De Drosophila eierstok is een uitstekende modelsysteem voor het bestuderen van de stamcel niche ontwikkeling. Hoewel de methoden voor het ontleden van larvale en volwassen eierstokken zijn gepubliceerd, vereisen pop eierstok dissecties verschillende technieken die niet zijn gepubliceerd in detail. Hier duidelijk naar voren komt een protocol voor ontleden, kleuring en montage van de pop eierstokken.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Dissectie en kleuring van Drosophila pop eierstokken
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
In tegenstelling tot volwassen Drosophila eierstokken, pop eierstokken zijn relatief moeilijk te openen en te onderzoeken vanwege hun kleine omvang, doorschijnendheid en impasses binnen een pop geval. De uitdaging van de ontrafeling van pop eierstokken ligt ook in hun fysieke locatie binnen de verpopping: de eierstokken zijn omringd door lichaamscellen van vet in de buik van de pop, en deze vetcellen moet worden verwijderd als u wilt toestaan voor de juiste antilichaam kleuring. Om deze uitdagingen te overwinnen, dit protocol maakt gebruik van aangepaste Pasteur pipets om vet lichaamscellen extract van de pop buik. Bovendien is een chambered dekglaasje gebruikt in plaats van een microcentrifuge buis tijdens het kleuring ter verbetering van de zichtbaarheid van de poppen. Echter, ondanks deze en andere voordelen van de instrumenten die gebruikt worden in dit protocol, succesvolle uitvoering van deze technieken nog mogelijk enkele dagen van praktijken als gevolg van de geringe omvang van pop eierstokken. De technieken die worden beschreven in dit protocol kunnen worden toegepast op tijd cursus experimenten waarin de eierstokken worden geanalyseerd in verschillende stadia van ontwikkeling van de pop.
Inleiding
Stamcelonderzoek met behulp van Drosophila eierstokken heeft wijd uitgebreid sinds de eerste documentatie van een stamcel niche1,2,3,4. Volgt de ontwikkeling van Drosophila eierstok dissecties hebben zijn gebruikt bij het bestuderen van de stamcel lineages lineage tracering genetische hulpmiddelen en signalering van trajecten die stamcel onderhoud, proliferatie, en lot in de niche van de cel van de stam regelen. Kennis van deze signaalroutes kan inzicht in mogelijke oorzaken van kanker die afkomstig van de cel van de stam van de afwijkende activiteit5,6,7 zijnopleveren. Het heeft ook onlangs aangetoond dat somatische stamcellen in het ovarium van Drosophila , bekend als de cellen van de stam van de follikel (FSCs), sterk lijken op zoogdieren intestinale stamcellen in vele aspecten van hun organisatie8. Om deze reden zijn Drosophila eierstokken een zeer nuttig modelsysteem voor het bestuderen van de stamcel gedrag.
Terwijl de larvale en volwassen eierstokken aanbieden aanwijzingen tot vroege ontwikkeling van de cel van de stam en de laatste cel van de stam in de niche, respectievelijk, is de pop eierstok een intermediaire structuur waarin de germline lichaamscellen reorganiseren en stellen hun identiteit 9 , 10. Hoewel verscheidene studies hebben onderzocht aspecten van weefsel ontwikkeling in de pop eierstok10,11,12,13, nog vragen met betrekking tot de differentiatie en de ruimtelijke organisatie van ovariële celtypes tijdens de ontwikkeling van de pop. In het bijzonder is de specificatie van FSCs treedt op tijdens deze periode. Dit protocol beschrijft een methode voor ontleden en kleuring pop eierstokken op gewenste tijdstippen — een techniek die gebruikt kan worden in tijd cursus experimenten die pop eierstok ontwikkeling in detail uit de larvale naar de volwassen fase analyseren.
