High Throughput, Absolute bepaling van het gehalte van een geselecteerde eiwit op weefsel niveaus met behulp van kwantitatieve Dot analyse (QDB) van de vlek

Samenvatting

Hier tonen we een gedetailleerd proces van kwantitatieve dot vlekkenanalyse (QDB) door de vaststelling van de absolute inhoud van een gerichte eiwit, aftopping actine eiwit, gelsolin-achtige (CAPG), in drie verschillende muis weefsels. We tonen een hoge doorvoer, handige, kwantitatieve immunoblot techniek voor biomerker validatie op het niveau van cellulaire en weefsel.

Samenvatting

Bij gebrek aan een handige, belemmert kwantitatieve, hoge doorvoer immunoblot methode voor absolute bepaling van het gehalte van een specifiek eiwit op cellulair en weefsel niveau aanzienlijk de vooruitgang in Proteoom onderzoek. Resultaten afgeleid van de momenteel beschikbare immunoblot technieken zijn ook relatief, elke poging tot onafhankelijke studies combineren met een grootschalige analyse van EiwitSteekproeven voorkomen. In deze studie tonen wij het proces van kwantitatieve dot vlekkenanalyse (QDB) om absolute kwantificering in een hoge doorvoer-indeling. Met behulp van een standaard verkrijgbare eiwit, zijn wij in staat om te bepalen van de absolute hoeveelheid van de aftopping van actine eiwit, gelsolin-achtige (CAPG) in EiwitSteekproeven bereid uit drie verschillende muis weefsels (nieren, milt en prostaat) samen met een gedetailleerde uitleg van de experimentele gegevens. Wij stellen de QDB analyse als een handige, kwantitatieve, hoge doorvoer immunoblot methode van absolute kwantificering van individuele eiwitten op het niveau van cellulaire en weefsel. Deze methode zal aanzienlijk steun biomerker validatie en verificatie van het traject in verschillende gebieden van biologische en biomedische onderzoek.

Inleiding

Naast met de spannende ontwikkelingen in de genomische onderzoek in de afgelopen jaren, getuige biomedisch onderzoeksveld ook van de aanzienlijke vooruitgang in Proteoom onderzoek. Met de toenemende accumulatie van biologische gegevens zowel genomic en proteomic niveaus, met behulp van bioinformatic hulpmiddelen voor het analyseren van deze gegevens is geworden de focus van het biomedisch onderzoek in de waarneembare toekomst. Bijgevolg, het succes van bioinformatical onderzoek verhoogt vraag naar meer en betere kwaliteit van de gegevens van de biologische en biomedische onderzoeksgemeenschap, een taak kan alleen worden bereikt door de vooruitgang van de techniek aan de genomic en proteomic niveaus.

De Spectrometrie van de massa (MS) en analyse van de immunoblot momenteel twee heersende technieken van eiwit analyse. MS heeft het proteoom onderzoek in de afgelopen jaren om de analyse van duizenden individuele eiwitten gelijktijdig gedomineerd. De immunoblot gebaseerde technieken, met inbegrip van de westelijke vlek en stip blot, aan de andere kant, ook een belangrijke rol hebben gespeeld in het eiwit onderzoek zelfs sinds haar uitvinding^{1,2,3,4, 5}. Enzym-verbonden immunosorbent assay (ELISA)^5,6,7 en omgekeerde fase eiwit microarray (RPPM)^8,9 kan worden beschouwd als de indeling van de hoge doorvoer van immunoblot analyse. Echter meet al deze immunoassay methoden, met uitzondering van ELISA, het niveau van de relatieve expressie van een specifieke proteïne. De relativiteit van deze methoden wordt een reëel probleem voor bevolkingsvraagstukken, zoals de analyse moet worden gedaan op hetzelfde moment, alle inspanningen om de grootte van de groep door meerdere analyses voorkomen. Bovendien zijn de resultaten afgeleid van deze studies slechts semi-kwantitatieve, complicerende dus alle inspanningen van de bio-informatica in de data-analyse. Ondertussen, hoewel ELISA leent zich uitstekend voor hoge doorvoer absolute analyse van EiwitSteekproeven, deze techniek lijkt om uitdagingen in complexe omgevingen zoals cellen of weefsels vanwege zijn lage bindingscapaciteit en multiplexing van¹⁰.

