Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Oogbeschadigingen en/of Kinematics gemeten door In Vitro stimulatie van de craniale zenuwen in de schildpad

7.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56864

⸱

2 juni 2018

 ,  ,  , 
1Department of Biology and Neuroscience Program, Lafayette College, 2Department of Information Technology, Computer Science, and Digital Media, Juniata College

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol wordt beschreven hoe u een in vitro geïsoleerd schildpad hoofd voorbereiding voor het meten van de kinematica van hun oogbewegingen. Na verwijdering van de hersenen van de schedel, worden craniale zenuwen gestimuleerd met stromingen te kwantificeren rotaties van de ogen en veranderingen in de maten van de leerling.

Samenvatting

Nadat de dieren zijn euthanized, beginnen hun weefsels te sterven. Schildpadden hebben een voordeel vanwege een langere overlevingstijd van hun weefsels, vooral vergeleken met warmbloedige gewervelde dieren. Hierdoor kunnen in vitro experimenten in schildpadden voor langere tijd te onderzoeken van de neurale signalen en beheersing van hun gerichte acties worden uitgevoerd. Met behulp van een geïsoleerde hoofd voorbereiding, we gemeten de kinematica van oogbewegingen in schildpadden en hun modulatie door elektrische signalen die door craniale zenuwen. Nadat de hersenen werd verwijderd uit de schedel, werd en de hersenzenuwen intact, de ontleed hoofd geplaatst in een gimbal kalibreren oogbewegingen. Glas elektroden aangesloten op craniale zenuwen (oculomotor, trochlear, en abducens) en gestimuleerd met stromingen te roepen van de oogbewegingen. We bewaakt oogbewegingen met een infrarood video tracking systeem en gekwantificeerde rotaties van de ogen. Huidige pulsen met een scala aan amplitudes, frequenties, en trein duur werden gebruikt voor het observeren van de effecten op de reacties. Omdat de voorbereiding is gescheiden van de hersenen, kan de efferent pathway gonna spier doelen in afzondering te onderzoeken neurale signalering bij gebrek aan centraal verwerkte sensorische informatie worden onderzocht.

Inleiding

Reden voor het gebruik van Red-eared schuifregelaar schildpadden in elektrofysiologische experimenten:

Red-eared schuifregelaar schildpadden (Trachemys scripta elegans), worden beschouwd als een van's werelds ergste invasieve soorten1 en kunt aangeven dat een ecosysteem is in de problemen. De reden waarom rood-eared schuifregelaar schildpadden zo succesvol zijn is slecht begrepen, maar het kan ten dele te wijten zijn aan hun tolerante fysiologie en het bezit van nerveuze weefsels die onder hypoxische voorwaarden2,3,4 overleven kunnen . Ze gebruikt voor experimenten geen bedreiging voor hun nummers vormt en met minimale inspanningen, elektrofysiologische preparaten levensvatbare over uitgebreide duur, zo lang als 18 uur5,6 blijven kunnen. Het voordeel is vergelijkbaar met het voordeel van het gebruik van ongewervelde dieren zoals rivierkreeft7, die hebben ook de mogelijkheid om te weerstaan lage niveaus van zuurstof8.

Technieken voor het meten van oogbewegingen:

Benaderingen voor het meten van oogbewegingen bij frontale-eyed dieren met behulp van niet-menselijke primaten zijn goed ontwikkelde9. Het oog draait in de baan rond drie assen: horizontale, verticale en torsional. De methode van de spoel magnetisch search wordt algemeen beschouwd als de meest betrouwbare voor meten rotaties, maar is invasief, waarbij kleine spoelen moet worden ingevoegd in de scleras van dieren10,11. Video-gebaseerde systemen kunnen ook meten van rotaties en hebben het voordeel dat ze niet-invasieve. De ontwikkeling van betere camera's samen met innovatieve beeldverwerking heeft zeer uitgebreide hun functionaliteit maken video-gebaseerde systemen een aantrekkelijk alternatief voor Overweeg12,13,14.

De technieken ontwikkeld voor het meten van oogbewegingen in nonmammals geweest veel minder groot. Maatregelen zijn beide lage resolutie of beschrijven slechts enkele van de rotaties15,16,17,18. Het gebrek aan ontwikkeling kan gedeeltelijk worden toegeschreven aan de moeilijkheid in nonmammals van de opleiding te volgen van visuele doelen. Hoewel oogbewegingen goed zijn bestudeerd in rood-eared schuifregelaar schildpadden19,20,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30, vanwege de uitdaging in de opleiding dieren voor het bijhouden van doelen, de precieze kinematica van hun oogbewegingen is slecht begrepen.

Red-eared schuifregelaar schildpadden worden algemeen beschouwd als laterale-eyed gewervelde dieren, maar omdat ze hun hoofd volledig in hun shell31 intrekken kunnen, aanzienlijke occlusie van de laterale visual velden door het kopborststuk komt32. Het resultaat is dat hun visuele lijn van het zicht is gedwongen naar de voorkant, waardoor ze zich meer gedraagt als frontale-eyed zoogdieren. Dus, het gebruik ervan als een model voor de ontwikkeling van methoden voor het meten van oogbewegingen biedt ook een unieke evolutionair perspectief.

