Methodenartikel

Een kwantitatieve Dot Blot Assay voor AAV titratie en het gebruik ervan voor functionele beoordeling van het Adeno-associated Virus Assembly-activeren eiwitten

DOI:

10.3791/56766

⸱

12 juni 2018

 ,  ,  , 
1Department of Molecular and Medical Genetics, Oregon Health & Science University, 2Department of Molecular Microbiology and Immunology, Oregon Health & Science University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit manuscript details een eenvoudig punt vlek assay voor kwantificatie van adeno-associated virus (AAV) titers en de toepassing ervan op het bestuderen van de rol van de vergadering-activeren eiwitten (AAPs), een nieuwe klasse van niet-structurele virale eiwitten gevonden in alle AAV serotypen, bij het bevorderen van de vergadering van capsids afgeleid van cognaat en heterologe AAV serotypen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Terwijl adeno-associated virus (AAV) algemeen aanvaard wordt als een aantrekkelijke vector voor gentherapie, dient het ook als een virus model voor het begrip van de biologie van het virus. De laatste betreft, heeft de recente ontdekking van een niet-structurele AAV eiwit, genoemd vergadering-activeren eiwit (AAP), werpen nieuw licht op de processen die betrokken zijn bij de vergadering van de virale Eiwitmantel VP-eiwitten in een Eiwitmantel. Hoewel veel AAV serotypen AAP voor montage vereist, hebben we onlangs gemeld dat AAV4, 5 en 11 zijn uitzonderingen op deze regel. Bovendien, we laten zien dat AAPs en geassembleerde capsids van verschillende serotypes naar verschillende subcellular compartimenten lokaliseren. Deze onverwachte heterogeniteit in de biologische eigenschappen en functionele rollen van AAPs onder verschillende AAV serotypen onderstreept die het belang van studies over AAPs afgeleid van verschillende serotypen. Dit manuscript detailleert een eenvoudig punt vlek assay voor AAV kwantificatie en de toepassing ervan te beoordelen AAP afhankelijkheid en serotype specificiteit in Eiwitmantel vergadering. Om aan te tonen het nut van deze dot vlek assay, uiteengezet we te karakteriseren Eiwitmantel vergadering en AAP afhankelijkheid van Snake AAV, een eerder genfunctieonderzoek reptiel AAV, evenals AAV5 en AAV9, die eerder is aangetoond dat het onafhankelijk is van AAP en AAP-afhankelijke serotypen, respectievelijk. De test bleek dat Snake AAV Eiwitmantel vergadering Snake AAP vereist en kan niet worden bevorderd door AAPs van AAV5 en AAV9. De test toonde ook aan dat, in tegenstelling tot veel van de gemeenschappelijke serotype AAPs ter bevordering van heterologe Eiwitmantel vergadering door cross-complementatie, Snake AAP niet vergadering van AAV9 capsids bevordert. Bovendien laten we zien dat de keuze van de nuclease heeft grote invloed op de uitlezing van de stip vlek bepaling, en dus voor het kiezen van een optimale enzym is van cruciaal belang voor succesvolle beoordeling van AAV titers.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adeno-associated virus (AAV) is een kleine, niet-gehuld, single-stranded DNA-virus met een genoom van ongeveer 4,7 kilobases (kb). Het genoom van AAV bevat open-lezing frames (ORFs) voor de rep en cap genen. In 2010, werd een eerder onbekende nonstructural eiwit gecodeerd door een + 1 frame-verschoven ORF binnen het AAV2 GLB -gen ontdekt door Sonntag et al. en gevonden om te spelen een cruciale rol in de vergadering van AAV2 Eiwitmantel VP monomeer eiwitten in een virale Eiwitmantel1. Vergadering-activeren eiwit (AAP) is deze roman eiwit vernoemd naar de rol die het speelt bij het bevorderen van Eiwitmantel vergadering1.

De ORFs voor AAP geweest geïdentificeerde bioinformatically in het genoom van alle parvoviruses binnen het geslacht Dependoparvovirus, maar niet binnen het genoom van virussen van verschillende geslachten van het parvovirus familie1,2. Functionele studies van deze roman eiwit richtten zich aanvankelijk op de AAP van het prototype AAV2 (AAP2), die de essentiële rol van AAP2 in doelgerichtheid gedemonteerde VP eiwitten aan de nucleolus voor hun accumulatie en de vorming in volledig heeft vastgesteld capsids1,3,4gemonteerd. Het onvermogen van de capsids van de AAV2 te monteren in de afwezigheid van AAP expressie is onafhankelijk bevestigd door meerdere groepen, met inbegrip van ons1,2,3,4,5 . Latere studies op AAV serotypen 1, 8 en 9 bevestigd de kritische rol van AAPs in Eiwitmantel vergadering, als VP3 monomeer proteïnen van AAV1, 8, en 9 niet konden vormen een volledig geassembleerde Eiwitmantel bij gebrek aan mede uiting van AAP2.

Onlangs, door benaderingen die het gebruik van kwantitatieve dot omvatten blot testen, we onderzochten het vermogen van AAV1 om 12 VP3 monomeren te monteren in capsids in de afwezigheid van AAP expressie en het vermogen van AAP1 tot en met 12 ter bevordering van de vergadering van VP3 monomeren van heterologe serotypen. Deze studie is gebleken dat AAV4, 5 en 11 VP3 monomeren kunnen samenstellen zonder AAP. Bovendien bleek dat acht van de twaalf AAP serotypen we onderzocht (d.w.z.alles behalve AAP4, 5, 11 en 12) weergegeven van een brede mogelijkheid ter ondersteuning van Eiwitmantel vergadering van heterologe AAV serotype capsids, terwijl AAP4, 5, 11 en 12 weergegeven een aanzienlijk beperkte capaciteit in deze verwijzing6. Deze vier serotypen zijn fylogenetisch ver van de andere AAP serotypen2,3verwijderd. Bovendien heeft de studie significante heterogeniteit in subcellular lokalisaties van verschillende AAPs6ontdekt. Bovendien, het onderzoek heeft voorgesteld dat de strakke vereniging van AAP met gemonteerde capsids en de nucleolus, hét waarmerk van AAV2 Eiwitmantel vergadering, noodzakelijkerwijs kan niet worden uitgebreid tot andere serotypes met inbegrip van AAV5, 8, en 9, die weer nucleolar uitsluiting van geassembleerde capsids6. Dus, de gegevens die u uit de studie van eventuele bijzondere serotype AAP geldt niet in het algemeen voor alle AAP biologie. Deze raadselachtige karakter van AAP biologie onderstreept de noodzaak te onderzoeken van de rol en functie van elke AAP uit zowel de canonieke en de niet-canonieke AAV serotypen.

