Een efficiënte In Vitro omzetting methode door een Transcriptionally gereglementeerde Sleeping Beauty systeem verpakt in een defecte lentivirale Vector integratie

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een methode om stabiele integratie van een gen van belang in het menselijk genoom door het transcriptionally gereglementeerde Sleeping Beauty -systeem. Voorbereiding van de integratie van defecte lentivirale vectoren, de in vitro -transductie van menselijke cellen en de moleculaire test op getransduceerde cellen worden gemeld.

Samenvatting

De Schone slaapster (SB) transposon is een niet-virale integratie systeem met bewezen werkzaamheid voor genenoverdracht en functionele genomica. Voor het optimaliseren van de SB transposon machine, zijn een transcriptionally gereglementeerde hyperactief transposase (SB100X) en T2 gebaseerde transposon tewerkgesteld. Typisch, de transposase en de transposon Transient worden geleverd door plasmide transfectie en SB100X expressie wordt aangestuurd door een constitutief promotor. Hier beschrijven we een efficiënte methode om te leveren van de SB-componenten aan menselijke cellen die resistent zijn tegen verschillende transfectie van fysische en chemische methoden, om te controleren SB100X expressie en stabiel integreren een gen van belang (Indiase) door middel van een "cut and paste" SB mechanisme. De expressie van hyperactieve transposase is streng gecontroleerd door het Tet-ON systeem, op grote schaal gebruikt om te bepalen van genexpressie sinds 1992. Het gen van belang wordt geflankeerd door omgekeerde herhalingen (IR) van de T2 transposon. Beide componenten SB zijn verpakt in integratie defecte lentivirale vectoren Transient geproduceerd in HEK293T cellen. Menselijke cellen, cellijnen of primaire cellen van menselijk weefsel, zijn in vitro Transient getransduceerde met virale vectoren. Bij toevoeging van doxycycline (dox, tetracycline analoge) in het kweekmedium, een fijnafstemming van transposase expressie wordt gemeten en leidt tot een duurzame integratie van het gen van belang in het genoom van de behandelde cellen. Deze methode is efficiënt en die gelden voor de cellijn (bijvoorbeeld HeLa cellen) en primaire cellen (bijvoorbeeld menselijke primaire keratinocyten), en vormt aldus een waardevol instrument voor genetische manipulatie en therapeutische genenoverdracht.

Inleiding

Het hyperactieve SB100X transposase gekoppeld aan de T2 gebaseerde transposon is reeds gebruikt in preklinische gene therapie toepassingen^1,2,3, genoom wijzigingen^4,5, en Geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC)^6,7te herprogrammeren. Typisch, de SB-componenten worden Transient verstrekt door plasmide transfectie en een sterke constitutieve promotor rijdt de uitdrukking van de transposase. Echter, ondanks de verbeterde nieuwe methoden van transfectie, levering van de tweecomponenten systeem blijft een uitdaging voor vele toepassingen. De ontwikkeling van een nieuw protocol voor de levering heeft dus steeds meer belangstelling. Naast de methoden van de transfectie voor plasmide⁸ en mRNA⁹, virale levering gebaseerd op adenovirale^10,11, adeno-geassocieerde virale (AAV)¹², Baculovirus¹³, gammaretroviral,¹⁴ en lentivirale vectoren¹⁵ heeft voorgesteld in het verleden. Met name moet het systeem van keuze garanderen een voorbijgaande aflevering van de SB-onderdelen zonder integratie van de virale vector. Toch roept de constituerende uitdrukking van transposase bezorgdheid over de veiligheid als gevolg van het risico van een onbeheersbare rehopping van het transposon.

Daarom, transcriptionele regulering van SB100X door een verfijnde Tet-ON systeem is de eerste uitdaging. Een gemodificeerde Tet-responsieve promotor, verkregen door te vervangen door de oorspronkelijke promotor van het ontwikkelde minimale cytomegalovirus (CMV) met de minimale promotor (-81) van het gen Timidine Kinase (TK) van Herpes Simplex Virus-1 (HSV-1)¹⁶, wordt gekloond stroomopwaarts van de SB100X cDNA (pTetOTKSB100X). De gemuteerde omgekeerde-tetracycline-transactivator rtTA2^s-M2¹⁷ onder de controle van de sterke constitutieve promotor (fosfoglyceraat promotor, PGK) gekloond in een verschillende plasmide wordt uitgedrukt (pCCL-PGKrtTA2^S-M2). Wanneer toegevoegd aan het kweekmedium, dox bindt de rtTA2^s-M2 modulator en aanbinden van de promotor van de Tet complexe of, resulterend in strak gereguleerde inductie van SB100X expressie¹⁸.