Het protocol beschreven in dit werk gebruikt een in vitro geïsoleerd hoofd voorbereiding om te identificeren van de kinematica van de oogbewegingen in rood-eared schuifregelaar schildpadden. Hersenen worden ontleed van de schedels en de hersenzenuwen intact. Hoofden worden in een gimbal kalibreren oogbewegingen te roepen reacties geplaatst door elektrische stimulatie van de hersenzenuwen die de spieren van het oog innervating. Maatregelen van rotaties door de ogen worden gedaan door een video-gebaseerd systeem, met behulp van softwarealgoritmen, die de donkere leerling en de markeringen van de iris volgen. De voorbereiding biedt de mogelijkheid voor het meten van kinematica van beide extraocular (d.w.z., horizontale, verticale en torsional rotaties)32 en intraoculaire (d.w.z., leerling wijzigingen)33 bewegingen.

Modelsysteem voor analyse van Efferent zenuwbanen:

Meer in het algemeen, de aanpak biedt onderzoekers de kans om te bestuderen hoe efferent neurale signalen genereren oogbewegingen wanneer spieren beginnen uit hun ontspannen Staten en in de afwezigheid van geïntegreerde sensorische informatie verwerkt door de hersenen32, 33. Daarom kan het oog bewegingen worden onderzocht in een modelsysteem waarin ze alleen worden verwerkt door de efferent neurale route verlaten van de hersenen en synapsing op de spieren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Opmerking: Red-eared schuifregelaar schildpadden, zowel mannelijke als vrouwelijke, werden gekocht bij een leverancier. Schildpadden werden gehuisvest in een warme dierlijke suite met twee 60-gallon tobben uitgerust met baksteen eilanden voor zonnen onder 250-W infrarood licht. Het milieu werd gehandhaafd op een 14/10-h licht/donker cyclus met de watertemperatuur 22 ° C. Lichten werden ingeschakeld om 6:00 am en uitgeschakeld om 8:00 pm. De tanks voorzien van filtersystemen wekelijks gereinigd en schildpadden werden gevoed ad libitum om de andere dag. De verzorging van rode-eared schuifregelaar schildpadden en alle van de volgende experimentele procedures beschreven hier32,33 werden goedgekeurd door de institutionele dier zorg en gebruik Comité (IACUC) aan het Lafayette College.

1. apparatuur Setup

  1. Schildpad Ringer's oplossing voor te bereiden. Voeg het volgende toe gedestilleerd water in deze volgorde: natriumchloride 96.5 mM (58.44 g/mol), kaliumchloride 2.6 mM (74.56 g/mol), magnesiumchloride 2.0 mM (203.31 g/mol), natriumbicarbonaat 31.5 mM (84.01 g/mol), dextrose 20,0 mM (180.16 g/mol), geconcentreerd zoutzuur aan Breng de pH op 7,51 en calciumchloride 4,0 mM (110.98 g/mol) (Zie Tabel van materialen). Meng de oplossing tijdens het toevoegen van elk zout.
    Let op: Geconcentreerde HCl is gevaarlijke (huid, ogen, inademing en inname gevaren).
  2. Tips voor de zuig elektroden van 5-cm lange capillair maken glas (Zie Tabel of Materials), door vuur-polijsten op verschillende grootte van innerlijke diameters zodat craniale zenuwen van verschillende dikte.
    1. Een klein bestand gebruiken om een lijn over een stuk van capillaire glas etch. Plaats in papieren zakdoekje en doormidden breken.
    2. Langzaam roll een van de uiteinden van de capillaire glas in de vlam van een brander van Bunsen. Periodiek onderzoeken de tip voor grootte, gladheid en symmetrie met behulp van een dissectie toepassingsgebied en een fiber optic licht bron (Zie Tabel van materialen).
      Opmerking: Voor schildpadden met hoofd breedtes tussen 20 en 30 mm, binnendiameter van optimale montage maten meestal variëren van 0,4 tot 0,8 mm voor de nervus oculomotorius (nIII), 0,3 tot 0,6 mm voor de trochlear zenuw (nIV) en 0.2 tot 0.4 mm voor de Nervus abducens (nVI).
  3. Schoon en organiseren van Rongeurs, een botte dissectie-sonde, microscissors, fijne pincet, gebogen pincet en een scalpel handvat met mesjes (Zie Tabel of Materials) voor de dissectie.
    Let op: Sterilisatie van instrumenten is optioneel.

2. anesthesie en euthanasie

  1. Plaats de schildpad in een ijs emmer voor 60 min te cryoanesthetize het.
  2. De schildpad euthanaseren door onthoofding met behulp van een kleine dierlijke guillotine (Zie Tabel van materialen).
    1. Zachtjes loerder de kaken van de dierlijke open met een klein gewicht spatel zodat een haak kunt invoegen en draaide zich om passen onder het puntje van de bovenkaak.
    2. Trek met constante druk uit te breiden van hoofd van het dier door middel van de guillotine. Snel het onthoofden van het dier.
  3. Hoofd van de schildpad in een dissectie schotel plaatsen. Heb genoeg schildpad Ringer's oplossing bij de hand te irrigeren van het weefsel. De oplossing met 95/5 O2/CO2 oxygenize (Zie Tabel van materialen).
  4. Het handhaven van het weefsel bij 4 ° C door het ijs rond de buitenkant van de schotel te plaatsen.

