Subretinal transplantatie van menselijke embryonale stamcellen afgeleid-retinale Pigment epitheliale cellen in een grote-eyed Model van geografische atrofie

Samenvatting

Retinale pigment epitheliale cellen kunnen dienen als een cel-vervangende therapie voor de geavanceerde vorm van droge leeftijdsgebonden Macula degeneratie. Dit protocol beschrijft de generatie van een grote-eyed model van geografische atrofie en subretinal transplantatie van menselijke embryonale stamcellen cel afkomstige retinale pigment epitheliale cellen in dit model van ziekte.

Samenvatting

Geografische atrofie (GA), het late stadium van droge leeftijdsgebonden maculaire degeneratie wordt gekenmerkt door verlies van de retinale pigment epitheliale (RPE) laag, die tot verdere ontaarding van vitale retinale structuren (bijvoorbeeld, researchdieren leidt) veroorzaken ernstige visie bijzondere waardevermindering. Evenzo wordt RPE-verlies en daling van de gezichtsscherpte gezien in de lange termijn volgen omhoog van patiënten met geavanceerde natte leeftijdsgebonden Macula Degeneratie (LMD) die intravitreal anti-vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) behandeling. Dus, aan de ene kant, het is van fundamenteel belang voor het efficiënt afleiden RPE cellen uit een oneindige bron, die als substitutietherapie dienen kunnen. Aan de andere kant, het is belangrijk om te evalueren van het gedrag en de integratie van de afgeleide cellen in een model van de ziekte met als gevolg dat chirurgische en beeldvormende methoden als dicht mogelijk bij die worden toegepast bij de mens. Hier, wij bieden een gedetailleerd protocol op basis van onze eerdere publicaties die beschrijft de generatie van een preklinische model voor GA met behulp van het albino konijn oog, voor de evaluatie van de menselijke embryonale stamcellen afgeleid retinale pigment epitheliale cellen (hESC-RPE) in een klinisch relevante instelling. Gedifferentieerde hESC-RPE in naïef ogen of ogen met NaIO₃worden getransplanteerd-geïnduceerde GA-achtige Retina degeneratie met behulp van een techniek met 25 G transvitreal pars plana. Beoordeling van gedegenereerd en getransplanteerde gebieden is uitgevoerd door multimodale high-resolution niet-invasieve real-time imaging.

Inleiding

Dit protocol beschrijft de generatie van een grote-eyed preklinische model van geografische atrofie (GA), waarmee de evaluatie van de integratie van getransplanteerde hESC-RPE in de subretinal ruimte. De in detail hier beschreven methoden zijn gebruikt in 3 recente publicaties die aantonen de productie van een verrijkte, zuivere en functionele bevolking van RPE cellen van hESC¹, evenals de oprichting van buitenste retinale schade en een GA-achtige fenotype dat veroorzaakt door subretinal injectie van fysiologische zoutoplossingen (d.w.z., BSS en PBS) of NaIO₃ in de konijn eye^2,3. We verder aangetoond dat sub retinale schorsing transplantaties van hESC-RPE uitgebreide functionele monolayers met fotoreceptor redding capaciteit²vormen.

Verschillende voordelen vergezeld gaan van het gebruik van het konijn-oog voor de generatie van een GA model van ziekte. Ten eerste, de grootte van het konijn oog, die is 70% van het volume van een volwassen menselijk oog, kan klinisch zinvolle transplantatie met behulp van een celdichtheid die veel lager is dan routinematig gebruikt in kleine knaagdieren ogen (1000 cellen/µL vs. 50.000 cellen/µL)^{4 , 5}. ten tweede chirurgie bij knaagdieren is meestal transscleral via het vaatvlies, die het netvlies barrière in het gedrang brengt en potentieel triggers een ontstekingsreactie en een mogelijke afwijzing⁶. Beide factoren leiden samen tot multilayering en samendoen van getransplanteerde cellen, en een over het algemeen slechte integratie van de getransplanteerde cellen in een verstoorde inheemse retinale weefsel. Echter kunt het grote-eyed konijn model uitvoeren van een chirurgische techniek met instrumentatie identiek aan een klinische setting. Ten derde, een grote-eyed model tevens in staat hoge resolutie in vivo imaging en bewaking van de getransplanteerde cellen en het bovenliggende netvlies door tijd^1,2,3. Dus beschrijven we een klinisch relevante en kosten-efficiënte preklinische model dat een aantrekkelijk alternatief voor knaagdieren voor iedereen met een interesse in onderzoek van het netvlies van normale en zieke en de sub retinale ruimte moet.

