Zeer gevoelige en kwantitatieve detectie van eiwitten en hun Isoforms door capillaire elektrisch gericht methode

Summary

Capillaire elektrisch gericht is een antilichaam gebaseerde, ultrasensitive, hoge doorvoer techniek, waardoor gedetailleerde karakterisering van eiwitten en hun isoforms van extreem kleine biologische monsters. Het volgende beschrijft een protocol voor de detectie en kwantificering van specifieke proteïnen en hun isoforms in een geautomatiseerd en gerobotiseerd wijze.

Abstract

Immunoblotting is uitgegroeid tot een routine techniek in veel laboratoria voor eiwit karakterisering van biologische monsters. Het volgende protocol biedt een alternatieve strategie, capillaire elektrisch scherpstellen (cIEF), met vele voordelen ten opzichte van conventionele immunoblotting. Dit is een methode van het antilichaam gebaseerde, geautomatiseerde, snelle en kwantitatieve waarin een volledige westelijke bevlekkende procedure binnen een uiterst dunne capillair plaatsvindt. Deze techniek niet vereisen een gel overbrengen naar een membraan, strippen van vlekken, of x-ray films, die doorgaans vereist voor conventionele immunoblotting zijn. Hier, de eiwitten worden gescheiden volgens hun lading (elektrisch punt, pI), met behulp van minder dan een microliter (400 nL) totaal eiwit lysate. Na elektroforese, eiwitten zijn geïmmobiliseerd op de capillaire wanden door ultraviolet licht behandeling, gevolgd door de primaire en secundaire (horseradish peroxidase (HRP) geconjugeerd) antilichaam-incubatie, waarvan de afhankelijkheid wordt gedetecteerd door middel van verbeterde Chemoluminescentie (ECL), het genereren van een licht signaal dat kan worden gevangen en opgenomen door een camera van de charge - coupled apparaat (CCD). Het digitale beeld kan worden geanalyseerd en gekwantificeerd (piekoppervlakte) met behulp van software. Deze hoge doorvoer procedure aankan 96 monsters tegelijk; is hoogst-gevoelig, met de detectie van de eiwitten in het picogram bereik; en produceert zeer reproduceerbare resultaten vanwege automatisering. Al deze aspecten zijn uiterst waardevol wanneer de hoeveelheid van monsters (b.v., weefselsteekproeven en biopten) een beperkende factor is. De techniek heeft bredere toepassingen, met inbegrip van screening van drugs of antilichamen, ontdekking van biomarker en diagnostische doeleinden.

Introduction

Capillaire elektrisch scherpstelling (cIEF) is een geautomatiseerde, capillair gebaseerde immunoassay dat eiwitten op basis van hun lading^{1,2,3 verhelpt}. Het is zeer reproduceerbaar en staat te oplossen van eiwitten en hun post-translationally gemodificeerde isoforms snel en kwantitatief. Het presenteert een alternatief voor conventionele methoden zoals het westelijke bevlekken. Terwijl het westelijke bevlekken is heel goed voor de bevestiging van de aanwezigheid van overvloedig eiwitten in gemakkelijk toegankelijke monsters; variabiliteit, tijd consumptie en nauwkeurige kwantificatie allemaal aanwezig uitdagingen, met name bij de behandeling van biologisch weefselmonsters. Inderdaad, variabiliteit is een inherent probleem in het westelijke bevlekken, want er zijn talrijke stappen betrokken, zoals laden en uitvoeren van SDS-pagina gelen, overdracht van eiwitten op membraan, incubatie met verschillende reagentia (bv. primaire en secundaire antistoffen, ECL), en de ontwikkeling op een X-ray film⁴. Op dit moment is de westelijke bevlekkende techniek verbeteren met de implementatie van digitale opname van chemiluminescentie signalen (digitale westerns). Onlangs, een geautomatiseerd westelijke bevlekkende systeem heeft ontwikkeld, namelijk het capillair westerse, dat is een meer handsfree en gel-vrij systeem. De gehele test is geautomatiseerd na het laden van een monster plaat (monsters met alle nodige reagentia) in het systeem^3,4. Het instrument zal het uitvoeren van alle stappen zoals eiwit scheiding, immobilisatie van eiwitten op capillaire wand, antilichaam incubations, wast tussen verschillende stappen, en de ontwikkeling en de kwantificering van de chemiluminescentie signalen. De procedure van de cIEF hier gepresenteerd biedt dus een hogere resolutie en gevoeligheid.