3. dissectie

  1. Het toepassingsgebied van de dissectie met een fiber optic lichtbron kunt uitvoeren van de dissectie.
  2. Verwijder de onderkaak. Plaats een botte dissectie sonde via de mond kunnen gemakkelijker behandeling van het hoofd. Snijd het gewricht die het dentary bot verbinden met de schedel met een scalpel. Gebruik rongeurs te trekken van de onderkaak uit de buurt van de schedel. Gebruik rongeurs om te trekken uit de huid en de spieren van hun bijlagen op de dorsale en een laterale regio's van de schedel.
  3. Het verwijderen van de wervelkolom.
    1. Het identificeren van de wervelkolom caudal eind van de schedel. Het buigen van de wervelkolom ventrally om het ruggenmerg bloot te stellen. Gebruik microscissors om het ruggenmerg snip. Gebruik rongeurs om te verwijderen van de wervelkolom en ander weefsel uit de schedel door caudally te trekken.
  4. Verwijder de hersenen uit de schedel na het snijden van de hersenzenuwen.
    1. Basisgewicht van het foramen magnum, gebruik rongeurs te snijden twee insnijdingen op de dorsale schedel. Snoeien om te voorkomen beschadiging van de hersenen onder oppervlakkig.
    2. Gebruik rongeurs om te Trek voorzichtig uit de dorsale schedel. Gebruik microscissors om te verwijderen van de meninx om de rest van de hersenen bloot te stellen. Genoeg meninx verwijderen totdat de bulbus bollen, in de voorste schedelholte, kan worden geïdentificeerd (Zie figuur 1A). Blijven voor de irrigatie van de hersenen met schildpad Ringer's solution, als dit nodig is.
    3. Gebruik gebogen pincet te zachtjes trekken de hersenen caudally en produceren van lichte spanning op de hersenzenuwen. Zorgvuldig weg knippen en verwijder de bulbus bollen en de hersenen met een gebogen Tang.
    4. Gebruik microscissors om Duw voorzichtig de veroorzaakt naar de middellijn aan het blootstellen van de hersenzenuwen; nIII, ongeveer 0,6 mm, kan worden gezien voor nIV, en de diameter van de nIV zal iets minder dan nIII. Gesneden nIII en nIV waar zij hechten aan de veroorzaakt (Zie figuur 1B). Herhaal dit aan de andere kant.
    5. Snijd de linker- en oogzenuw (nII) met microscissors. Vervolgens tilt de hersenstam aan de ene kant. Observeren van de nVI die voortkomen uit het ventrale oppervlak in de buurt van de kruising van de pons en de medulla (Zie Figuur 1 c); de diameter van de nVI is klein en ongeveer 0,3 mm. Snij zowel de linker- en nVI.
    6. Verwijder de overige delen van de hersenstam uit de schildpad met fijne pincet en microscissors. Nadat de schedel leeg is, bestuderen de schedelholte vloer. NIII, nIV en nVI wordt aangeduid.
  5. Verwijder de bovenste en onderste oog-deksels met fijne pincet en microscissors.