We hebben ontwikkelde een immunoblot methode geschikt voor bevolkingsonderzoeken met de belangrijkste kenmerken van het zijn handige, hoge doorvoer, kwantitatieve, en geschikt voor absolute bepaling van het gehalte aan andere melkeiwitten, en noemde deze techniek kwantitatieve dot Smet analyse (QDB)¹¹. In deze studie, we presenteren een gedetailleerd protocol voor QDB analyse en demonstreren de methode door bepaling van het absolute eiwitgehalte van een specifieke proteïne, CAPG, in drie verschillende muis weefsel, met inbegrip van de prostaat, nier en milt. Wij denken dat dit gedetailleerde protocol goed de haalbaarheid en het gemak van deze methode illustreert, en als leidraad over hoe om te voorkomen dat de potentiële valkuilen in de praktijk van deze methode.

Protocol

Alle dierlijke procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met Binzhou medische universiteit dier gebruik richtlijn en goedgekeurd door de board van de ethische evaluatie van Binzhou Medizinische Universität.

1. de monstervoorbereiding

1. 50 mg muis weefsel rekening een 1,5 mL Tube. Toevoegen van 200 µL lysis-buffermengsel (50 mM Hepes, pH 7.4, 137 mM NaCl, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 1 mM MgCl₂, 10 mM nb₂P2O₇, 1% Triton X-100, 10% glycerol), aangevuld met protease en phosphatase inhibitors (100 mM NaF, 0.1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride 5 µg/mL pepstatin, 10 µg/mL leupeptin, 5 µg/mL aprotinin).
2. Meng het weefsel met een homogenizer voor 1 min op ijs.
3. Centrifugeer gedurende 10 min bij er 8000 x g bij 4 ° C.
4. De bovendrijvende substantie in nieuwe buizen (1,5 mL) verzamelen en nemen 1 µL voor eiwit concentratie assay met BCA kit.
   Opmerking: Alle de veelgebruikte lysis buffers voor westelijke vlekkenanalyse en Dot vlekkenanalyse kunnen worden gebruikt voor QDB analyse.

2. de vaststelling van het specifieke karakter van het antilichaam

1. Voorbereiding van monster lysates (20 µg) in punt 1.4, IgG gratis BSA (20 µg), standaard eiwitten (600 pg), voor westelijke vlekkenanalyse.
   Opmerking: IgG gratis BSA wordt gebruikt als een negatieve controle en de standaard eiwit wordt gebruikt als positieve controle. De specificiteit van het antilichaam wordt aangetoond door het tonen van een band van de juiste grootte met behulp van de westelijke vlekkenanalyse.

3. de definitie van het lineaire bereik van de analyse QDB

1. Los van de standaard eiwit met ddH₂O. Dilute het eiwit tot een concentratie van 1.200 pg/µL.
2. Het verdunnen van de geconcentreerde eiwit uit de bereide monsters in sectie 1.4 tot en met 4 µg/µL.
3. Los van de BSA met ddH₂O. Dilute het eiwit tot een concentratie van 1.200 pg/µL en 4 µg/µL.
4. Een reeks van verdunning van standaard eiwitten en bereid monsters werden voorbereid met de begeleiding van tabel 1 en tabel 2.
5. Mix 10 µL verdunning standaard eiwit of verdunning bereid monsters en 10 µL 2 x laden van de buffer (120mM Tris-HCl pH 6.8, 20% Glycerol, 4% SDS, 0,2% Bromphenol blauw, 200 mM DTT) samen.

