Genoom-brede kwantificering van vertaling in de ontluikende gist door het ribosoom profilering

Samenvatting

Translationeel verordening speelt een belangrijke rol in de controle van eiwitten overvloed. Hier beschrijven we een hoge gegevensdoorvoer methode voor de kwantitatieve analyse van vertaling in de ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae.

Samenvatting

Vertaling van mRNA in eiwitten is een complex proces waarbij verschillende lagen van de verordening. Er wordt vaak verondersteld dat wijzigingen in de transcriptie van mRNA in de eiwitsynthese wijzigingen, maar veel uitzonderingen zijn waargenomen. Onlangs, een techniek genaamd ribosoom profiling (of Ribo-Seq) heeft ontpopt als een krachtige methode waarmee identificatie, met een hoge nauwkeurigheid, welke regio's van mRNA worden omgezet in eiwitten en kwantificering van de vertaling op de genoom-brede niveau. Hier presenteren we een gegeneraliseerde protocol voor genoom-brede kwantificering van vertaling Ribo-Seq met ontluikende gist. Daarnaast kan Ribo-Seq gegevens combineren met mRNA overvloed metingen we tegelijkertijd kwantificeren vertaling efficiëntie van duizenden mRNA afschriften in hetzelfde monster en wijzigingen in deze parameters in reactie op experimentele vergelijken manipulaties of in verschillende fysiologische staten. Beschrijven we een gedetailleerd protocol voor generatie van ribosoom footprints nuclease spijsvertering, isolatie van intact ribosoom-voetafdruk complexen via sacharose kleurovergang fractionering en voorbereiding van DNA bibliotheken gebruiken voor het diepe rangschikken samen met passende kwaliteitscontroles nodig om ervoor te zorgen nauwkeurige analyse van in vivo vertaling.

Inleiding

vertaling van mRNA is een van de fundamentele processen in de cel, die een belangrijke rol in de regulatie van eiwit expressie speelt. Vertaling van mRNA is daarom streng gecontroleerd in reactie op verschillende interne en externe fysiologische stimuli ^1,2. De mechanismen van translationeel verordening blijven echter understudied. Hier beschrijven we het protocol voor genoom-brede kwantificering van vertaling in de ontluikende gist door het ribosoom profilering. Het algemene doel van het ribosoom profiling techniek is om te studeren en kwantificeren van de vertaling van specifieke mRNAs onder verschillende ce....

Protocol

1. de voorbereiding van het uittreksel

1. Streak giststammen uit bevroren voorraden voor enkele kolonies op YPD platen (gistextract 1%, 2% pepton, glucose van 2% en 2% agar). Incubeer de platen bij 30 ° C gedurende 2 dagen.
2. Inoculeer gist uit een plaat van de YPD (gebruik een één kolonie) in 15 mL YPD medium (gistextract 1%, 2% pepton, 2% glucose) in een tube van 50 mL conische centrifuge en 's nachts groeien met schudden (200-250 rpm) bij 30 ° C.
3. Cultuur in 500 mL voor YPD medium in een steriele kolf van 2 L, verdunnen zodat de OD₆₀₀ < 0.1. Groeien van gistcellen met schudden bij 30 ° C gedurende 3-5 h tot OD₆₀₀ ....

Resultaten

Gedetailleerde pijpleidingen voor bioinformatic analyse van data profiling ribosoom geweest eerder ^8,9beschreven. Verschillende onderzoeksgroepen hebben voorts bioinformatica tools voor differentiële gen expressie analyse en verwerking van gegevens van reeksnummers, die specifiek zijn voor ribosoom profilering methode ^{10,11,12 ,}

Discussie

De Ribo-Seq-aanpak heeft ontpopt als een krachtige technologie voor de analyse van mRNA vertaling in vivo aan de genoom-brede niveau ³. Studies met deze aanpak, die zorgt voor de opvolging van de vertaling met single-codon resolutie, heeft bijgedragen aan ons begrip van translationeel verordening. Ondanks zijn voordelen heeft Ribo-Seq verscheidene beperkingen. Ribosomaal RNA (rRNA) fragmenten zijn altijd mede gezuiverde tijdens Isolatievan ribosoom beveiligd voetafdrukken minderen van de .......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.45 μM membraanfilters	Millipore	HVLP04700
0.5 M EDTA	Invitrogen	AM9261
0.5 mL centrifugale filters (100 kDa MWCO)	Millipore	UFC510024
1 M Tris-HCl, pH 7.0	Invitrogen	AM9850G
1 M Tris-HCl, pH 7.5 (pH 8.0 bij 4°C)	Invitrogen	15567-027
10X TBE buffer	Invitrogen	AM9863
10% TBE-ureageel	Invitrogen	EC6875BOX
15% TBE-ureageel	Invitrogen	EC6885BOX
2 M MgCl2	RPI	M24500-10.0
2X TBE-ureageel buffer	Invitrogen	LC6876
3M NaOAc, pH 5.5	Invitrogen	AM9740
5' Deadenylase (10 U/μL)	Epicentre	DA11101K
5X Nucleïnezuur monster buffer	Bio-Rad	161-0767
8% TBE geel	Invitrogen	EC6215BOX
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (met IAA, 125:24:1)	Invitrogen	AM9722
Blauwlicht transilluminator	Clare Chemical Research	DR-46B
Chrome-staalkorrels, 3,2 mm	BioSpec Products	11079132c
Cryogrinder	Biospec product	3110BX
Cycloheximide	RPI	C81040-5.0
Data verzamelsysteem	DATAQ Instruments	DI-245
Deoxynucleotide (dNTP) oplossingsmix (10 mM)	NEB	N0447L
Glycogen	Invitrogen	AM9510
Gradiënt fractionering systeem	Brandel	BR-184X
High-fidelity DNA polymerase (2.000 U/mL)	NEB	M0530S	Geleverd met 5X Phusion HF Buffer
Next-generation sequencing bibliotheek kwantificeringskit	Kapa Biosystems	KK4824
Nucleïnezuur gel vlek	Invitrogen	S11494
Optima XE-90 ultracentrifuge	Beckman Coulter	A94471
Poly(A) mRNA isolatiekit	Invitrogen	61011
Rec J exonuclease (10 U/μL)	Epicentre	RJ411250
Reverse transcriptase (200 U/μL)	Invitrogen	18080093	Geleverd met 5X first-strand buffer en 0,1 M DTT
RNA fragmentatie buffer	NEB	E6186A
RNase I (100 U/μL)	Invitrogen	AM2295
RNase inhibitor (20 U/μL)	Invitrogen	AM2696
Silicone rubber doppen	BioSpec Products	2008
ssDNA ligase (100 U/μL)	Epicentre	CL9021K	Geleverd met 10X CircLigase II buffer en 50 mM MnCl2
Roestvrijstalen microvialen, 1,8 mL	BioSpec Products	2007
Sucrose	RPI	S24060-5000.0
SW-41 Ti rotor	Beckman Coulter	331362
Spuitpomp	New Era Pump Systems	NE-300
T4 polynucleotide kinase (10.000 U/mL)	NEB	M0201S	Geleverd met 10X T4 polynucleotide kinase buffer
T4 RNA ligase 2 getrunceerd KQ (200.000 U/mL)	NEB	M0373S	Geleverd met 10X T4 RNA ligase buffer en 50% PEG8000
Thermische cycler	Bio-Rad	1851148
Dunwandige polyallomer buizen, 13,2 mL	Beckman Coulter	331372
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100-100ML
UV monitor	Bio-Rad	7318160
Saccharomyces cerevisiae stam BY4741	Open Biosystems	YSC1048