Gestroomlijnde 3D cerebellaire differentiatie Protocol met optionele 2D wijziging

Summary

We beschrijven een vereenvoudigde 3D differentiatie protocol voor hPSCs, met behulp van gedefinieerd medium en verminderd van groeifactoren, geschikt voor het genereren van cel aggregaten met vroege neuroepithelial structuren en gunstig zijn voor de cerebellaire-geassocieerde markeringen, evenals een optionele 2D modificatie voor differentiatie van cellen als een enkelgelaagde voor het genereren van functionele neuronen.

Abstract

Vermindering van de complexiteit en de kosten van differentiatie protocollen is belangrijk voor onderzoekers. Deze belangstelling past met bezorgdheid over de mogelijke onbedoelde effecten dat patronen van extrinsieke factoren in menselijke pluripotente stamcellen (hPSC) modellen van ontwikkeling van de hersenen of pathofysiologie introduceren kunnen, zoals ziekte fenotype maskeren. Hier presenteren we twee cerebellaire differentiatie protocollen voor hPSCs, ontworpen met eenvoudiger opstartmethode, minder patronen factoren, en minder materiële eisen dan eerdere protocollen. Onlangs, ontwikkelden we cultuur procedures, die vrij-zwevende 3-dimensionale (3D) producten consistent zijn met andere hersenen "organoid" protocollen, waaronder morphologies relevant zijn voor de modellering van de ontwikkeling van de hersenen zoals sub/ventriculaire zone- en rhombic genereren lip-achtige structuren. De tweede maakt gebruik van een aanhangend, 2D enkelgelaagde procedure volledige differentiatie, die is geschikt voor het genereren van functionele cerebellaire neuronen, zoals producten positief voor cerebellaire-geassocieerde markeringen zijn, en neuron-achtige calcium instroom vertonen getoond. Samen bieden deze protocollen wetenschappers een keuze van opties die geschikt is voor verschillende onderzoeksdoeleinden, evenals een basismodel voor het testen van andere soorten gestroomlijnde Neurale differentiatie.

Introduction

In vitro protocollen voor differentiatie van de hPSCs richting cerebellaire lineages aanvankelijk geopereerd aan het beginsel van het nabootsen van in vivo Cerebellaire ontwikkeling^1,2,3,4. Als zodanig, is zij verplicht een opeenvolging van factoren leidt op bepaalde tijdstippen te rijden pro-cerebellaire patronen en rijping. De belangrijkste daarvan waren van de WNT, bone morfogenetische eiwitten (BMP's) en groeifactoren fibroblast (FGFs) met bekende rollen in medio hindbrain ontwikkeling en vorming van de organisator van de isthmic^5,6,7. Natuurlijk, elke extra stap en factor betekent een toename van de arbeidsintensieve manipulaties en meer kosten voor de onderzoeker, en dus ontwikkeling eenvoudiger protocollen kan bereiken van gelijkwaardige resultaten is van belang. Deze praktische kwestie sluit mooi aan bij de hypothetische vraag, of cellen deze strakke, externe controle over hun ontwikkeling in vitro vereisen.

Een protocol gepubliceerd in 2015 gericht voor cerebellaire differentiatie, de noodzaak van het gebruik van een uitgebreid aantal groeifactoren met behulp van slechts FGF2, FGF19 en stromale cel-afgeleide factor 1 (SDF1) voor doeleinden⁸patronen. Deze studie ook verschilde van voorafgaande cerebellaire protocollen, met behulp van een systeem van zwevende 3D cultuur. Naast het produceren van cellen positief voor cerebellaire markeringen, bleken de hersenen "organoids" gegenereerd door hun techniek om relevante morfologie, beschikbaar in traditionele 2D enkelgelaagde culturen, zoals rhombic lip-achtige structuren tentoon te stellen. Hoewel minder complex en duur ten opzichte van groeifactoren, andere functies zoals totstandkoming van uniform embryoid organen (EBs) en cultuur in 96-wells-platen (96WPs), het procedureel ingewikkelder gemaakt tijdens de eerste stappen. Een ander 3D protocol gepubliceerd hetzelfde jaar, succesvolle differentiatie naar neurale lineages met behulp van gemeenschappelijke en goedkope cel cultuur technieken⁹gemeld. Hoewel deze groep corticale in plaats van cerebellaire differentiatie onderzocht, kan toepassing van hun concept voor cerebellaire differentiatie niet worden gedisconteerd.