	S1 (0pg/µl)	S2 (33.3pg / µl)	S3 (100pg/µl)	S3 (300pg/µl)	S5 (600pg/µl)	S6 (1200pg/µl)
standaard protein(1200pg/µl)	0	1.39	4.17	12,5	25	50
IgG gratis BSA (4pg/µl)	50	48.61	45.83	37,5	25	0
totaal	50	50	50	50	50	50

Tabel 1. Verdunning regeling voor standaard eiwit curve.

	X1 (0µg/µl)	X2 (0.25µg / µl)	X3 (0.5µg / µl)	X4 (1µg/µl)	X5 (2µg/µl)	X6 (4 µg/µl)
Sample(4µg/µl)	0	3.125	6.25	12,5	25	50
IgG gratis BSA(4µg/µl)	50	46.875	43.75	37,5	25	0
totaal	50	50	50	50	50	50

Tabel 2. Verdunning regeling voor bereide monsters

6. Verwarm het mengsel bij 85 ° C gedurende 5 min.

4. het proces van QDB analyse

1. Voorbeeldtoepassing
   1. Steun de QDB plaat om te voorkomen dat de onderkant van de plaat aan het oppervlak van de tabel te raken. Bijvoorbeeld, een lege Pipetteer tip vak te gebruiken als ondersteuning.
   2. Maximaal 2 µL van het monster naar het midden van het membraan aan de onderkant van de individuele eenheid van de plaat QDB laden.
2. Drogen van de plaat
   1. Laat de geladen QDB plaat voor 1 h op kamer gematigd (RT) of als alternatief laat de geladen plaat bij 37 ° C gedurende 15 min. in een goed geventileerde ruimte.
3. Het blokkeren van de plaat
   1. Dompel de plaat QDB in de buffer van de overdracht (0.039 M Glycine, 0.048 M Tris, 0,37 procent SDS, 20% methylalcohol) en schud zachtjes de plaat voor 10 s.
   2. Spoel de QDB plaat zachtjes met TBST (Tris-gebufferde zoutoplossing, 0,1% Tween 20) drie keer, en daarna wassen de plaat gedurende 5 min. in TBST onder voortdurend schudden.
   3. Blokkeren van de QDB plaat met een blokkeerbuffer (5% nonfat melk in TBST (100 µL per putje) voor 1 h onder voortdurend schudden.
4. Primair antilichaam-incubatie
   1. Verdun het primaire antilichaam in de blokkeerbuffer bij een gekozen concentratie (vanaf 1:500 tot 1:5 000) en voeg 100 µL aan elke individuele putje van een gewone 96 goed plaat. De plaat QDB invoegen de 96 goed plaat en Incubeer de gecombineerde platen hetzij gedurende 2 uur op RT of 's nachts bij 4 ° C onder voortdurend schudden.
   2. Als alternatief, plaats de QDB plaat in een doos, en vul in het vak met een blokkeerbuffer 2 tot 3 mm boven het membraan-gedeelte van de plaat als het dezelfde antilichaam wordt gebruikt voor de hele plaat. Het primaire antilichaam toevoegen in de gekozen concentratie, en de plaat ofwel gedurende 2 uur op RT of 's nachts bij 4 ° C door onder voortdurend schudden uit te broeden.
   3. Spoel de plaat zachtjes met TBST voor drie keer voordat het wordt gewassen met TBST voor driemaal, telkens gedurende 5 minuten onder voortdurend schudden.
5. Incubatie van secundair antilichaam
   1. Het secundaire antilichaam in de blokkeerbuffer in de gekozen concentratie (van 1:1, 000 tot 1:50 000), en beide aliquoot 100 µL per putje in een 96 goed plaat of in een doos zoals beschreven in sectie 4.4.2 Verdun en vervolgens Incubeer de QDB plaat binnen ofwel de geladen 96 goed pla te of het vak voor 1 h bij RT onder voortdurend schudden.
   2. Spoel de QDB plaat zachtjes 3 keer met TBST, dan wassen van de plaat voor 3 keer, 5 minuten elk met TBST onder voortdurend schudden.
6. Kwantificering
   1. Verbeterde Chemiluminescentie substraat (ECL) voor te bereiden door het volgen van de instructies van de fabrikant.
   2. Aliquot ECL substraat in een 96 goed plaat (100 µL per putje) en invoegen de QDB plaat binnen de 96 goed plaat gedurende 2 minuten onder voortdurend schudden.
   3. Verwijder de QDB plaat uit de 96 goed plaat en schud kort te verwijderen van de overtollige vloeistof. Plaats de plaat op een witte microtiterplaat bord.
   4. Schakel de microplate-lezer, en selecteer "plaat met cover" op de user interface alvorens de gecombineerde platen (QDB plaat + witte plaat adapter) binnen de microplate-lezer voor kwantificering te plaatsen.
      Opmerking: Zorg ervoor dat de witte, ondoorzichtige microtiterplaat plaat als een adapter gebruiken om eventuele storing van de plaat te voorkomen. Zorg ervoor om te kiezen "plaat met cover" om te voorkomen dat de machine tegen wanneer gecombineerd jammen platen (QDB plaat + 96 goed plaat adapter) worden geplaatst binnen de microplate-lezer.