Deze methode is gevoelig, zoals signalen kunnen worden gegenereerd en gekwantificeerd van picogram van eiwitten¹. De hoge gevoeligheid met uitstekende reproduceerbaarheid maakt deze technologie zeer nuttig zijn voor de analyse van klinische monsters. Het kan detecteren evenals onderscheiden post translationeel wijziging (bijvoorbeeld verschillende gefosforyleerd eiwit isoforms) van eiwitten. Deze technologie is met succes gebruikt om te ontleden van verschillende signalering trajecten^4,5 in klinische studies gericht op de ontwikkeling van nieuwe therapieën in kanker³, en het heeft een groot potentieel voor eiwit biomerker en drug discovery .

Protocol

1. cultuur, stimulatie en Lysis van de cel

Opmerking: Deze methode kan worden gebruikt met vele celtypes. Ter illustratie van de methode, wordt een voorbeeld van het gebruik van menselijke navelstreng ader endotheliale cellen (HUVECs) beschreven.

1. HUVECs op 10 cm petrischalen gelatine-bekleed, in de basale medium endothelial cel met passende suppletie cultuur (Zie Tabel of Materials), en ook met 5% FCS, epidermale groeifactor (5 ng/mL), vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF: 0,5 ng/mL), basic FGF (10 ng/mL), insuline-achtige groeifactor (20 ng/mL) en hydrocortison (0,2 µg/mL) ascorbinezuur (1 µg/mL).
2. Verhongeren cellen 's nachts met Basaal medium endothelial cel aangevuld met 1% FCS en geen groeifactor supplement.
3. Alle medium gecombineerd, voeg toe 2 mL endothelial cel kweekmedium zonder groeifactoren (honger medium) in één schotel (control) en voeg 50 ng/mL VEGF in 2 mL zuiver honger voedingsbodem in een tweede schotel voor 7 min.
4. Het medium gecombineerd en wassen van cellen 2 keer met kamertemperatuur 10 mL PBS.
5. Zorgen de petrischaaltjes op ijs en houden ze er van deze stap verder.
6. Voeg toe 250-400 µL van ijs koud lysis buffer (Bicine/CHAPS; Zie Tabel van materialen) met waterige protease inhibitor mix en DMSO remmer mix (Phosphatase inhibitors; Zie Tabel van materialen) aan elke plaat 10 cm. Swirl de plaat om te zorgen voor goede dekking en houd het voor 10 minuten op het ijs.
   Opmerking: De uiteindelijke concentratie van protease en de mix van DMSO remmer moet 1 x.
7. Schraap de cellen van de schotel met een cel schraper en overdracht aan een vooraf gekoeld microfuge buis. Pipetteer omhoog en omlaag 5 keer lyse cellen.
8. Kort Bewerk ultrasone trillingen ten de cellen bij 4 ° C. Stel de ultrasoonapparaat als volgt: aantal cycli = 5, macht = laag op = 5 sec, uitgeschakeld = 30 s. Deze stap is opgenomen te breken van nucleïnezuren, en niet te lyse cellen.
   Opmerking: Ultrasoonapparaat moet mild tot denaturatie van eiwitten voorkomen.
9. Vortex de buis voor 5 s (niet constant), 2 s op een moment (3 keer), en houd op ijs.
10. Verduidelijken lysate door centrifugeren bij 14.000 x g gedurende 15 min bij 4 ° C, dan onmiddellijk het supernatant naar een schone vooraf gekoeld microfuge buis.
11. Meet de eiwitconcentratie met behulp van een Bicinchoninic zuur (BCA) eiwit assay kit⁴.
12. Maak 10 µL aliquots, module bevriezen in droog ijs of vloeibare stikstof, en bewaren bij-80 ° C tot gebruik.