Om de kleine grootte, doorschijnendheid en ontoegankelijkheid van de pop eierstokken in de buik van de pop te verklaren, dit protocol maakt gebruik van hulpmiddelen zoals een op maat gemaakte dun-tipped Pasteur Pipetteer om buik vet lichaamsweefsel belemmeren antilichaam toegang tot de eierstokken. Een duidelijke, chambered dekglaasje gebruikt tijdens het antilichaam kleuring biedt grotere zichtbaarheid van de poppen en een zachtere platform voor het schommelen van de eierstokken op een "Nutator." Gebaseerd op een protocol voor het larvale eierstok ontledingen van Maimon en Gilboa14, een relatief hoge concentratie van Triton X-100 is werkzaam in de eerste stappen van de kleuring procedure te maximaliseren van de celmembraan permeabilization en antilichaam toegang tot de ovariale cellen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. EggLaying
- Combineer ongeveer tien mannen en vijftien vrouwelijke volwassen Drosophila vliegen van het gewenste genotype in een flesje van normale rijke vliegen voedsel aangevuld met gist. Om te voorkomen dat overbevolking op de flacon, kunt u erop vrouwtjes om niet langer dan 2 – 4 h14eieren te leggen.
- De volwassenen van de flacon overboeken naar een nieuwe flacon door te tikken op de flacon openen tegen een ander flesje met vliegen voedsel. Laat de eieren om te ontwikkelen tot larven bij kamertemperatuur gedurende 3-4 dagen.
2. selecteren van vrouwelijke larven
- Met een vochtige fijne borstel met zachte borstelharen, maken een rollende beweging met de borstel langs de muur van de flacon dolende derde-instar-larven van de flacon overbrengen naar een glas goed tot de rand gevuld met 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Wassen het voedsel puin uit de larven door het overbrengen van hen naar de andere goed gevuld met 1 x PBS.
- De larven van het mannelijke en vrouwelijke met pincet te scheiden. De mannelijke larven identificeren door een paar grote, ronde, en doorschijnend teelballen ingebed in vet lichamelijk aan de laterale kant van het lichaam ongeveer tweederde neer van zijn voorste einde15. Vrouwelijke larven zijn gemiddeld groter, minder doorschijnend dan mannetjes, en hebben veel kleinere geslachtsklieren die moeilijker zijn te detecteren.
- Selecteer tegen mannelijke larven voor het verzamelen van vrouwelijke larven. Het verzamelen van ten minste tien vrouwtjes uit de put. Plaats de vrouwelijke larven in een aparte goed gevuld met 1 x PBS.
- Gebruik pincet de vrouwelijke larven zachtjes overbrengen naar een nieuwe flacon van vers vliegen voedsel aangevuld met gist.
- Plaats de ampul met de vrouwelijke larven in een donkere locatie om pupariation16. Gedurende de dag, de larven voor pupariation te controleren. Zoals elke larve ummobiliseerd en ontwikkelt zich tot een prepupa, cirkel de prepupa tegen de flacon en de geschatte tijd wanneer het eerst in een prepupa vormt opnemen. Het identificeren van prepupae door het uitsteeksel van anterior spiracles en timing van puparium formatie17. Laat de prepupae te ontwikkelen naar het gewenste tijdstip (gemeten in uren na de vorming van de puparium, APF).
Opmerking: Alle dieren die ondergaan puparium formatie binnen een interval van ongeveer 10 h kan worden beschouwd als een prepupa. Het popstadium begint ongeveer 12 uur na de vorming van de puparium na een interne molt heeft plaatsgevonden.
3. voorbereiding poppen van antilichaam kleuring
-
Vormen een dunne glazen pipet moet worden gebruikt in latere stappen voor het ontruimen van het lichaam vet pop.
- Smelt het puntje van het glas van een pipet van Pasteur over een bunsenbrander. Als het glas smelt, gebruik pincet te trekken het uiteinde horizontaal uit de buurt van de rest van de pipet om een dunner tip.
- Afkoelen en breek af een klein gedeelte van het uiteinde van de pipet te vormen een nette cirkelvormige opening. Bevestig een lamp aan het andere uiteinde van de pipet.
- Laad de Pipetteer met 1 x PBS.
- Om te oogsten van de poppen, die zijn gelijmd aan de muur van de flacon, een kleine daling van water langs de contact zone tussen Verpopping en flacon van toepassing. 1-2 min wachten te laten het eiwit lijm los voordat de verpopping uit de muur met een vochtige fijne borstel voorzichtig op te heffen. Overdracht van de verpopping met een goed glas gevuld met 1 x PBS. Draag een enkele goed per Verpopping om te voorkomen dat de overbevolking van de put.
