Methodenartikel

Genoom-brede kwantificering van vertaling in de ontluikende gist door het ribosoom profilering

11.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56820

⸱

21 december 2017

 ,  ,  , 
1Department of Dermatology, Boston University School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Translationeel verordening speelt een belangrijke rol in de controle van eiwitten overvloed. Hier beschrijven we een hoge gegevensdoorvoer methode voor de kwantitatieve analyse van vertaling in de ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae.

Samenvatting

Vertaling van mRNA in eiwitten is een complex proces waarbij verschillende lagen van de verordening. Er wordt vaak verondersteld dat wijzigingen in de transcriptie van mRNA in de eiwitsynthese wijzigingen, maar veel uitzonderingen zijn waargenomen. Onlangs, een techniek genaamd ribosoom profiling (of Ribo-Seq) heeft ontpopt als een krachtige methode waarmee identificatie, met een hoge nauwkeurigheid, welke regio's van mRNA worden omgezet in eiwitten en kwantificering van de vertaling op de genoom-brede niveau. Hier presenteren we een gegeneraliseerde protocol voor genoom-brede kwantificering van vertaling Ribo-Seq met ontluikende gist. Daarnaast kan Ribo-Seq gegevens combineren met mRNA overvloed metingen we tegelijkertijd kwantificeren vertaling efficiëntie van duizenden mRNA afschriften in hetzelfde monster en wijzigingen in deze parameters in reactie op experimentele vergelijken manipulaties of in verschillende fysiologische staten. Beschrijven we een gedetailleerd protocol voor generatie van ribosoom footprints nuclease spijsvertering, isolatie van intact ribosoom-voetafdruk complexen via sacharose kleurovergang fractionering en voorbereiding van DNA bibliotheken gebruiken voor het diepe rangschikken samen met passende kwaliteitscontroles nodig om ervoor te zorgen nauwkeurige analyse van in vivo vertaling.

Inleiding

vertaling van mRNA is een van de fundamentele processen in de cel, die een belangrijke rol in de regulatie van eiwit expressie speelt. Vertaling van mRNA is daarom streng gecontroleerd in reactie op verschillende interne en externe fysiologische stimuli 1,2. De mechanismen van translationeel verordening blijven echter understudied. Hier beschrijven we het protocol voor genoom-brede kwantificering van vertaling in de ontluikende gist door het ribosoom profilering. Het algemene doel van het ribosoom profiling techniek is om te studeren en kwantificeren van de vertaling van specifieke mRNAs onder verschillende cellulaire omstandigheden. Deze techniek maakt gebruik van volgende-generatie sequencing kwantitatief ribosoom bezetting gedurende het genoom te analyseren en zorgt voor de opvolging van het tempo van de eiwit synthese in vivo aan de enkel codon resolutie 3,4. Op dit moment deze methode biedt de meest geavanceerde middelen voor het meten van de hoeveelheid eiwit vertaling, en heeft bewezen te zijn een nuttige ontdekkingshulpmiddel verstrekken van informatie die door andere momenteel beschikbare technieken, bijvoorbeeld microarrays kan niet worden onthuld of vertaling staat matrix analyse (TSAA) 5. Als ribosoom profilering van de verslagen over de gecombineerde wijzigingen in afschrift niveaus en eindmaterialen zijn translationeel, biedt het ook veel grotere gevoeligheid ten opzichte van andere methoden.

Deze aanpak is gebaseerd op diep sequentiebepaling van ribosoom beveiligd mRNA fragmenten 3. Tijdens de eiwit vertaling, ribosomen beschermen ~ 28 nt gedeelten van de mRNA (genaamd voetafdrukken) 6. Door het bepalen van de volgorde van de fragmenten ribosoom-beschermd, kan Ribo-Seq betreffendedepositie van ribosomen op het vertaalde mRNA in kaart en bepalen welke gebieden van mRNA zijn waarschijnlijk actief in eiwit 3,7worden omgezet. Daarnaast kunnen we de vertaling van mRNA kwantitatief meten door het tellen van het aantal voetafdrukken die zijn afgestemd op een bepaalde transcriptie van mRNA.

Om te isoleren van het ribosoom beveiligd fragmenten, worden cel lysates in eerste instantie behandeld met een vertaling-remmer tot stilstand van de ribosomen gevolgd door ribonuclease spijsvertering. Overwegende dat vrije mRNA en delen van vertaalde mRNAs niet beschermd door de ribosomen zijn afgebroken door ribonuclease, kunnen het ribosoom beveiligd mRNA fragmenten worden hersteld door het zuiveren van intact ribosoom-voetafdruk complexen. Deze mRNA voetafdrukken worden vervolgens omgezet in cDNA Bibliotheek en geanalyseerd door diepe sequentiebepaling (Figuur 1). Parallel aan het ribosoom profilering, is intact mRNA geëxtraheerd uit hetzelfde monster en sequenced. Door het vergelijken van het niveau van de vertaling geïdentificeerd door Ribo-Seq met mRNA overvloed metingen, kunnen we identificeren van genen die specifiek up - of down-geregeld op het niveau van de vertaling en berekenen van de efficiëntie van de vertaling van mRNA op het genoom-brede niveau. Terwijl het protocol beschreven in dit artikel specifiek voor gist is, zou het ook nuttig zijn voor onderzoekers die proberen zal om het Ribo-Seq-protocol in andere systemen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. de voorbereiding van het uittreksel