2. monstervoorbereiding Mix (berekening voor 150 µL monster Mix)

1. Eerst, het voorbereiden van een monster verdunningsmiddel mix door toevoeging van 1 µL van DMSO remmer mix (voorraad 50 x) en 2 µL van proteaseinhibitors (voorraad 25 x) tot 47 µL monster verdunningsmiddel (Zie Tabel of Materials), zodat de uiteindelijke concentratie van DMSO-remmers en proteaseremmers toegediend krijgen. wordt 1 x. Vervolgens verdund het eiwit lysates met behulp van de steekproef verdunningsmiddel mix te verkrijgen van de gewenste concentraties (zie stap 2.3).
2. Ampholyte/ladder/protease inhibitor van de omwenteling/DMSO remmer mix voorbereiden door toe te voegen 3.325 µL standaard ladder (Zie Tabel of Materials; voorraad 60 x), 6 µL van proteaseinhibitor (25 x), 3 µL van DMSO (50 x)-remmer te 137.675 µL ampholyte premix (Zie tabel van Materialen). Vortex de buis minstens 15 s totale, 5 s tegelijk (3 - 4 keer), en houd op ijs.
3. Vermeng de oplossingen uit stap 2.1 en 2.2 in een verhouding van 1:3, zodat de eindconcentraties van DMSO, proteaseinhibitors en de pI standaard ladder 1 X geworden, en de eiwitten in het capillair de gewenste eindconcentraties bereiken (b.v., 50 µg Mo/mL werd gebruikt voor Figuur 2).
   Opmerking: Eiwitconcentratie in het capillair en goed zijn hetzelfde.
4. Laden van 10 µL van monster mix in de passende goed, volgens de 384-well plaat assay sjabloon lay-out (zie stap 3 en Figuur 1) en houd de plaat op ijs.
5. Verdun de primaire (pERK1/2, 1:50; ERK1/2, 1:100; HSP 70, 1:500) en secundaire antilichamen (1:300) met antilichaam verdunningsmiddel (Zie Tabel van materialen) en Pipetteer 10 µL van primaire en 15 µL van secundaire antilichamen in elk putje.
   Opmerking: In het algemeen hogere concentratie van antilichamen zijn nodig voor cIEF testen in vergelijking tot conventionele western blots.
6. Luminol mengen en peroxide XDR (1:1 verhouding; Zie Tabel van materialen) samen en Pipetteer 15 µL in elk putje.
   Opmerking: Meng deze oplossingen vers telkens vóór gebruik en houd op ijs.
7. Zodra monsters en alle reagentia zijn afgepipetteerde in de plaat, centrifugeer de plaat bij 2.500 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C tot spin down de vloeistof en het verwijderen van de bubbels. Als belletjes nog steeds bestaan, verwijdert u deze handmatig met behulp van een dunne pipette uiteinde.
   Let op: Laad niet meer dan 20 µL van het monster of reagentia per putje; anders, kan niet de pipet instrument goed gewassen worden. Zorg ervoor dat volg de gebruiksaanwijzing van de fabrikant te bereiden alle reagentia.

3. ontwerpt een nieuwe Assay met systeemsoftware (Figuur 1)

1. Open de systeemsoftware en klik "nieuw" uit het menu bestand.
2. Ga naar het deelvenster lay-out en vestigingen van reagentia en monsters in een 384 well-plate toewijzen. Uitputten tot een maximum van 96 wells per 384-well plaat.
3. Een reagens-toewijzing maakt door te klikken op een goed overal in het blok. Selecteer een rij blok van elk 12 putten. Wells, bijvoorbeeldvan 1-12 of 13-24, worden standaard toegewezen als een blok.
4. Ga naar de werkbalk van de lay-out-deelvenster en voeg een lege rij blok of een monster, primaire, secundaire of luminol rij blok. Elk blok krijgt een andere kleur, zodat ze makkelijk zijn te onderscheiden.
   Opmerking: Wanneer het klikken van een put, een zwarte rand kan worden gezien rond het blok waar het nieuwe blok wordt ingevoegd in het deelvenster. Een rij blok kan ook worden verwijderd.
5. Ga naar het deelvenster protocol en selecteer een locatie reagens in de plaat. Vervolgens klikt u op een cel in de voorbeeldkolom en selecteer het reagens in het dropdownmenu.
6. Op deze zelfde manier, selecteer het reagens locaties voor de primaire, secundaire en luminol voor elke cyclus.
7. Klik op de gewenste cellen, één filter tegelijk, in de kolom primaire of secundaire antilichaam en de incubatie times, indien nodig wijzigen.
   Let op: Ingang notities voor elke cyclus kunnen ook worden toegevoegd.
8. Cycli toevoegen door te klikken op de knop 'toevoegen' in de sectie protocol. 1 cyclus, 4 cycli of alle cycli (maximaal 8 cycli kan worden toegevoegd aan het protocol).
   Opmerking: Het is mogelijk om te kopiëren en plakken van informatie van de cyclus in deze stap: Selecteer een cyclus, ga naar bewerken, kopiëren en plakken.
9. Voerdegegevensin met betrekking tot het monster, zoals de identiteit van de primaire en secundaire antilichamen, hun catalogus nummers en verdunningen, etc., in het deelvenster van de sjabloon. Dit is een optionele stap, dat is handig tijdens de post uitvoeren analyse.
10. Sla het nieuwe assay-bestand. Voordat u klikt op de knop 'start', snel controleren de lay-out om ervoor te zorgen dat alles correct is.