De tweede belangrijke uitdaging vloeit voort uit de inefficiënte transfectie van menselijke primaire cellen door verschillende fysische en chemische methoden. Om efficiënt transposase in menselijke cellen resistent tegen transfectie, de SB100X en de rtTA2^s-M2 expressie cassettes worden verpakt in twee integratie defecte lentivirale vectoren (IDLVs)¹⁹: IDLVTKSB en IDLVrtTA2^s- M2. Virale vectoren worden Transient geproduceerd als derde generatie vectoren in HEK293T cellen²⁰ en pseudotyped met de glycoproteïne G van het Vescicular Stomatitis Virus (VSV-G), die een breed spectrum van infectie verleent. Vector deeltjes worden geconcentreerd door ultracentrifugatie en getitreerd met HIV-1 Gag p24 immunocapture. Als u wilt transduce cellijnen en primaire cellen, vector deeltjes zijn complexvorm met polybrene en worden geïncubeerd met de doelcellen in de aanwezigheid of afwezigheid van dox. Drug-afhankelijke activering van SB100X expressie in getransduceerde cellen wordt gemeten door kwantitatieve RT-PCR (qRT-PCR)¹⁸.

Zodra het Tet-gereglementeerde SB100X expressie wordt aangetoond, volgt omzetting van de Indiase overheid (bijvoorbeeld groen fluorescent proteïne, GFP) in het genoom van de cel doelgroep de moleculaire gebeurtenissen die duidelijk geschematiseerde door Bak en Mikkelsen²¹. Een derde IDLV vector uitvoering een expressie cassette voor de Indiase overheid gekloond tussen de T2-transposon IRs (IDLVT2) moet worden gebouwd en verpakt zoals hierboven vermeld. Ten slotte, de drie IDLV vectoren kunnen worden gebruikt om efficiënt menselijke cellen (bv. primaire keratinocyten) in vitro transduce en integreren van de Indiase overheid in aanwezigheid van doxycycline¹⁸.

Protocol

1. plasmiden werkzaam

Opmerking: Plasmide pCCL-PGKrtTA2^S-M2 werd vriendelijk geleverd door Prof. Zappavigna (Universiteit van Modena en Reggio Emilia, Modena, Italië). De pCMVSB100X plasmide uitvoering de codering opeenvolging van hyperactieve transposase en pT2/BH transposon plasmide werden beschikbaar gesteld door Prof Z. Ivics (Paul Ehrlich Instituut, Langen, Duitsland) en Prof. Z. Izvak (Max Delbruck Center for Molecular Medicine, Berlin, Duitsland).

1. Voor alle klonen in Escherichia Coli (E. coli), volg de klonen strategie van keuze en restrictie-enzym procedure of PCR versterking van het fragment dat moet worden gekloond.
   Opmerking: Tabel 1 geeft een overzicht van alle van de plasmiden, werkzaam in dit protocol. Een beschrijving en verwijzingen voor elke plasmide zijn verstrekt.

2. virale vector productie

Opmerking: Alle van de virale vectoren worden geproduceerd in een biohazard kap op een BSL2 bioveiligheid beheersingsniveau, volgens institutionele regels en voorschriften.