Protocol

Het volgende protocol volgt de dierenverzorgers richtsnoeren van Karolinska Instituet. Alle dierproeven met behulp van Nieuw-Zeeland albino konijnen (Tabel of Materials) zijn goedgekeurd door het Comité regionale dierenethiek (Stockholms Norra Djurförsöksetiska Nämnd) (toestaan: dnr 56/15). Het gebruik van hESC (dnr 2011/745-31/3) en de overdracht en de manipulatie van hESC-RPE (dnr 2013/813-31/2) is ook in overeenstemming met de Zweedse wet- en regelgeving van het Karolinska Institutet, en is goedgekeurd door de regionale menselijke ethische Commissie ( 1regional Etikprövningsnämnden ik Stockholm).

1. subretinal injectie van natrium Kaliumjodaat (NaIO₃) in een grote-eyed diermodel

1. Anesthetize van dieren door intramusculaire toediening in de dij met een mengsel van 35 mg/kg ketamine en 5 mg/kg xylazine in zout met behulp van een injectiespuit 30 G en verwijden van leerlingen met actuele oogdruppels gebruiken een mix van 0,75% Cyclopentolaat en 2,5% phenylephrine. Juiste afstomping wordt bevestigd als het dier niet op een harde snuifje haar rug been reageert.
2. Plaats het konijn onder de chirurgische Microscoop met het hoofd geconfronteerd met de chirurg (figuur 1A). Gebruik een oprolmechanisme van het deksel te verwijderen van de oogleden en nictitans membraan met een steriele doek om te minimaliseren van het risico van besmetting. Gebruik evenwichtig zoutoplossing (BSS) om te voorkomen dat droogte terwijl onder verdoving in beide ogen.
3. Voor microchirurgie, gebruik een 2-poort (of optionele 3-poort) 25 G transvitreal pars plana techniek met niet-schuifkleppen trocars voor het inbrengen van microchirurgische instrumenten (figuur 1B). De multifunctionele Vitrectomie machine heeft poorten om verbinding te maken met een infusie canule, endoillumination, vitrector en endolaser. Voor subretinal injecties is alleen de endoillumination verplicht, waardoor een set-up 2-poort voldoende. Voeg de endoillumation door de bovenste linker trocar en gebruik van de bovenste rechts trocar voor de canule subretinal injectie.
   1. Voor een 3-poort set-up, gebruikt u de lagere temporele trocar voor de BSS infusie canule. Als optionele instrumenten (zoals een vitrector) zijn gebruikt, voegt u deze via de bovenste rechts trocar.
   2. De bovenste 2 trocars 1-2 mm uit de limbus klauwkikker pincet met pak en verdringen het bindvlies overliggende de invoeging site invoegen.
   3. Zorg ervoor dat de trocars zijn ingevoegde transsclerally onder een hoek van 30-45° limbus parallelle en ga naar het midden van het puntje van de trocar. Draai de trocar 90° en vooraf in het oog, die gericht zijn op de achterste paal van het oog. Deze procedure zal voorkomen na chirurgische lekkage uit de sclerotomies, en ook het verlagen van het risico op endophthalmitis (dat wil zeggen, bacteriële infectie in het oog). Zie ook figuur 2B voor trocar posities.
   4. Zet een éénpersoons gebruik platte contactlens op het hoornvlies te visualiseren van het netvlies, met synthetische tranen als contact gel tussen het oog en de contactlens (figuur 1A).
   5. Trekken 500 µL van NaIO₃ in een spuit van 1 mL aangesloten op een verlenging buis (gerund door de Office-assistent) en een 38 G polytip canule (gerund door de chirurg).
   6. De sonde van de endoillumination door de bovenste linker trocar en de injectie canule via de bovenste rechts trocar invoegen, en verder de canule via het glasvocht ruimte naar het netvlies, streven naar het gebied net onder het hoofd van de oogzenuw.
   7. Laat het uiteinde van de canule te langzaam het netvlies raken totdat een focale whitening zichtbaar is. De injectie zelf zal doordringen in het netvlies, waardoor subretinal levering. Laat niet de canule doordringen van het netvlies, aangezien dit kan bloeding veroorzaken.
   8. Injecteren 50 µL van NaIO₃ subretinally een periode van 5 s. Aangezien er een natuurlijke decolleté vliegtuig tussen het netvlies en de onderliggende vaatvlies, moet een duidelijk zichtbaar semi-transparante bleb geleidelijk vormen tijdens de injectie.
   9. Tijdens de injectie, langzaam intrekken van de naald, maar zorg ervoor dat het uiteinde wordt gehandhaafd binnen het bleb om te minimaliseren van reflux.
   10. Na verwijdering van de endoillumation en injectie canule, verwijder de trocars met behulp van klauwkikker pincet en toepassing lichte druk voor 30 s tot de zelfsluitende hechtdraad-minder sclerotomies met behulp van de tip of het botte uiteinde van de verlostang.
4. Had het geven van 10 mL zoutoplossing subcutaan om uitdroging te voorkomen. Geef niet na chirurgische topische steroïden of antibiotica. Voor pijnstillers 0,5 mL van buprenorfine 0,3 mg/ml subcutaan na chirurgie, evenals de dag na de operatie geven.
5. Na gebruik, wassen alle instrumenten door het onder te dompelen hen voor een paar seconden in de eerste plaats in 70% ethanol, de tweede in ethanol 45%, en tot slot in gedistilleerd water. Droog ze goed met een papieren handdoek.
6. Dieren wonen totdat zij weer voldoende bewustzijn en plaats ze allen één encaged. Indien nodig (bijvoorbeeldvoor doeleinden van immunohistochemistry), euthanaseren van dieren door intraveneuze injectie van 100 mg/kg pentobarbital (Zie Tabel van materialen).
7. 7 dagen om verder te gaan met de transplantatie van cellen van de hESC-RPE wachten.