4. kalibratie van de oogbewegingen

  1. Gebruik een stijve tabel (Zie Tabel van materialen) ter ondersteuning van de plaatsing van de gimbal en andere instrumenten. Het hoofd van de schildpad in de gimbal chuck plaatsen zodat het dorsale oppervlak van het hoofd is evenwijdig aan de horizon met behulp van een kleine waterpas rust in de schedel. Plaats een van de ogen ongeveer in het midden van de horizontale en verticale rotaties van de gimbal.
  2. De infrarood camera, uitgerust met een infrarood licht emitterende diode (LED), dat deel uitmaakt van de videogebaseerd eye tracking systeem (Zie Tabel of Materials), op een kijkafstand van ongeveer 12 cm vanaf de turtle's oog.
    1. Hoek van de camera 45 graden boven de lijn van het zicht van het oog. De LED moet op de 11 uur positie als we kijken naar de cameralens. Hiermee centreert u de LED langs de optische as van het oog. De camera zal worden iets af as (zoals weergegeven boven het oog).
    2. De afstand van de camera van het oog zodanig aanpassen dat de cameraweergave is maximaal gevuld door de oogbol. Ervoor zorgen dat de hoeken van de ogen (canthi) aan de randen van de horizontale weergave.
  3. Sluit de camera aan de videogebaseerd eye tracking systeem om de gegevens te verwerken. Het splitsen van het signaal naar een DVD-recorder om de ruwe video te vangen. Focus van de camera om te verkrijgen van een duidelijk beeld van het oog. Zorg voor schone-positie het oog in het midden van de weergave van de camera met behulp van de drie graden van lineaire aanpassing (x, y, z) is voorzien van de gimbal.
  4. Detecteren de donkere leerling door de drempel en het contrast op de juiste wijze met behulp van het programma voorzien van de videogebaseerd eye tracking systeem.
    1. Met behulp van de muis, klik op het menu "Video" en selecteer "Hoge precisie" te fotograferen bij een sampling rate van 30 Hz (resolutie van 640 pixels x 480 lijnen) onder "Mode". Ook "Video", Selecteer onder "Donkere leerling" voor "Leerling Type" en "Ellips (gedraaide ellips)" voor "Leerling segmentatie methode".
    2. Klik in het venster "EyeCamera" op de "leerling zoek gebied" aanpassingspictogram (kleine verticale rechthoek met een stip in het midden). Gebruik de muis te slepen uit een rechthoek die de grenzen van een gebied rondom de pupil. Vermijd donkere gebieden die kunnen worden verward met de leerling.
    3. Bevestigen dat de selectievakjes voor "Auto beeld" en "positief-Lock drempel-Tracking" zijn ingeschakeld in het venster "Controls". Klik op "Auto-drempel" voor het optimaliseren van de dichtheid van scannen, die over de donkere leerling als groene stippen tonen zal.
  5. Kalibreren van de video-display van de videogebaseerd eye tracking programma aan de rotaties van de gimbal 12,5 ° (+/-) om de horizontale as en 10 ° (+/-) rond de verticale as.
    1. Klik in het venster "Controls" op "Display". Schakel de selectievakjes onder zowel "Blik" en "Stim" voor "Blik Point", "Calib regio" en "Meetkunde Grid". Na het controleren van de vakken onder "Grid geometrie", zal een venster opduiken en zeggen, "de geometrie van de display stimulans moet worden gemeten voordat de geometrie raster kan worden weergegeven. Wilt u dit nu doen?" Selecteer "Y" voor Ja.
    2. Met behulp van de muis, klik op het menu "Windows" en selecteer "Stimulus". De "Stimulus" venster zal openen weergegeven: een kruising van de verticale en horizontale lijn in het midden van het display. Meet de lengte van de lijnen naar de dichtstbijzijnde mm. Druk op "Esc" op het toetsenbord om de "Stimulus" venster te sluiten.
    3. Met behulp van de muis, klik op de "Stimulus" menu en selecteer "Meetkunde Setup". Ingang van de lengtes van de lijnen die waren net gemeten. De kijkafstand zodanig aanpassen dat de graden/lijn gelijk 25 ° voor de horizontale lijn en 20 ° voor de verticale lijn. Klik op de knop 'Store' en sluit het venster.
    4. Selecteer het aantal kalibratie "Gegevenspunt" naar "9" worden in het venster "EyeSpace". Met de turtle's oog gepositioneerd in het midden, klik op het center gegevens wijs en klik op de knop "Opnieuw present".
      Opmerking: De "Stimulus" venster wordt geopend, en "Get Ready" verschijnt in het midden van het scherm. Een doos zal verschijnen in het midden en vervolgens verdwijnen. Over haar verdwijning, wordt de "Stimulus" venster gesloten. De middenpositie moet nu worden gekalibreerd.
    5. Herhaal de procedure door het draaien van de gimbal rechts/links, +12.5 ° /-12.5 °, en omhoog/omlaag + 10 ° /-10 ° kalibreren van de resterende gegevenspunten.
  6. Gebruik de sjabloon past algoritme de videogebaseerd eye tracking programma voorzien om te kalibreren torsional rotatie. Het algoritme stelt een nulpositie op basis van de markeringen van de iris en berekent een hoek van de rotatie als de markeringen verschoven ten van het zwaartepunt van de leerling opzichte worden.
    1. Met behulp van de muisaanwijzer, klik op het menu "Windows" en selecteer "Torsie". Klik op de knop "START" in het "Torsie" venster. In het venster "EyeCamera" verschijnt een boog boven de afbeelding van het oog.
    2. De straal, de hoek en de lengte van de boog met de schuifregelaars op een locatie waar onregelmatige aftekeningen aanwezig in de iris zijn aanpassen. Schakel de selectievakjes voor "Real-time beelden" en "Auto-Set na aanpassen". Indien nodig, de helderheid en het contrast in de Controls venster en re-drempel de donkere leerling (zie stap 4). Klik op de knop "Sjabloon instellen".
  7. Plaats een liniaal in de dezelfde brandvlak als de leerling en de breedte van de volledige cameraweergave opnemen. De waarde zal later worden gebruikt om te bepalen van de werkelijke breedte van de leerling.

5. plaatsing van zuiging elektrode op craniale zenuw te roepen oogbewegingen

  1. Zorgvuldig plaatst een pin referentie-elektrode in het weefsel van het bindweefsel of spier nog op het hoofd.
  2. Plaats de zuig elektrode (Zie Tabel van materialen) op de craniale zenuw met behulp van een micromanipulator en dissectie scope gemonteerd op een boom. Gebruik een fiber optic lichtbron te bekijken en de plaatsing begeleiden.
    1. Overeenkomen met de grootte van een zenuw naar een capillaire glas-tip. Trial and error is nodig zijn om een passend rond de diameter van een zenuw (zie stap 1.2 voor aanbevelingen voor de grootte). Plaats het uiteinde van het glas op de zuig elektrode. Vul de zuig elektrode met Ringer's oplossing en het volume binnen de spuit tot ongeveer de helft van de capaciteit.
    2. Zorgvuldig verplaatsen het puntje van het glas van de elektrode met behulp van de micromanipulator naar een positie boven de cut-einde van de geselecteerde zenuw. Ervoor zorgen dat Ringer's oplossing de schedel vult en de tip onder het oppervlak is. Indien nodig kunt modelleren klei dam vestigingen waar de Ringer's oplossing uit de schedel lekt.
    3. U kunt zich terugtrekken op de plunjer van de injectiespuit.
      Opmerking: Het vacuüm zal trekken de zenuw in het einde van de capillaire tip. Een goede pasvorm wordt aangegeven door de nervus resterende binnen de tip met weinig of geen extra vacuüm toegepast.

