Method Article

Robuuste DNA isolatie en High-throughput Sequencing bibliotheek bouw voor Herbarium Specimens

DOI:

10.3791/56837

⸱

March 8th, 2018

 ,  , 
1Donald Danforth Plant Science Center, 2Department of Biological Sciences, The University of Alabama

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel demonstreert een gedetailleerd protocol voor DNA isolatie en hoge gegevensdoorvoer sequencing bibliotheek bouw van herbarium materiaal met inbegrip van de redding van uitzonderlijk slechte kwaliteit DNA.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Herbaria zijn een onschatbare bron van plantaardig materiaal dat kan worden gebruikt in een verscheidenheid van biologische studies. Het gebruik van herbarium specimens wordt geassocieerd met een aantal uitdagingen met inbegrip van monster behoud kwaliteit gedegradeerde DNA en destructieve bemonstering van zeldzame exemplaren. Om effectiever gebruiken herbarium materiaal grote sequencing projecten, een betrouwbare en schaalbare methode van DNA isolatie en bibliotheek voorbereiding nodig. Deze paper toont een robuuste, begin-to-end protocol voor DNA isolatie en hoge gegevensdoorvoer bibliotheek constructie van herbarium specimens die geen wijziging voor afzonderlijke monsters vereist. Dit protocol is op maat gemaakt voor lage kwaliteit gedroogde plant materiaal en neemt profiteren van bestaande methoden door het optimaliseren van weefsel slijpen, bibliotheek maat keuze wijzigen en invoering van een optionele reamplification stap voor lage opbrengst bibliotheken. Reamplification van lage opbrengst DNA bibliotheken kan redden monsters afgeleid van onvervangbare en potentieel waardevolle herbarium specimens, ontkenning van de noodzaak voor extra destructieve bemonstering en zonder merkbare sequencing bias voor common fylogenetische toepassingen. Het protocol is getest op honderden soorten gras, maar wordt verwacht om flexibel te zijn voor gebruik in andere geslachten van de plant na verificatie. Dit protocol kan worden beperkt door de uiterst aangetaste DNA, waar fragmenten niet bestaan in het bereik van de gewenste grootte, en secundaire metabolieten in sommige plantaardige materiaal aanwezig die een remmende werking schoon DNA isolatie. Globaal, is dit protocol introduceert een snelle en uitgebreide methode waarmee voor DNA isolatie en voorbereiding van de bibliotheek voor 24 samples in minder dan 13 h, met slechts 8 h van actieve hands-on tijd met minimale wijzigingen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Herbarium collecties zijn een potentieel waardevolle bron van zowel de soorten en de genomische diversiteit voor studies inclusief fylogenie1,2,3, populatie genetica4,5, instandhouding biologie6, invasieve soorten biologie7en trek evolutie8. De mogelijkheid om het verkrijgen van een rijke diversiteit aan soorten, populaties, geografische locaties en tijdstippen hoogtepunten de "schatkamer"9 thats het herbarium. Historisch, heeft de aangetaste aard van herbarium afkomstige DNA PCR-gebaseerde projecten, vaak indelings onderzoekers aan het gebruik van alleen markeringen gevonden in hoge exemplaar, zoals regio's van de chloroplast genoom- of de interne getranscribeerde spacer (ITS) voor de ribosomal belemmerd RNA. Kwaliteit van specimens en DNA variëren uitgebreid op basis van methoden van behoud9,10, met double-stranded pauzes en versnippering van warmte in het droogproces wordt de meest voorkomende vormen van schade, het creëren van gebruikt de zogenaamde 90% DNA lock-up die PCR gebaseerde studies11heeft bezwaard. Afgezien van fragmentatie is het tweede meest voorkomende probleem in herbarium genomics besmetting, zoals die afkomstig is van endophytic schimmels13 of schimmels postmortale verworven na collectie maar vóór de montage in het herbarium12, hoewel Dit probleem kan worden opgelost bioinformatically gegeven de juiste schimmel database (zie hieronder). Een derde, en minder vaak, probleem is wijziging van de volgorde via cytosine (C/G→T/A) deamination14, hoewel het wordt geschat op lage (~ 0,03%) in herbarium specimens11. Met de komst van high-throughput sequencing (HTS), kan het probleem van de versnippering worden overwonnen met korte leest en sequencing diepte12,15, waardoor genomic-niveau data-acquisitie van talrijke exemplaren met lage kwaliteit DNA, en soms zelfs het hele genoom sequencing15toelaat.

Herbarium monsters worden steeds vaker gebruikt en zijn een grotere component fylogenetische projecten16. Een uitdaging van dit moment herbarium exemplaren te gebruiken voor HTS is consequent voldoende dubbele gestrande DNA, een noodzakelijke voorwaarde voor sequencing protocollen, verkrijgen van talrijke soorten in een tijdig, zonder te optimaliseren van methoden voor het individu exemplaren. In deze paper wordt een protocol voor DNA-extractie en bibliotheek voorbereiding van herbarium specimens die profiteert van bestaande methoden en hen te voorzien van snelle en repliceerbaar resultaten wijzigt aangetoond. Deze methode zorgt voor volledige verwerking vanaf specimen aan een bibliotheek voor 24 samples in 13 h, met 8 h hands-on tijd, of 16 h, met 9 h hands-on tijd, wanneer de optionele reamplification stap nodig is. Gelijktijdige verwerking van meer monsters is haalbaar, al is de beperkende factor centrifuge capaciteit en technische vaardigheid. Het protocol is ontworpen om alleen typische laboratoriumapparatuur (thermocycler centrifuge en magnetische stands) in plaats van gespecialiseerde apparatuur, zoals een vernevelaar of ultrasoonapparaat, voor het scheren van DNA vereisen.