- Terwijl het posterieure einde van de verpopping grijpen met één paar pincet, scheuren zorgvuldig het voorste gedeelte van de pop zaak met een ander paar totdat het hoofd van de verpopping zichtbaar is.
- Grip van het anterior-meeste puntje van de pop hoofd met een tang en trek voorzichtig de verpopping uit haar pop geval.
Opmerking: Een deel van het lichaam vet kan morsen uit tijdens dit proces. - Scheiden en de voorste helft van de verpopping uit de achterste helft negeren totdat alleen de abdominale zak blijft.
-
Pak de lichaamscellen van vet uit de buikholte zak.
- Pak de abdominale zak tegen de bodem van de put met de pincet in de ene hand terwijl de dunne glazen pipet gevuld met 1 x PBS in een andere hand.
- Het doel van het uiteinde van de dunne Pipetteer naar de opening van de zak en langzaam Pipetteer 1 x PBS in de buik weg te wassen de lichaamscellen van vet rond de pop eierstokken.
Opmerking: De eierstokken zijn een paar kleine, doorschijnend Locustella en langwerpige structuren die binnen de abdominale zak blijven moeten. - Wassen weg dat het lichaam vet cellen totdat ten minste tweederde van het lichaam vet is verdwenen of de eierstokken zijn zichtbaar in de buurt van de opening van de abdominale zak. Het is zeer belangrijk voor het uitvoeren van deze stap langzaam om niet te wassen van de eierstokken uit de buik per ongeluk.
- Het goed om te controleren als de eierstokken hebt gemorst uit tijdens het wassen van de cel vet lichamelijk onderzoeken. Als de eierstokken niet zichtbaar in de put, moeten zij in de buik zijn gebleven. Als de eierstokken zijn gekomen, een nieuwe Verpopping plaats in de put en herhaal deze stap.
- De buik overboeken naar een duidelijke dekglaasje kamer gevuld met fixatie buffer (1 x PBS, 4% paraformaldehyde) en plaats de deksel op de top. Om een voldoende aantal eierstokken weerstaan de kleuring en de montage proces, ontleden meer eierstokken dan nodig.
Let op: De fixatie buffer bevat paraformaldehyde die giftig is. Gelieve draag passende bescherming, zoals handschoenen, veiligheidsbril, enz.
4. Immunohistochemistry
- Tijdens de kleuring, kunt pincet voorzichtig duw van elke zwevende eierstokken naar de bodem van de put cover glas om ervoor te zorgen dat de eierstokken worden volledig ondergedompeld in antilichaam oplossing.
- Plaats strips van dubbelzijdige tape op het platte oppervlak van een Nutator en plaats vervolgens de chambered dekglaasje op het zelfklevende oppervlak.
- Incubeer de eierstokken in fixatie buffer uit stap 3.7 gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Spoel de eierstokken driemaal in 1 x PBS met 1% Triton X-100 voor 5, 10 en 45 min (1 h in totaal), respectievelijk aan toestaan grondig permeabilization.
- Blokkeren van de eierstokken in 10% normale geit serum in 1 x PBS met 0,5% Triton X-100 voor 30 min.
- Na de eierstokken een nacht bebroeden in 600 µL van primair antilichaam van keus verdund tot de juiste concentratie in 1 x PBS met 0,5% Triton X-100 bij 4 ° C.
- Spoel de eierstokken drie keer, gedurende 5 minuten in 1 x PBS met 0,5% Triton X-100.
- Incubeer de eierstokken voor 2 h in 600 µL van secundair antilichaam van keus verdund tot de juiste concentratie in 1 x PBS met 0,5% Triton X-100 bij kamertemperatuur.
- Spoel de eierstokken tweemaal gedurende 5 minuten in 1 x PBS met 0.5% Triton X-100 en eenmaal gedurende 5 minuten in 1 x PBS.
5. ontleden en montage van de pop eierstokken
- Plaats een kleine daling van 1 x PBS op een microscoopglaasje. Gebruik pincet om de buik zak van de chambered dekglaasje naar een glazen goed gevuld met 1 x PBS. Draag een enkele goed per Verpopping om te voorkomen dat de overbevolking van de put.