1. Cultuur aanhangend HEK293T cellen in de Dulbecco bewerkt Eagle Medium aangevuld met 10% HyClone serum, 100 U/mL penicilline-streptomycine en 2 mM glutamine.
2. Dag 0: Bereiden vijf 15 cm platen/virale voorbereiding en zaad 5.5x10⁶ cellen in 30 mL van het medium.
3. Dag 1: transfectie
   1. Voordat u begint transfectie, opstellen van 100 mL 2 x HEPES buffer zoutoplossing (HBS):
      NaCl (5 M) 5,6 mL
      HEPES (1 M) 10,0 mL
      NB₂HPO₄ (0,5 M) 0.3 mL
      Steriel water 84,1 mL
      Aanpassen aan pH 7.1 met 37% HCl.
      Opmerking: 2 x HBS kan worden achtergelaten bij 4 ° C. Een exacte pH is uiterst belangrijk voor efficiënte transfectie. De optimale pH bereik is 7.10 aan 7.12.
   2. Verwijder van middellange en voeg 22.5 mL/plaat van verse middellange 4 h voor Transfectie.
   3. Transfect HEK293T cellen met de plasmide overdracht, het pMD.Lg/pRRE.D64VInt verpakking plasmide, de pMD2.G envelop-encoding plasmide en de pRSV-Rev (tabel 1) volgens de volgende bedrag/plaat:
      overdracht van de plasmide 25,00 µg
      pMD.Lg/pRRE.D64VInt 16.25 µg
      pMD2.G 8,75 µg
      pRSV-Rev 6.25 µg
      Opmerking: De ANI van de plasmide zijn bereid volgens de CsCl protocol beschreven door Maniatis²² of met behulp van een plasmide endotoxine-gratis reiniging kit.
      1. Resuspendeer 56.25 µg DNA (mix van 4 plasmiden) in 1.125 mL steriel water en voeg 125 µL van 2,5 M CaCl₂ (oplossing A).
      2. Voeg 1.250 mL 2 x HBS tot een steriele 15 mL conische centrifugebuis (oplossing B).
      3. Voeg oplossing een (1.250 mL) naar B (1.250 mL) ontkleuring terwijl borrelen met een 1 of 2 mL Pipet (transfectie oplossing, totaal volume 2.500 mL).
      4. Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (RT).
      5. Met behulp van een P1000 micropipet, alle van de transfectie oplossing (2.500 mL) voor de cel enkelgelaagde ontkleuring distribueren.
   4. Na een nacht bebroeden in een cel cultuur incubator bij 37 ° C, 5% CO₂.
4. Dag 2: Verwijder het medium en voeg toe 15 mL verse voedingsbodem (zie stap 2.1).
5. Dag 3: Verzamelen en concentreren van het lentivirale deeltje-bevattende supernatant.
   1. Alle supernatant (~ 70 mL) ophalen (n = 5) transfected cel platen, filtreer door een 0,45 µm PESS filteren en vul 2 polyallomer buizen (1-inch x 3,5 inch) / virale voorbereiding.
   2. Het concentreren van de vector deeltjes door ultracentrifugatie bij 106.000 x g gedurende 2,5 h, bij 15 ° C met rem.
   3. Onmiddellijk na het stoppen van de ultracentrifugatie (Voorkom resuspensie van de pellet in de buis), zachtjes giet het supernatant in een container met 10% bleekwater en de 2 nauwelijks zichtbaar pellets op te schorten in 100 µL van 1 x PBS (+ 1% BSA). Dit is normaal als de pellet duidelijk en zeer klein is. De geconcentreerde vector vers bereide of aliquoot gebruiken en opslaan van virale preparaten bij-80 ° C.
      Let op: Het supernatant bevat lentivirale deeltjes die grondig voordat de teruggooi in de biohazard afval moeten worden gebleekt.
6. Om Titreer de virale vector-voorbereiding, een HIV-1 Gag p24 immunocapture kit volgens protocol van de fabrikant te gebruiken.
   Opmerking: Om te standaardiseren de productie van virale vector, liposomen gebaseerde reagentia kon worden ingezet. De virale vector-titer is echter sterk afhankelijk van transfectie efficiëntie en zuiverheid van de plasmide DNA.

3. transductie van menselijke cellijnen (bijvoorbeeld HeLa cellen)

Opmerking: HeLa cellen worden gekweekt in Dulbecco van gemodificeerde Eagle's medium aangevuld met 10% foetaal kalfsserum, 100 U/mL penicilline-streptomycine en 2 mM glutamine. Tabel 1 geeft een overzicht van alle van de vectoren werkzaam in dit protocol. Een beschrijving voor elke vector wordt gegeven. Transductie van HeLa cellen kan verificatie van het transcriptionele Reglement van SB transposase in de beste dosis combinatie van de twee IDLV vectoren. Variatie van IDLV doses kan worden gerelateerd aan de vector deeltje titratie en doeltype van de cel.