Resultaten

De vaststelling van de absolute hoeveelheid van een eiwit met inbegrip van de CAPG eiwitten in muis weefsel vereist zowel een specifiek antilichaam en een gezuiverde eiwit als standaard. Het lineaire bereik van de analyses van het eiwit standaard én de lysates moet ook worden vastgesteld voordat een grootschalige analyse. Het lineaire bereik van het antilichaam is sterk afhankelijk van het antilichaam per se, en het bereik van de aangewezen verdunning van een specifiek antilichaam moeten door elke afzonderlijke gebruiker worden geverifieerd.

Wij vastbesloten eerst de specificiteit van het antilichaam van de CAPG in muis nier, milt- en prostaatkanker weefsels met behulp van westelijke vlekkenanalyse met de negatieve controle (IgG gratis BSA) en de positieve controle (verkrijgbare CAPG eiwit)(Figuur 1). Het antilichaam van de anti-CAPG was specifiek tegen lysates van muis milt, hart, spieren en prostaat (één band gedetecteerd). Niet-specifieke banden werden waargenomen in lysates van nieren en lever. Echter, in nier lysate, de niet-specifieke banden waren aanzienlijk zwakker dan de specifieke band, die suggereert dat het antilichaam is geschikt voor nier weefsel analyse. Vervolgens werden de lineaire bereik van het standaard eiwit en de hoeveelheid lysates voor analyses vastgesteld door twee naast elkaar dosis krommen. Een commercieel verkrijgbare CAPG eiwit was serieel verdund zoals aangegeven in tabel 1 op basis van onze ervaringen uit het verleden, en de lysates weefsel van de muis nieren, milt en prostaat waren ook verdund gebaseerd op het bedrag van totale eiwitten in de lysates bepaald door een BCA kit voor de bepaling van de totale proteïne. Twee dosis studies werden uitgevoerd naast elkaar en samen weergegeven in Figuur 1B. De juiste hoeveelheid lysates van muis nieren, de milt en de prostaat werden gekozen op basis van de signalen van de QDB gemeten door de lezer microplate in willekeurige eenheid. De oorspronkelijke lezing voor dit experiment is weergegeven in tabel 3.

In de laatste stap, de serieel verdunde CAPG eiwit standaard en de lysates van muis nier, waren op de plaat QDB milt en prostaat geladen. In dit geval, kozen we te laden 0,3 µg/monster voor lysates van muis nier en milt en 1 µg/monster voor lysates muis prostates analusis, zoals op deze niveaus, de QDB lezing was op zijn minst 20-fold op de achtergrond terwijl goed binnen het lineaire bereik van de analyse gebaseerd op de curve van de dosis van zowel de lysates en het eiwit standaard. De plaat werd onderworpen aan het beschreven QDB protocol voordat de plaat werd gekwantificeerd rechtstreeks door de microplate-lezer. Met behulp van het serieel verdunde, gezuiverde CAPG-eiwit, kan er een dosis-responscurve, de vergelijking en R2 door enkelvoudige regressie-analyse met behulp van beschikbare software (bijvoorbeeld Microsoft office excel). De QDB signalen van lysates van muis nieren, milt en prostates werden bekeerd tot het absolute bedrag van CAPG eiwitten in deze lysates met behulp van de gevestigde vergelijking, en de resultaten werden gecorrigeerd door de totale proteïne bedrag, in dit geval 0,3 µg voor lysates uit muis milt en nieren, en 1 µg voor lysates van muis prostates, voor de uiteindelijke concentratie van CAPG eiwitten in deze weefsels als pg/µg. De resultaten worden weergegeven in Figuur 1C met de oorspronkelijke lezing weergegeven in tabel 4.