  1. Streak giststammen uit bevroren voorraden voor enkele kolonies op YPD platen (gistextract 1%, 2% pepton, glucose van 2% en 2% agar). Incubeer de platen bij 30 ° C gedurende 2 dagen.
  2. Inoculeer gist uit een plaat van de YPD (gebruik een één kolonie) in 15 mL YPD medium (gistextract 1%, 2% pepton, 2% glucose) in een tube van 50 mL conische centrifuge en 's nachts groeien met schudden (200-250 rpm) bij 30 ° C.
  3. Cultuur in 500 mL voor YPD medium in een steriele kolf van 2 L, verdunnen zodat de OD600 < 0.1. Groeien van gistcellen met schudden bij 30 ° C gedurende 3-5 h tot OD600 = 0,5 (Mid log fase).
  4. Verzamelen cellen door te filteren door middel van 0,45 micrometer membraanfilters met behulp van een glazen houder filter vergadering. De pellet Schraap met een spatel, flash bevriezen in vloeibare stikstof, en opslaan bij-80 ° C. De verwachte omvang van de bevroren pellet is ~ 0,2 - 0,5 g.
    Let op: Vloeibare stikstof is extreem lage temperatuur; Draag passende bescherming.
  5. Voorbereiding van een verse Lysis Buffer (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 140 mM KCl, 5 mM MgCl2, 100 μg/mL cycloheximide, 0.5 mM DTT, 1% Triton X-100) onmiddellijk vóór gebruik, houd op ijs.
  6. Zet 3 chroomstaal kralen (3.2 mm) in een 1.8 mL roestvast stalen buis. Vooraf chill in vloeibare stikstof en bevroren pellets toevoegen, dek af met een siliconen rubberen dop. Meng het monster door de cryogrinding voor 10 s 4200 rpm; Herhaal 10 keer. Chill de buis in vloeibare stikstof voor ten minste 10 s tussen elke ronde.
    Opmerking: Het is belangrijk om altijd het monster bevroren.
  7. Voeg 1 mL Lysis-buffermengsel, meng goed door pipetteren. Pipetteer in een nieuwe 1,5 mL-buis.
  8. Centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Breng de bovendrijvende substantie in een nieuwe 1,5 mL-buis tijdens het werken op ijs. 100 μl van lysate overbrengen in een nieuwe 1,5 mL-buis voor poly(A) mRNA isolatie. Ga onmiddellijk naar RNA isolatie of flash bevriezen de buis in vloeibare stikstof. Maatregel OD260 van de rest van de lysate, die zal worden gebruikt voor de extractie van de voetafdruk, en flash bevriezen de buizen in vloeibare stikstof. Winkel de lysates bij-80 ° C.