- Scheuren de abdominale sack en enig overgebleven vet lichaam met een tang.
Opmerking: De eierstokken, die een paar kleine, doorschijnend Locustella en langwerpige structuren, zichtbaar moeten zijn in de put. De eierstokken zijn vaak strak omgeven door het lichaam vet, dus het is belangrijk om te controleren of alle vet lichamelijk grondig is gescheurd uit elkaar. - Breng de eierstokken uit de put in de daling van 1 x PBS op de Microscoop slide door het midden van de eierstokken tussen de toppen van de verlostang grijpen. Het is zeer belangrijk om een stevige grip zonder het knijpen van de eierstokken niet te verliezen of te vernietigen tijdens de overdracht. Een paar druppels 1 x PBS aan de dia toevoegen wanneer de oplossing na verloop van tijd droogt.
- Zodra alle eierstokken zijn ontleed en overgebracht naar het microscoopglaasje, Pipetteer 40 µL van montage medium op een 22 x 22 mm dekglaasje aan en plaats het dekglaasje aan zachtjes op de top van de eierstokken. Laat de dia droog 's nachts voorafgaand aan de beeldvorming.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Succesvolle uitvoering van deze procedure moet leiden tot duidelijke antilichaam kleuring die de structuur en de cellulaire organisatie van een Drosophila pop eierstok onthult. Immunohistochemistry uiteengezet in dit protocol kan worden gebruikt om te identificeren celtypes vaak gekleurd in larvale en volwassen eierstokken. Cellen van de pop stengel afgeleid van zwerm cellen18 (aangegeven door Fasciclin III in wit) zijn afgebeeld in Fi...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De meest kritische en moeilijke stap van dit protocol omvat de voorbereiding van pop eierstokken voorafgaand aan de fixatie. Om ervoor te zorgen dat de eierstokken, kleine en begraven door vet lichaamscellen binnen de pop buik, voldoende zijn gekleurd met antilichamen, het is belangrijk om niet alleen een grote opening in de buik zak scheuren met een tang, maar ook het extraheren van de vet-lichaamscellen die belemmeren de de eierstokken van de antistoffen. Succesvolle uitvoering van deze stap vereist toepassing van subt...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen conflicten van belang te verklaren.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek werd gesteund door de National Institutes of Health (RO1 GM079351 aan DK). Wij danken Dorothea Godt voor haar nuttig advies over pop eierstok dissecties gebaseerd op haar oorspronkelijke protocol. Wij danken ook Amy Reilein voor haar hulp en commentaar op het manuscript.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Dumont #5 Forceps, biologie | Fine Scientific Tools | 11252-20 | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155383 | |
| Dissectiemicroscoop | Nikon | SMZ-10A | |
| Confocale microscoop | Carl Zeiss | LSM 700 | |
| Analysesoftware | Carl Zeiss | Zen | |
| 9 depressieglas spot platen | Pyrex | 7220-85 | |
| Pasteurpipet | Fisher Scientific | 13-678-6B | |
| Pasteurpipet glas | Diverse leveranciers | ||
| Bunsenbrander | Diverse leveranciers | ||
| Fisherfinest Premium Frosted Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| 22 x 22 mm glazen dekglasjes No 1 | VWR | 48366-067 | |
| Dapi Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Dubbelzijdig plakband | Scotch | ||
| Nutator | Clay Adams | ||
| Fijne borstel #0, #3-#5 | Diverse leveranciers | ||
| Gilson Pipetman Starter Kit | Thomas Scientific | F167300 | Bevat p20, p200, p1000 pipetters |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Verdun tot 4% paraformaldehyde in 1x PBS |
| Triton | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| 10x PBS | Ambion | AM9624 | Verdun tot 1x PBS |
| Normaal geitenserum | Jackson ImmunoResearch | 5000121 | Verdun tot 10% normaal geitenserum in PBST met 0,5% Triton concentratie |
| Primaire antilichamen (in protocol: 7G10 anti-Fasciclin III verdund 1:250, konijn anti-fosfohistone H3 verdund 1:1000) | Diverse leveranciers (in protocol: Developmental Studies Hybridoma Bank, Millipore) | Verdun in PBST met 0,5% Triton concentratie | |
| Secundaire antilichamen (in protocol: Alexa-546, FITC-geconjugeerd konijnserum) | Diverse leveranciers (in protocol: Molecular Probes, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) | Verdun in PBST met 0,5% Triton concentratie | |
| Vliegvialen | Denville Scientific | V9406 | |
| Katoenen ballen, voor brede flesjes | Genesee Scientific | 51-102W | |
| Gist, Bakers Dried Active | MP Biomedicals | 101400 | |
| Vliegvoer | Geproduceerd in laboratorium | Mengsel van water, biergist, maïsmeel, melasse, agar, EtOH, penicilline, methyl 4-hydrobenzoaat en propionzuur | |
| Mannelijke en vrouwelijke Drosophila vliegen (genotype gebruikt in protocol: yw; P[Fz3-RFP, w+]/TM2) | Bloomington Drosophila Stock Center |
Referenties
- Losick, V., Morris, L., Fox, D., Spradling, A. Drosophila Stem Cell Niches: A Decade of Discovery Suggests a United View of Stem Cell Regulation. Dev Cell. 21 (1), 159-171 (2011).
