Hier presenteren we een protocol om te evalueren van het effect van peptiden op de migratie van bronchiale epitheliale cellen. Deze methode zorgt voor de snelle en zeer reproduceerbaar accumulatie van kwantitatieve gegevens over de snelheid van cel migratie en wond sluiting.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een roman In Vitro wond genezing Assay om te evalueren van de cel migratie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het doel van dit werk is om te laten zien van een nieuwe methode voor de evaluatie van het vermogen van sommige immunomodulerende moleculen, zoals antimicrobiële peptiden (ampère), ter stimulering van de cel migratie. Nog belangrijker is, is cel migratie een snelheidsbeperking evenement tijdens de wondgenezing proces te herstellen de integriteit en de normale functie van lagen weefsel na blessure. Het voordeel van deze methode ten opzichte van de klassieke bepaling, die is gebaseerd op een handmatig gemaakte kras in een cel enkelgelaagde, is dat het gebruik van speciale silicone cultuur wordt ingevoegd die twee compartimenten een cel-vrije pseudo-wond als veld wilt maken met een welomschreven breedte (500 μm ). Daarnaast, als gevolg van een geautomatiseerde beeld analyse platform is het mogelijk om snel het verkrijgen van kwantitatieve gegevens over de snelheid van de wond sluiting en cel migratie. Meer precies, wordt het effect van twee kikker-huid versterkers op de migratie van bronchiale epitheliale cellen getoond. Bovendien zal de voorbehandeling van deze cellen met specifieke remmers informatie verschaffen over de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan dergelijke gebeurtenissen.
Inleiding
Het is grotendeels bekend dat wondgenezing in dieren een fundamentele proces is om opnieuw de integriteit en de normale functie van lagen weefsel na letsel1. Ondanks de epitheliale oppervlakken die zijn blootgesteld aan de externe omgeving (bijvoorbeeld de huid, luchtwegen, en gastro-intestinale traktaten) vormen een beschermende barrière van fysische en chemische beledigingen, de vorming van wonden kan gemakkelijk optreden, vooral na chirurgie of microbiële infecties2. Als voorbeeld leidt kolonisatie van longweefsel door de opportunistische bacteriële pathogenen Pseudomonas aeruginosa, met name in cystic fibrosis (CF) patiënten, tot schade aan het epitheel van de luchtwegen met daaruit voortvloeiende respiratoir falen3, 4. Wondgenezing is een complexe host reparatie mechanisme om te herstellen van de normale architectuur van een gewonde weefsel5. Het wordt gekenmerkt door een eerste ontsteking, gevolgd door een periode van de regeneratie omvat epithelialization, angiogenese, en weefsel remodeling met collageenproductie en cel differentiatie6,7,8 . Om de integriteit van de epitheliale garanderen en zo de besturing van de microbiële proliferatie, produceren alle levende organismen verdediging moleculen, met inbegrip van antimicrobiële peptiden (AMPs)9,10. De wond genezing proces is zeer moeilijk te simuleren in vitro als gevolg van het ontbreken van cel puin en complexe interacties tussen de verschillende soorten cellen. Echter de mogelijkheid in vitro van een peptide voor het versnellen van de sluiting van een pseudo-wond door het stimuleren van migratie van epitheliale cellen is kenmerkend voor haar vermogen om te genezen van een gecompromitteerde epitheel. Inderdaad, cel migratie is een snelheidsbeperking evenement in de wondgenezing en bestuderen van de factoren die van invloed kunnen zijn op de cel migratie zal bijdragen tot doel therapieën voor betere wondgenezing.