1. Dag 0: Zaad 2 x 10⁵ cellen in 3 mL medium voor elk putje van de plaat van een 6-well. Maak 4 putten.
2. Dag 1: Transductie van HeLa cellen.
   1. Voor elke voorwaarde, Verdun lentivirale vectoren tot een eindvolume van 1 mL medium (zie bovenstaande opmerking) in aanwezigheid van 10 μL van polybrene (eindconcentratie 8 μg/mL):
      Verdunning voor goed #1: bespotten getransduceerde cellen (negatieve controle).
      Verdunning voor goed #2: IDLVTKSB vector (2.600 ng van p24).
      Verdunning voor putten #3, #4: IDLVTKSB vector (2.600 ng van p24) + IDLVrtTA2^s-M2 vector (9600 ng van p24).
   2. Verwijder het medium van elk putje waar HeLa cellen werden verguld op dag 0 en voeg lentivirale vector verdunningen aan de corresponderende goed.
   3. Spinoculate de 6-well plaat duikt met 754 x g gedurende 45 minuten bij 20-25 ° C, en vervolgens transfer de 6-well plaat naar een cel cultuur incubator bij 37 ° C en 5% CO₂.
   4. Na 6 uur, vervang de middellange met vectoren met verse medium in alle putjes en doxycycline toevoegen aan 1 μM in goed #4. Zet de plaat in een cel cultuur incubator bij 37 ° C gedurende 48 uur.
3. Dag 3: Voorbereiding van cel pellet RNA extractie.
   1. Vóór het loskoppelen van cellen, bereiden een trypsine werkoplossing (1 x):
      2,5% trypsine (10 x) 5,0 mL
      500 mM EDTA (eindconcentratie = 5 mM) 0,5 mL
      1 x PBS 44,5 mL
   2. Warme trypsine werkende oplossing bij 37 ° C vóór gebruik. Bewaar de werkoplossing trypsine bij 4 ° C.
   3. Verwijderen van middellange en wassen van cellen met 1 x PBS. Voeg 0,5 mL van de werkoplossing voor voorverwarmde 37 ° C trypsine aan elk putje en Incubeer bij 37 ° C gedurende 7 min. (in een cel cultuur incubator).
   4. Na de incubatie, Voeg 0,5 mL serum-bevattende middellange aan elk putje aan de inactivering van trypsine en verzamelen cellen in een centrifugebuis. Spoel na elk nou eenmaal met 3 mL 1 x PBS en de celsuspensie gedurende 5 minuten bij 240 x g centrifugeren.
   5. Cellen met 5 mL 1 x PBS, centrifuge voor 5 min op 240 x g wassen en weggeworpen. Gebruik vers verzameld is cel pellets of Bewaar bij-80 ° C. Uittreksel totaal RNA van pellets uit te voeren van semi-kwantitatieve RT-PCR (zie stap 6).

4. transductie van menselijke primaire cellen (bijvoorbeeld keratinocyten)

Opmerking: Menselijke primaire keratinocyten worden overgeënt op dodelijk bestraalde 3T3-J2 cellen (feeder layer)²³, een soort geschenk van Yan Barrandon (EPFL, Lausanne, Zwitserland).