2. voetafdruk extractie

  1. Voorbereiding van sacharose verlopen
    1. Bereid oplossingen voor 50%, 40%, 30%, 20% en 10% sacharose in kleurovergang Buffer (20 mM Tris-HCl pH 8.0, van 140 mM KCl, 5 mM MgCl2, 100 μg/mL cycloheximide, 0.5 mM DTT).
    2. Pipetteer 2.2 mL van de bereid 50% sacharose buffer naar de onderkant van de tube 13.2 mL dunne wand polyallomer en bevriezen van de oplossing voor 10 min bij-80 ° C (Figuur 2). Vervolgens laag 2.2 mL van 40% sucrose buffer op de top van de bevroren 50% sacharose buffer en bevriezen voor 10 min bij-80 ° C. Na de zelfde instructies laag 30%, dan 20%, en tot slot 10% sacharose buffers bovenop elkaar. Vermijden makend luchtbellen terwijl gelaagdheid. Houd de hellingen bij-80 ° C tot gebruik. De hellingen van sacharose moeten ten minste één dag voor het experiment voorbereid en opgeslagen bij-80 ° C.
  2. Nuclease spijsvertering
    1. Ontdooi de sacharose verlopen de avond tevoren experimenten bij 4 ° C.
    2. Ontdooi cel lysate (voetafdruk voorbeeld) op het ijs. Pipetteer een aliquoot deel van cel lysate met 50 OD260 eenheden tot een nieuwe 1,5 mL koker en toevoegen van verse Lysis-buffermengsel tot 1 mL. Bewaar de resterende lysate bij-80 ° C. Voeg 10 μL RNase ik (100 U/μl) en Incubeer 1 uur bij kamertemperatuur met zachte rotatie op een hoofd-over-heels rotator.
    3. (Optioneel) Verduidelijking van de monsters bij 20.000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C en herstellen van de bovendrijvende substantie in een nieuwe 1,5 mL-buis.
  3. Ultracentrifugatie
    1. Zachtjes laag lysate monsters naar de top van een helling van 10-50% sucrose.
    2. Ultracentrifuge de polyallomer buizen bij 210.000 x g (35.000 rpm) bij 4 ° C gedurende 3 uur met behulp van SW-41 Ti rotor.
  4. Kleurovergang fractionering systeeminstallatie
    1. Zet op de onderdelen en laat de UV monitor warming-up voor ten minste 30 min.
    2. Als met behulp van een digitale recorder software, start de software op de computer, de grafiek van schalen grenzen te stellen aan-0.01 en 1.
    3. Vul de injectiespuit met Chase oplossing (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 140 mM KCl, 5 mM MgCl2, 60% sucrose), Verwijder eventuele luchtbellen binnen de spuit en de canule.
    4. Installeer een ultracentrifuge buis gevuld met RNase-gratis water. Doorboren de buis met de canule totdat twee zwarte vlekken te zien. Start de spuitpomp op 1 mL/min.
    5. Als het water de stroom cel passeert, druk op "Auto-Zero" knop op de UV-monitor aan te passen van de basislijn op 0. Instellen van de gevoeligheid van de UV monitor "2.0 AU". Nadat een stabiele basislijn heeft ingesteld, stoppen de spuitpomp. Herstellen van de Chase-oplossing en verwijder de ultracentrifuge buis.
  5. Monosome isolatie
    1. Installeer en doorboren de ultracentrifuge buis met het verloop van sacharose. Start de spuitpomp op 1 mL/min, 1 mL breuken toezicht op een254 waarden te verzamelen. Bundelen van breuken vertegenwoordigen de 80S monosome piek in één buis, houd op ijs (Figuur 3).
    2. Zodra Chase oplossing de stroom cel bereikt, stopt de spuitpomp. Chase oplossing herstellen en verwijderen van de buis van de ultracentrifuge. Herhaal fractionering voor de rest van de monsters die begint bij stap 2.5.1.
      Opmerking: Wanneer u klaar bent, het systeem van de fractionering met ten minste 30 mL RNase-gratis water schoon. Grondig wassen buis, spuit en alle verwijderbare onderdelen met warm water.
    3. Filtreer de breuken door 0,5 mL centrifugaal filters (100 kDa MWCO) bij 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C en negeren de doorstroming, herhaal volume < 100 μl. Voeg 400 l Release Buffer (20 mM Tris-HCl pH 7.0, van 2 mM EDTA, 40 U/mL RNase-remmer). Meng door pipetteren, incubeer op ijs van 10 min en breng de eenheid in een nieuwe collectie buis. Centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C en het verzamelen van de doorstroming.
  6. Voetafdruk fragment zuivering
    1. Overdracht van de doorstroming met voetafdruk RNA fragmenten naar een nieuwe 1,5 mL tube, 20 μL van 20% SDS (om een eindconcentratie van 1%), Meng door pipetteren toe te voegen.
    2. Voeg 1 deel zuur-fenol: Chloroform (pH 4.5), vortex voor 10 s.
      Let op: Acid-fenol: Chloroform is giftig, Vermijd contact met de huid en inhalatie.
    3. Warmte bij 65 ° C gedurende 5 minuten, zet op ijs voor 1 min. Centrifuge het monster bij 12.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 ° C, de waterige fase (boven) overbrengen naar een nieuwe 1,5 mL-buis.
    4. Neerslag voetafdruk RNA fragmenten door toevoeging van 1/10 volume van NaOAc (pH 5.5), 1/100 volume van glycogeen (10 mg/mL) en 2,5 volumes van 100% ethanol.
Incubeer bij-20 ° C gedurende ten minste 1 uur.