4. protocol voor cIEF Instrument tot oprichting

1. Capillaire elektroforese van elektrisch scherpstellen scheiding voorwaarden stellen. Deze moet 15.000 μW en 40 min, en de tijd van UV immobilisatie moet 80 s. Echter de tijd UV immobilisatie kan worden ingesteld binnen het bereik van 80-140 s, en wellicht worden geoptimaliseerd voor de proteïne van belang.
   Opmerking: Een tijdstip voor UV immobilisatie kan worden ingesteld voor elke cyclus, maar niet voor elke capillair.
2. Set wassen 1 tot 2 wasbeurten, voor 150 s elke wassen (standaard) en primair antilichaam-incubatie gedurende 120 minuten.
3. Set wassen 2 tot 2 wasbeurten, voor 150 s elke wash (standaard), en secundair antilichaam-incubatie gedurende 60 min.
4. Instellen van wassen 3, die 2 wasbeurten, voor 150 moet s elke wassen (standaard).
5. Instellen van blootstelling tijden wanneer Chemoluminescentie zal worden opgespoord; Deze moeten 30, 60, 120, 240, 490 en 960 s. Alle stappen (1-8) zal worden uitgevoerd in een enkele capillair.

5. het uitvoeren van de test-bestand

1. Zodra alles klaar is, klikt u op start om te beginnen de run. De software zal prompt u voor het verwijderen van het afval, om te vullen van het water en het capillaire vak, anolyte en catholyte toevoegen aan het Dienblad van de resource, toe te voegen was buffer en ten slotte voor het laden van de plaat in de afgekoelde monster lade.
   Opmerking: Verwijder het deksel van het capillaire vak, maar verwijder het deksel niet van de plaat assay. Het deksel van de plaat kan automatisch worden verwijderd door het instrument wanneer dat nodig is. Dit helpt voorkomen dat reagens verdamping.
2. Een paar minuten na de run is begonnen, de bar van de status van een instrument zal worden weergegeven op het computerscherm. Statusberichten en voortgangsbalken kunnen worden gezien overeenkomt met de huidige fase van het instrument.
   Opmerking: In eerste instantie het instrument zal controleren als alles correct is voordat er te Pipetteer van de anolyte en de catholyte in het Dienblad van de scheiding, het oppakken van het eerste blok van 12 haarvaten verwijderen van het deksel van de plaat en plaatsen van de monsters van het monster plaat in de haarvaten, en dan ten slotte in de bedwelmingsruimte scheiding voor elektroforese.
3. Klik op het scherm uitvoeren samenvatting te zien van twee deelvensters: status en scheiding. Gebruikers kunnen de run voortgang weergeven, en films van de scheiding (de 12 haarvaten van elke cyclus) kunnen worden opgeslagen wanneer de stap van de Elektroforese van elke cyclus is voltooid. Om te zien hoe de elektroforese scheiding in een capillair, spelen de scheiding film voor die capillaire door te klikken op de gewenste cyclus en vervolgens op de knop afspelen in het deelvenster Beheer.
4. Het beheerde bestand kan automatisch worden opgeslagen na de voltooiing van de run.

