification by echocardiography in adults: an update from the American Society of Echocardiography and the European Association of Cardiovascular Imaging. Eur Heart J Cardiovasc Imaging. 16, 233-270 (2015).
  25. Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods Mol Biol. 1180, 31-43 (2014).
  26. Howat, W. J., Wilson, B. A. Tissue fixation and the effect of molecular fixatives on downstream staining procedures. Methods. 70, 12-19 (2014).
  27. Cohen, A. H. Masson's trichrome stain in the evaluation of renal biopsies. An appraisal. Am J Clin Pathol. 65, 631-643 (1976).
  28. Corti, R., et al. Real time magnetic resonance guided endomyocardial local delivery. Heart. 91, 348-353 (2005).
  29. Springer, M. L., et al. Closed-chest cell injections into mouse myocardium guided by high-resolution echocardiography. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 289, H1307-H1314 (2005).
  30. Aoki, M., et al. Efficient in vivo gene transfer into the heart in the rat myocardial infarction model using the HVJ (Hemagglutinating Virus of Japan)--liposome method. J Mol Cell Cardiol. 29, 949-959 (1997).
  31. Guzman, R. J., Lemarchand, P., Crystal, R. G., Epstein, S. E., Finkel, T. Efficient gene transfer into myocardium by direct injection of adenovirus vectors. Circ Res. 73, 1202-1207 (1993).
  32. Magovern, C. J., et al. Direct in vivo gene transfer to canine myocardium using a replication-deficient adenovirus vector. Ann Thorac Surg. 62, 425-433 (1996).
  33. Suzuki, K., et al. Role of interleukin-1beta in acute inflammation and graft death after cell transplantation to the heart. Circulation. 110, II219-II224 (2004).
  34. Fukushima, S., et al. Direct intramyocardial but not intracoronary injection of bone marrow cells induces ventricular arrhythmias in a rat chronic ischemic heart failure model. Circulation. 115, 2254-2261 (2007).
  35. Miller, L. W., Taylor, D. A., Willerson, J. T. Stem Cell and Gene Therapy for Cardiovascular Disease. , Academic Press. 13-23 (2016).
  36. Fargas, A., Roma, J., Gratacos, M., Roig, M. Distribution and effects of a single intramuscular injection of India ink in mice. Ann Anat. 185, 183-187 (2003).
  37. Dib, N., et al. Recommendations for successful training on methods of delivery of biologics for cardiac regeneration: a report of the International Society for Cardiovascular Translational Research. JACC Cardiovasc Interv. 3, 265-275 (2010).
  38. Mu, Y., Cao, G., Zeng, Q., Li, Y. Transplantation of induced bone marrow mesenchymal stem cells improves the cardiac function of rabbits with dilated cardiomyopathy via upregulation of vascular endothelial growth factor and its receptors. Exp Biol Med (Maywood). 236, 1100-1107 (2011).
  39. Giraldo, A., et al. Percutaneous intramyocardial injection of amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells improves ventricular function and survival in non-ischaemic cardiomyopathy in rabbits. Eur Heart J. 36, 149(2015).
  40. Giraldo, A., et al. Allogeneic amniotic membrane-derived mesenchymal stem cell therapy is cardioprotective, restores myocardial function, and improves survival in a model of anthracycline-induced cardiomyopathy. Eur J Heart Fail. 19, 594(2017).
  41. Prendiville, T. W., et al. Ultrasound-guided transthoracic intramyocardial injection in mice. J Vis Exp. , e51566(2014).
  42. Laakmann, S., et al. Minimally invasive closed-chest ultrasound-guided substance delivery into the pericardial space in mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 386, 227-238 (2013).
  43. Hasenfuss, G. Animal models of human cardiovascular disease, heart failure and hypertrophy. Cardiovasc Res. 39, 60-76 (1998).
  44. Ponikowski, P., et al. Depressed heart rate variability as an independent predictor of death in chronic congestive heart failure secondary to ischemic or idiopathic dilated cardiomyopathy. Am J Cardiol. 79, 1645-1650 (1997).
  45. Nolan, J., et al. Prospective study of heart rate variability and mortality in chronic heart failure: results of the United Kingdom heart failure evaluation and assessment of risk trial (UK-heart). Circulation. 98, 1510-1516 (1998).
  46. Galinier, M., et al. Depressed low frequency power of heart rate variability as an independent predictor of sudden death in chronic heart failure. Eur Heart J. 21, 475-482 (2000).
  47. Sheng, C. C., Zhou, L., Hao, J. Current stem cell delivery methods for myocardial repair. BioMed Res Int. 2013, 547902(2013).
  48. Kim, R. J., et al. The use of contrast-enhanced magnetic resonance imaging to identify reversible myocardial dysfunction. N Engl J Med. 343, 1445-1453 (2000).
  49. Perin, E. C., et al. Transendocardial, autologous bone marrow cell transplantation for severe, chronic ischemic heart failure. Circulation. 107, 2294-2302 (2003).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Percutane injectiekonijnenmodelechogeleidingmyocardweefselChinese inkteGFP positieve cellenHolter monitoring
Percutane Contrast echocardiografie geleide Intramyocardial injectie en cel levering in een grote preklinische Model
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.