1. Groeien Zwitserse muis 3T3-J2 cellen in de Dulbecco bewerkt Eagle Medium aangevuld met 10% donor runderserum, 50 U/mL penicilline-streptomycine en 4 mM glutamine (3T3 medium).
2. Groeien van keratinocyten op cellen van de dodelijk bestraalde 3T3-J2 in cFAD medium, van een Dulbecco bewerkt Eagle Medium en Ham van F12 media mengsel (3:1) met foetale runderserum (10%), glutamine (2%), penicilline-streptomycine (1%) en insuline (5 µg/mL), adenine (verguld 0.18 mM), hydrocortison (0.4 µg/mL), cholera-toxine (0,1 nM), en trijodothyronine (2 nM).
3. Dag 0: Zaad 3 x 10,⁵ bestraald dodelijk 3T3-J2 cellen, eerder verdund tot 3T3 medium om een eindconcentratie van 1 X 10⁵ cellen/mL, in elk putje van de plaat 6-well. 9 putten voor te bereiden.
4. Dag 1: Transductie van primaire keratinocyten
   Opmerking: Transductie van keratinocyten kunt kwantificering van de transcriptionele regulering van SB transposase in de beste dosis combinatie van de twee IDLV vectoren (door qRT-PCR) en om te controleren of de integratie van de Indiase overheid (GFP) in de doelcellen (door cytofluorimetric analyse).
   1. Vóór het loskoppelen van cellen, bereiden de werkoplossing trypsine:
      0,5% trypsine-EDTA (10 x) 5,0 mL
      500mM EDTA (eindconcentratie = 5 mM) 0,5 mL
      1 x PBS 44,5 mL
   2. Warme trypsine werkende oplossing bij 37 ° C vóór gebruik. Bewaar de werkoplossing trypsine bij 4 ° C.
   3. Als u wilt loskoppelen subconfluent keratinocyten in cultuur, medium verwijderen en wassen van cellen met 1 x PBS 1 mL van de werkoplossing voorverwarmde trypsine toevoegen aan elk putje. Incubeer bij 37 ° C gedurende 15 min. in de cel cultuur incubator.
   4. Na de incubatie resuspendeer de cellen van een goed grondig en de celsuspensie overbrengen in een centrifugebuis met 2 mL serum-bevattende medium (als vele cellen nog steeds verbonden zijn, Incubeer gedurende een extra minuten bij 37 ° C). Spoel elke nou eenmaal met 3 mL 1 x PBS of verse medium en de spoelen-oplossing toevoegen aan de centrifugebuis met de celsuspensie.
   5. Centrifugeer gedurende 5 min op 580 x g en verwijder het supernatant.
   6. Cellen met 5 mL 1 x PBS, centrifuge voor 5 min op 580 x g wassen en verwijder het supernatant.
   7. In een polypropyleen tube van 15 mL, Verdun 1.6x10⁵ keratinocyten in 1 mL van cFAD medium, één verdunning voor elke voorwaarde.
   8. Verdun lentivirale vectoren in 1 mL van cFAD medium in aanwezigheid van 20 μL van polybrene (eindconcentratie van 8 µg/mL bij een eindvolume van 2 mL):
      Verdunningen voor putten #1, #2, #3: getransduceerde cellen (negatieve controle zonder vectoren) bespotten.
      Verdunningen voor putten #4, #5: IDLVTKSB vector (13.000 ng van p24) + IDLVrtTA2^s-M2 vector (48.000 ng van p24).
      Verdunningen voor putten #6, #7, #8, #9: IDLVTKSB vector (13.000 ng van p24) + IDLVrtTA2^s-M2 vector (48.000 ng van p24) + IDLVT2 vector (9,160 ng van p24).
   9. Transduce cellen in suspensie door elke lentivirale vector verdunning (1 mL) toe te voegen tot de overeenkomstige Keratinocyt schorsing (1.6x10⁵ keratinocyten in 1 mL).
   10. Verwijder het medium van dodelijk bestraalde 3T3-J2 cellen ontpit op dag 0 en plaat getransduceerde keratinocyten (1.6x10⁵ keratinocyten in 2 mL) op hen. Na een goed transducing gaat u verder met de volgende.
   11. Incubeer bij 25 ° C gedurende 30 minuten, en breng de cellen tot 37 ° C in de cel cultuur incubator voor 6 uur.
       Opmerking: Doe niet spinoculate primaire keratinocyten, zoals levensvatbaarheid en proliferatie zal sterk worden beïnvloed.
   12. Na 6 uur, voeg 1 mL van cFAD medium aan elk putje. Voeg 1 μM doxycycline (eindconcentratie) in putten #5, #8 en #9. Cellen retourneren tot 37 ° C.
5. Dag 2: Vervang cFAD medium met 3 mL KC medium met 10 ng/mL EGF.
6. Dag 3: Trypsinize en wassen van cellen uit putten #1, #4 en #5 zoals beschreven (zie 4.4.1 aan 4.4.6). Bevriezen van cel pellets bij-80 ° C tot het extract van de totale RNA voor qRT-PCR analyse (zie stap 7).
7. Trypsinize van cellen uit goed #2 #6 en #8, zoals beschreven in stappen 4.4.1 aan 4.4.5 en cytofluorimetric analyses uit te voeren voor GFP expressie (zie stap 5).
8. Houd de cultuur uit putten #3, #7 en #9 voor ten minste 3-4 verdubbelingen, voldoende om te verdunnen un-geïntegreerde IDLVT2 vector (5 dagen voor menselijke primaire keratinocyten verguld op feeder laag).
9. Dag 6: Ongeveer 5 dagen post signaaltransductie, trypsinize cellen (Zie stappen 4.4.1 aan 4.4.5) uit putten #3, #7 en #9 tot en met cytofluorimetric analyses uit te voeren voor GFP expressie (zie stap 5).
   Opmerking: De timing en transductie efficiëntie Experiment zijn sterk beïnvloed door primaire celtype en variabiliteit van verzamelde monsters.

5. Cytofluorimetric analyse op getransduceerde primaire keratinocyten

Opmerking: Een stroom cytometer geconfigureerd met een blauwe laser (488 nm), een rode laser (633 nm) en filters voor detectie van GFP en APC fluorescentie werkzaam is (Zie Materialen tabel).