De biologische rol van AAP in Eiwitmantel vergadering kan worden beoordeeld door het bepalen van dat de volledig-verpakt AAV virale deeltjes titers geproduceerd in menselijke embryonale nier (HEK) 293 cellen, de meest gebruikte cellijn voor de productie van de vector van AAV, met of zonder AAP eiwit expressie. De standaardmethoden voor AAV kwantificatie zijn kwantitatieve PCR (qPCR)-gebaseerd testen7,8 en kwantitatieve dot vlek gebaseerde testen9. Andere methoden voor AAV virale deeltjes kwantificatie zoals enzyme-linked immunosorbent assay10,11 of optische dichtheid meting12 zijn niet ideaal voor afgeleid van vele verschillende AAV serotypen monsters of besmet met onzuiverheden (ruwe lysates of voedingsbodems), die vaak de monsters gebruikt voor AAV onderzoek. Op dit moment is qPCR meest gebruikte voor AAV kwantificatie; het is echter noodzakelijk te erkennen potentiële valkuilen van de qPCR gebaseerde bepaling, als de bepaling kunnen leiden tot systematische fouten en significante titer variaties13,14. PCR-gebaseerde testen worden beïnvloed door een aantal potentieel verstorende factoren, zoals de aanwezigheid van covalent gesloten terminal haarspelden in PCR sjablonen die een remmende werking amplificatie13. Zelfs een ervaren persoon kan introduceren potentieel storende factoren in een op qPCR gebaseerde assay onbewust13. Kwantitatieve dot blot testen zijn daarentegen een klassieke moleculaire biologie-techniek die geen genoom versterking en maakt gebruik van een veel eenvoudiger principe met een minimaal risico van fouten ten opzichte van de qPCR gebaseerde tests. De methode is minder technisch uitdagende; de test-resultaten zijn dus redelijk reproduceerbare zelfs door onervaren individuen.

In dit verslag beschrijven we de methodologische details van een kwantitatieve dot vlek assay we regelmatig gebruiken voor AAV vector kwantificatie en bieden een voorbeeld van hoe toe te passen de bepaling om te bestuderen van de vergadering-bevordering van rol van AAPs gemeen serotypen (AAV5 en AAV9) en een eerder genfunctieonderzoek AAP van Snake AAV14. In de natuur, AAV VP eiwitten en AAP eiwitten worden uitgedrukt in cis uit een enkel gen (dat wil zeggen, VP-AAP cis-complementatie), terwijl in de hier beschreven test, VP en AAP eiwitten worden geleverd in trans uit twee aparte plasmiden (d.w.z., VP-AAP trans-complementatie). Aangezien elke VP of AAP proteïne uit verschillende serotypen kan van elke onafhankelijke plasmide worden uitgedrukt, wordt het mogelijk om te testen van heterologe VP-AAP combinaties voor Eiwitmantel vergadering (d.w.z., VP-AAP Kruis-complementatie). Kort, AAV VP3 uit verschillende serotypen wordt uitgedrukt in HEK 293 cellen door plasmide DNA transfectie voor het inpakken van een genoom AAV vector in de aan- of afwezigheid van het cognaat serotype AAP, of in de aanwezigheid van een heteroloog serotype AAP. Na productie, cultuurmedia en cel lysates worden onderworpen aan een kwantitatieve analyse van dot, vlek te kwantificeren van het virale genoom binnen de Eiwitmantel-shell. De eerste stap van de stip blot test is voor de behandeling van de monsters met een nuclease verwijderen van contaminerende plasmide ANI's en onverpakte AAV genoom in monsters. Niet te doen zou het verhogen van de signalen van de achtergrond in het bijzonder wanneer ongezuiverde monsters zijn vehiculumcontrolegroep. Dit wordt dan gevolgd door een protease-behandeling te breken van virale capsids en introductie nuclease-resistente virale genoom in monsteroplossingen. Volgende, virale genoom worden gedenatureerd, bevlekt op een membraan en gekruist met een virale genoom-specifieke DNA sonde voor de kwantificatie. In het voorbeeld assay gemeld hier, we laten zien dat de slang AAV VP3 Snake AAP voor Eiwitmantel vergadering vereist en dat Snake AAP is niet bevorderlijk voor de vergadering van AAV9 capsids in tegenstelling tot veel van de AAPs afgeleid van AAP-afhankelijke serotypen die ook vergadering van bevorderen kunnen heterologe serotype capsids. Tot slot brengen wij verslag een belangrijk voorbehoud qPCR of dot vlek gebaseerde AAV kwantificatie testen dat de keuze van de nuclease heeft grote invloed op de resultaten van de test.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opmerking: Recepten voor de oplossingen, en buffers die nodig zijn voor dit protocol zijn opgenomen in tabel 1. Het protocol die hieronder beschreven is voor de VP-AAP Kruis-complementatie dot vlek assay te bestuderen van de rollen van de eiwitten van de AAP in Eiwitmantel vergadering. De methode voor de meer algemene kwantitatieve dot vlek assay voor gezuiverde AAV vector titratie wordt uitgelegd in de sectie Vertegenwoordiger resultaten .