- Kirilly, D., Xie, T. The Drosophila ovary: an active stem cell community. Cell Res. 17 (1), 15-25 (2007).
- Dansereau, D. A., Lasko, P. The Development of Germline Stem Cells in Drosophila. Method Mol Biol. 450, 3-26 (2008).
- Pearson, J., López-Onieva, L., Rojas-Ríos, P., Gonzáles-Reyes, A. Recent advances in Drosophila stem cell biology. Int J Dev Biol. 53, 1329-1339 (2009).
- Arwert, E. N., Hoste, E., Watt, F. M. Epithelial stem cells, wound healing and cancer. Nat Rev Cancer. 12 (3), 170-180 (2012).
- Barker, N., et al. Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer. Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).
- Daley, G. Q. Chronic myeloid leukemia: proving ground for cancer stem cells. Cell. 119 (3), 314-316 (2004).
- Reilein, A., et al. Alternative direct stem cell derivatives defined by stem cell location and graded Wnt signaling. Nat Cell Biol. 19 (5), 433-444 (2017).
- Eliazer, S., Buszczack, M. Finding a niche: studies from the Drosophila ovary. Stem Cell Res Ther. 2 (6), 45(2011).
- Godt, D., Laski, F. A. Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric à brac. Development. 121 (1), 173-187 (1995).
- King, R. C., Aggarwal, S. K., Aggarwal, U. The development of the female Drosophila reproductive system. J Morphol. 124 (2), 143-166 (1968).
- Vlachos, S., Jangam, S., Conder, R., Chou, M., Nystul, T., Harden, N. A Pak-regulated cell intercalation event leading to a novel radial cell polarity is involved in positioning of the follicle stem cell niche in the Drosophila ovary. Development. 142 (1), 82-91 (2015).
- Irizarry, J., Stathopoulos, A. FGF signaling supports Drosophila fertility by regulating development of ovarian muscle tissues. Dev Biol. 404 (1), 1-13 (2015).
- Maimon, I., Gilboa, L. Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries. J Vis Exp. (51), e2537(2011).
- Kerkis, J. The Growth of the Gonads in DROSOPHILA MELANOGASTER. Genetics. 16 (3), 212-224 (1931).
- Yamanaka, N., et al. Neuroendocrine Control of Drosophila Larval Light Preference. Science. 341 (6150), 1113-1116 (2013).
- Bainbridge, S., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Development. 66, 57-80 (1981).
- Courdec, J., et al. The bric à brac locus consists of two paralagous genes encoding BTB/POZ domain proteins and acts as a homeotic and morphogenetic regulator of imaginal development in Drosophila. Development. 129, 2419-2433 (2002).
- Arrese, E. L., Soulages, J. L. INSECT FAT BODY: ENERGY, METABOLISM, AND REGULATION. Annu Rev Entomol. 55, 207-225 (2011).
- Zhang, Y., Xi, Y. Fat Body Development and its Function in Energy Storage and Nutrient Sensing in Drosophila melanogaster. J Tissue Sci Eng. 6 (1), (2014).
- Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of Drosophila Ovaries. J Vis Exp. (1), e52(2006).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