3. Poly(A) mRNA extractie

  1. Totaal RNA extractie
    1. Een hoeveelheid van 100 μl van cel lysate (Totaal RNA monster) op ijs ontdooien, voeg 300 μL van 20 mM Tris-HCl pH 7.0 en 20 μL van 20% SDS (om een eindconcentratie van 1%), Meng door pipetteren.
    2. 1 hoeveelheid (400 μL) zuur toevoegen-fenol: Chloroform (pH 4.5) en vortex voor 10 s.
    3. Warmte bij 65 ° C gedurende 5 minuten, zet op ijs voor 1 min. Centrifuge het monster bij 12.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 ° C, de waterige fase (boven) overbrengen naar een nieuwe 1,5 mL-buis.
    4. Een tweede fenol-extractie uit te voeren. Voeg 1 deel zuur-fenol: Chloroform (pH 4.5), vortex voor bij 65 ° C gedurende 5 min, 10 s. warmte zetten ijs voor 1 min. Centrifuge het monster bij 12.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 ° C, de waterfase overbrengen in een nieuwe 1,5 mL-buis.
    5. Neerslaan van het RNA. Voeg 1/10 volume van 3 M NaOAc (pH 5.5), 1/100 volume van glycogeen (10 mg/mL) en 2,5 volumes van 100% ethanol hiervoor. Incubeer bij-20 ° C gedurende ten minste 1 uur.
  2. Poly(A) mRNA isolatie
    1. Centrifugeer het RNA samples bij 20.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 ° C, verwijderen van ethanol. Spin down 30 s max snelheid, verwijderen van de rest van de ethanol met een gel-laden-tip, en lucht drogen de pellet gedurende 5 minuten.
    2. Los de pellet in 300 μL van Lysis/bindende buffer uit de poly(A) mRNA isolatie kit. Ga naar poly(A) mRNA extractie volgens protocol van de poly(A) mRNA isolatie kit van de fabrikant.
    3. Neerslag het mRNA monsters door toevoeging van 1/10 volume van 3 M NaOAc (pH 5.5), 1/100 volume van glycogeen (10 mg/mL) en 2,5 volumes van 100% ethanol. Incubeer bij-20 ° C gedurende ten minste 1 uur.
  3. mRNA fragmentatie
    1. Centrifugeer het mRNA monsters bij 20.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 ° C, verwijderen van ethanol. Spin down 30 sec, verwijderen van de rest van de ethanol met een gel-loading uiteinde en lucht drogen de pellet gedurende 5 minuten.
    2. Resuspendeer mRNA in 18 μL van RNase-gratis water, voeg 2 μL van 10 x RNA fragmentatie buffer. Incubeer 5 min bij 94° C. Overdracht buis aan ijs.
    3. Neerslag door toevoeging van 1/10 volume van 3 M NaOAc (pH 5.5), 1/100 volume van glycogeen (10 mg/mL) en 2,5 volumes van 100% ethanol. Incubeer bij-20 ° C gedurende ten minste 1 uur.

4. defosforylerings

  1. Voetafdruk en gefragmenteerde mRNA monsters met T4 polynucleotide kinase behandelen. Voor dit, centrifugeren van de monsters bij 20.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 ° C, verwijderen van ethanol. Spin down 30 s max snelheid, het verwijderen van de rest van de ethanol met een gel laden tip. Lucht drogen de pellet gedurende 5 minuten.
  2. Resuspendeer de pellet in 7,75 µL van water, voeg 1 µL van 10 x T4 polynucleotide kinase buffer, 1 µL van T4 polynucleotide kinase (10.000 U/mL) en 0,25 µL van RNase remmer (20 U/µL). Incubeer 1 uur bij 37 ° C.
  3. (Optioneel) Vooraf een 15% TBE-ureum gel op 180 V gedurende 15 minuten met behulp van 1 x TBE buffer uitvoeren.
  4. Voeg toe 10 µL van 2 X TBE-ureum monster buffer aan 10 µL van elk monster voetafdruk en mRNA. Een controlemonster met 1 µL van 10 µM bovenste grootte markering oligonucleotide bereiden (32 nt), 1 µL van 10 µM lagere grootte markering oligonucleotide (28 nt), 8 µL water, en 10 µL van 2 x TBE-ureum monster buffer voor voetafdruk monsters. Een controlemonster met 1 µL van 10 µM RNA marker oligonucleotide bereiden (63 nt), 9 µL water, en 10 µL van 2 x TBE-ureum monster buffer voor mRNA monsters.
  5. Incubeer de monsters en de besturingselementen 3 min op 75 ° C, spin down, premieaffaires te ontvangen op het ijs voor 1 min. elk monster in 2 putten van de 15% TBE-ureum gel, afzonderlijke fragmenten van RNA door elektroforese van het gel bij 180 V gedurende 1 uur laden.
  6. Vlek de gel gedurende 5 minuten met een nucleïnezuur gel vlek (verdund 10.000 x in water), beschermen tegen licht.
  7. Met behulp van een blauwe lichte transilluminator, gesneden van de goede band tussen 28 en 32 nt markeringen voor voetafdruk monsters (figuur 4A) en rond monsters 50-70 nt voor mRNA (figuur 4B) met een schone scheermesje. Het bevriezen van het polyacrylamidegel stukken bij-80 ° C gedurende ten minste 10 min.
  8. Uittreksel RNA van het polyacrylamidegel als volgt. Verhit de gel stukken bij 70 ° C gedurende 2 minuten, de gel met behulp van wegwerp pellet pestles vermalen. RNA Elueer met 300 µL elutie buffer (20 mM Tris-HCl pH 7.0, van 2 mM EDTA), voeg 1 µL RNase remmer (20 U/µL) en Incubeer bij 37 ° C gedurende 3 uur.
  9. Centrifugeer het monster bij 12.000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C, verzamelen het supernatant en neerslag door toe te voegen 1/10 volume van NaOAc (pH 5.5), 1/100 volume van glycogeen (10 mg/mL) en 2,5 volumes van 100% ethanol. Incubeer bij-20 ° C gedurende ten minste 1 uur.