DNA kwaliteit, fragment grootte en het aantal beperken factoren voor het gebruik van herbarium specimens in high-throughput sequencing experimenten. Andere methoden voor het isoleren van herbarium DNA en het maken van high-throughput sequencing bibliotheken hebben aangetoond dat het nut van het gebruik van zo weinig als 10 ng DNA16; maar ze vereisen het optimale aantal PCR experimenteel te bepalen cycli vereist voor de voorbereiding van de bibliotheek. Dit wordt onpraktisch als omgaan met buitengewoon kleine hoeveelheden van levensvatbare dubbele strandde DNA (dsDNA), zoals sommige herbarium exemplaren alleen voldoende DNA voor een preparaat één bibliotheek produceren. De methode die hier gepresenteerd maakt gebruik van een enkel getal van cycli ongeacht monster kwaliteit, dus geen DNA is verloren in bibliotheek optimization stappen. In plaats daarvan, is een stap in de reamplification wordt aangeroepen wanneer bibliotheken niet voldoen aan de minimale bedragen die nodig zijn voor het rangschikken. Vele herbarium monsters zijn zeldzaam en weinig materiaal, waardoor het moeilijk te rechtvaardigen destructieve bemonstering in veel gevallen bezitten. Om dit tegen te, kunt het gepresenteerde protocol dsDNA ingang maten van minder dan 1,25 ng in het voorbereidingsproces van de bibliotheek, uitbreiding van het toepassingsgebied van levensvatbare monsters voor high-throughput sequencing en het minimaliseren van de noodzaak voor destructieve bemonstering van specimens.

Het volgende protocol is geoptimaliseerd voor grassen en getest op honderden verschillende soorten van herbarium monsters, hoewel we verwachten dat het protocol kan worden toegepast op vele andere plantengroepen. Het bevat een optionele herstelstap, die kan worden gebruikt voor het opslaan van lage kwaliteit en/of zeldzame exemplaren. Gebaseerd op meer dan tweehonderd herbarium exemplaren getest, werkt dit protocol op monsters met lage weefsel input en kwaliteit, waardoor het behoud van zeldzame specimens via minimale destructieve bemonstering. Hier is het aangetoond dat dit protocol kan bieden hoge kwaliteit Bibliotheken, die kunnen worden sequenced voor phylogenomics gebaseerde projecten.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. voorafgaand aan de Start

  1. Maken van verse cetyl trimethylammoniumformiaat bromide (CTAB) buffer17 door toevoegen van 20 g CTAB, 10 g van polyvinylpyrrolidon (PVP) 40, 100.0 mL 1 M Tris pH 8.0, 40 mL 0,5 M ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) pH 8,0 280,0 mL van 5 M NaCl en 400,0 milliliters reagens water samen, en het totale volume aan 1 L met behulp van reagens-grade water brengen. Breng de pH op 8.0.
    Opmerking: Extra reagentia kunnen worden toegevoegd aan CTAB afhankelijk van secundaire verbindingen in afzonderlijke taxa. Zie Allen et al. 18 voor een grondige lijst van additieve reagentia.
  2. Voeg 10 µL van β-mercaptoethanol per 5 mL CTAB buffer.
    Opmerking: dit kan worden bereid in batches van 50 mL en 3-4 weken bij kamertemperatuur bewaard.
    1. Verwarm de CTAB oplossing in een waterbad van 65 ° C.
  3. Chill mortieren en pestles in-20 ° C gedurende ten minste 20 minuten.
  4. Label 4 sets van 2 x n 2 mL buizen (waar n = het aantal monsters). 1 set van de gelabelde buizen op ijs gezet.
  5. Chill isopropanol en op ijs of in een vriezer van-20 ° C.
  6. Vaste fase omkeerbare immobilisatie (SPRI) kralen (Zie Tabel van materialen) te verwijderen uit de koelkast en laten equilibreer tot kamertemperatuur (minstens 30 min).
  7. 80% ethanol te bereiden.
  8. Selecteer herbarium exemplaren voor extractie en ~ 1 cm2of 10 mg, weefsel per model, bij voorkeur blad materiaal op te halen.