Hier, wordt een zeer reproduceerbaar experimentele bepaling verstrekt op basis van speciale silicone cultuur inzetstukken te evalueren cel migratie in vitro. Het is gebaseerd op het creëren van een 500 μm kloof (pseudo-wond) op een enkelgelaagde confluente cel. De cellen aan de rand van de kunstmatige "wounded" veld zal beginnen migreren in de cel-vrije zone, de vorming van de nieuwe cel contacten. Het invoegen van cultuur vertegenwoordigt een nieuw instrument voor snelle wond genezing experimenten. Twee reservoirs die zijn gescheiden door een muur μm 500 worden geleverd, en ze kunnen goed geplaatst worden in een plaat van 3 cm schotel of in de put van een 12-well-plate. Elk compartiment van de insert te vullen met een celsuspensie kunt cellen groeien in elke aangewezen zone tot samenvloeiing, terwijl verwijdering van het donormateriaal zal het nastreven van een schoon cel-vrije kloof van ongeveer 500 μm (dezelfde breedte als de scheidingsmuur). De juiste cel voedingsbodem aangevuld met een teststof kunnen vervolgens worden toegevoegd in de schotel plaat per putje. Daarna kan de kloof sluiting op verschillende tijdstippen onder een omgekeerde Microscoop, bij voorkeur een uitgerust met een video-camera voor Beeldacquisitie worden gevisualiseerd. Tot slot zal de meting van veranderingen in de cel bedekte gebied door de web gebaseerde image met geautomatiseerde analyseprogramma de kwantificering van de snelheid van de wond sluiting en cel migratie toestaan. Deze methode is over het geheel genomen een stap voorwaarts met betrekking tot de klassieke bepaling, waar een kras is handmatig gemaakt door confluente cel monolayers gebeuren met een steriele naald of een pipet tip11. Inderdaad, de laatste procedure op de plastic onderkant van de schotel kan vernietigen plaat per putje en de oppervlaktelaag, rimpels maken. Bovendien, het "wounded" gebied beschikt niet over een welomschreven breedte langs de gehele lengte van de kloof, zoals dit is sterk afhankelijk van de uitgeoefende door onderzoekers naar de naald/tip. Bovendien, de dislodged cellen kunnen vormen bosjes van levende en dode cellen aan de randen van de kras; Bovendien, de verspreiding van levende cellen in het "wounded" gebied kan interfereren met de snelheid van cel migratie, het genereren van niet-reproduceerbare resultaten12.
Bovendien, dankzij een kras beeld analyse platform, kunnen gebruikers snel ontvangen (in minuten) kwantitatieve gegevens over het trekgedrag van de geselecteerde cellen zonder de noodzaak van het verwerven van extra software. Dit platform is geschikt voor het analyseren van de fase contrast microscopie afbeeldingen van lage (~ 5 X), medium (~ 10 X) en hoog (~ 20 X) vergroting. Na het uploaden van een zip-bestand van beelden (in *.jpg *.jpeg, *.jp2, *.png, *.gif, *.tiff formaat) wordt de analyse automatisch uitgevoerd om een samenvatting bestand genereren dat het percentage van zowel cel bedekte gebieden en kras gebieden, alsmede de snelheid van de cel toont migratie, op verschillende tijdstippen.
In dit werk, met behulp van een kikker-huid AMP-derivaat, dat wil zeggen Esc(1-21) en haar Diastereomeer Esc(1-21) - 1 c13en een bronchiale cellijn uitdrukken van de functionele CF transmembraan huidgeleiding regulator (CFTR)14,15, een voorbeeld van peptide-geïnduceerde cel migratie in vergelijking met onbehandelde (controlemonsters) wordt verstrekt. Merk op dat het epitheel van de luchtwegen en CFTR een cruciale rol spelen bij het handhaven van de longfunctie en wond reparatie16. Bovendien, door middel van selectieve inhibitors (bijvoorbeeld AG1478),17 van de epidermale groeifactor receptor (EGFR), bewijs dat migratie van bronchiale cellen geïnduceerd door de bovengenoemde peptiden activering van EGFR12impliceert, 18 wordt gemeld.
Kortom is het doel van deze procedure om te laten zien hoe het gebruik van dergelijke siliconen cultuur inzetstukken vertegenwoordigt een snelle en gemakkelijk toegankelijke assay nauwkeurig bepalen migratie van Adherente cellen (bijvoorbeeld bronchiale epitheliale cellen) en de moleculaire mechanismen waarmee dergelijke gebeurtenissen worden bestuurd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. cel voorbereiding
- Zaad van 2.5x106 cellen in 10 mL van Minimum essentiële Medium (MEM) aangevuld met 2 mM glutamine (MEMg), vermeerderd met 10% foetale runderserum (FBS), antibiotica (0,1 mg/mL penicilline en streptomycine) en puromycin (0,5 µg/mL voor selectie en onderhoud van de cel regel) in een maatkolf van T75. Incubeer de erlenmeyer op 37 ° C en 5% CO2 gedurende 2 dagen. Controleer voordat u begint het experiment, de samenvloeiing van de cellen onder een omgekeerde Microscoop.
Opmerking: De cellen die worden gebruikt voor het experiment zijn vereeuwigd menselijke bronchiale epitheliale cellen getransduceerde met een lentivirale vector overdracht van resistentie tegen puromycin. Zij uiten stabiel een functionele CFTR14,15. - Zodra de cellen samenvloeiing 90-100% heeft bereikt, gecombineerd het medium van de kolf en gooi het in een afval fles onder een biologische veiligheid kabinet klasse II. Wassen van de cellen met 6 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing zonder calcium en magnesium (CMF-PBS). Zachtjes de kolf handmatig rock en gooi CMF-PBS.