5. 3'-adapter afbinding

  1. Centrifugeer de voetafdruk en mRNA monsters bij 20.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 ° C, verwijderen van ethanol. Spin down 30 s max snelheid, verwijderen van de rest van de ethanol met een gel-laden-tip. Lucht drogen de pellet gedurende 10 minuten.
  2. Resuspendeer de pellet in 4,75 µL van nuclease-gratis water, 2 µL van 50% PEG8000, 1 µL van 10 X T4 RNA ligase buffer, 1 µL van 3'-adapter (100 ng/µL), 0,25 µL van RNase remmer (20 U/µL), 1 µL van T4 RNA ligase 2 afgekapt KQ (200.000 U/mL). Na een nacht bebroeden bij 16 ° C.
  3. De volgende ochtend Verwijder de overmaat van adapter door toevoeging van 0,5 µL van 5'-deadenylase (10 U/µL) en 0,5 µL van Rec J exonuclease (10 U/µL) rechtstreeks naar de reactie van de afbinding. Incubeer gedurende 30 minuten bij 30 ° C.
  4. Het neerslaan van de monsters. Voeg hiervoor 30 µL van nuclease-gratis water, 1 µL glycogeen (10 mg/mL), 1/10 volume van NaOAc (pH 5.5) en 2,5 volumes van 100% ethanol. Incubeer bij-20 ° C gedurende ten minste 1 uur.

6. omgekeerde transcriptie

  1. Centrifugeer de monsters bij 20.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 ° C, verwijderen van ethanol. Spin down 30 s max snelheid, verwijderen van de rest van de ethanol met een gel-laden-tip. Lucht drogen de pellet gedurende 10 minuten.
  2. Resuspendeer de pellet in 11,5 µL van nuclease-gratis water, Voeg 0,5 µL 8 µM omgekeerde transcriptie primer (RT primer) en 1 µL van dNTP mix (10 mM). Incubeer gedurende 5 minuten bij 65 ° C, op ijs.
  3. Voeg 4 µL van 5 X eerste onderdeel buffer, 2 µL van 0,1 M DTT, 0,5 µL van RNase remmer (20 U/µL), 0,5 µL van reverse-transcriptase (200 U/µL). Incubeer gedurende 30 minuten bij 48 ° C, 1 min. bij 65 ° C, 5 min bij 80 ° C.
  4. Niet neerslaan en onmiddellijk overgaan tot de hydrolyse van RNA, door 0.8 µL van 2 M NaOH toe te voegen, incubeer 30 min bij 98 ° C. Voeg 0.8 µL 2M HCl te neutraliseren reactie.
  5. Het neerslaan van de monsters.
Voeg hiervoor 20 µL van nuclease-gratis water, 1 µL glycogeen (10 mg/mL), 1/10 volume van NaOAc (pH 5.5) en 2,5 volumes van 100% ethanol. Incubeer bij-20 ° C gedurende ten minste 1 uur.
  • Centrifugeer de monsters bij 20.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 ° C, verwijderen van ethanol. Spin down 30 s max snelheid, verwijderen van de rest van de ethanol met een gel-laden-tip. Lucht drogen de pellet gedurende 10 minuten.
  • Resuspendeer de pellet in 5 µL nuclease-gratis water, voeg 5 µL van 2 X TBE-ureum monster buffer. Incubeer 3 min op 75 ° C, spin naar beneden, zet op ijs voor 1 min.
  • (Optioneel) Vooraf een 10% TBE-ureum gel op 180 V gedurende 15 minuten met 1 X TBE buffer uitvoeren.
  • Het laden van het monster op 1 van de 10% TBE-ureum gel. De producten van de reactie van omgekeerde transcriptie van elkaar gescheiden door de Elektroforese van het gel bij 180 V voor 50 min. Als een besturingselement, bereiden een steekproef met 1 µL van 2,5 µM RT primer, 1 µL van 2,5 µM 128 nt marker oligonucleotide, 3 µL water, en 5 µL van 2 X TBE-ureum proeven buffer, en voert op een afzonderlijke lane van de gel.
  • Vlek de gel gedurende 5 minuten met een nucleïnezuur gel vlek (verdund 10.000 x in water), beschermen tegen licht. Met behulp van een blauwe lichte transilluminator, knip de band ongeveer 128 nt en hoger (Figuur 5) met een schone scheermesje. Het bevriezen van het polyacrylamidegel stukken bij-80 ° C gedurende ten minste 10 min.
  • Verhit de gel stukken bij 70 ° C gedurende 2 minuten, de gel met behulp van wegwerp pellet pestles vermalen. DNA Elueer met 300 µL van 20 mM Tris-HCl pH 7.0 en Incubeer bij 37 ° C gedurende 3 uur.
  • Centrifugeer het monster bij 12.000 x g, voor 5 min bij 4 ° C, verzamelen het supernatant en neerslag door toe te voegen 1/10 volume van NaOAc (pH 5.5), 1/100 volume van glycogeen (10 mg/mL) en 2,5 volumes van 100% ethanol. Incubeer bij-20 ° C gedurende ten minste 1 uur.