2. DNA-extractie

  1. Slijpen ~ 1 cm,2 van vooraf geselecteerde herbarium weefsel met behulp van prechilled mortieren en pestles. Vloeibare stikstof en 30-50 mg gesteriliseerd zand toevoegen. Grind totdat weefsel in fijn poeder verandert.
    Opmerking: 10 mg of meer weefsel is wenselijk, maar minder werkte ook in sommige gevallen. Zodra de vloeibare stikstof verdampt, voeg meer tot weefsel volledig wordt gemalen. Een andere gemeenschappelijke methode voor het verstoren van cellen en weefsels is het gebruik van een kraal-beater. Echter bleek deze methode niet werken goed voor de specimens gebruikt in deze experimenten.
  2. Breng het bevroren poeder in twee 2 mL buizen (niet meer dan de helft van de buis van volume toevoegen). Voeg 600 µL van warme CTAB oplossing aan elke buis en mengeling van de buizen grondig door inversie en vortexing.
    Opmerking: Aangezien de kwantiteit en kwaliteit van materiaal van het herbarium is vaak laag, uitvoeren van DNA isolatie in twee herhalingen helpt bij het verkrijgen van hogere opbrengsten.
  3. Incubeer de monsters in een waterbad van 65 ° C gedurende 1-1,5 uur, vortexing elke 15 min.
  4. Centrifugeer steekproeven bij 10.000 x g gedurende 5 min. overbrengen het supernatant in een verse set van gelabelde buizen (~ 500 µL). Gooi de pellet met behulp van een standaard niet-gechloreerde verwijdering-procedure.
  5. Voeg 4 µL van RNase-A (10 mg/mL) aan elke buis en mengeling door omkeren of pipetteren. Incubeer de monsters bij 37 ° C in een warmte blok of water bad gedurende 15 minuten.
  6. Voeg een gelijk volume (~ 500 µL) uit een mengsel van 25:24:1 fenol: chloroform: isoamyl alcohol zodra de buizen kamer temperatuur heeft bereikt. Meng door omhoog en omlaag pipetteren en/of met inversie. Centrifuge die de buizen bij 12.000 x g gedurende 15 min. de waterige laag (bovenste laag) overbrengen in een nieuwe reeks van label buizen (~ 400 µL). Gooi de organische laag in een gechloreerd afval container.
    Opmerking: Stap 2.6 kan worden herhaald als grote hoeveelheden van secundaire verbindingen worden verwacht in plantmateriaal.
  7. Voeg een gelijk volume (~ 400 µL) uit een mengsel van chloroform: isoamyl 24:1 alcohol. Meng door omhoog en omlaag pipetteren en/of met inversie. Centrifugeer de buizen bij 12.000 x g gedurende 15 min. overdracht de waterige laag (bovenste laag) een nieuwe reeks van prechilled, gelabelde buizen (~ 300 µL). Gooi de organische laag in een gechloreerd afval container.
  8. Voeg een gelijk volume (~ 300 µL) van prechilled isopropanol en 12 µL van 2,5 M Natriumacetaat aan elke buis. Incubeer monsters bij-20 ° C gedurende 30-60 min.
    Opmerking: De incubatie tijden kunnen worden uitgebreid (tot overnachting incubatie), maar DNA kwaliteit zal verminderen, hoe langer de monsters uit te broeden.
  9. Neem de monsters uit de vriezer en centrifuge de buizen bij 12.000 x g gedurende 15 min. verwijderen en verwijder het supernatant voorzichtig zonder de pellet te verstoren. De pellet wassen door ophanging met verse 70% ethanol (ongeveer 300-500 µL). Samenvoegen voor elk verdubbelde monster, de twee afzonderlijke pellets in een met bijbehorende ethanol.
    Opmerking: Monsters moeten worden geconsolideerd in één buis met behulp van ethanol eerst en dan verder. Het is niet nodig om elk monster met ethanol apart wassen.
  10. Centrifugeer de buizen bij 12.000 x g gedurende 10 min. verwijderen en verwijder het supernatant voorzichtig zonder de pellet te verstoren. Lucht drogen de pellets.
    Opmerking: Monsters kunnen worden gedroogd sneller met een droge warmte blok (niet hoger dan 65 ° C). Zorg ervoor dat de monsters niet overdreven doen drogen, als dit de uiteindelijke opbrengst van DNA kan verminderen.
  11. De geïsoleerde DNA in 50 µL voor 1 x TE schorsen. Bewaren in de vriezer van-20 ° C voor lange termijn opslag of 4 ° C voor gebruik in de volgende week.

3. kwaliteitscontrole (QC)

  1. Voer een agarose gel voor kwaliteitscontrole.
    1. Bereiden van een buffer van de Tris/boraat/EDTA (FSME) 1 x door het toevoegen van 54 g Tris base, 27.5 g boorzuur en 3,75 g EDTA Dinatrium zout, het totale volume om 5 L met behulp van reagens rang water.
    2. Bereiden van een 1% agarose gel door toevoeging van 1 g agarose tot 100 mL voor 1 x TBE. Magnetron de oplossing totdat geen agarose zichtbaar is. Toevoegen van 0,01% nucleïnezuur gel vlek (Zie Tabel van materialen). Laat de kolf afkoelen totdat het warm aanvoelt. Meng goed door roeren. Agarose giet in een gel-lade en laat het zitten totdat het stolt.
    3. Mix 3 µL van monster, 2 µL van reagens rang water en 1 µL van 6 x laden kleurstof. Laden van de monsters in de gel-matrix, vaststellend van hun orde.
    4. De voorbeelden voor 60 – 70 min uitvoeren bij 60 – 70 V. beeld, wordt de gel onder UV-licht met de juiste belichting en focus.
      Opmerking: Aanwezigheid van een duidelijk ultrahoog moleculair gewicht band is een teken van hoge kwaliteit DNA, terwijl uitstrijkjes meestal de aantasting van het DNA geven. De meeste exemplaren van het herbarium zijn gedegradeerd.
  2. Een analyse van de kwantificering dsDNA uitvoeren (zie tabel van materialen) om te bepalen van de hoeveelheid dubbele strandde DNA.
    1. Gebruik 2 µL van monster voor analyse.
      Opmerking: Verdunningen niet nodig zijn voor de analyse van de kwantificering van materiaal van het herbarium aangezien zij neigen te worden in minimale hoeveelheden. Succesvolle bibliotheken zijn van zo weinig zoals 1.26 ng totale dsDNA van deze stap vervaardigd.