Opmerking: Wees voorzichtig niet aan te raken de enkelgelaagde van de cel met het pipet. - Voeg 10 mL van CMF-PBS en Incubeer de erlenmeyer op 37 ° C en 5% CO2 voor 10 min.
- Gecombineerd CMF-PBS en verwerpen. Voeg vervolgens 2 mL trypsine/EDTA aan de maatkolf.
- Zachtjes rock de kolf, waardoor de oplossing volledig jas van de cellen, en Incubeer de erlenmeyer op 37 ° C en 5% CO2 voor 10 minuten totdat de cellen zichtbaar onder een Microscoop zijn vrijstaand.
Opmerking: Aan het eind van de incubatietijd, de cellen moeten verschijnen afgeronde en niet verbonden aan het plastic oppervlak. Als de cellen niet goed vrijstaande, kan handmatige agitatie nodig zijn. - Voeg vervolgens 10 mL MEMg plus 10% FBS inactivering van trypsine en de cellen verzamelen door het wassen van de onderkant van de kolf. Breng het volume in een buis conisch 50 mL.
- De buis gedurende 5 minuten bij 80 x gcentrifugeren.
- Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de cellen in 6 mL MEMg vermeerderd met 10% FBS. Pipetteer herhaaldelijk te breken van eventuele klontjes.
- Neem 10 µL celsuspensie met een micropipet en het volume onder het glas van de cover eerder zetten over een Burker of Neubauer kamer injecteren.
- Het aantal cellen tellen
2. de cel zaaien in de cultuur wordt ingevoegd
- In elk putje van de plaat van een 12-well, overdracht van de cultuur invoegen met een steriel pincet (Figuur 1). Gebruik pincet indrukken langs de randen van inzetstukken om te corrigeren op het oppervlak van de plaat.
Opmerking: Inserts hebben een kleverige onderkant waarmee hechting.
Figuur 1 : Schematische weergave van de siliconen cultuur inserts, goed gestoken putjes van de plaat van een 12-well. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
- Goed verdunnen de celsuspensie in MEMg vermeerderd met 10% FBS. Vul elk compartiment van de insert met 70 µL celsuspensie (ongeveer 3.5x104 cellen/kamer).
Opmerking: De dichtheid van de cellen in elk compartiment toegepast is afhankelijk van het type van cellen. Het is aanbevolen om gebruik van een celdichtheid die leidt tot het voltooien van de samenvloeiing binnen de 24u. - Controleer of de cellen niet van de compartimenten invoegen lekken en Incubeer de plaat van de 12-well gedurende 24 uur bij 37 ° C en 5% CO2onder de Microscoop.
3. pseudo-wond genezing Assay
- Na incubatie, visualiseer de cellen onder de omgekeerde Microscoop om te verifiëren dat confluente cel monolayers zijn gevormd.
- Resuspendeer de test verbindingen (bijvoorbeeld versterkers) in 1 mL MEMg.
Opmerking: Maak verse versterkers verdunningen vanaf de stockoplossing opgeslagen bij-20 ° C. - Verwijder voorzichtig de inserts door steriel pincet. Wees voorzichtig niet te breken de cel monolayers. Overdracht van de inserts op absorberend papier.
Opmerking: Als u wilt opnieuw gebruiken de zelfde inserts, steriliseren hen in 70% ethanol voor ten minste 3 uur. Het is aanbevolen om ze weg te gooien na afloop. - Niet-aanhanger cellen verwijderen, voeg 1 mL MEMg per goed met behulp van een micropipet. Sluit de plaat en zachtjes rock.
Opmerking: Voeg geen medium direct bovenop cel monolayers om hun onderbrekingen te voorkomen. - Het medium gecombineerd en MEMg 1 mL per putje te vervangen. Sluit de plaat en visualiseren van de cel-vrije lacunes (gemaakt door de inserts) onder de omgekeerde Microscoop op 4 X vergroting, uitgerust met een video-camera. Verwerven van beelden op moment nul (T0) en opslaan in een indeling .jpg.
- Verwijder het medium van de putten, was ze met 1 mL PBS en verwerp het.
- Voeg de verbindingen van de test (voorbereid op een punt 3.2) toe aan de putjes. Voor onbehandelde controlemonsters, voeg 1 mL MEMg. Incubeer de plaat bij 37 ° C en 5% CO2.