    • 7. circularization

    1. Centrifugeer de monsters bij 20.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 ° C, verwijderen van ethanol. Spin down 30 s max snelheid, verwijderen van de rest van de ethanol met een gel-laden-tip, en lucht drogen de pellet gedurende 10 minuten.
    2. Resuspendeer de pellet in 16.75 µL van nuclease-gratis water. Voeg 2 µL van 10 x single-stranded (ssDNA) DNA ligase buffer, 1 µL van 50 mM MnCl2, 0,25 µL van ssDNA Ligase (100 U/µL). Incubeer gedurende 1 uur bij 60 ° C, 10 min bij 80 ° C. Geen neerslag en slaan de ssDNA afbinding reactieproduct bij-20 ° C.

    8. PCR bibliotheek versterking

    1. Terwijl werken aan ijs, meng het volgende in een PCR-buis: µL van de 146 nuclease-gratis water, 2 µL van 20 µM Forward primer, 2 µL van 20 µM geïndexeerd Reverse primer, 40 µL van 5 x HiFi-DNA plymerase buffer, 4 µL van dNTPs (10 mM), 4 µL van ssDNA afbinding reactieproduct , en 2 µL van HiFi-polymerase van DNA. Kies een verschillende geïndexeerd Reverse primer voor elk monster die zal worden multiplexed voor het rangschikken. Pipetteer een aliquoot 50 µL van het PCR-mengsel in 4 nieuwe PCR-buizen.
    2. Uitvoeren van de PCR versterking met wisselend aantal cycli (8, 10, 12, 14) met de volgende instellingen:
      1 min bij 98 ° C initiële denaturatie
      8 tot en met 14 cycli:
      15 bij 94 ° C s
      5 s bij 55 ° C
      10 s bij 65 ° C
      2 min op uiteindelijke uitbreiding van 65 ° C
    3. Neerslag het PCR-product door toevoeging van 1/10 volume van 3 M NaOAc (pH 5.5), 1/100 volume van glycogeen (10 mg/mL) en 2,5 volumes van 100% ethanol. Incubeer bij-20 ° C gedurende ten minste 1 uur.
    4. Centrifugeer de monsters bij 20.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 ° C, verwijderen van ethanol. Spin down 30 s max snelheid, verwijderen van de rest van de ethanol met een gel-laden-tip, en lucht drogen de pellet.
    5. Resuspendeer de pellet in 8 µL van nuclease-gratis water, voeg 2 µL van niet-denaturering 5 x nucleïnezuur monster buffer. Het laden van het monster op 1 goed van een niet-denaturering 8% TBE gel. De DNA-producten van elkaar gescheiden door de Elektroforese van het gel bij 150 V voor 35 min. Als een besturingselement, bereiden een steekproef met 0,5 µL van 10 bp DNA ladder (1 µg/µL), 7,5 µL water en 2 µL van niet-denaturering 5 x nucleïnezuur monster buffer, en draaien op een afzonderlijke lane van de gel.
    6. Vlek de gel gedurende 5 minuten met een nucleïnezuur gel vlek (verdund 10.000 x in water), beschermen tegen licht. Met behulp van een blauwe lichte transilluminator, knip de band ongeveer 150 bp voor voetafdruk monsters en ongeveer 180 bp voor mRNA monsters (Figuur 6) met een schone scheermesje. Slaan van de stukken van de gel bij-80 ° C gedurende ten minste 10 min.
    7. Verhit de gel stukken bij 70 ° C gedurende 2 minuten, de gel met behulp van wegwerp pellet pestles vermalen. DNA Elueer met 300 µL van 20 mM Tris-HCl pH 7.0 en Incubeer bij 37 ° C gedurende 3 uur.
    8. Centrifugeer het monster bij 12.000 x g, voor 5 min bij 4 ° C, verzamelen het supernatant en neerslag door toe te voegen 1/10 volume van NaOAc (pH 5.5), 1/100 volume van glycogeen (10 mg/mL) en 2,5 volumes van 100% ethanol. Incubeer bij-20 ° C gedurende ten minste 1 uur.
    9. Centrifugeer de monsters bij 20.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 ° C, verwijderen van ethanol. Spin down 30 s max snelheid, verwijderen van de rest van de ethanol met een gel-laden-tip, en lucht drogen de pellet. Ten slotte resuspendeer de bibliotheken in 20 µL van nuclease-gratis water en overgaan tot kwantificering, kwaliteitscontrole en rangschikken.