Figuur 1 . Representatief resultaat van een QDB analyse om te bepalen van de absolute niveaus van het CAPG in drie muis weefsels (nier-, milt- en prostaatkanker). A. behandeling van de specificiteit van konijn anti-CAPG antistof met behulp van de muis weefsel lysates bereid uit de milt, hart, spieren, nieren, lever en prostaat met behulp van westerse analyse van de vlek met de negatieve controle (IgG gratis BSA) en de positieve controle (commercieel beschikbaar CAPG eiwit). B. vaststelling van de lineaire bereik van QDB analyses van konijn anti-CAPG antistof met behulp van lysates bereid uit de prostaat, nieren, milt, en met behulp van gezuiverd recombinant CAPG eiwit standaard. De resultaten waren een gemiddelde van triplicates. C. Absolute gehaltebepaling CAPG in lysates bereid uit prostates muis nieren en milt. Elke staaf vertegenwoordigt een weefsel van een individuele muis. De resultaten waren de gemiddelde van drievoud. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Tabel 3: Gevolg van microplate lezer van de studies van de dosis met behulp van zowel serieel verdund, gebundelde lysates van muis milt, nieren, en prostates en gezuiverde recombinante CAPG eiwit.

Tabel 4: Resultaat van microplate lezer van de QDB analyse van het absolute CAPG in muis nieren (8), de milt (4) en de prostates (5) het gebruik van een recombinant eiwit CAPG als standaard.

Discussie

Onder alle huidige beschikbaar immunoassay technieken van eiwit analyse behalve ELISA is QDB analyse de enige methode om absolute inhoud van een specifieke proteïne op cellulair en weefsel niveaus in een hoge doorvoer-indeling. Hoewel met stabiele isotoop-label standaard, massaspectrometrie staat om absolute kwantificering van een paar eiwitten, is deze methode niet nog ontworpen voor hoge doorvoer prestaties. In dit onderzoek aangetoond we het proces van QDB analyse om absolute bepaling van CAPG eiwit gehalte in muis weefsel, met inbegrip van de prostaat, nier en milt. CAPG niveaus bleken te zijn tussen de 200 tot 360 pg/g in muis nier weefsels, 460 tot en met 650 pg/g in de milt van de muis en 330 tot 390 pg/g in muis prostaat weefsels.

Vergeleken met ELISA, vereist QDB analyse minimale inspanningen worden ontwikkeld in een regelmatige lab. Ten eerste, de QDB plaat is een op basis van een membraan van het nitrocellulose te elimineren van de coating stap in ELISA. Ten tweede, QDB analyse vereist slechts één in plaats van twee specifieke antilichamen in een sandwich-ELISA. Ten derde, de hoge bindingscapaciteit van membraan van het nitrocellulose ten opzichte van het oppervlak van de plaat ELISA staat ook het membraan te weerstaan de stappen van de strenge wassen meestal gebruikt bij de analyse van de immunoblot te verminderen de interferentie van de achtergrond. Deze functie is handig bij het analyseren van ingewikkelde lysates bereid uit cellen en weefsels. In tegenstelling, als gevolg van de relatief lage bindingscapaciteit van ELISA-plaatjes wordt de vermindering van de achtergrond bij het analyseren van complexe cellulaire en weefsel lysates een echte uitdaging in het ontwikkelings proces.