6. het analyseren van de gegevens (figuur S1)

1. Open het run bestand en selecteer het tabblad analyse scherm. In Figuur S1Ais de gegevens (pieken) in de voorbeeld grafiek weergegeven van het geselecteerde capillair (d.w.z., 4^th capillair uit cyclus 1).
2. Klik op bewerken en vervolgens analyse (Figuur S1B). In dit stadium, kunnen gebruikers wijzigen van het bereik van de pI, toepassen van de juiste pI standaard voor een gegeven experiment toevoegen een piek pasvorm en een piek-naam toevoegen.
   Opmerking: Meng met behulp van een pH 5-8-ampholyte (zoals hier het geval), de aanbevolen standaard ladder te gebruiken is een met fluorescently geëtiketteerde peptiden met pIs van 4.9, 6.4, 6.0, 7.0 en 7.3 als bij het gebruik een pH van 3-10 premix, de aanbevolen ladder is een met pIs van 4.0 , 4.9, 6.0, 6.4 en 7.3. ²
3. Resultaten worden weergegeven op het tabblad van de toppen; de waarden die worden weergegeven voor de monsters zijn positie, pI, piek hoogte gebied, % gebied, piek breedte en signaal aan lawaai (S/N) (Figuur S1C). Kies welke gegevens te gebruiken en de gegevens voor verdere analyse exporteren.
   Opmerking: Gegevens kunnen alleen worden geëxporteerd na het labelen van de piek (Figuur S1C).

Results

Ontwerp van een nieuwe test: Een plaat van assay lay-out wordt weergegeven in figuur 1A. 96-wells, kunnen maximaal, voor elke voorwaarde (antilichamen) van de plaat 384-well in blokken van 12 putjes te worden gebruikt. Elk blok met 12 putjes kunt starten vanuit A1-A12 of A13-A24. Kleurcode rijen kunnen men onderscheiden van monsters of reagentia van elkaar. De assay sjabloon (figuur 1B), relevante informatie voor...

Discussion

Gevoeligheid en resolutie van eiwitten zijn cruciaal voor proteoom onderzoek naar biologische monsters. Er is grote waarde zijnde kundig voor detecteren van eiwitten die in minieme hoeveelheden in cellen aanwezig zijn. cIEF bieden verbeterde gevoeligheid en resolutie voor de detectie van eiwitten en hun isoforms⁴.

Deze technologie is met succes gebruikt in vele Proteoom Onderzoek rapporten^5,6,

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
NanoPro 1000	ProteinSimple
Premix G2, pH 5–8 (nested) separation gradient, pH 2–4 plug	ProteinSimple	040-972	Ampholyte premix
DMSO inhibitor mix	ProteinSimple	040-510	Fosfatase remmer; voor cIEF 1:50 verdunning gebruikt
Aqueous Inhibitor Mix	ProteinSimple	040-482	Protease remmer; voor cIEF 1:25 verdunning gebruikt
pI standard ladder 3	ProteinSimple	040-646	Voor cIEF 1:60 verdunning gebruikt
Sample diluent	ProteinSimple	040-649
Antibody diluent	ProteinSimple	040-309
Wash concentrate	ProteinSimple	041-108
Anolyte Refill	ProteinSimple	040-337
Catholyte Refill	ProteinSimple	040-338
Peroxide XDR	ProteinSimple	041-084
Luminol	ProteinSimple	040-652
Bicine/CHAPS Lysis Buffer	ProteinSimple	040-764
Capillaries-Charge Separation (1 pack) for	ProteinSimple	CBS700
Assay Plate/Lid Kit	ProteinSimple	040-663
Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-035-152	Voor cIEF gebruikt (1: 300)
Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	715-035-150	Voor cIEF gebruikt (1: 300)
Phospho-Erk 1/2 Primary Antibody	Cell Signaling	9101	Voor cIEF gebruikt (1: 50)
Pan Erk Primary Antibody	Cell Signaling	9102	Voor cIEF gebruikt (1: 100)
Compass software	ProteinSimple
HUVEC	ATCC	PCS-100-010
MV2 (EBM-2)	PromoCell	C-22221	Endothelia cel basaal medium
Endothelial Cell Growth Medium MV2 SupplementPack	PromoCell	C-39221	Supplementering op MV2 hierboven
VEGFA	PeproTech	100-20
Long R3 IGF	Sigma-Aldrich	85580C/I1146	Insuline-achtige groeifactor
Bioruptor (Sonicator)	Diagenode	B01020001
BCA Protein Assay kit	Thermo Fischer Scientific	23225
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels	Thermo Fischer Scientific	NP0322BOX
NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X)	Thermo Fischer Scientific	NP0001
NuPAGE Transfer Buffer (20X)	Thermo Fischer Scientific	NP0006
Immobilon PVDF membrane	Millipore	IPVH00010
Microfuge tube vortexer
Centrifuge
Microtiter plate adapter for centrifuge
Pipettors
Tips
Ice