    9. bibliotheek kwantificering en High-throughput Sequencing

    1. Bepaal voordat u de monsters voor het rangschikken verzendt, de opbrengst en kwaliteit van de PCR-versterkte bibliotheken. Representatieve profielen voor voetafdruk en mRNA sequencing bibliotheken worden weergegeven in Figuur 7. De verwachte omvang van de PCR-versterkte bibliotheek is 148-152 bp voor voetafdruk monsters, en 170-190 bp voor mRNA monsters.
    2. Als verschillende monsters met verschillende barcodes zullen worden samengevoegd voor het rangschikken, voert u nauwkeurige kwantificering van de bibliotheken met behulp van een qPCR gebaseerde sequencing assay voor de kwantificering van de bibliotheek.
    3. Het zwembad van de bibliotheken in mengsel verhoudingen. Bereken het totale volume van het zwembad als 3 µL x totaal aantal monsters dat moet worden samengevoegd. Bepaal het volume van elke bibliotheek die worden toegevoegd moet zodat bibliotheken zijn gemengd in het mengsel verhoudingen te bereiken van 10 nM eindconcentratie van het zwembad. De berekende volumes van elke bibliotheek toevoegen aan een nieuwe tube 1,5 mL, Meng door pipetteren. Voeg water om het berekende totale volume. Winkel gebundeld bibliotheken bij-20 ° C.
    4. Stuur een aliquoot gedeelte van de gebundelde bibliotheek te worden sequenced met 50 bp single-end sequencing draaien op een platform van Illumina sequencing. We routinematig multiplex 12 monsters in een enkele volgorde uitvoert, welke opbrengsten ~ 200 miljoen leest per sequencing rijstrook.
      Opmerking: Het definitieve aantal voetafdruk leest verzameld per elk monster hangt af van de hoeveelheid van het uitgangsmateriaal en de mate van rRNA besmetting.

    Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

    Resultaten

    Gedetailleerde pijpleidingen voor bioinformatic analyse van data profiling ribosoom geweest eerder 8,9beschreven. Verschillende onderzoeksgroepen hebben voorts bioinformatica tools voor differentiële gen expressie analyse en verwerking van gegevens van reeksnummers, die specifiek zijn voor ribosoom profilering methode 10,11,12 ,

    Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

    Discussie

    De Ribo-Seq-aanpak heeft ontpopt als een krachtige technologie voor de analyse van mRNA vertaling in vivo aan de genoom-brede niveau 3. Studies met deze aanpak, die zorgt voor de opvolging van de vertaling met single-codon resolutie, heeft bijgedragen aan ons begrip van translationeel verordening. Ondanks zijn voordelen heeft Ribo-Seq verscheidene beperkingen. Ribosomaal RNA (rRNA) fragmenten zijn altijd mede gezuiverde tijdens Isolatievan ribosoom beveiligd voetafdrukken minderen van de ...

    Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

    Openbaarmakingen

    De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

    Dankbetuigingen

    Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health grants AG040191 en AG054566 naar VML. Dit onderzoek werd uitgevoerd terwijl VML een onderzoeksbeurs van de AFAR-ontvanger van de Amerikaanse Federatie voor veroudering onderzoek was.

    Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

    Materialen

    Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
    NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
    0.45 μM membraanfiltersMilliporeHVLP04700
    0.5 M EDTAInvitrogenAM9261
    0.5 mL centrifugale filters (100 kDa MWCO)MilliporeUFC510024
    1 M Tris-HCl, pH 7.0InvitrogenAM9850G
    1 M Tris-HCl, pH 7.5 (pH 8.0 bij 4°C)Invitrogen15567-027
    10X TBE bufferInvitrogenAM9863
    10% TBE-ureageelInvitrogenEC6875BOX
    15% TBE-ureageelInvitrogenEC6885BOX
    2 M MgCl2RPIM24500-10.0
    2X TBE-ureageel bufferInvitrogenLC6876
    3M NaOAc, pH 5.5InvitrogenAM9740
    5' Deadenylase (10 U/μL)EpicentreDA11101K
    5X Nucleïnezuur monster bufferBio-Rad161-0767
    8% TBE geelInvitrogenEC6215BOX
    Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (met IAA, 125:24:1)InvitrogenAM9722
    Blauwlicht transilluminatorClare Chemical ResearchDR-46B
    Chrome-staalkorrels, 3,2 mmBioSpec Products11079132c
    CryogrinderBiospec product3110BX
    CycloheximideRPIC81040-5.0
    Data verzamelsysteemDATAQ InstrumentsDI-245
    Deoxynucleotide (dNTP) oplossingsmix (10 mM)NEBN0447L
    GlycogenInvitrogenAM9510
    Gradiënt fractionering systeemBrandelBR-184X
    High-fidelity DNA polymerase (2.000 U/mL)NEBM0530SGeleverd met 5X Phusion HF Buffer
    Next-generation sequencing bibliotheek kwantificeringskitKapa BiosystemsKK4824
    Nucleïnezuur gel vlekInvitrogenS11494
    Optima XE-90 ultracentrifugeBeckman CoulterA94471
    Poly(A) mRNA isolatiekitInvitrogen61011
    Rec J exonuclease (10 U/μL)EpicentreRJ411250
    Reverse transcriptase (200 U/μL)Invitrogen18080093Geleverd met 5X first-strand buffer en 0,1 M DTT
    RNA fragmentatie bufferNEBE6186A
    RNase I (100 U/μL)InvitrogenAM2295
    RNase inhibitor (20 U/μL)InvitrogenAM2696
    Silicone rubber doppenBioSpec Products2008
    ssDNA ligase (100 U/μL)EpicentreCL9021KGeleverd met 10X CircLigase II buffer en 50 mM MnCl2
    Roestvrijstalen microvialen, 1,8 mLBioSpec Products2007
    SucroseRPIS24060-5000.0
    SW-41 Ti rotorBeckman Coulter331362
    SpuitpompNew Era Pump SystemsNE-300
    T4 polynucleotide kinase (10.000 U/mL)NEBM0201SGeleverd met 10X T4 polynucleotide kinase buffer
    T4 RNA ligase 2 getrunceerd KQ (200.000 U/mL)NEBM0373SGeleverd met 10X T4 RNA ligase buffer en 50% PEG8000
    Thermische cyclerBio-Rad1851148
    Dunwandige polyallomer buizen, 13,2 mLBeckman Coulter331372
    Triton X-100Sigma AldrichX100-100ML
    UV monitorBio-Rad7318160
    Saccharomyces cerevisiae stam BY4741Open BiosystemsYSC1048