6. stimulatie van craniale zenuw en analyse van oogbewegingen

  1. Een zenuw-/ Spierstimulator voor algemene doeleinden gebruiken met een huidige isolatie-apparaat (Zie Tabel van materialen) ter stimulering van de craniale zenuw via de zuig elektrode.
    1. De zuiging elektrode verbinden met het huidige isolement apparaat via een kabel. Steek de stekker van de pin referentie-elektrode in de grond-aansluiting van het apparaat van de isolatie.
    2. Selecteer parameters van de stromingen die met behulp van de wijzerplaten en wordt overgeschakeld op het apparaat stimulator en isolatie. Gebruik een aantal stromingen van 1 tot 100 µA, met frequentie van 10 tot 400 die Hz. gebruik 1 - of 2-ms pulseert in treinen duurzame 100, 500 of 1000 ms.
  2. De timing van de stimulaties opnemen.
    Opmerking: Transistor-transistor-logic (TTL) peulvruchten worden gesynchroniseerd met de leveringen van de stromingen van de stimulator en communiceert in real-time via een kabel met ingangskanalen van de videogebaseerd eye tracking systeem. Een softwaremodule is voorzien van de videogebaseerd eye tracking programma besturingselementen de mededeling.
    1. Om te visualiseren de timing van de huidige toepassingen en hun invloed op de oogbewegingen, klik op het menu "PenPlots". Selecteer "X Gaze positie", "Y Gaze positie", "Torsie" en "Leerling breedte" te tonen real-time onbewerkte gegevens percelen voor X en Y eye posities, torsie en breedte van de leerling. Ook selecteren de "seconden & Markers" uit het menu "PenPlots" te tonen van een complot van de timing met de maatstreepjes, die 1 s tussenpozen verschijnen.
      Opmerking: Een hoofdletter "T" verschijnt de markering van het begin van de TTL-puls, die gelijktijdig met de huidige toepassing.
    2. Voor het opslaan van de gegevens van de oogbewegingen die worden opgeroepen door stromingen, klik op het menu "Bestand" en selecteer "Nieuw gegevensbestand" onder "Data". Een bestandsnaam kunnen invoeren en druk op "Enter". Het opslaan van gegevens kan worden onderbroken en vervolgens herstarten met behulp van de combinatie van de belangrijkste opdrachten, "Ctrl" + "p". Wanneer een experimentele sessie is voltooid, selecteert u "Nauwe gegevensbestand" uit "File" menu onder "Data".
    3. Om te helpen houden van het soort stromingen toegepast, klik op het menu "Windows" en selecteer "Gegevens Pad". De "Toetsenbord/DataMarker" venster zal verschijnen. Klik op een letter of een nummer voor het identificeren van de parameters van de huidige stimulaties wordt geleverd aan de zenuw.
      Opmerking: bijvoorbeeld, "X" kon staan voor 10 µA. klikken op "X" worden opgeslagen bij de inwerkingtreding van het gegevensbestand in real time voor post hoc analyse. Het verschijnt ook op de "PenPlot" voor "Seconden & Markers" voor voortdurende observatie.
  3. Analyseren van gegevens uit het oog tracker-systeem.
    1. Open de opgeslagen gegevens-bestand, dat in een tekstindeling gescheiden is, in een programma blad verspreiding van keuze om de gegevens naar wens indelen en statistische analyse worden uitgevoerd.
      1. De leerling breedte waarden opgeslagen in het bestand aan echte maten in mm converteren.
      2. Converteren van de waarden van X en Y eye posities en torsies aan eenheden van graad en conventies gebruiken voor het beschrijven van oogbewegingen; Daarom, positieve richtingen van rotaties: intorsion, hoogte, en adductie; en negatieve richtingen van rotaties: extorsion, depressie en ontvoering.
    2. Kopieer de header-informatie op een nieuw werkblad. Hierbij zal de waarden voor de grootte van het scherm (breedte en hoogte) en de kijkafstand. Acht kolommen met gegevens die zijn verzameld met een snelheid van 30 Hz zal Volg onderstaande gegevens in de berichtkop.
    3. Ga terug naar het werkblad met de onbewerkte gegevens. Doe een "zoeken" voor "X" in de laatste kolom getiteld "Marker" om te zoeken waar de stimulatie werd toegepast met 10 µA. Find incidentie van "T", het begin van de huidige stimulatie. 15 rijen kopiëren (0,5 s) gegevens die plaatsvinden voordat de "T" en 90 frames na de "T" (3.0 s); dat wil zeggen, 3,5 s totaal. Plak de gegevens in het nieuwe werkblad onder de header-informatie.
    4. Een lege kolom ingevoegd na "PupilWidth". In de lege kolom omzetten in de gekalibreerde dimensie in mm:
      Horizontale leerling diameter = "PupilWidth" × de dimensie met breedte van de weergave van de camera
    5. 2 lege kolommen invoegen na "X_Gaze" en "Y_Gaze". Normaliseren van de posities aan de afmetingen van het scherm: coördinaten (0, 0) aan de bovenkant verlaten van het scherm uit te breiden tot (1, 1) rechts onderaan. In de eerste lege kolom vertalen posities aan het hebben van een coördinatenstelsel (0, 0) in het midden van het scherm. Neem de conversie naar de afmetingen van het scherm in mm:
      X = (0,5 × breedte) – ("X_Gaze" × breedte); Y = (0,5 × hoogte) – ("Y_Gaze" × hoogte)
      Opmerking: De volgorde van de operatie is voor het linker oog. De volgorde moet worden teruggeboekt voor het rechter oog te volgen van de Conventie van negativiteit voor ontvoering en positiviteit voor adductie.
    6. In de tweede kolom, gebruikt u trigonometrische functies te converteren naar hoeken (°) van rotatie:
      horizontale rotatie arctan (X/viewing afstand); = verticale rotatie = arctan (Y/viewing afstand)
    7. Torsie is reeds weergegeven in eenheden van graden, maar om te voldoen aan de Conventie van positiviteit voor intorsion, als het meten gebeurt op het linker oog, te vermenigvuldigen met -1. Voor het rechter oog is geen vermenigvuldiging noodzakelijk. Het programma codes rechtsom draaien als positief.
    8. De diameter van de leerling en de rotaties worden uitgezet als functie van de tijd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Figuur 1 toont foto's van beelden uit een video met een beschrijving van de dissectie. Afbeeldingen geven typische locaties van de zenuwen voorafgaand aan het snijden van de hersenen.