2. subretinal transplantatie van cellen van de hESC-RPE in dieren behandeld

1. Beheren van 2 mg (100 µL) van intravitreal Triamcinolon in narcose dieren met behulp van een naald van 30 g injectie ingevoegd van 1-2 mm van de limbus in de lagere temporele kwadrant 1 week voor transplantatie van hESC-RPE en opnieuw beheren het elke 3 maanden. Zorg ervoor dat punt van de tip naar de achterste paal van het oog om te voorkomen dat de aanraking van een lens.
2. Cultuur een hESC-RPE enkelgelaagde zoals eerder beschreven¹.
3. Verwijderen van cel differentiatie media (Zie Tabel van materialen) van een 24-well confluente hESC-RPE enkelgelaagde en wassen elk goed met 500 µL van PBS zonder Ca^{2 +} en Mg^{2 +}. Herhaal deze actie nogmaals, voor een totaal van 2 wasbeurten.
4. Vloeistof wordt weggeworpen, voeg 500 µL van trypsine per putje en incubeer gedurende 12 minuten bij 37 ° C.
5. Kantelen van de plaat en verwijder voorzichtig trypsine (cellen moeten blijven gekoppeld aan de plaat). Cellen in 800 µL van vers 37 ° C voorverwarmde differentiatie media verzamelen door zachte pipetteren, of zelfs schrapen indien nodig, te verkrijgen van de schorsing van een enkele cel.
   Opmerking: Gebruik een zeef 40 µm cel als cel klontjes in acht worden genomen.
6. Cellen tellen in een hemocytometer kamer met 0,2% Trypan blauw, volgens de instructies van de fabrikant.
7. Voeg 5 mL van de media en centrifuge cellen differentiatie bij kamertemperatuur, 300 x g gedurende 5 minuten.
8. Verwijder supernatant en resuspendeer de pellet in vers filter-gesteriliseerde PBS (doorgegeven door middel van een 25 mm spuit filter), om een eindconcentratie van 1000 cellen/µL.
9. Aliquot de vorige celsuspensie in 600 µL aliquots en houd op ijs tot en tijdens de operatie.
10. Anesthetize dieren door intramusculaire toediening in de dij met een mengsel van 35 mg/kg ketamine en 5 mg/kg xylazine in zout met behulp van een injectiespuit 30 G. Verwijden leerlingen met actuele oogdruppels gebruiken amix van 0,75% Cyclopentolaat en 2,5% phenylephrine. Juiste afstomping wordt bevestigd als het dier niet op een harde snuifje in zijn achterste been reageert.
11. Plaats het konijn met het hoofd geconfronteerd met de chirurg. Gebruik een oprolmechanisme van het deksel te verwijderen van de oogleden en nictitans membraan met een steriele doek om te minimaliseren van het risico van besmetting. Met BSS voorkomen dat droogte terwijl onder verdoving in beide ogen.
12. Voor microchirurgie, gebruik een 2-poort (of optionele 3-poort) 25 G transvitreal pars plana techniek met trocars in dezelfde positie geplaatst, zoals beschreven in stap 1.3 en Figuur 2. Als de vorige sclerotomies zichtbaar zijn, voeren trocar inbrengen net naast, maar niet via deze, tot een minimum beperken van het risico van postoperatieve lekkage.
    1. Zet een éénpersoons gebruik platte contactlens op het hoornvlies te visualiseren van het netvlies, met synthetische tranen als het contact gel tussen het oog en de contactlens (figuur 1A).