1. Om te discrimineren keratinocyten uit 3T3-J2 feeder laag, label getransduceerde keratinocyten vrijstaand op dag 3 en dag 6 (zie stap 4.7 en 4.9) met muis monoclonal APC-geconjugeerd antilichaam van de anti-Feeder.
   1. 4 mL buffer voor elk monster kleuring voor te bereiden:
      5% FBS 200 ΜL
      500 mM EDTA (eindconcentratie = 2,5 mM) 20 μL
      PBS 1 x 3780 μL
   2. Wassen vrijstaande cellen met 1 mL buffer kleuring. Centrifugeer gedurende 5 min op 580 x g en verwijder het supernatant.
   3. In een buis voor stroom cytometry verwerving, 5 x 10⁴ cellen in 100 μl van kleuring buffer resuspendeer en voeg 2 μL van anti-Feeder antilichaam (1:50). Meng goed en incubeer gedurende 30 min op ijs in het donker.
   4. Na 30 min, wassen met 2 mL buffer kleuring. Centrifugeer gedurende 5 min op 580 x g en verwijder het supernatant. Resuspendeer in 200 μL van de kleuring van de buffer.
   5. Verwerven van APC en GFP signalen door cytofluorimetric analyse¹⁸. De Fractie van de cel GFP⁺ van de APC^- -celpopulatie wordt aangegeven getransduceerde keratinocyten.
      Opmerking: Indien gewenst herstellen het gebeitst monster vóór stroom cytometry met 2% paraformaldehyde in PBS 1 x en winkel bij 4 ° C in het donker tot de run.
2. Stroom cytometry gegevens analyseren door het uitzetten van de verhouding tussen het percentage van GFP⁺cellen op het eindpunt (5 dagen) en het percentage van GFP⁺cellen 2 dagen post signaaltransductie, genormaliseerd naar residuele niveau van de IDLVT2-getransduceerde cellen.

6. semi-kwantitatieve RT-PCR

Opmerking: Gebruik een PCR thermische cycler.

1. Uittreksel totaal RNA van getransduceerde of controle cellen met behulp van een RNA zuivering kit, volgens protocol van de fabrikant.
   Opmerking: Totale RNA kan worden opgeslagen bij-80 ° C.
2. Synthetiseren van cDNA in een 20 µL-reactie met 100 ng van totale RNA en een reverse-transcriptase-kit, volgens protocol van de fabrikant.
   Opmerking: cDNA kan worden opgeslagen bij-20 ° C.
3. Ontwerp primers specifiek voor SB100X, rtTA2^s-M2 en GAPDH (een huishouden-gen).
   Voorgestelde designs:
   SB toekomen primer: 5'-GCCACTCAGCAAGGAAGAAG-3'
   SB reverse primer: 5'-GTGTTGGAAGACCCATTTGC-3'
   rtTAM2 toekomen primer: 5'- GACGACAAGGAAACTCGCTC-3'
   rtTAM2 reverse primer: 5'-TTACCCGGGAGCATGTCAA-3'
   GAPDH toekomen primer: 5'-GACCACAGTCCATGCCATCAC-3'
   GAPDH reverse primer: 5'-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'
4. PCR in een volume van de uiteindelijke reactie van 50 µL uitvoeren. In het bijzonder monteren in elke buis PCR de volgende reactie:
   cDNA (in de verdunning 1:5) (uit stap 6.2) 1,00 µL
   Toekomen primer (10 µM stock) 1,00 µL
   Omgekeerde primer (10 µM stock) 1,00 µL
   dNTPs (10 µM stock) 1,00 µL
   Buffer (+ MgCl₂) (10 x stock) 5,00 µL
   Taq polymerase (5 U/µL stock) 0,25 µL
   Steriel water 40.75 µL
5. Het volgende programma van de thermische cycler gebruiken: 1 cyclus bij 95 ° C gedurende 5 minuten vervolgens doorgaan met 95 ° C gedurende 30 s, 58 ° C gedurende 30 s, en 72 ° C gedurende 30 s voor 34 cycli voor SB100X, 32 cycli voor rtTA2^s-M2 , en 25 cycli voor GAPDH.
6. Bereiden 1% agarose gel. Los 1 g agarose in 100 mL TBE 1 x (10 x voorraad verdund in steriel water), in een maatkolf of bekerglas. Smelten in een magnetron, zwenken van elke minuut totdat de agarose volledig is opgelost. De gesmolten agarose afkoelen tot ongeveer 50 ° C is bereikt, en voeg vervolgens 5 µL van ethidiumbromide (10 mg/mL stockoplossing). Giet gesmolten agarose in een lade van de geassembleerde gel met een kam, voor het gieten van de gel.
7. Monsters (van elk 10 µL) van de belasting op de agarose gel en het uitvoeren van elektroforese.
8. Indien gewenst, verwerven van gel foto en densitometric analyses uit te voeren op de PCR banden.