1. bouw van VP3, AAP en AAV2 Rep uiting van plasmiden

  1. Bouw van pCMV-AAVx-VP3 (x = serotypen)
    1. PCR-versterken de hele VP3 ORF (1.6 kb) met behulp van een polymerase van DNA van hifi- en de volgende paar van de primer: VP3 forward, CTAA-RE1-CACC-N25 (de eerste 25 nucleotiden van het VP3-ORF); VP3 omgekeerde, TCTT-RE2-N25 (de laatste 25 nucleotiden van het VP3-ORF).
      Opmerking: RE1 en RE2 zijn sites voor enzymen van de beperking (REs) voor het klonen. CTAA en TCTT zijn de terminal 5' en 3' tetranucleotides toegevoegd aan het vergemakkelijken van de spijsvertering van het beperkingsenzym in de buurt van het einde van de double-stranded DNA. CACC is een opeenvolging van Kozak consensus.
    2. Kloon de RE-digested PCR producten tussen de corresponderende RE sites van een vector zoogdieren expressie die gebruikmaakt van de menselijke cytomegalovirus onmiddellijk-vroege (CMV-IE) enhancer-promotor voor op hoog niveau expressie.
      Opmerking: Voor het moleculaire klonen, verteren 5 µg van de ruggengraat plasmide DNA met een restriction enzyme(s) bij een concentratie van 4 U/µg DNA gedurende 1 uur bij een optimale temperatuur. Voor PCR fragmenten, verhoging van de eenheden van enzymen worden gebruikt (bijvoorbeeld10 U/µg voor het VP3 ORF PCR-product van 1.6 kb) en een langere incubatietijd (bijvoorbeeld4 h) als gevolg van een stijging van het aantal restrictie-enzym erkenning sites per eenheid lengte. Nuttige informatie in moleculaire biologie enzymen en klonen procedures met inbegrip van bacteriële transformatie kan worden gevonden elders15,16,17.
  2. Bouw van pCMV-vlag-AAPx (x = serotypen)
    1. PCR-versterken de hele AAP ORF (0.6 kb) met uitzondering van het eerste aminozuur met behulp van een polymerase van DNA van hifi- en de volgende paar van de primer: AAP forward, CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAA-N25 (de 25 nucleotiden uit de 4e nucleotide in de AAP ORF); AAP omgekeerde, TCTT-RE2-N25 (de laatste 25 nucleotiden van de AAP ORF).
      Opmerking: GACTACAAGGACGACGATGACAAA codes een vlag-tag, die heeft aangetoond dat geen nadelige gevolgen4,5 , maar kan worden weggelaten als niet onnodig.
    2. De RE-digested PCR producten tussen de bijbehorende sites van een vector zoogdieren expressie met de CMV-IE enhancer-promotor15,16,17-kloon.
  3. Bouw van pHLP-Rep
    1. De pAAV-RC2 plasmide (7.3 kb) met 20 eenheden van Xho Digest 5 µg ik en Xcm ik, en het zuiveren van het DNA met behulp van een commerciële DNA zuivering kit of door fenol-chloroform extractie.
      Opmerking: Het verwijderen van de 1,8 kb Xho ik-Xcm, die ik uit de 7.3 kb pAAV-RC2 plasmide resulteert in een verlies van Eiwitmantel VP eiwit expressie fragment met behoud van de Rep eiwit expressie.
    2. Stomp het DNA eindigt met 6 eenheden van de Polymerase van het DNA van de T4, agarose gel-zuiveren het 5.5 kb DNA-fragment en zelf het afbinden van de gezuiverde fragment met behulp van 50 tot 100 ng van DNA en 400 eenheden van T4 DNA ligase volgens de fabrikant aanbeveling15.
    3. Volg de procedure van de standaard bacteriële transformatie waarnaar wordt verwezen in stap 1.1.2 opmerking.
  4. Controleer of dat de plasmide construeert door de spijsvertering van het beperkingsenzym en sequencing15,18.
  5. Plasmide-minipreps of maxipreps met behulp van commercieel beschikbare kits te verkrijgen van een voldoende hoeveelheid plasmide DNA voor de downstream AAV productie experimenten uitvoeren.

2. productie van AAV in HEK 293 cellen door plasmide DNA transfectie (Cross-complementatie Assay)