4. DNA schuintrekken

Nota: Dit is een geoptimaliseerde versie van een commerciële double-stranded fragmentase protocol (Zie Tabel van materialen).

  1. Plaats dsDNA fragmentatie enzym op ijs na vortexing voor 3 s.
  2. In een steriele 0,2 mL polymerase kettingreactie (PCR) buis geïsoleerd mix 1 – 16 µL DNA met 2 µL van de begeleidende fragmentatie reactie buffer. Zodat het totale volume 18 µL door nuclease gratis water toe te voegen. Voeg 2 µL van dsDNA fragmentatie enzym en vortex het mengsel voor 3 s.
    Opmerking: De hoeveelheid DNA die nodig zijn varieert afhankelijk van DNA-concentratie (aim voor 200 ng totaal in de buis).
  3. Incubeer de monsters bij 37 ° C gedurende 8,5 minuten. Voeg vervolgens 5 µL van het EDTA 0.5 M aan de buizen.
    Opmerking: Deze stap moet worden uitgevoerd zodra de incubatietijd is over het beëindigen van de reactie en voorkomen dat DNA-monsters te scheren.

5. kraal Clean-up

  1. Meng de SPRI kralen door vortexing.
  2. Het totale volume van de sheared DNA brengen met 50 µL door 25 µL van nuclease gratis water toe te voegen. Toevoegen 45 µL van kamertemperatuur SPRI parels (90% volume) aan 50 µL sheared DNA en meng grondig door pipetteren omhoog en omlaag.
    Opmerking: Toevoegen van parels op 90% van de totale monstervolume wordt gedaan om de kleinste van de fragmenten van DNA, vaak onder 200 basenparen verwijderen.
  3. Laat de monsters Incubeer voor 5 min. de buizen op een magnetische plaat zet en laat ze zitten voor 5 min. zorgvuldig verwijderen en verwijder het supernatant.
    Opmerking: Wees voorzichtig niet te verstoren, de parels, omdat zij de gewenste doelstellingen van DNA bevatten.
  4. 200 µL van verse 80% ethanol toevoegen aan de buizen terwijl op de magnetische stand. Incubeer bij kamertemperatuur voor 30 s en vervolgens zorgvuldig te verwijderen en verwijder het supernatant. Herhaal deze stap eenmaal. Lucht drogen de kralen voor 5 minuten, terwijl de buis is op de magnetische stand met het deksel open.
    Opmerking: Vermijd overdreven drogen de kralen. Dit kan resulteren in lagere herstel van DNA.
  5. Verwijder de buizen van de magneet. Het DNA van de kralen in 55 µL van 0.1 x TE elueren en meng door pipetteren omhoog en omlaag. Incubeer bij kamertemperatuur voor 5 min. plaats buizen op de magnetische stand en wachten tot de oplossing om te zetten schakelt (~ 2 min).
  6. Trek 52 µL van het supernatans. Een analyse van de kwantificering van DNA worden uitgevoerd op de monsters te controleren van het herstel en de beginconcentratie dat in bibliotheek prep gaat.
    Opmerking: Bibliotheken hebben geboekt met totale dsDNA geschat op minder dan 1,25 ng, maar in elk geval reamplification was vereist.

6. bibliotheek voorbereiding

Nota: Dit is een gewijzigde versie van een commercieel beschikbare bibliotheek kit (Zie Tabel van materialen protocol).