    Referenties

    1. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
    2. Tanenbaum, M. E., Stern-Ginossar, N., Weissman, J. S., Vale, R. D. Regulation of mRNA translation during mitosis. Elife. 4, (2015).
    3. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
    4. Ingolia, N. T. Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting. Methods Enzymol. 470, 119-142 (2010).
    5. Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).
    6. Wolin, S. L., Walter, P. Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA. EMBO J. 7 (11), 3559-3569 (1988).
    7. Guo, H., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Bartel, D. P. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature. 466 (7308), 835-840 (2010).
    8. Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).
    9. Bartholomaus, A., Del Campo, C., Ignatova, Z. Mapping the non-standardized biases of ribosome profiling. Biol Chem. 397 (1), 23-35 (2016).
    10. Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies. Bioinformatics. 27 (10), 1440-1441 (2011).
    11. Zhong, Y., et al. RiboDiff: detecting changes of mRNA translation efficiency from ribosome footprints. Bioinformatics. 33 (1), 139-141 (2017).
    12. Xiao, Z., Zou, Q., Liu, Y., Yang, X. Genome-wide assessment of differential translations with ribosome profiling data. Nat Commun. 7, 11194(2016).
    13. Chung, B. Y., et al. The use of duplex-specific nuclease in ribosome profiling and a user-friendly software package for Ribo-seq data analysis. RNA. 21 (10), 1731-1745 (2015).
    14. Popa, A., et al. RiboProfiling: a Bioconductor package for standard Ribo-seq pipeline processing. F1000Res. 5, 1309(2016).
    15. Dunn, J. G., Weissman, J. S. Plastid: nucleotide-resolution analysis of next-generation sequencing and genomics data. BMC Genomics. 17 (1), 958(2016).
    16. Baranov, P. V., Michel, A. M. Illuminating translation with ribosome profiling spectra. Nat Methods. 13 (2), 123-124 (2016).
    17. Calviello, L., et al. Detecting actively translated open reading frames in ribosome profiling data. Nat Methods. 13 (2), 165-170 (2016).
    18. Michel, A. M., et al. RiboGalaxy: A browser based platform for the alignment, analysis and visualization of ribosome profiling data. RNA Biol. 13 (3), 316-319 (2016).
    19. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet J. 17 (1), 10-12 (2011).
    20. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25(2009).
    21. Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).
    22. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550(2014).
    23. van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress. EMBO J. 33 (3), 265-276 (2014).
    24. Guydosh, N. R., Green, R. Dom34 rescues ribosomes in 3' untranslated regions. Cell. 156 (5), 950-962 (2014).
    25. Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).
    26. Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17394-17399 (2012).
    27. Weinberg, D. E., et al. Improved ribosome-footprint and mRNA measurements provide insights into dynamics and regulation of yeast translation. Cell Rep. 14 (7), 1787-1799 (2016).
    28. Park, J. E., Yi, H., Kim, Y., Chang, H., Kim, V. N. Regulation of poly(A) tail and translation during the somatic cell cycle. Mol Cell. 62 (3), 462-471 (2016).
    29. Howard, M. T., Carlson, B. A., Anderson, C. B., Hatfield, D. L. Translational redefinition of UGA codons is regulated by selenium availability. J Biol Chem. 288 (27), 19401-19413 (2013).
    30. Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Ribonuclease selection for ribosome profiling. Nucleic Acids Res. 45 (2), e6(2017).
    31. Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments. Nucleic Acids Res. 42 (17), e134(2014).
    32. O'Connor, P. B., Andreev, D. E., Baranov, P. V. Comparative survey of the relative impact of mRNA features on local ribosome profiling read density. Nat Commun. 7, 12915(2016).

    Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

    Herprints en machtigingen

    Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

    Toestemming aanvragen

    Trefwoorden

    Kwantificering van translatiesucrosegradi ntfractioneringnucleaseverdijstingRNA librarypreparatiedeep sequencingtranslatie effici ntiemRNA abundantiegenoombrede analyse

    Gerelateerde artikelen