figure-results-1
Figuur 1: stilstaande beelden van beelden van de video van de dissectie te tonen van de locaties van de oogzenuw (nII), de ner...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Kritische stappen:

De kritische stappen binnen dit protocol zijn de volgende: 1) de dissectie en de zorgvuldigheid om de levensvatbaarheid van de transected zenuwen; 2) de onderlinge afstemming van de maten door de zuigkracht elektroden aan craniale zenuwen consequent te reageren; en 3) de plaatsing van het hoofd in de gimbal om voldoende kalibratie van de rotaties van het oog.

Problemen oplossen:

De dissectie kan uitdagend, maar na het een paa...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs bedanken Mrs. Paulette McKenna en Lisa Pezzino in deze studie voor secretariële ondersteuning en Mr. Phil Auerbach voor technische ondersteuning. De auteurs bedanken ook Drs. Michael Ariel en Michael S. Jones (Saint Louis University School of Medicine) voor het introduceren van ons aan de hoofd voorbereiding in vitro geïsoleerd. Financiering voor de ondersteuning van deze samenwerking werd verstrekt door het Department of Biology (Robert S. Chase Fonds), de academische Commissie van onderzoek en het programma van de neurowetenschappen aan het Lafayette College. Tot slot, dit werk is opgedragen aan m. Phil Auerbach, die overleed op 28 September 2016; hij een Scannende Elektronen Microscoop ontmanteld en het nut van de 5-assige fase voor gebruik in dit protocol herkend. Zijn vriendschap en vindingrijkheid zal sterk worden gemist.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Red-eared slider turtlesKons ScientificTrachemys scripta elegansGrote maat (schildlengte 15-20 cm)
Sodium chlorideSigma-Aldrich Co. LLC.S5886
Potassium chlorideSigma-Aldrich Co. LLC.P5405
Magnesium chorideSigma-Aldrich Co. LLC.M7304
Sodium bicarbonateSigma-Aldrich Co. LLC.S5761
DextroseSigma-Aldrich Co. LLC.C5767
Concentrated hydrochloric acidSigma-Aldrich Co. LLC.H7020
Calcium chlorideSigma-Aldrich Co. LLC.C7902
pH meterOaktonpH 6+
Suction stimulation electrodeA-M Systems573000Bipolare zuignaaldelektrode. Let op: 573000 is vervangen door 573050.
Capillary glassA-M systems626000Enkelvoudige borosilicaat capillaire glas zonder microfilament, lengte 10 cm, buitendiameter 1,0 mm, binnendiameter 0,50 mm
Alternatieve zuignaaldelektrodeA-M Systems573050Bipolare zuignaaldelektrode. Vereist een capillair glas met een grotere diameter: 627000, buitendiameter 1,2 mm, binnendiameter 0,68 mm
StereoscoopLiecaGZ7Vergrotingsbereik, 10x – 70x
Vezeloptische lichtbronAmscopeHL250-A150W fiberoptisch microscoopverlichtingslichtbox
RongeursCarolina Biological Supply Company625654roestvrij staal, rechte veer, 5,25"
Blunt dissectie sondeCarolina Biological Supply Company627405Huber mall sonde, dubbelzijdige sonde en zoeker, 6"
MicroschaarCarolina Biological Supply Company623555Iris microdissectie schaar, roestvrij staal, 0,5" messen, 4,75" lang
Fijne pincettenSigma-Aldrich Co. LLC.F6521Juwelierstangen, dumont nr. 5, roestvrij staal, 4,25"
Gebogen pincettenSigma-Aldrich Co. LLC.Z168696Medium tip, gebogen pincetten, roestvrij staal, 4"
ScalpelhandgreepSigma-Aldrich Co. LLC.S2896Scalpel handgrepen, nr. 3, roestvrij staal
ScalpelmesSigma-Aldrich Co. LLC.S2771Scalpelmessen, nr. 11, staal
GuillotineHarvard Apparatus73-1918Kleine guillotine type 7575
SpatelSigmaZ648299Microlepel en spatel weegset. Gebruik kleine spatel: 5,9” lang x 0,07” diameter handgreep met vierkant einde: 0,17” x 1,3” lang, andere kant rond: 0,17” x 1,27” lang
HaakAutozone98069SureBilt haak en pick set. Gebruik grinder om scherpe punten van de haak te doven om letsel aan de mond van het dier te voorkomen.
95/5% O2/CO2Airgas, Inc.X02OX95C20031025% Koolstofdioxide evenwicht zuurstof gecertificeerde standaard gasmengsel, maat 200 Cylinder, CGA-296
RegelaarAirgas, Inc.Y11244D296-AGEnkeltraps messing 0-100 psi analytische cilinderregelaar CGA-296 met naalduitlaat. Gebruik messing verstelbare luchtleidingklep om te gaan van 3/8", binnendiameter, vinyl luchtleidingslang aangesloten op de regelaar naar een 3/16", binnendiameter, luchtverbinding die naar een luchtsteen of glazen pasteuripijpje gaat.
Verstelbare luchtleidingklepDoctors Foster and SmithCD-12061Messing klep
Starre tafelOnbekendOnbekendAuto-clave deur op een stevige tafel gelegd. Negen 5" diameter tennisballen isoleren trillingen vanaf het bovenoppervlak van de tafel.
5" tennisbalPetco Animal Supplies, Inc.712868Petco Jumbo Pet Tennisbal: ballen zijn ongesneden en worden vastgehouden in een geïntegreerd frame aan de onderkant van de autoclavedeur.
Alternatieve trillingsisolatie tafelNewport CorporationINT1-36-6-NStijf trillingscontrolesysteem, integriteit 1: Oppervlakteafmetingen, 3' x 6'
GimbalISI, International Scientific Instruments, Inc.Stage uit SUPER III-A Scanning EM5-as eucentrische stage: X, Y en Z lineaire bewegingen, ±20 mm, 0,1 mm precisie; Rotaties, verticaal, ±10°, en horizontaal, ±12,5°, met 1,25° precisie. Opmerking: van gedecommissioneerd instrument.
Klem voor gimbalOnbekendOnbekendKlem van een oude microtoom van onbekende fabrikant werd bewerkt om op de as van de monsterstandaard van de Scanning EM-stage te passen
Alternatieve gimbalThorLabs, Inc.GN2/M met MBT602/MDual-axis goniometer (GN2/M) gemonteerd op 3-as microblok stage met thumbscrew aanpassingen (MBT602/M): ontwerp een klemm om de schildpaddenkop met het oog op 12,7 mm boven het bovenoppervlak van de goniometer te houden (afstand tot het rotatiepunt)
Video-gebaseerd oogvolgsysteemArrington Research, Inc.ViewPoint EyeTracker, PC-60Volgmethode: Infrarood video door donkere pupil; Zwart-wit camera (Item BC02): 30 Hz, 640 x 480; Systeemvereisten: Windows 2000, XP, 7, 8, 8.1, 10; Visueel bereik: Horizontaal +/- 44°; verticaal +/- 20°; Nauwkeurigheid ~0,5°