- Na 15, 20 en 24 h behandeling, observeren van de migratie van de cel onder de Microscoop op 4 X vergroting en verwerven van beelden.
Opmerking: Tijdens deze stap proberen te vangen van beelden in de zelfde gebieden wat betreft T0. De keuze van tijdsintervallen waartegen beelden worden vastgelegd, is afhankelijk van de snelheid van de cel migratie. - Gecombineerd om te bestuderen van het effect van sommige selectieve remmers, dat wil zeggen AG1478, op cel migratie, het medium van elk compartiment invoegen voordat u verwijdert inzetstukken.
- Wassen van elk compartiment met verse MEMg en vul het met 70 µL van MEMg aangevuld met AG1478.
- Na 30 min van incubatie bij 37 ° C en 5% CO2, gaat u verder zoals beschreven in punt 3.3.
Opmerking: Tijdens het wassen stap en voorbehandeling van cel monolayers met de specifieke remmers, wees voorzichtig niet te verwijderen van de inserts.
4. de beeldanalyse
- Na voltooiing van het experiment, selecteer beelden van de meest representatieve monsters van de verschillende experimentele groepen en maken een zipbestand met enkele beelden bij T0, T15, T20 en T24 h.
Opmerking: Enkele beelden worden op de geselecteerde tijdsintervallen voor alle monsters genomen. Run triplicates voor elk experiment, die ten minste driemaal wordt herhaald. Aan het eind, voor alle experimentele groepen, een minimum van 3 beelden ("a", "b", "c", enz., die voortvloeien uit elke onafhankelijke experiment) op elk tijdstip worden geanalyseerd. - Upload het zip-bestand naar de beeld-analysesoftware waarmee automatisch per e-mail een samenvatting werkbladbestand dat de experimentele gegevens van cel bedekte en kras gebieden (als percentage) op de geselecteerde tijd punten bevat.
Opmerking: De erkenning van de voorkant motorkap en de gap omgeving is grotendeels gebaseerd op de rand detectiemethode (gericht op het identificeren van punten waartegen de helderheid van de afbeelding scherp verandert). - Opslaan van de gegevens en het verzamelen van hen. Normaliseren alle gegevens met betrekking tot de gemiddelde waarde op moment nul. Berekening van de gemiddelde waarde van de genormaliseerde gegevens van alle replicatieonderzoeken bij elk punt van de tijd en de relatieve standaardafwijking (SEM). Met behulp van twee-weg variantieanalyse (ANOVA), statistische analyses uitvoeren met een goede statistieken software. Verschillen tussen groepen peptide-behandelde en controlegroepen op verschillende tijdstippen worden beschouwd als statistisch significant voor een p< 0.05.
- De verkregen gegevens uitzetten in een grafiek als een histogram, die het percentage van cel bedekte gebied van alle monster groepen ten opzichte van de geselecteerde tijdsintervallen toont.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Dit protocol werd gebruikt voor het bepalen van de wond helende effect van Esc(1-21) en Esc(1-21) - 1 c in termen van cel migratie activiteit geïnduceerd op bronchiale epitheliale cellen uiten van de functionele CFTR. In deze test, werden de cultuur inzetstukken in putjes van de plaat van een 12-well geplaatst, en elk compartiment was bezaaid met 35.000 cellen in MEMg aangevuld met 10% FBS. De cellen bereikt volledige samenvloeiing binnen 24 h. daarna, een kloof van 500 micrometer is gege...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Cel migratie is een essentieel proces in vele fysiologische en pathologische evenementen waaronder wondgenezing, embryonale ontwikkeling en uitzaaiing van de kanker. De basisprocedure cel migratie in vitro te studeren omvat: (i) de oprichting van een cel enkelgelaagde, (ii) de productie van een pseudo-wond in de confluente laag van cellen, (iii) het vastleggen van beelden op verschillende tijdstippen tot wond sluiting is bereikt , en (iv) de analyse van de reeks van de afbeeldingen om de snelheid van de migratie...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen
Dankbetuigingen
Dit werk werd gesteund door financiële middelen van de Sapienza universiteit in Rome en de Italiaanse Cystic Fibrosis Research Foundation (Project FFC #11/2014 aangenomen door FFC delegaties van Siena, Sondrio Valchiavenna, Cerea Il Sorriso di Jenny en Pavia). Onderdeel van dit werk werd ook ondersteund door FILAS Grant Prot. FILAS-RU-2014-1020.