  1. Cultuur HEK 293 cellen in de Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM)-hoge glucose (4.5 g/L) aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS), 1%, penicilline en streptomycine Mix, en 1 mM L-glutamine, in een incubator 37 ° C met 5% kooldioxide (CO2).
    Opmerking: AAV titers aanzienlijk variëren, afhankelijk van de bron van HEK 293 cellen.
    Let op: Hoewel AAV kan worden afgehandeld op biosafety level 1 (BSL1)-insluiting, BSL2 insluiting wordt aanbevolen voor HEK 293 cel werk.
  2. Op dag -1 (24 h vóór transfectie), plaat 6-7 x 105 HEK 293 cellen per putje in 2 mL van het volledige medium beschreven in stap 2.1 in een 6-well plate(s). Dit over het algemeen bereikt confluentie ~ 90% de volgende dag.
  3. Dag 0: transfectie
    1. Voorbereiding voor DNA transfectie
      1. Zorg ervoor dat de cellen confluentie ~ 90% hebben bereikt.
      2. Opwarmen van DMEM aangevuld met 1% penicilline en streptomycine Mix en 1 mM L-glutamine maar zonder 10% FBS (d.w.z., middellange serumvrij) in een waterbad 37 ° C.
      3. Toestaan dat de polyethylenimine (PEI) oplossing tot kamertemperatuur.
    2. Voorbereiding van de plasmide DNA mengsel
      1. Meng de plasmiden in 96 µL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) zonder CaCl2 of MgCl2 in steriele 1,5 mL microcentrifuge buizen zoals aangegeven in tabel 2. De totale hoeveelheid DNA is 2 µg per putje.
        Opmerking: De volumes naar plasmide DNA oplossing kunnen buiten beschouwing worden gelaten indien er nominale. Volumeregeling wordt aanbevolen als het totale volume van de plasmide DNA oplossingen ≥10 µL.
    3. PEI transfectie
      1. Voeg 4 µL van PEI oplossing (1 mg/mL) toe aan de mix van de PBS-plasmide DNA (opgesteld zoals hierboven). Het eindvolume is ongeveer 100 µL (5% volume van het kweekmedium). Vortex de buizen kort en het DNA: PEI mengsel gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur incuberen.
      2. Tijdens het wachten voor de 15 minuten incubatie te voltooien, vervang het kweekmedium met voorverwarmde serumvrij medium beschreven in stap 2.3.1.2.
      3. Eenmaal de 15-minuten incubatie van het DNA: PEI mengsel is voltooid, kort draaien de buizen met een microcentrifuge voor het verzamelen van de vloeistof naar de onderkant van de buizen en het mengsel van DNA: PEI ontkleuring toevoegen aan het kweekmedium in elk putje van de plaat HEK 293 cultuur. Zachtjes doorroeren van de platen en deze terugsturen naar een incubator 37 ° C met 5% CO2.
      4. De cellen in dit medium transfectie handhaven tot de oogst op dag 5 (geen middellange verandering is vereist).
  4. Op dag 1 en dag 2, observeren cellen transfected met pCMV-GFP plasmide onder een omgekeerde fluorescentie Microscoop om transfectie efficiëntie te beoordelen.
    Opmerking: voor fluorescentie microscopie, hier een 10 X / 0,25 numerieke diafragma doelstelling in combinatie met een 10 × oculair werd gebruikt, en 450 – 490 nm excitatie bandfilter filter en 515-565 nm bandpass emissie filter werkten. De bovenstaande voorwaarde levert normaal gesproken meer dan 70% transfectie efficiëntie. Cellen kunnen sommige morfologische veranderingen (bijvoorbeeld cellen zijn slank geworden) te wijten aan de serumvrij aandoening vertonen.
  5. Op 3-5 dagen, blijven de transfected cellen in een incubator 37 ° C met 5% CO2cultuur.
  6. Op dag 5, verzamelen zowel cellen en virus-bevattende medium in 15 mL polypropyleen conische buizen door pipetteren op en neer of door schrapen met een cel schraper.
  7. De monsters bij-80 ° C bewaren tot gebruik.