  1. Einde Prep
    1. 3 µL van endonuclease en fosfaat residuvijvers enzymen en 7 µL van de begeleidende reactie buffer tot 50 µL van gereinigd, sheared DNA toevoegen. Meng door pipetteren omhoog en omlaag. Draai de buizen om te bellen te verwijderen.
      Opmerking: Het totale volume moet 60 µL.
    2. Leg de monsters in een thermocycler met het volgende programma: 30 minuten bij 20 ° C, 30 min bij 65 ° C, houd vervolgens bij 4 ° C.
      Opmerking: Verwarmde deksel is ingesteld op ≥75 ° C
  2. Adapter afbinding
    1. Verdun de adapter 25 – 50 vouwen (werken adapter concentratie van 0,6 – 0,3 µM). 30 µL van afbinding master mix, 1 µL van afbinding enhancer en 2.5 µL van adapter voor high-throughput korte Lees sequencing toevoegen aan de buizen.
      Opmerking: Het totale volume moet 93.5 µL.
    2. Meng door pipetteren omhoog en omlaag. Draai de buizen om te bellen te verwijderen. Incubeer de buizen bij 20 ° C gedurende 15 minuten.
    3. Voeg 3 µL van commerciële mengsel van uracil DNA glycosylase (UDG) en het DNA glycosylase-lyase Endonuclease VIII (Zie Tabel van materialen) de buizen. Zorg ervoor dat het totale volume 96,5 µL. Meng en Incubeer bij 37 ° C gedurende 15 minuten met behulp van een thermocycler.
      Opmerking: De klep moet worden ingesteld op ≥47 ° C. De oorspronkelijke versie van het commerciële protocol heeft maat keuze na de adapter afbinding stap, gevolgd door een kraal opruimen als de laatste stap. Dit protocol, die hogere opbrengsten bereikt, schakelt de volgorde van deze stappen en maat keuze als laatste stap implementeert.
  3. Cleanup enzymen en kleine fragmenten verwijderen
    1. Meng magnetische kralen door vortexing.
    2. Voeg 78 µL van SPRI magnetische kralen (80 volumeprocenten) en meng door pipetteren omhoog en omlaag.
      Opmerking: Toevoegen van parels op 80% van de totale monstervolume wordt gedaan om het verwijderen van de kleinste DNA-fragmenten, die vaak korter is dan 250 basenparen. De strengere verwijdering van kleine fragmenten van DNA is (i) het verwijderen van overtollige adapters en (ii) het benadrukken van versterking van grotere fragmenten in de volgende stappen uit.
    3. Laat die de monsters Incubeer gedurende 5 min. Zet de buizen op een magnetische plaat voor 5 min. zorgvuldig verwijderen en verwijder het supernatant waarin het DNA buiten het bereik van de gewenste grootte.
      Opmerking: Wees voorzichtig niet te verstoren, de kralen die de gewenste doelstellingen van DNA bevatten.
    4. 200 µL van verse 80% ethanol toevoegen aan de buizen terwijl op de magnetische stand. Incubeer bij kamertemperatuur voor 30 s en vervolgens zorgvuldig te verwijderen en verwijder het supernatant. Herhaal deze stap eenmaal. Lucht drogen de kralen voor 5 minuten, terwijl de buis is op de magnetische stand met deksel open.
      Opmerking: Voorkomen over het drogen van de kralen. Dit kan resulteren in lagere herstel van DNA.
    5. Verwijder de buizen van de magneet. Elueer de DNA-doelstelling van de kralen door 17 µL van 0.1 x TE toe te voegen en meng door pipetteren omhoog en omlaag.
    6. Incubeer bij kamertemperatuur voor 5 min. plaats buizen op de magnetische stand en wachten tot de oplossing om te zetten schakelt (~ 2 min).
    7. Trek 15 µL van het supernatans.
  4. PCR versterking
    1. 25 µL van high-fidelity PCR master mix, 5 µL van korte Lees high-throughput sequencing bibliotheek prep 5' primer en 5 µL van high-throughput korte Lees sequencing bibliotheek prep 3' primer, toevoegen aan 15 µL van het schoongemaakte adapter-afgebonden DNA.
      Opmerking: Totale volume moet 50 µL.
    2. Meng goed door vortexing. Leg de monsters in een thermocycler met behulp van de instellingen die worden gevonden in tabel 1: Thermocycler amplificatie instelling.
      Opmerking: Een groot aantal cycli nodig is als gevolg van de lage hoeveelheid input DNA.
Cyclus stapTemp.TijdCycli
Eerste denaturatie98 ° C30 s1
Denaturatie98 ° C10 s12
Gloeien/extensie65 ° C75 s12
Final Extension65 ° C5 min1
Houd4 ° C

Tabel 1: PCR protocol denaturatie, gloeien en uitbreiding tijden en temperaturen. Temperatuur en de tijden werden geoptimaliseerd voor de reagentia gepresenteerd in dit protocol. Als de reagentia worden gewijzigd, moeten temperaturen en tijden opnieuw worden geoptimaliseerd.