7. kwantitatieve RT-PCR (qRT-PCR)

Opmerking: Een commerciële Sequence-detectiesysteem wordt gebruikt. PCR de inleidingen en 6-carboxyfluorescein (FAM) sonde voor glyceraldehyde 3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH) worden commercieel gekocht.

1. Zie stap 6.2 voor retro-transcriptie.
2. Het gebruik van software voor het ontwerpen van inleidingen en specifieke sonde voor SB100X.
   Voorgestelde ontwerp:
   SB.2 toekomen primer: 5'-GAAGAAGCCACTGCTCCAAAA-3',
   SB.2 reverse primer: 5'-CCCCATGTGCAGTTGCAA-3'
   sonde SB FAM: 5'-CATAAGAAAGCCAGACTACGG-3'
3. Real-Time PCR uitvoeren in 96-wells-platen met een Master van de PCR-Mix en inleidingen + sonde mix, in een laatste reactie volume van 25 µL. In het bijzonder rekening houden met de volgende reactie voor elk putje:
   cDNA (1:10 verdunning in steriel water) 1,00 µL
   2 x Master Mix 12,50 µL
   Inleidingen + 20 x sonde Meng 1,25 µL
   Steriel water 10.25 µL
   Opmerking: Alle reacties in drievoud uitvoeren. Voorkom pipetting fouten en bereiden een mix voor minstens n + 3 Reacties (zonder cDNA). Aliquot met behulp van een meerkanaalspipet.
4. Uitvoeren van PCR in real time met behulp van het volgende programma: 1 cyclus bij 95 ° C gedurende 10 minuten, dan 40 cycli van 95 ° C voor 15 s en 60 ° C gedurende 1 minuut en houd bij 4 ° C.
5. QRT-PCR gegevens analyseren door de relatieve uitdrukking (RQ-waarde) van de SB100X naar het niveau van GAPDH van cDNA hetzelfde monster door de 2^-ΔΔCT kwantificering, met behulp van de software van de analyse van de typische gegevens normaliseren.

Resultaten

Met behulp van de procedure die hier, drie IDLV vectoren uitvoering de gereglementeerde SB-onderdelen (SB100X, rtTA2^S-M2 en T2-GFP transposon) waren verpakt en gebruikt voor het efficiënt leveren en strak regelen de SB-systeem in menselijke cellen. Figuur 1A blijkt een regeling voor de in vitro transductie van HeLa cellen, die werd uitgevoerd voor de evaluatie van de transcriptionele regulering van SB transposase met de beste dosis combina...