QDB analyse kan gemakkelijk worden vastgesteld in een lab met de toegang van een specifiek antilichaam. Het is echter belangrijk te vermelden dat de specificiteit van het antilichaam een relatief begrip is is, beperkt door factoren met inbegrip van de soorten, de weefseltypes (HLA) en celtypes. Zoals blijkt uit Figuur 1A, CAPG antilichaam is specifiek bij het analyseren van lysate van muis nier en milt, prostaat en nog aspecifieke wordt bij het analyseren van de lever van de muis. In feite, vonden we regelmatig één antilichaam aan zijn specifiek voor één weefseltype, maar niet altijd specifiek om andere weefseltype van dezelfde soorten. Voorafgaande westelijke vlekkenanalyse is dus noodzakelijk zijn om het specifieke karakter van de QDB analyse. In feite, de relatieve specificiteit van het antilichaam mogelijk de oorzaak van valse resultaten vaak geassocieerd met ELISA analyse, zoals ongeacht hoeveel moeite het productiebedrijf mag hebben besteed het om ervoor te zorgen de specificiteit van de test, kunnen niet zij alle mogelijke uitlaat soorten monsters de gebruikers kunt analyseren met behulp van hun ELISA-producten.

Zoals met alle immunoassay, is een potentieel probleem met de analysemethode QDB het gebrek aan samenhang van de kwaliteit van het commerciële antilichaam. Zelfs als de zichtbare kwaliteit van een antilichaam uit hetzelfde bedrijf (dezelfde catalogus nummer, etc.) wordt gebruikt, kunnen er grote verschillen ten opzichte van één aankoop naar de andere als gevolg van-charges-variabiliteit. Daarom, tenzij het volste vertrouwen in de kwaliteit van het antilichaam beschikbaar wordt bereikt, opnieuw het karakteriseren van het antilichaam bij elke aankoop is belangrijk.

Kortom bieden wij hier een gedetailleerde protocol en een voorbeeld bij het gebruik van de methode van de analyse van de QDB om absolute kwantitatieve bepaling van een specifieke proteïne op het niveau van het weefsel. We laten zien dat de analysemethode QDB is een handig hulpmiddel voor iedereen die geïnteresseerd is in hoge-doorvoer, kwantitatieve immunoblot analyse. Deze techniek haar vermogen om absolute bepaling van het gehalte van een specifiek eiwit op een cellulaire en weefsel niveau ook onderscheiden van traditionele immunoblot technieken. Deze functie zorgt voor de combinatie en de vergelijking van de resultaten van meerdere analyses, een stap die nodig zijn met name in grotere bevolkingsonderzoeken en de realisatie van relevante vereniging studies op het niveau van eiwit in de nabije toekomst.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Microplate reader	Tecan	Tecan Infinite 200 PRO
QDB plate	Yantai Zestern Co.Ltd		Plates zijn beschikbaar op aanvraag voor verificatiedoeleinden, per e-mail of via www.zestern.net.
Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot)	jackson	711-035-152
Enhanced chemiluminesence substraat	Thermo	32134
Konijn anti-CAPG	Sino Biologic Inc	14213-T52
CAPG-eiwit	Sino Biologic Inc	14213-HNAE
Hepes	Sigma	H4034
NaCl	Tianjin Ruiji Jin special Chemical Co., Ltd	10461220
MgCl2	Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd	20120802
EDTA	Sigma	E9884-500G
EGTA	Sigma	BNN1913
Na2P2O7	Haituo Chinese medicine test	20160914
Triton X-100	Sigma	T9284
Glycerol	Sigma	G7757
fenylmethylsulfonylfluoride	Sigma	P7626-5G
pepstatin	Sigma	Z290033
leupeptine	Sigma	L2884
aprotinine	Sigma	A3428
Tris-HCl	Sigma	T6455
SDS	Sigma	L5750-500G
DTT	Sigma	43815-1G
Bromfenolblauw	Sigma	B-0126
NaF	Sigma	S7920