  1. Maat keuze voor de grootte van de gewenste bibliotheek
    Opmerking: Deze stap kraal verwijdert fragmenten zowel boven als onder het doelbereik.
    1. Meng SPRI kralen door vortexing.
    2. Voeg 25 µL (50% volume) van kamertemperatuur magnetische kralen en meng door pipetteren omhoog en omlaag. Laat de monsters Incubeer voor 5 min. de buizen op een magnetische plaat zet en laat ze zitten voor 5 min. zorgvuldig verwijderd en het supernatant overbrengen in een nieuwe reeks van gelabelde buizen.
      Opmerking: Dit volume kan worden aangepast op basis van de grootte van de gewenste bibliotheek. De bovendrijvende vloeistof bevat DNA-fragmenten van de gewenste grootte. In de eerste kraal incubatie, zijn de kralen bindend grotere fragmenten van de bibliotheek. Deze worden verwijderd om zich te concentreren op die in het bereik van 400-600 basenpaar. De bovendrijvende vloeistof bevat kleinere fragmenten.
    3. Toevoegen 6 µL van kamertemperatuur SPRI parels aan de bovendrijvende substantie en meng grondig door pipetteren omhoog en omlaag. Laat die de monsters Incubeer voor 5 min. de buizen op een magnetische plaat zet en laat ze zitten voor 5 minuten.
      Opmerking: Dit volume kan worden aangepast op basis van de grootte van de gewenste bibliotheek overeenkomstig stap 6.5.2.
    4. Verwijder voorzichtig en verwijder het supernatant.
      Opmerking: Wees voorzichtig niet te verstoren, de kralen die de gewenste DNA bevatten. In de tweede parel incubatie, zijn de kralen bindend voor de fragmenten die overblijft na de eerste verwijdering van de grootste DNA fragmenten. Deze set van fragmenten is meestal in het bereik van de gewenste grootte.
    5. 200 µL van verse 80% ethanol toevoegen aan de buizen terwijl op de magnetische stand. Incubeer bij kamertemperatuur voor 30 s, vervolgens zorgvuldig verwijderen en verwijder het supernatant. Herhaal deze procedure. Lucht drogen de kralen voor 5 minuten, terwijl de buis is op de magnetische stand met deksel open.
      Opmerking: Vermijd overdreven drogen de kralen. Dit kan resulteren in lagere herstel van DNA.
    6. Verwijder de buizen van de magneet. Elueer de DNA-doelstelling van de kralen in 33 µL van 0.1 x TE en meng door pipetteren omhoog en omlaag.
    7. Incubeer bij kamertemperatuur voor 5 min. plaats buizen op de magnetische stand en wachten tot de oplossing om te zetten schakelt (~ 2 min). Trek 30 µL van het supernatant en overdracht van 2 mL buizen (Zie Tabel of Materials) voor opslag.
      Opmerking: De bibliotheken kunnen worden bewaard bij-20 ˚C voor langdurige opslag.
  2. Kwaliteitscontrole
    1. Voer een test van de kwaliteitscontrole op de DNA-bibliotheken. Verwijzen naar stap 3.1 en 3.2.
      Opmerking: Voor DNA Bibliotheken, voert u de gel voor ~ 45 min op 96 V.
  3. Bibliotheek reamplification: optioneel als bibliotheek hoeveelheid niet voldoende is.
    Opmerking: Monsters met bibliotheek concentraties beneden 10 nM kan worden reamplified aan de hand van de volgende stappen. Reamplification van lage concentratie bibliotheken werkbare resultaten voor het rangschikken kan bereiken, maar reamplification kan veroorzaken een bescheiden verschuiving in basis samenstelling diversiteit, hoewel verzamelde gegevens (tabel 3) suggereren dat dit verwaarloosbaar voor bepaalde statistieken .
    1. Verdun de inleidingen van de universele reamplification 10-fold 0.1 x TE gebruiken.
    2. 25 µL van high-fidelity PCR master mix, 5 µL van verdunde universele reamplification primer 1 (AATGATACGGCGACCACCGA) en 5 µL van verdunde universele reamplification primer 2 (CAAGCAGAAGACGGCATACGA) aan 15 µL van lage concentratie bibliotheken toevoegen. Opmerking: Totale volume moet op 50 µL.
    3. Meng goed door vortexing. Leg de monsters in een thermocycler met behulp van de instellingen die worden gevonden in tabel 1: Thermocycler amplificatie instelling
      Opmerking: Het grote aantal cycli nodig is als gevolg van lage hoeveelheid input DNA.
    4. Kraal-opschonen
    5. Meng SPRI kralen door vortexing. Voeg 45 µL van kamertemperatuur SPRI parels (90% volume) en meng door pipetteren omhoog en omlaag.
    6. Laat de monsters Incubeer gedurende 5 min. Zet de buizen op een magnetische plaat voor 5 min.
    7. Verwijder voorzichtig en verwijder het supernatant waarin het ongewenste DNA.
      Opmerking: Wees voorzichtig niet te verstoren, de kralen die de gewenste doelstellingen van DNA bevatten.
    8. 200 µL van verse 80% ethanol toevoegen aan de buizen terwijl op de magnetische stand. Incubeer bij kamertemperatuur voor 30 s, en vervolgens zorgvuldig te verwijderen en verwijder het supernatant. Herhaal deze stap eenmaal.
    9. Lucht drogen de kralen voor 5 minuten, terwijl de buis is op de magnetische stand met het deksel open.