3. dot Blot Assay voor AAV Quantitation

  1. Herstel van virale deeltjes
    1. Snel ontdooien de bevroren buizen in een waterbad 37 ° C. Vortex de buizen krachtig gedurende 1 minuut om te maximaliseren van de terugwinning van AAV uit cellen.
    2. Pellet het puin van de cel door centrifugatie bij 3700 x g bij 4 ° C gedurende 10 minuten. Neem 200 µL van het supernatans van elke buis en breng dit in een gelabelde microcentrifuge buis met een schroefdop voor de dot vlek assay.
      Opmerking: Aliquot het resterende supernatant in microcentrifuge buizen en sla deze bevroren bij-80 ° C voor toekomstig gebruik. Hier, polypropyleen microcentrifuge buizen bevestigd met schroefdoppen en een O-ring werden gebruikt. Strak afdichting is vereist ter voorkoming van lekkages van AAV en fenol-chloroform.
  2. Behandeling met Serratia marcescens endonuclease
    1. Bereiden Mix A en Mix B reagentia (tabel 3). Voeg 10 µL van Mix A en 10 µL van Mix B in elke buis. Vortex de buizen voor 5 s, kort draaien de buizen voor het verzamelen van de vloeistof naar de onderkant van de buizen en de buizen bij 37 ° C ten minste Incubeer gedurende 1 uur.
      Opmerking: Mix A bevat NaOH en optimaliseert pH voor behandeling met S. marcescens endonuclease. Mix B vormt een aanvulling van magnesium. Concentratie van S. marcescens endonuclease in commercieel beschikbare enzyme voorraden variëren. Het volume van S. marcescens endonuclease moet dienovereenkomstig worden aangepast om 200 U/mL toevoeg Mix A en B van de Mix in buizen in stap 3.2.1.
      Opmerking: Een langere incubatietijd, omhoog tot 4 h, kan verminderen achtergrond signalen.
    2. Aan het eind van de incubatie, spin kort de buizen met een benchtop centrifuge voor het verzamelen van condensatie en oplossing van de bovenkant en zijkanten van de buizen.
      Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. De monsters kunnen worden opgeslagen bevroren bij-20 ° C of -80 ° C.
  3. Proteïnase K behandeling
    1. Bereiden de Mix C-reagens (tabel 3). Voeg 180 µL van Mix C in elke buis. Vortex de buizen voor 5 s, kort draaien de buizen en de buizen bij 55 ° C gedurende 1 uur uit te broeden.
      Opmerking: Het EDTA in het reagens Mix C chelateert gratis magnesium ionen en inactiveert S. marcescens endonuclease.
    2. Aan het eind van de incubatie, toestaan monsters bij kamertemperatuur en kort draaien de buizen met een benchtop centrifuge voor het verzamelen van condensatie en oplossing van de bovenkant en zijkanten van de buizen.
      Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. De monsters kunnen worden opgeslagen bevroren bij-20 ° C of -80 ° C. Incubeer om te hervatten het protocol, de buizen bij 55 ° C gedurende 5 tot 10 min te ontbinden SDS kristallen volledig opgenomen in de buffer.
  4. Fenol-chloroform extractie en ethanol neerslag
    1. Voeg toe 200 µL van fenol-chloroform aan de monsters en de vortex hen voor 1 min. draaien de monsters in een microcentrifuge op ≥16, 100 x g voor ≥5 min bij kamertemperatuur.
      Let op: Fenol-chloroform moet worden behandeld in een chemische zuurkast met passende persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM; dat wil zeggen, nitril handschoenen, veiligheidsbril of gelaatsscherm en laboratoriumjas met lange mouwen).
    2. 320 µL van de waterige laag (160 µL tweemaal met een pipet P200) overdragen aan een nieuwe standaard microcentrifuge buis (80% van de waterige vloeistof volume).
      Opmerking: Het is van vitaal belang om dezelfde hoeveelheid waterige oplossing tussen monsters, anders verliest de kwantitatieve analyse kwantitatieve nauwkeurigheid.
    3. Bereid het reagens Mix D (tabel 3). Voeg 833 µL van Mix D in elke buis. Vortex de buizen voor 5 s, en de buizen bij-80 ° C voor ≥20 min uit te broeden.
      Opmerking: Mix D is een mengsel van ethanol, natriumacetaat en glycogeen voor handige ethanol neerslag van DNA. Monsters kunnen worden opgeslagen bij-80 ° C bij deze stap en later het protocol kan worden hervat.
    4. Centrifugeer steekproeven met een microcentrifuge op ≥16, 100 x g bij 4 ° C voor ≥15 min. Giet af supernatant en vlek eenmaal op een schone papieren handdoek. Zet ongeveer 500 µL van 70% ethanol in elke buis, vortex de buizen voor 5 s en centrifuge de buizen met een benchtop-microcentrifuge op ≥16, 100 x g bij 4 ° C voor ≥5 min.
    5. Giet af het supernatant en vlek eenmaal op een schone papieren handdoek. Droge korrels bij 65 ° C; pellets kunnen volledig worden gedroogd.
      Opmerking: Gebruik geen een pipet voor het verwijderen van overtollige ethanol die achterblijft nadat het bevlekken van de buizen. Pellets kunnen ook worden gedroogd bij kamertemperatuur 's nachts. Het protocol kan hier worden gepauzeerd en gedroogde DNA pellets kunnen worden opgeslagen op kamertemperatuur voor meerdere dagen buis garen met gesloten deksel.
  5. Resuspensie van viraal DNA in TE buffer
    1. De DNA-pellets in 120 µL van buffer TE ontbinden door elke buis voor 30 min tot 1 h schudden bij kamertemperatuur.
  6. Stip vlek
    1. Opstelling van plasmide DNA normen
      1. Verdun AAV vector genoom plasmide DNA naar 10 ng/µL in water of Tris-HCl buffer (10 mM, pH 8,0). Neem 25 µL van deze verdunning en verteren met een geschikte restrictie-enzym voor 1 h van de plasmide DNA, in een reactie volume van 50 µL linearize.
        Opmerking: We maken een dubbele set van spijsvertering (zie stap 3.6.4.1). Het juiste enzym moet een dat het plasmide-DNA buiten de stip vlek sonde-bindende regio snijdt. Voor het gemak, de verdunde plasmide-DNA kunnen aliquoted (25 µL/buis) en opgeslagen bevroren bij-20 ° C voor toekomstig gebruik. Het plasmide DNA verteren terwijl de buizen zijn schudden in stap 3.5.1. Niet overdreven het plasmide DNA standaard verteren.
      2. 450 µL van water of TE voegen aan de buis met het verteerd plasmide DNA standaard en meng. Breng 70 µL van dit mengsel tot een nieuwe 1,5 mL microcentrifuge koker met 1330 µL van water of TE maken een verdunde plasmide standaard (25 pg/µL).
      3. Volg tabel 4 om een set van twee-voudige seriële verdunningen (600 µL/buis) te maken. Meng de verdunningen zorgvuldig vortexing voor 5 s.
    2. Denaturering van normen en virale DNA-monsters
      1. 600 µL van 2 x Alkaline oplossing toevoegen aan elke standaard verdunning. Meng goed door vortexing gedurende 5 tot 10 s. Incubate bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