    2. Na goede tip (zie stap 1.3.5 en 1.3.6) positionering, injecteren 50 µL van een voorzichtig-gemengde hESC-RPE schorsing (50.000 cellen) subretinally. Streven naar het midden van de NaIO₃ voorbehandeld gebied onderscheidt zich door een karakteristieke "metalen" endo-verlichting-reflex. Het hormoonfuncties netvlies moet scheiden gemakkelijk maken een duidelijk zichtbare bleb. Flush de naald met steriele H₂O daartussenin konijnen/na gebruik te voorkomen van naald verstoppingen als gevolg van cel samengeklonterd. Verandering de naald bij verstopping is opgemerkt.
    3. Tijdens de injectie, langzaam intrekken van de naald, maar zorg ervoor dat het uiteinde wordt gehandhaafd binnen het bleb om te minimaliseren van reflux.
    4. Na verwijdering van de endoillumation en injectie canule, verwijder de trocars met behulp van klauwkikker pincet en toepassing lichte druk voor 30 s tot de zelfsluitende hechtdraad-minder sclerotomies met behulp van de tip of het botte uiteinde van de verlostang.
13. Had het geven van 10 mL zoutoplossing subcutaan om uitdroging te voorkomen. Geef niet na chirurgische topische steroïden of antibiotica. Voor pijnstillers 0,5 mL van buprenorfine 0,3 mg/ml subcutaan na chirurgie, evenals de dag na de operatie geven.
14. Na gebruik, wassen alle instrumenten door het onder te dompelen hen voor een paar seconden, om te beginnen in 70% ethanol, de tweede in ethanol 45%, en tot slot in gedistilleerd water. Droog ze goed met een papieren handdoek.
15. Dieren wonen totdat zij weer voldoende bewustzijn en plaats ze allen één encaged. Indien nodig (bijvoorbeeld voor doeleinden van immunohistochemistry) euthanaseren van dieren door intraveneuze injectie van 100 mg/kg pentobarbital.

3. in Vivo Retina en Subretinal Imaging

1. Een spectrale domein optische coherentie tomografie (SD-OCT) apparaat gebruiken met de meegeleverde software (zie tabel van materialen) te verkrijgen van transversale b-scans van de behandelde dieren, volgens de instructies van de fabrikant. Om te vermijden vervagen van de afbeelding, ervoor te zorgen het hoornvlies om vochtig te houden door te spoelen met actuele saline elke 30-60-s.
   1. Plaats de narcose en leerling-uitgezet dieren (zie stap 1.1 en 2.10) in een verstelbare mount te verkrijgen van een onbelemmerde pad van de lichtbron instrument aan het netvlies konijn.
   2. Het verkrijgen van ten minste 3 OCT scans met gelijktijdige infrarood-confocale scanning laser ophthalmoscopy (IR-cSLO) reflectiecoëfficiënt referentie afbeeldingen vertegenwoordigen het bovenste, Centraal en onderste gedeelte van het geïnjecteerde gebied.
   3. Verkrijgen van nl-gezicht fundus beelden met cSLO blauwe, groene, infrarood en multicolor laser reflectie (d.w.z., meerdere gelijktijdige laser kleuren), respectievelijk.
   4. Blauw licht autofluorescence (BAF) opnamen met behulp van het vermogen van de blauw-licht laser van de SD-OCT-apparaat.