      Opmerking: Vermijd overdreven drogen de kralen. Dit kan resulteren in lagere herstel van het DNA-doel.
    10. Verwijder de buizen van de magneet. Elueer de DNA-doelstelling van de kralen in 33 µL van 0.1 x TE en meng door pipetteren omhoog en omlaag.
    11. Incubeer bij kamertemperatuur voor 5 min. plaats buizen op de magnetische stand en wachten tot de oplossing om te zetten schakelt (~ 2 min).
    12. Trek 30 µL van het supernatans. De bibliotheken kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C voor langdurige opslag.
  4. Kwaliteitscontrole
    1. Voer een test van de kwaliteitscontrole op de DNA-bibliotheken. Verwijzen naar stap 3.1 en 3.2. Voor DNA Bibliotheken, voert u de gel voor ~ 45 min op 96 V.
      Opmerking: Als een dubbele band wordt gezien in de gel, dit is waarschijnlijk een gevolg van uitputting van de primer van de reamplification stap. De bands kunnen worden verwijderd door herhalende 6,9, maar met behulp van slechts één cyclus in het programma van de PCR afgebeeld in tabel 1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA isolatie en definitieve bibliotheek opbrengst
In deze studie werd de doeltreffendheid van het protocol voor de isolatie van DNA van het herbarium en het herstel van hoge kwaliteit sequencing bibliotheken aangetoond door middel van vijftig verschillende monsters met de oudste van 1920 en de jongste vanaf 2012 (tabel 2). Voor elk monster werd ongeveer 10 mg blad weefsel gebruikt voor DNA-isolatie. Groener blad weefsel werd begunstigd, indien beschikb...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol hier gepresenteerd is een uitgebreide en robuuste methode voor DNA isolatie en het rangschikken van bibliotheek bereiding op basis van gedroogde plant exemplaren. De consistentie van de methode en de minimale behoefte te wijzigen op basis van specimen kwaliteit maken het schaalbare voor groot herbarium gebaseerde sequencing projecten. De opname van een optionele reamplification stap voor lage opbrengst bibliotheken kan de opname van lage kwaliteit, geringe hoeveelheid, zeldzame, of historisch belangrijke voo...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij hebben geen concurrerende belangen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken Taylor AuBuchon-Elder, Jordanië Teisher, en Kristina Zudock voor hulp bij bemonstering herbarium exemplaren en de Missouri Botanical Garden voor toegang tot herbarium exemplaren voor destructieve bemonstering. Dit werk was ondersteuning door een subsidie van de National Science Foundation (DEB-1457748).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Veriti Thermal CyclerApplied Biosystems445230096 well 
Gel Imaging SystemAzure Biosystemsc300
Microfuge 20 SeriesBeckman CoulterB30137
Digital Dry BathBenchmark ScientificBSH1001
Electrophoresis SystemEasyCastB2
PURELAB flex 2 (Ultra pure water)ELGA 89204-092
DNA LoBind Tube Eppendorf301080782 ml
Mini centrifugeFisher Scientific12-006-901
Vortex-Genie 2Fisher Scientific12-812
MortarFisher ScientificS02591porselein
PestleFisher ScientificS02595porselein
Centrifuge tubesFisher Scientific21-403-161
MicrowaveKenmore405.7309231
Qubit Assay TubesInvitrogenQ32856
0.2 ml Strip tube and Cap for PCRVWR20170-004
Qubit 2.0 FluorometerInvitrogenQ32866
BalanceMettler ToledoPM2000
Liquid Nitrogen Short-term StorageNalgeneF9401
Magnetic-Ring Stand ThermoFisher Scientific AM1005096 well 
Water BathVWR89032-210
Hot Plate StirrersVWR97042-754
Liquid NitrogenAirgasUN1977
1 X TE BufferAmbionAM9849pH 8.0
CTABAMRESCO0833-500G
2-MERCAPTOETHANOLAMRESCO0482-200ML
Ribonuclease AAMRESCOE866-5ML10 mg/ml oplossing
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63882
Sodium Chloridebio WORLD705744
Isopropyl Alcoholbio WORLD40970004-1
Nuclease Free waterbio WORLD42300012-2
Isoamyl AlcoholFisher ScientificA393-500
Sodium Acetate TrihydrateFisher Scientifics608-500
LE AgaroseGeneMateE-3120-500
100bp PLUS DNA LadderGold BiotechnologyD003-500
EDTA, Disodium SaltIBI ScientificIB70182
Qubit dsDNA HS Assay KitLife TechnologiesQ32854
TRISMP Biomedicals103133ultra pure
Gel Loading Dye Purple (6 X)New England BioLabsB7024S
NEBNext dsDNA FragmentaseNew England BioLabsM0348L
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina New England BioLabsE7645L
NEBNext Multiplex Oligos for IlluminaNew England BioLabsE7600SDual Index Primers Set 1
NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master MixNew England BioLabsM0543L
Mag-Bind RXNPure PlusOmega bio-tekM1386-02
GelRed 10000 XPheonix Research41003-1
Phenol solutionSIGMA Life ScienceP4557-400ml
PVP40SIGMA-AldrichPVP40-50G
ChloroformVWREM8.22265.2500
EthanolKoptecV1016200 Proof
Silica sandVWR14808-60-7
Reamplification primersIntegrated DNA Technologieszie tekst
Sequencher v.5.0.1GeneCodes

