De Drosophila eierstok is een uitstekende modelsysteem voor het bestuderen van de stamcel niche ontwikkeling. Hoewel de methoden voor het ontleden van larvale en volwassen eierstokken zijn gepubliceerd, vereisen pop eierstok dissecties verschillende technieken die niet zijn gepubliceerd in detail. Hier duidelijk naar voren komt een protocol voor ontleden, kleuring en montage van de pop eierstokken.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Dissectie en kleuring van Drosophila pop eierstokken
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
In tegenstelling tot volwassen Drosophila eierstokken, pop eierstokken zijn relatief moeilijk te openen en te onderzoeken vanwege hun kleine omvang, doorschijnendheid en impasses binnen een pop geval. De uitdaging van de ontrafeling van pop eierstokken ligt ook in hun fysieke locatie binnen de verpopping: de eierstokken zijn omringd door lichaamscellen van vet in de buik van de pop, en deze vetcellen moet worden verwijderd als u wilt toestaan voor de juiste antilichaam kleuring. Om deze uitdagingen te overwinnen, dit protocol maakt gebruik van aangepaste Pasteur pipets om vet lichaamscellen extract van de pop buik. Bovendien is een chambered dekglaasje gebruikt in plaats van een microcentrifuge buis tijdens het kleuring ter verbetering van de zichtbaarheid van de poppen. Echter, ondanks deze en andere voordelen van de instrumenten die gebruikt worden in dit protocol, succesvolle uitvoering van deze technieken nog mogelijk enkele dagen van praktijken als gevolg van de geringe omvang van pop eierstokken. De technieken die worden beschreven in dit protocol kunnen worden toegepast op tijd cursus experimenten waarin de eierstokken worden geanalyseerd in verschillende stadia van ontwikkeling van de pop.
Inleiding
Stamcelonderzoek met behulp van Drosophila eierstokken heeft wijd uitgebreid sinds de eerste documentatie van een stamcel niche1,2,3,4. Volgt de ontwikkeling van Drosophila eierstok dissecties hebben zijn gebruikt bij het bestuderen van de stamcel lineages lineage tracering genetische hulpmiddelen en signalering van trajecten die stamcel onderhoud, proliferatie, en lot in de niche van de cel van de stam regelen. Kennis van deze signaalroutes kan inzicht in mogelijke oorzaken van kanker die afkomstig van de cel van de stam v....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. EggLaying
- Combineer ongeveer tien mannen en vijftien vrouwelijke volwassen Drosophila vliegen van het gewenste genotype in een flesje van normale rijke vliegen voedsel aangevuld met gist. Om te voorkomen dat overbevolking op de flacon, kunt u erop vrouwtjes om niet langer dan 2 – 4 h14eieren te leggen.
- De volwassenen van de flacon overboeken naar een nieuwe flacon door te tikken op de flacon openen tegen een ander flesje met vliegen voedsel. Laat de eieren om te ontwikkelen tot larven bij kamertemperatuur gedurende 3-4 dagen.
2. selecteren van vrouwelijke larven
- Met een....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Succesvolle uitvoering van deze procedure moet leiden tot duidelijke antilichaam kleuring die de structuur en de cellulaire organisatie van een Drosophila pop eierstok onthult. Immunohistochemistry uiteengezet in dit protocol kan worden gebruikt om te identificeren celtypes vaak gekleurd in larvale en volwassen eierstokken. Cellen van de pop stengel afgeleid van zwerm cellen18 (aangegeven door Fasciclin III in wit) zijn afgebeeld in Fi.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De meest kritische en moeilijke stap van dit protocol omvat de voorbereiding van pop eierstokken voorafgaand aan de fixatie. Om ervoor te zorgen dat de eierstokken, kleine en begraven door vet lichaamscellen binnen de pop buik, voldoende zijn gekleurd met antilichamen, het is belangrijk om niet alleen een grote opening in de buik zak scheuren met een tang, maar ook het extraheren van de vet-lichaamscellen die belemmeren de de eierstokken van de antistoffen. Succesvolle uitvoering van deze stap vereist toepassing van subt.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen conflicten van belang te verklaren.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek werd gesteund door de National Institutes of Health (RO1 GM079351 aan DK). Wij danken Dorothea Godt voor haar nuttig advies over pop eierstok dissecties gebaseerd op haar oorspronkelijke protocol. Wij danken ook Amy Reilein voor haar hulp en commentaar op het manuscript.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Dumont #5 Forceps, biologie | Fine Scientific Tools | 11252-20 | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155383 | |
| Dissectiemicroscoop | Nikon | SMZ-10A | |
| Confocale microscoop | Carl Zeiss | LSM 700 | |
| Analysesoftware | Carl Zeiss | Zen | |
| 9 depressieglas spot platen | Pyrex | 7220-85 | |
| Pasteurpipet | Fisher Scientific | 13-678-6B | |
| Pasteurpipet glas | Diverse leveranciers | ||
| Bunsenbrander | Diverse leveranciers | ||
| Fisherfinest Premium Frosted Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| 22 x 22 mm glazen dekglasjes No 1 | VWR | 48366-067 | |
| Dapi Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Dubbelzijdig plakband | Scotch | ||
| Nutator | Clay Adams | ||
| Fijne borstel #0, #3-#5 | Diverse leveranciers | ||
| Gilson Pipetman Starter Kit | Thomas Scientific | F167300 | Bevat p20, p200, p1000 pipetters |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Verdun tot 4% paraformaldehyde in 1x PBS |
| Triton | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| 10x PBS | Ambion | AM9624 | Verdun tot 1x PBS |
| Normaal geitenserum | Jackson ImmunoResearch | 5000121 | Verdun tot 10% normaal geitenserum in PBST met 0,5% Triton concentratie |
| Primaire antilichamen (in protocol: 7G10 anti-Fasciclin III verdund 1:250, konijn anti-fosfohistone H3 verdund 1:1000) | Diverse leveranciers (in protocol: Developmental Studies Hybridoma Bank, Millipore) | Verdun in PBST met 0,5% Triton concentratie | |
| Secundaire antilichamen (in protocol: Alexa-546, FITC-geconjugeerd konijnserum) | Diverse leveranciers (in protocol: Molecular Probes, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) | Verdun in PBST met 0,5% Triton concentratie | |
| Vliegvialen | Denville Scientific | V9406 | |
| Katoenen ballen, voor brede flesjes | Genesee Scientific | 51-102W | |
| Gist, Bakers Dried Active | MP Biomedicals | 101400 | |
| Vliegvoer | Geproduceerd in laboratorium | Mengsel van water, biergist, maïsmeel, melasse, agar, EtOH, penicilline, methyl 4-hydrobenzoaat en propionzuur | |
| Mannelijke en vrouwelijke Drosophila vliegen (genotype gebruikt in protocol: yw; P[Fz3-RFP, w+]/TM2) | Bloomington Drosophila Stock Center |
Referenties
- Losick, V., Morris, L., Fox, D., Spradling, A. Drosophila Stem Cell Niches: A Decade of Discovery Suggests a United View of Stem Cell Regulation. Dev Cell. 21 (1), 159-171 (2011).
- Kirilly, D., Xie, T. The Drosophila ovary: an active stem cell community. Cell Res. 17 (1), 15-25 (2007).
- Dansereau, D. A., Lasko, P.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