      2. 120 µL van 2 x Alkaline oplossing toevoegen aan elk virale DNA-monster. Meng goed door vortexing gedurende 5 tot 10 s. Incubate bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
    3. Instellen van het toestel van de vlek stip
      1. Met behulp van schaar, een membraan bevlekken (b.v., zeta-sonde) op een passende maat voor het aantal monsters en normen gesneden. Geniet van het membraan met water gedurende 10 minuten alvorens het te plaatsen op een stip vlek apparaat. Dekking van ongebruikte putjes op het membraan-apparaat.
        Opmerking: Omgaan met het membraan met een schone pincet. Ter dekking van lege wells, kan het blad van de licht blauwe bescherming die meegeleverd met het membraan wordt worden gebruikt. Laat niet het membraan te drogen voordat bindende monsters en standaarden. Raadpleeg voor meer informatie over de vergadering en het gebruik van het apparaat, de gebruiker handmatig19.
      2. Voeg water toe tot de putjes waarin monsters worden geladen. Vacuüm en haal water door de putten om te controleren op fouten en test u opnieuw bij de vaststelling van toepassing. Draai de schroeven opnieuw tijdens het toepassen van vacuüm om strak afdichting.
        Opmerking: Onvolledige verzegeling kan veroorzaken monster lekkage tussen de putten.
      3. Als water wordt volledig getrokken door, laat het vacuüm volledig (dat wil zeggen, de vacuüm variëteit moet openstaan voor luchtdruk).
    4. Laden van normen en monsters op de stip vlek apparatuur
      1. Breng 400 µL van elke verdunde plasmide DNA standaard aan elk putje en vier rijstroken standaard verdunningen worden uitgevoerd. Gebruik twee aparte aliquots van het standaard digest en laden elk in tweevoud. 200 µL per putje van elk virale DNA-monster van toepassing.
        Opmerking: Het gebruik van de resterende ~ 40 µL van gedenatureerde monsters, kunnen verdunde monsters worden bereid (bv10-fold verdunde monsters met 20 µL van monster plus 180 µL 1 x Alkaline oplossing) en wiste indien nodig.
      2. Toepassing zacht vacuüm te trekken van de DNA-oplossingen door middel van de put.
        Opmerking: Vacuüm druk moet worden aangepast door een drie-weg klep gedeeltelijk open zodat het vacuüm druk wordt toegepast op de stip vlek apparatuur evenals de sfeer (dat wil zeggen, met de armen van de afsluiter gepositioneerd op een hoek van ongeveer 45 ° waar het Zuig luider geluid maakt).
      3. Zodra alle de putjes hebt leeggemaakt, laat u het vacuüm door de drie-weg klep aan te passen. Voeg 400 µL 1 x Alkaline oplossing aan elk putje die normen en monsters. 5 min wachten alvorens opnieuw vacuüm om de putten leeg.
      4. Het vacuüm opnieuw op dezelfde manier toepassen (zie stap 3.6.4.2).
      5. Demonteren van het toestel van de vlek dot onder vacuüm, verwijder het membraan en spoel het na met 2 x SSC. Plaats het membraan op een schone papieren handdoek met de DNA-gebonden zijde naar boven om te verwijderen van de overtollige 2 x SSC.
      6. UV-dwarslijn dichtgelopen DNA aan het membraan met een passende UV crosslinker; het membraan is nu klaar voor hybridisatie.
        Opmerking: Natte membranen kunnen worden gebruikt voor UV crosslinking. De gedroogde, UV-kruisverwijzende membranen kunnen worden opgeslagen op kamertemperatuur. Verdere informatie vindt u in de Tabel van materialen.
  7. Hybridisatie en wassen
    1. Opwarmen van de kruising Buffer in een waterbad van 65 ° C.
    2. Enzymatisch label een DNA-sonde met radioactieve α -32P dCTP en zuiveren met behulp van commercieel beschikbare kits volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
      Opmerking: We gebruiken een sonde van 0,5 – 2.0 kb in lengte van een versterker-promotor regio of een sequentie van eiwit-codeert in het virale genoom. Hoewel dit protocol maakt gebruik van 32P-geëtiketteerden radioactieve sondes voor signaal detectie, kunnen ook niet-radioactieve chemiluminescentie of TL sondes worden gebruikt (Raadpleeg de sectie discussie ).
    3. Plaats het membraan in een fles van de kruising met de DNA-afhankelijke kant boven, spoel het membraan met 5 mL voorverwarmde hybridisatie Buffer en negeren van de buffer. Daarna voeg toe 10 mL voorverwarmde hybridisatie Buffer en plaats de fles in een roterende hybridisatie-oven, ingesteld op 65 ° C. Draaien voor ≥5 min.
    4. Warmte-denatureren 20 µL van 10 mg/mL geschoren haring of zalm sperma DNA oplossing en de 32P-geëtiketteerden sonde (≥107 cpm) voor 5 min door het plaatsen van de buizen op een warmte blok set bij 100 ° C. Vervolgens module-chill hen op ijs voor ≥2 min, draai kort, en houd op ijs tot gebruik.
      Let op: Voor radioactieve DNA-sondes, 1,5 mL buisjes met schroefdop en O-ring moeten worden gebruikt.
    5. Snel toevoegen de gedenatureerde sperma DNA en radioactieve sonde aan de hybridisatie Buffer in de kruising fles en schud de fles voor 10 s te mengen. De fles terug naar de 65 ° C-oven en de fles met rotatie bij 65 ° C gedurende ≥4 h uit te broeden.
    6. Zodra de kruising voltooid is, stoppen de rotatie, de kruising fles verwijderen en giet de radioactieve sonde-oplossing in een conische buis van 50 mL met een lekvrije plug zegel cap. Winkel de sonde in een geschikte container geplaatst in een koelkast aangewezen voor radioactieve materialen.
      Opmerking: Gebruikte hybridisatie Buffer met een sonde die is opgeslagen bij 4 ° C kan worden hergebruikt minstens 5 keer door het plaatsen van de conische tube van 50 mL met een lekvrije plug zegel cap die kruising Buffer in een waterbad van 100 ° C gedurende 5 minuten bevat.
    7. Wassen van het membraan met wassen Buffer verwarmd tot 65 ° C. 20 tot 30 mL was Buffer toevoegen aan de hybridisatie fles en roteren voor 5 min. Herhaal dit 2 vaker wassen.
      Opmerking: Meten van de radioactiviteit van wassen oplossingen en opnemen indien nodig door het lokale Instituut.
    8. Plaats tijdens het wassen het membraan, een fosfor imaging scherm op een afbeelding gum gedurende 5 minuten.
    9. Na de derde wash, verwijder het membraan uit de kruising fles verwijderen overtollige buffer op het membraan met keukenpapier en plaats het membraan in een doorzichtige plastic rolhouder. Controleer radioactieve signalen op het membraan met behulp van een geigerteller. Bloot het gewiste fosfor imaging scherm naar de membraan voor 10 min naar girale afhankelijk van de intensiteit van het signaal.
    10. Scannen van het scherm met behulp van een beeld van de fosfor systeem scannen en verkrijgen van de gegevens over de signaalsterkte van elke dot.