Discussie

Hier beschrijven we een breed toegankelijke methodologie om een Indiase stabiel te integreren in het genoom van doelcellen door Doornroosje-gemedieerde omzetting. Hoewel de SB-systeem werd ontwikkeld om een nonviral methode voor het bewerken van het genoom te bieden, is efficiënte levering van de machines van de integratie (transposase en T2 transposon) verplicht. Daarom gebruiken de SB-systeem op nauwelijks transfectable primaire cellen, werd een virale levering van SB componenten voortgezet in de afgelopen jar...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Dulbecco’s modified Eagle’s medium with 4.5g/L glucose w/o L-Glutamine	Lonza	BE12-614F	Celcultuurmedium.
HyClone Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized	GE Healthcare Life Sciences	SH30071.03	Serum gebruikt voor HEK293T-celcultuur voor productie van lentiviraal deeltje.
Penicillin 10.000 UI/ml Streptomycin 10.000 UI/ml	Lonza	DE17-602E	Reagentia voor celcultuurmedium.
L-Glutamine 200mM	Lonza	BE17-605E	Reagens voor celcultuurmedium.
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	Reagens voor HBS 2X-voorbereiding.
HEPES Buffer, 1M Stock in normal saline	Lonza	BE17-737E	Reagens voor HBS 2X-voorbereiding.
Disodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4·2H2O), 99.5%	Merck	106580	Reagens voor HBS 2X-voorbereiding.
Hydrochloric acid - ACS reagent 37% (HCl)	Sigma-Aldrich	320331	Reagens voor HBS 2X-voorbereiding.
Sterile water for injection	Fresenius Kabi	-	Reagens voor HBS 2X-voorbereiding.
0.45 µm PESS filter	Whatman	10462100	Filters gebruikt om cellulaire resten uit virologisch supernatant te verwijderen.
Polyallomer Beckman tubes	Beckman Coulter	326823	Buizen voor het concentreren van IDLV-vectoren door ultracentrifugatie.
PBS-1X w/o Ca, Mg	Lonza	BE17-516F	Buffer voor celwassing en herophanging van lentiviraal deeltje.
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153	(Optioneel) Buffer voor herophanging van lentiviraal deeltje.
HIV-1 Gag p24 immunocapture kit	Perkin Elmer	NEK50001KT	Kit voor titratie van IDLV-deeltjes.
Polybrene	Sigma-Aldrich	107689	Reagens om de transductie-efficiëntie te verbeteren.
Trypsin (10X) 2.5% in HBSS w/o Ca, Mg	GIBCO	BE17-160E	Reagens om HeLa-cellen los te maken (voorraadoplossing, dient te worden verdund).
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA)	100938B	AnalaR BDH	Reagens voor de bereiding van trypsinewerkoplossing.
0.5% Trypsin-EDTA, no phenol red (10X)	GIBCO	15400-054	Reagens om keratinocyten los te maken (voorraadoplossing, dient te worden verdund).
Donor Bovine Serum, New Zealand Origin	GIBCO	16030-074	Serum voor de celcultuur van Zwitserse muis 3T3-J2-cellen (voedingslaag).
Ham’s F12 media	GIBCO	21765	Medium voor keratinocyten.
Fetal bovine serum	Lonza	DE14-801F	Serum voor HeLa-celcultuurmedium.
Fetal Bovine Serum, qualified, Australia Origin	GIBCO	10099-141	Serum voor het kweekmedium van humane primaire keratinocyten.
Insulin from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	I5500	Reagentia voor keratinocytengroei.
Adenine	VWR	1152-25	Reagentia voor keratinocytengroei.
Hydrocortisone	VWR	3867-1	Reagentia voor keratinocytengroei.
Cholera Toxin from Vibrio cholerae	Sigma-Aldrich	C8052	Reagentia voor keratinocytengroei.
Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T5516	Reagentia voor keratinocytengroei.
Human EGF	Austral Biological	GF-010-9	Reagentia voor keratinocytengroei.
Mouse monoclonal APC-conjugated Anti-Feeder antibody	Miltenyi Biotech	130-096-099	Om voedingslaag te labelen.
RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	74134	RNA-zuiveringskit.
SuperScript III Reverse Transcriptase	Life Technologies	18080051	Reverse transcriptasekit.
Deoxynucleotide Mix, 10 mM (dNTP)	Sigma-Aldrich	D7295	Reagens voor semi-kwantitatieve PCR.
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	(elke)	-	Reagens voor semi-kwantitatieve PCR en qRT-PCR.
GoTaq G2 Hot Start Polymerase	Promega	M740B	Taq-polymerase.
Agarose, for molecular biology	Sigma-Aldrich	A9539	Reagens voor agarosegelelektroforese.
UltraPure TBE Buffer, 10X	Invitrogen	15581028	Reagens voor agarosegelelektroforese, te verdunnen (1X) in ddH2O.
Ethidium bromide	Sigma-Aldrich	E1510	Reagens voor agarosegelelektroforese.
Doxycycline	Sigma-Aldrich	D-9891	medicijn om transposase-expressie in HeLa-cellen en keratinocyten te induceren
TaqMan Universal PCR Master Mix	Applied Biosystem	4304437	TaqMan Universal PCR Master Mix inclusief primers en sonde.
15mL High Clarity polypropylene Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile	Falcon Corning	352096	Buizen voor celcollectie en bereiding van vectorverdunning.
150 mm TC-Treated Cell Culture Dish with 20 mm Grid, Sterile	Falcon Corning	353025	Celcultuurschaal voor virale productie.
6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid, Individually Wrapped, Sterile	Falcon Corning	353046	Celcultuurplaat voor transductie van HeLa- en humane primaire keratinocyten.
Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 1.5 mL	Eppendorf	0030 120.086	Buizen voor bereiding van verdunningen.
Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 2 mL	Eppendorf	0030 120.094	Buizen voor bereiding van verdunningen.