Wij zijn dankbaar aan Dr Loretta Ferrera (U.O.C. Genetics Medica, Istituto Giannina Gaslini, Genova, Italië) voor het verstrekken van de bronchiale epitheliale cellen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Minimum essential medium (MEM) | Euroclone | ECB2071L | Verwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik |
| Glutamine | Euroclone | ECB3000D | |
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS) | Euroclone | ECS0180DH | |
| Penicilline en Streptomycine | Euroclone | ECB3001D | |
| Puromycine | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| Trypsin/EDTA 1X in PBS | Euroclone | ECB3052D | Verwarmen op kamertemperatuur voor gebruik |
| DPBS zonder calcium en magnesium (CMF-PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| DPBS met calcium en magnesium (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Ibidi Culture-Insert 2 well | Ibidi | 80209 | |
| Wimasis Image Analysis | Ibidi | 30002 | |
| PRISM software | GraphPad | versie 6.0 |
Referenties
- Enyedi, B., Niethammer, P. Mechanisms of epithelial wound detection. Trends Cell Biol. 25, 398-407 (2015).
- Kujath, P., Kujath, C. Complicated skin, skin structure and soft tissue infections - are we threatened by multi-resistant pathogens? Eur J Med Res. 15, 544-553 (2010).
- Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway. Pulm Pharmacol Ther. 21, 595-599 (2008).
- Chiappini, E., Taccetti, G., de Martino, M. Bacterial lung infections in cystic fibrosis patients: an update. Pediatr Infect Dis J. 33, 653-654 (2014).
- Mangoni, M. L., McDermott, A. M., Zasloff, M. Antimicrobial peptides and wound healing: biological and therapeutic considerations. Exp Dermatol. 25, 167-173 (2016).
- Lau, K., Paus, R., Tiede, S., Day, P., Bayat, A. Exploring the role of stem cells in cutaneous wound healing. Exp Dermatol. 18, 921-933 (2009).
- Hu, M. S., et al. Tissue engineering and regenerative repair in wound healing. Ann Biomed Eng. 42, 1494-1507 (2014).
- Ramot, Y., et al. The role of PPARgamma-mediated signalling in skin biology and pathology: new targets and opportunities for clinical dermatology. Exp Dermatol. 24, 245-251 (2015).
- Lai, Y., Gallo, R. L. AMPed up immunity: how antimicrobial peptides have multiple roles in immune defense. Trends Immunol. 30, 131-141 (2009).
- Zasloff, M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature. 415, 389-395 (2002).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3, 107-124 (2011).
- Di Grazia, A., et al. The frog skin-derived antimicrobial peptide esculentin-1a(1-21)NH2 promotes the migration of human HaCaT keratinocytes in an EGF receptor-dependent manner: a novel promoter of human skin wound healing? PLoS One. 10, e0128663(2015).
- Di Grazia, A., et al. D-Amino acids incorporation in the frog skin-derived peptide esculentin-1a(1-21)NH2 is beneficial for its multiple functions. Amino Acids. 47, 2505-2519 (2015).
- Cappiello, F., et al. Esculentin-1a-derived peptides promote clearance of Pseudomonas aeruginosa internalized in bronchial cells of cystic fibrosis patients and lung cell migration: biochemical properties and a plausible mode of action. Antimicrob Agents Chemother. 60, 7252-7262 (2016).
- Bebok, Z., et al. Failure of cAMP agonists to activate rescued deltaF508 CFTR in CFBE41o- airway epithelial monolayers. J Physiol. 569, 601-615 (2005).
- Trinh, N. T., et al. Improvement of defective cystic fibrosis airway epithelial wound repair after CFTR rescue. Eur Respir J. 40, 1390-1400 (2012).
- Gan, H. K., et al. The epidermal growth factor receptor (EGFR) tyrosine kinase inhibitor AG1478 increases the formation of inactive untethered EGFR dimers. Implications for combination therapy with monoclonal antibody 806. J Biol Chem. 282, 2840-2850 (2007).
- Tokumaru, S., et al. Induction of keratinocyte migration via transactivation of the epidermal growth factor receptor by the antimicrobial peptide LL-37. J Immunol. 175, 4662-4668 (2005).
- Tjabringa, G. S., et al. The antimicrobial peptide LL-37 activates innate immunity at the airway epithelial surface by transactivation of the epidermal growth factor receptor. J Immunol. 171, 6690-6696 (2003).
- Di Grazia, A., Luca, V., Segev-Zarko, L. A., Shai, Y., Mangoni, M. L. Temporins A and B stimulate migration of HaCaT keratinocytes and kill intracellular Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 58, 2520-2527 (2014).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