  8. Data-analyse
    1. Een standaard curve softwarematig werkblad en data analyse (bijvoorbeeldExcel) tekenen.
      Opmerking: Log-log lineaire regressie werd gebruikt om een standaard curve tekenen.
    2. Bepalen nanogramgebied-equivalent (ng-eq) voor elk van de virale DNA-monsters door interpolatie. De ng-eq is het bedrag van de plasmide DNA gebruikt bij het tekenen van een standaard curve die gelijk is aan het aantal virale DNA-moleculen. Wanneer de lengte van de plasmide DNA is 8000 bp, 1 ng-eq single-stranded AAV viraal DNA correspondeert 2.275 x 108 deeltjes.
      Opmerking: De ng-eq kan worden geconverteerd naar het getal van virale deeltjes door de volgende vergelijkingen:
      figure-protocol-1
      figure-protocol-2
      Het aantal AAV deeltjes worden conventioneel uitgedrukt als "vg" (vector genomes) of "DRP" (DNase ik-resistente deeltjes).
    3. Bereken de AAV concentraties van de grondstoffen. Omdat de volgelopen viraal DNA vertegenwoordigt op 66,7% figure-protocol-3 het viraal DNA in de grondstoffen, 1 ng-eq correspondeert met 1,7 x 109 deeltjes/mL figure-protocol-4 .
      Opmerking: Deze correctie is niet nodig als het virale DNA vervat in de grondstof is bevlekt op een membraan zonder verlies (Zie Figuur 1).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een representatief resultaat kwantitatieve dot blots voor kwantificatie van gezuiverde AAV vector voorraden geproduceerd op grote schaal is afgebeeld in Figuur 1. Met dit punt vlek assay, werd de titer van een double-stranded AAV2G9-CMV-GFP vector voorraad vastgesteld. De vector werd gezuiverd door twee rondes van cesium chloride (CsCl) dichtheid-verloop ultracentrifugatie gevolgd door dialyse als eerder beschreven20. In het algemeen, ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit verslag, wordt het nut van kwantitatieve dot blot testen om te studeren AAV AAPs en hun rol in Eiwitmantel vergadering beschreven. Kennis die is opgedaan met deze studies kan gedetailleerde inzicht verwerven in de aangeboren verschillen in het proces van AAV Eiwitmantel vergadering en de functionele rol van AAPs tussen verschillende serotypen. In dit opzicht de AAV VP3-AAP Kruis-complementatie stip blot test bleek dat Snake AAV VP3 een strikte afhankelijkheid op de co uitdrukking van haar cognaat AAP voor Eiwitman...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken Xiao Xiao aan de Universiteit van North Carolina te Chapel Hill voor het verstrekken van ons met de pEMBL-CMV-GFP plasmide. Wij danken Christopher Cheng en Samuel J. Huang voor kritische lezing van het manuscript. Dit werk werd gesteund door Public Health Service verleent (NIH R01 NS088399 en T32 EY232113).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
BenzonaseMilliporeSigma1016970001Aangeduid als Serratia marcescen endonuclease in de hoofdtekst.
DNase IRoche4716728001Aangeduid als DNase I Enzym A in de hoofdtekst.
DNase IInvitrogen18047019Aangeduid als DNase I Enzym B in de hoofdtekst.
DNase INew England BiolabsM0303LAangeduid als DNase I Enzym C in de hoofdtekst.
1.5 mL Attached O-Ring Screw Cap Microcentrifuge TubesCorning430909
1.5 mL Microcentrifuge TubesThermo Fisher Scientific05-408-129
15 mL Polypropylene Conical TubeCorning352097
3 M Sodium AcetateTeknovaS0298
50 mL Polypropylene Conical TubeCorning430291
AAV-293 CellsAgilent240073HEK-293 cel lijn geoptimaliseerd voor de verpakking van AAV virionen.
AccuGENE 0.5 M EDTA SolutionLonza51234
AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8.0Lonza51238
AccuGENE 10% SDSLonza51213
AccuGENE 1X TE BufferLonza51235
Bio-Dot ApparatusBio-Rad1706545
Bovine Serum AlbuminMilliporeSigmaA3294
Cell LifterCorning3008
ChloroformMilliporeSigma372978
DNA Extractor KitWako Pure Chemical Industries295-50201Dit wordt gebruikt voor kwantitatieve dot blots op gezuiverd virus. We gebruiken slechts een half volume van alle reagentia in elke stap aanbevolen voor het Protocol Schema 2 in de handleiding die door de fabrikant wordt verstrekt.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)-high glucose (4.5 g/L)Lonza12-614F
ElectroMAX DH10B CellsThermo Fisher Scientific18290015
Ethanol 200 ProofDecon Labs2716
Fetal Bovine SerumVWR1500-500
Ficoll 400Alfa AesarB22095Aangeduid als Polysucrose 400.
Fluorescence MicroscopeZeissAxiovert 40 CFL
GlycogenRoche10901393001
Herring Sperm DNAInvitrogen15634-017
Hybridization TubesThermo Fisher Scientific13-247-150
ImageQuant TLGE Healthcare Life SciencesImageQuant TL
L-glutamine 200 mMLonza17-605E
Magnesium Chloride HexahydrateMilliporeSigmaM0250
MicroPulser ElectroporatorBio-Rad1652100
Mini Quick Spin DNA ColumnsMilliporeSigma11814419001
pAAV-RC2 VectorCell Biolabs IncVPK-422
Penicillin/Streptomycin 10K/10KLonza17-602E
Phosphate Buffered SalineLonza17-516F
Phosphorimaging Exposure CassetteGE Healthcare Life SciencesVarious
Phosphorimaging ScreenGE Healthcare Life SciencesVarious
Plasmid Maxi KitQIAGEN12162
Platinum Pfx DNA PolymeraseInvitrogen11708013
PolyethyleniminePolysciences Inc23966-2
PolyvinylpyrrolidoneMilliporeSigmaP5288
Prime-It II Random Primer Labeling KitAgilent Technologies300385
Primer AAP Forward (N25 nucleotiden van de 4e nucleotide in de AAP ORF, RE1 is een restrictie-enzymlocatie voor klonen): CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGA
CGACGATGACAAA-N25		MilliporeSigmaCustom Primer
Primer AAP Reverse (N25 is de laatste 25 nucleotiden van de AAP ORF, RE2 is een restrictie-enzymlocatie voor klonen): TCTT-RE2-N25MilliporeSigmaCustom Primer
Primer VP3 Forward (N25 de eerste 25 nucleotiden van de VP3 ORF, RE1 is een restrictie-enzymlocatie voor klonen): CTAA-RE1-CACC-N25MilliporeSigmaCustom Primer
Primer VP3 Reverse (N25 is de laatste 25 nucleotiden van de AAP ORF, RE2 is een restrictie-enzymlocatie voor klonen): TCTT-RE2-N25MilliporeSigmaCustom Primer
Proteinase K SolutionInvitrogen25530-049
Restriction EnzymesNew England BiolabsVarious
Salmon Sperm DNAInvitrogen15632011
Serological PipettesThermo Fisher Scientific13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11
Sodium ChlorideThermo Fisher ScientificS271-10
Sodium Citrate Tribasic DihydrateMilliporeSigmaC8532
T4 DNA PolymeraseNew England BiolabsM0203L
Thermal CyclerEppendorf6321000515
Tissue-culture Treated 6-well PlateCorning353046
Tris BaseThermo Fisher ScientificBP152-5
Typhoon FLA 7000GE Healthcare Life Sciences28955809
UltraPure Buffer-Saturated PhenolInvitrogen15513-047
UV CrosslinkerSpectrolineXLE-1000Optimal