Resultaten

Vertegenwoordiger in vivo afbeeldingen van BAF, IR-cSLO en SD-LGO van een normale albino konijn netvlies zijn afgebeeld in Figuur 2. Opmerking de verschillende retinale lagen met hun kenmerkende licht reflectie gevangen genomen door de SD-OCT-instrument.

In de figuren 1A en figuur 1B, de setup te creëren sub retinale blebs wordt ge...

Discussie

In dit protocol, wordt de generatie van een grote-eyed model van GA en het preklinische gebruik voor het evalueren van hESC-RPE integratie in vivo beschreven.

Vertaling van regeneratieve therapieën voor GA en de verwante ziekten in de kliniek⁷is het belangrijk te ontwikkelen en optimaliseren van methoden die getrouw de klinische methoden voor transplantatie en beeldbewerking vangen. Het konijn is in dit aantrekkelijke aspect: het heeft een relatief grote oog da...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
NutriStem hESC XF differentiatiemedium –bFGF en –TGFb	Biological Industries	06-5100-01-1A
TrypLE Select 1x	Gibco, ThermoFisher Scientific Corp	12563-011
PBS zonder Ca2+ en Mg2+	Gibco, ThermoFisher Scientific Corp	14190-094
Cell strainer 40 μm Nylon	VWR	732-2757
Naald 30 G 0.5’’; 0.3 mm x 13 mm	BD Microlance	304827
Acrodisc 25 mm spuitfilter	Acrodisc	PN4612
0,4% trypanblauw	ThermoFisher Scientific Corp	15250061	Gebruik bij 0,2%
NaIO3	Sigma-Aldrich Corp	S4007
BSS	Alcon Nordic A/S	65079550
70% Ethanol	Solveco AB	1047
Ketaminol, 100 mg/mL	Intervet, Boxmeer	511519	Gebruik 35 mg/kg ketamin
Rompun vet, 20 mg/mL	Bayer Animal Health	22545	Gebruik 5 mg/kg xylazine
Triescence, 40 mg/mL	Alcon Nordic A/S	412915	2 mg intraviterial
Cyklopentolaat-fenylephrine, 0,75% + 2,5%	APL	321968	Gebruik 1 druppel in elk oog
Viscotears	Laboratoires Théa	597562
Topische zoutoplossing	Apotea AB	7053249369080
Allfatal vet. 100 mg/mL	Omnidea	77168	Gebruik 100 mg/mL pentobarbital
Extensiebuis (Hammer)	MedOne Surgical Inc	3223
25 G/38 G polytip subretinale canule	MedOne Surgical Inc	3219	25 G/38 G
Single Use Flat Lens	Volk	#VWFD10
Barraquer Colibri ooglid retractor	AgnTho's AB	42-020-030
Trocars zonder klep	Alcon Nordic A/S	8065751448
Klauwtang	Bausch & Lomb Nordic AB	ET1811
Alcon Accurus 400VS Vitrectomie machine	Alcon Nordic A/S	8065740238
Accurus 25+ Gauge Vitrectomie TotalL Plus Pak	Alcon Nordic A/S	8065751493
SD-OCT apparaat	Heidelberg Engineering	Spectralis HRA+OCT	Gebruik Heidelberg Eye Explorer versie 1.9.10.0
24 welplaten	Sarstedt	83.3922
Neubauer hemocytometers	VWR	631-0925
New Zealand albino konijnen	Lidköpings Konijnenboerderij, Zweden
hESC-RPE cellen			Zie referentienummer 1
Buprenodale Vet, 0,3 mg/ml	Dechra	660500	Gebruik 0,5 mL buprenorfine subcutaan