Referenties

  1. Kikillus, K. H., Hare, K. M., Hartley, S. Minimizing false-negatives when predicting the potential distribution of an invasive species: A bioclimatic envelope for the red-eared slider at global and regional scales. Anim Conserv. 13, 5-15 (2010).
  2. Lutz, P. L., Rosenthal, M., Sick, T. J. Living without oxygen: turtle brain as a model of anaerobic metabolism. Mol Physiol. 8, 411-425 (1985).
  3. Lutz, P. L., Milton, S. L. Negotiating brain anoxia survival in the turtle. J Exp Biol. 207, 3141-3147 (2004).
  4. Storey, K. B. Anoxia tolerance in turtles: Metabolic regulation and gene expression. Comp Biochem Physiol A-Mol Integr Physiol. 147 (2), 263-276 (2007).
  5. Granda, A. M., Dearworth, J. R., Subramaniam, B. Balanced interactions in ganglion-cell receptive fields. Vis Neurosci. 16, 319-332 (1999).
  6. Dearworth, J. R., Granda, A. M. Multiplied functions unify shapes of ganglion-cell receptive fields in retina of turtle. J Vis. 2 (3), 204-217 (2002).
  7. Nesbit, S. C., Van Hoof, A. G., Le, C. C., Dearworth Jr, J. R. Jr Extracellular recording of light responses from optic nerve fibers and the caudal photoreceptor in the crayfish. J Undergrad Neurosci Educ. 14 (1), A29-A38 (2015).
  8. McMahon, B. R. Respiratory and circulatory compensation to hypoxia in crustaceans. Resp Phsiol. 128 (3), 349-364 (2001).
  9. Leigh, R. J., Zee, D. S. The neurology of eye movements. , 3rd edition, Oxford University Press. New York. (1999).
  10. Robinson, D. A. A method of measuring eye movement using a scleral search coil in a magnetic field. IEEE Trans Biomed Eng. 10, 137-145 (1963).
  11. Judge, S. J., Richmond, B. J., Chu, F. C. Implantation of magnetic search coils for measurement of eye position: an improved method. Vis Res. 20, 535-538 (1980).
  12. Ong, J. K. Y., Halswanter, T. Measuring torsional eye movements by tracking stable iris features. J Neurosci Meth. 192, 261-267 (2010).
  13. Kimmel, D. L., Mammo, D., Newsome, W. T. Tracking the eye non-invasively: simultaneous comparison of the scleral search coil and optical tracking techniques in the macaque monkey. Front Behav Neurosci. 6 (49), 1-17 (2012).
  14. Otero-Millan, J., Roberts, D. C., Lasker, A., Zee, D. S., Kheradmand, A. Knowing what the brain is seeing in three dimensions: A novel, noninvasive, sensitive, accurate, and low-noise technique for measuring ocular torsion. J Vis. 15 (14), 1-15 (2015).
  15. Demski, L. S., Bauer, D. H. Eye movements evoked by electrical stimulation of the brain in anesthetized fishes. Brain Behav Evol. 11, 109-129 (1975).
  16. Gioanni, H., Bennis, M., Sansonetti, A. Visual and vestibular reflexes that stabilize gaze in the chameleon. Vis Neurosci. 10, 947-956 (1993).
  17. Straka, H., Dieringer, N. Basic organization principles of the VOR: lessons from frogs. Prog Neurobio. 73 (4), 259-309 (2004).
  18. Voss, J., Bischof, H. -J. Eye movements of laterally eyed birds are not independent. J Exp Biol. 212 (10), 1568-1575 (2009).
  19. Ariel, M. Independent eye movements in the turtle. Vis Neurosci. 5, 29-41 (1990).
  20. Ariel, M., Rosenberg, A. F. Effects of synaptic drugs on turtle optokinetic nystagmus and the spike responses of the basal optic nucleus. Vis Neurosci. 7, 431-440 (1991).
  21. Balaban, C. D., Ariel, M. A "beat-to-beat" interval generator for optokinetic nystagmus. Biol Cybern. 66, 203-216 (1992).
  22. Keifer, J. In vitro eye-blink reflex model: Role of excitatory amino acid receptors and labeling of network activity with sulforhodamine. Exp Brain Res. 97, 239-253 (1993).
  23. Keifer, J., Armstrong, K. E., Houk, J. C. In vitro classical conditioning of abducens nerve discharge in turtles. J Neurosci. 15, 5036-5048 (1995).
  24. Rosenberg, A. F., Ariel, M. A model for optokinetic eye movements in turtles that incorporates properties of retinal slip neurons. Vis Neurosci. 13, 375-383 (1996).