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sonntag, F., Schmidt, K., Kleinschmidt, J. A. A viral assembly factor promotes AAV2 capsid formation in the nucleolus. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (22), 10220-10225 (2010).
  2. Sonntag, F., et al. The assembly-activating protein promotes capsid assembly of different adeno-associated virus serotypes. J Virol. 85 (23), 12686-12697 (2011).
  3. Naumer, M., et al. Properties of the adeno-associated virus assembly-activating protein. J Virol. 86 (23), 13038-13048 (2012).
  4. Earley, L. F., et al. Identification and characterization of nuclear and nucleolar localization signals in the adeno-associated virus serotype 2 assembly-activating protein. J Virol. 89 (6), 3038-3048 (2015).
  5. Kawano, Y., Neeley, S., Adachi, K., Nakai, H. An experimental and computational evolution-based method to study a mode of co-evolution of overlapping open reading frames in the AAV2 viral genome. PLoS One. 8 (6), e66211(2013).
  6. Earley, L. F., et al. Adeno-associated Virus (AAV) Assembly-Activating Protein Is Not an Essential Requirement for Capsid Assembly of AAV Serotypes 4, 5, and 11. J Virol. 91 (3), (2017).
  7. Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
  8. Clark, K. R., Liu, X., McGrath, J. P., Johnson, P. R. Highly purified recombinant adeno-associated virus vectors are biologically active and free of detectable helper and wild-type viruses. Hum Gene Ther. 10 (6), 1031-1039 (1999).
  9. Samulski, R. J., Chang, L. S., Shenk, T. Helper-free stocks of recombinant adeno-associated viruses: normal integration does not require viral gene expression. J Virol. 63 (9), 3822-3828 (1989).
  10. Wobus, C. E., et al. Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection. J Virol. 74 (19), 9281-9293 (2000).
  11. Grimm, D., et al. Titration of AAV-2 particles via a novel capsid ELISA: packaging of genomes can limit production of recombinant AAV-2. Gene Ther. 6 (7), 1322-1330 (1999).
  12. Sommer, J. M., et al. Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement. Mol Ther. 7 (1), 122-128 (2003).
  13. Fagone, P., et al. Systemic errors in quantitative polymerase chain reaction titration of self-complementary adeno-associated viral vectors and improved alternative methods. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 1-7 (2012).
  14. Farkas, S. L., et al. A parvovirus isolated from royal python (Python regius) is a member of the genus Dependovirus. J Gen Virol. 85 (Pt 3), 555-561 (2004).
  15. NEB, 2017-2018 Catalog & Technical Reference. , New England Biolabs. 302-368 (2017).
  16. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , 4th edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  17. Addgene. Bacterial Transformation. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/bacterial-transformation/ (2017).
  18. Addgene. Sequence Analysis of your Addgene Plasmid. , Available from: https://www.addgene.org/recipient-instructions/sequence-analysis/ (2017).
  19. Bio-Rad. Bio-Dot® microfiltration apparatus instruction manual. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1706545.pdf (2017).
  20. Burton, M., et al. Coexpression of factor VIII heavy and light chain adeno-associated viral vectors produces biologically active protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (22), 12725-12730 (1999).
  21. Grimm, D., Pandey, K., Kay, M. A. Adeno-associated virus vectors for short hairpin RNA expression. Methods Enzymol. 392, 381-405 (2005).
  22. Leonard, J. N., Ferstl, P., Delgado, A., Schaffer, D. V. Enhanced preparation of adeno-associated viral vectors by using high hydrostatic pressure to selectively inactivate helper adenovirus. Biotechnol Bioeng. 97 (5), 1170-1179 (2007).
  23. Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR. Hum Gene Ther Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
  24. Werling, N. J., Satkunanathan, S., Thorpe, R., Zhao, Y. Systematic Comparison and Validation of Quantitative Real-Time PCR Methods for the Quantitation of Adeno-Associated Viral Products. Hum Gene Ther Methods. 26 (3), 82-92 (2015).
  25. Kafatos, F. C., Jones, C. W., Efstratiadis, A. Determination of nucleic acid sequence homologies and relative concentrations by a dot hybridization procedure. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1541-1552 (1979).
  26. Reue, K. mRNA quantitation techniques: considerations for experimental design and application. J Nutr. 128 (11), 2038-2044 (1998).
  27. Clementi, M., et al. Quantitative PCR and RT-PCR in virology. PCR Methods Appl. 2 (3), 191-196 (1993).
  28. Mezzina, M., Merten, O. W. Adeno-associated viruses. Methods Mol Biol. 737, 211-234 (2011).
  29. Chen, W. J., Liao, T. H. Structure and function of bovine pancreatic deoxyribonuclease I. Protein Pept Lett. 13 (5), 447-453 (2006).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Samenstellingsactiverend eiwitCapside assemblageAAV kwantificeringNucleasebehandelingHerstel van virale deeltjesPlasmid DNA standaardenHybridisatiebufferDetectie met geigerteller

Gerelateerde artikelen