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Savolainen, V., Cuénoud, P., Spichiger, R., Martinez, M. D. P., Crèvecoeur, M., Manen, J. F. The use of herbarium specimens in DNA phylogenetics: Evaluation and improvement. Plant Syst Evo. 197 (1-4), 87-98 (1995).
  2. Zedane, L., Hong-Wa, C., Murienne, J., Jeziorski, C., Baldwin, B. G., Besnard, G. Museomics illuminate the history of an extinct, paleoendemic plant lineage (Hesperelaea, Oleaceae) known from an 1875 collection from Guadalupe Island, Mexico. Bio J Linn Soc. 117 (1), 44-57 (2016).
  3. Teisher, J. K., McKain, M. R., Schaal, B. A., Kellogg, E. A. Polyphyly of Arundinoideae (Poaceae) and Evolution of the Twisted Geniculate Lemma Awn. Ann Bot. , (2017).
  4. Cozzolino, S., Cafasso, D., Pellegrino, G., Musacchio, A., Widmer, A. Genetic variation in time and space: the use of herbarium specimens to reconstruct patterns of genetic variation in the endangered orchid Anacamptis palustris. Conserv Gen. 8 (3), 629-639 (2007).
  5. Wandeler, P., Hoeck, P. E. A., Keller, L. F. Back to the future: museum specimens in population genetics. Tre Eco & Evo. 22 (12), 634-642 (2007).
  6. Rivers, M. C., Taylor, L., Brummitt, N. A., Meagher, T. R., Roberts, D. L., Lughadha, E. N. How many herbarium specimens are needed to detect threatened species? Bio Conserv. 144 (10), 2541-2547 (2011).
  7. Saltonstall, K. Cryptic invasion by a non-native genotype of the common reed, Phragmites australis, into North America. PNAS USA. 99 (4), 2445-2449 (2002).
  8. Besnard, G., et al. From museums to genomics: old herbarium specimens shed light on a C3 to C4 transition. J Exp Bot. 65 (22), 6711-6721 (2014).
  9. Särkinen, T., Staats, M., Richardson, J. E., Cowan, R. S., Bakker, F. T. How to open the treasure chest? Optimising DNA extraction from herbarium specimens. PLoS ONE. 7 (8), e43808(2012).
  10. Harris, S. A. DNA analysis of tropical plant species: An assessment of different drying methods. Plant Syst Evo. 188 (1-2), 57-64 (1994).
  11. Staats, M., et al. DNA damage in plant herbarium tissue. PLoS ONE. 6 (12), e28448(2011).
  12. Bakker, F. T., et al. Herbarium genomics: plastome sequence assembly from a range of herbarium specimens using an Iterative Organelle Genome Assembly pipeline. Bio J of the Linn Soc. 117 (1), 33-43 (2016).
  13. Camacho, F. J., Gernandt, D. S., Liston, A., Stone, J. K., Klein, A. S. Endophytic fungal DNA, the source of contamination in spruce needle DNA. Mol Eco. 6 (10), 983-987 (1997).
  14. Hofreiter, M., Jaenicke, V., Serre, D., Von Haeseler, A., Pääbo, S. DNA sequences from multiple amplifications reveal artifacts induced by cytosine deamination in ancient DNA. Nucl Acids Res. 29 (23), 4793-4799 (2001).
  15. Staats, M., et al. Genomic treasure troves: Complete genome sequencing of herbarium and insect museum specimens. PLoS ONE. 8 (7), e69189(2013).
  16. Bakker, F. T. Herbarium genomics: skimming and plastomics from archival specimens. Webbia. 72 (1), 35-45 (2017).
  17. Doyle, J. J., Doyle, J. L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem Bul. 19, 11-15 (1987).
  18. Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., Thompson, W. F. A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissue using cetryltrimethylammonium bromide. Nat Prot. 1, 2320-2325 (2006).
  19. Twyford, A. D., Ness, R. D. Strategies for complete plastid genome seqeuncing. Mol Eco Resour. , (2016).
  20. Aird, D., et al. Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries. Genome Bio. 12 (2), R18(2011).
  21. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinf. 30, 2114-2120 (2014).
  22. Grigoriev, I. V., et al. MycoCosm portal: gearing up for 1000 fungal genomes. Nucl Acids Res. 42 (1), D699-D704 (2014).
  23. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Meth. 9 (4), 357-359 (2012).
  24. McKain, M. R. Herbarium Genomics. , Github Repository https://github.com/mrmckain/ (2017).
  25. McKain, M. R., Wilson, M. A. Fast-Plast: Rapid de novo assembly and finishing for whole chloroplast genomes. , Github Repository https://github.com/mrmckain/ (2017).
  26. McKain, M. R., McNeal, J. R., Kellar, P. R., Eguiarte, L. E., Pires, J. C., Leebens-Mack, J. Timing of rapid diversification and convergent origins of active pollination within Agavoideae (Asparagaceae). Am J Bot. 103 (10), 1717-1729 (2016).
  27. McKain, M. R., Hartsock, R. H., Wohl, M. M., Kellogg, E. A. Verdant: automated annotation, alignment, and phylogenetic analysis of whole chloroplast genomes. Bioinf. , (2016).
  28. Staton, S. E., Burke, J. M. Transposome: A toolkit for annotation of transposable element families from unassembled sequence reads. Bioinf. 31 (11), 1827-1829 (2015).
  29. Bao, W., Kojima, K. K., Kohany, O. Repbase Update, a database of repetitive elements in eukaryotic genomes. Mobile DNA. 6 (1), 11(2015).
  30. McKain, M. R. Transposons. , Github Repository https://github.com/mrmckain/ (2017).
  31. Weiß, C. L., et al. Temporal patterns of damage and decay kinetics of DNA retrieved from plant herbarium specimens. Royal Soc Open Sci. 3 (6), 160239(2016).
  32. Sawyer, S., Krause, J., Guschanski, K., Savolainen, V., Pääbo, S. Temporal patterns of nucleotide misincorporations and DNA fragmentation in ancient DNA. PLoS ONE. 7 (3), e34131(2012).
  33. Head, S. R., et al. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. BioTechniques. 56 (2), 61-64 (2014).
  34. Grover, C. E., Salmon, A., Wendel, J. F. Targeted sequence capture as a powerful tool for evolutionary analysis. Am J Bot. 99, 312-319 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Herbarium DNA IsolationHigh throughput Sequencing LibraryCTAB DNA ExtractionSPRI Bead PurificationDNA Fragmentation EnzymeLibrary Size SelectionOptional Reamplification StepAgarose Gel AnalysisThermocycler AmplificationMagnetic Stand Separation

Related Articles