  25. Ariel, M. Open-loop optokinetic responses of the turtle. Vis Res. 37, 925-933 (1997).
  26. Anderson, C. W., Keifer, J. Properties of conditioned abducens nerve responses in a highly reduced in vitro brainstem preparation from the turtle. J Neurophysiol. 81, 1242-1250 (1999).
  27. Keifer, J. In vitro classical conditioning of the turtle eyeblink reflex: Approaching cellular mechanisms of acquisition. Cerebell. 2, 55-61 (2003).
  28. Zhu, D., Keifer, J. Pathways controlling trigeminal and auditory nerve-evoked abducens eyeblink reflexes in pond turtles. Brain Behav Evol. 64, 207-222 (2004).
  29. Jones, M. S., Ariel, M. The effects of unilateral eighth nerve block on fictive VOR in the turtle. Br Res. 1094, 149-162 (2006).
  30. Jones, M. S., Ariel, M. Morphology, intrinsic membrane properties, and rotation-evoked responses of trochlear motoneurons in the turtle. J Neurophysiol. 99 (3), 1187-1200 (2008).
  31. Krenz, J. G., Naylor, G. J. P., Shaffer, H. B., Janzen, F. J. Molecular phylogenetics and evolution of turtles. Mol Phylogenet Evol. 37 (1), 178-191 (2005).
  32. Dearworth, J. R. Jr, et al. Role of the trochlear nerve in eye abduction and frontal vision of the red-eared slider turtle (Trachemys scripta elegans). J Comp Neur. 52, 3464-3477 (2013).
  33. Dearworth, J. R. Jr, et al. Pupil constriction evoked in vitro by stimulation of the oculomotor nerve in the turtle (Trachemys scripta elegans). Vis Neurosci. 26, 309-318 (2009).
  34. Mead, K., et al. IFEL TOUR: a description of the introduction to FUN electrophysiology labs workshop at Bowdoin College, July 27-30, and the resultant faculty learning community. J Undergrad Neurosci Educ. 5, A42-A48 (2007).
  35. Jackson, D. C., Ultsch, G. R. Physiology of hibernation under the ice by turtles and frogs. J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. 313 (6), 311-327 (2010).
  36. Romano, J. M., Dearworth, J. R. Jr Pupil constriction evoked by stimulation of the ciliary nerve in the red-eared slider turtle (Trachemys scripta elegans). J Penns Acad Sci. 85, 4-8 (2011).
  37. Miller, J. M., Robins, D. Extraocular-muscle forces in alert monkey. Vis Res. 32, 1099-1113 (1992).
  38. Gamlin, P. D., Miller, J. M. Extraocular muscle motor units characterized by spike-triggered averaging in alert monkey. J Neurosci Meth. 204, 159-167 (2011).
  39. Quaia, C., Ying, H. S., Optican, L. M. The Viscoelastic properties of passive eye muscle in primates. III: Force elicited by natural elongations. PLOS ONE. 5, A236-A254 (2010).
  40. Anderson, S. R., et al. Dynamics of primate oculomotor plant revealed by effects of abducens microstimulation. J Neurophys. 101, 2907-2923 (2009).
  41. Maxwell, J. H. Anesthesia and surgery. Turtles: Perspective and Research. Harless, M., Morlock, H. , Wiley. New York. 127-152 (1979).
  42. AVMA Panel on Euthanasia. American Veterinary Medical Association. J Am Vet Med Assoc. 218 (5), 669-696 (2001).
  43. Clarke, R. J. Shaping the pupil's response to light in the hooded rat. Exp Br Res. 176, 641-651 (2007).
  44. Bennett, R. A. A review of anesthesia and chemical restraint in reptiles. J Zoo Wild Med. 22 (3), 282-303 (1991).
  45. Bickler, P. E., Buck, L. T. Hypoxia Tolerance in Reptiles, Amphibians, and Fishes: Life with Variable Oxygen Availability. Ann Rev Physiol. 69, 145-170 (2007).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Meting van oogbewegingenstimulatie van schedelnervenin vitro preparatieisolatie van schildpadkopinfrarood videotrackinggimbalcalibratieelektrische stimulatieparametersanalyse van neurale signaleringkwantificering van oogrotatie
Oogbeschadigingen en/of Kinematics gemeten door In Vitro stimulatie van de craniale zenuwen in de schildpad
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.