Wij onlangs een 3D cerebellaire differentiatie-protocol met behulp van een beperkt aantal patronen factoren gemeld (namelijk FGF2, 4 en 8), evenals een vereenvoudigde setup doordat cellen in 6-Wells-platen (6WPs) in om te minimaliseren van middellange eisen¹⁰. Om te helpen bij de productie van de submodule cellen, werd egaliseren agonist (SAG) gebruikt tijdens de rijping van de definitieve stap. SAG is een minder dure chemische alternatief voor sonic hedgehog (SHH), die werden gebruikt in eerder cerebellaire protocollen, vanwege haar rol bij de bevordering van de groei van de submodule cel precursoren (GCP) in vivo^{1,2, 11,12,13}. Differentiatie producten waren consistent met die van andere 3D-protocollen, waaronder de aanwezigheid van cerebellaire-geassocieerde markers in morfologisch relevante structuren^8,9. Deze resultaten versterken het eerdere bericht dat mimicry gedetailleerde van het in vivo milieu niet noodzakelijk kan zijn voor complexe 3D in vitro differentiatie protocollen.

Naast het 3D protocol, dit verslag beschrijft een 2D protocol, ontworpen met de dezelfde snelle setup, basismaterialen, en het verminderde aantal van groeifactoren. Het is geschikt voor het produceren van cellen van menselijke embryonale stamcellen (hESCs) of geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs), positief voor markeringen gekoppeld vroeg neurale, cerebellaire, en submodule cel identiteiten. Daarnaast duidt calcium imaging op de aanwezigheid van functionele menselijke neuronen. De mogelijkheid om te kiezen tussen protocollen, voegt een niveau van flexibiliteit voor onderzoekers, voor diegenen die geïnteresseerd zijn in hetzij: (1) genereren specifieke cel typen, de ontwikkeling van de menselijke hersenen van (2) modellering en bijbehorende structuren, (3) analyse in enkelgelaagde geoptimaliseerd instellingen (b.v., patch-clamp opnames), of (4) cel interacties in gemengde neurale culturen. Hun eenvoudige en goedkope aard maakt ze toegankelijk voor onderzoekers die zijn toegevoegd aan het veld hPSC, of nodig basis hPSC procedures waaruit verdere differentiatie om opties te verkennen.

Protocol

1. voorbereiding

Opmerking: Zie Tabel van materialen voor alle maatregelen voor bepaalde artikelen.

1. 500 mL gedefinieerd hPSC kweekmedium voorbereiden hPSC cultuur
   Opmerking: Gebruik medium voor stappen 2.1-2.6.
   1. Ontdooien hPSC middellange supplement's nachts (o/n) bij 4 ° C. Verwijderen van 12,5 mL hPSC basis voedingsbodem uit middelgrote fles, dan toevoegen van 10 mL supplement en 2,5 mL (waardoor 100 U/L) penicilline/streptomycine (Pen/Strep) op de fles.
   2. Bewaren bij 4 ° C en gebruik binnen 2 weken.
      Opmerking: Het hPSC medium kan worden gebruikt om te bevriezen van cellen door toevoeging van 10 µM ROCK remmer (RI) en 10% DMSO.
2. 1 L neurale onderhoud medium (NMM) voorbereiden differentiatie cultuur
   Opmerking: Gebruik medium voor stappen 3.1-4.4.
   1. Mix-glutamine verrijkte DMEM/F12 en neurale voedingsbodem (1:1 verhouding) in een 1 L fles, dan supplement met (1 x) N2 supplement, (1 x) B27 aanvullen, 5 µg/mL insuline, 1.5 mM L-glutamine, 100 µM niet-essentiële aminozuren (NEAA), 100 U/L Pen/Strep, en 10 µM Bèta-mercaptoethanol.
   2. Opslaan van medium bij 4 ° C en binnen 3 weken gebruiken.
      Opmerking: Voordat u supplementen aan gemengde Basaal medium toevoegt, verwijdert het juiste volume aan te passen voor de vereiste hoeveelheid toegevoegde componenten op basis van voorraad concentraties.
3. 500 mL van de werkoplossing voor 0,5 mM EDTA voorbereiden passaging hPSCs
   Opmerking: Gebruik medium voor stappen 2.4 en 2.5.
   1. Onder een stroom-motorkap, breng 49 mL van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) uit een fles van 500 mL steriele PBS een tube van 50 mL. 0,5 mL van de EDTA 0.5M en 0.9 g NaCl toevoegen aan de tube van 50 mL. Mix zachtjes te ontbinden.
   2. Filter-steriliseren oplossing met behulp van een 0,22 µm filter en overdracht aan de steriele PBS-fles van 500 mL. Bewaren bij kamertemperatuur (RT).
4. Voorbereiden hPSC cultuur platen hPSC cultuur
   Opmerking: Gebruik platen voor stappen 2.1-2.6.
   1. Maken 50 x werkoplossing van hPSC-geschikte aanhangend coating (PAAC): ontdooien van een flacon van PAAC o/n bij 4 ° C. Verdun PAAC in 1:1 verhouding met DMEM/F12 en overdracht als 400 µL aliquots in 1,5 mL buizen. Winkel 50 x werkoplossing PAAC bij-80 ° C.
      Opmerking: (belangrijk) PAAC snel stolt op RT, daarom is het noodzakelijk dat alle onderdelen (DMEM, buizen, enz.) op het ijs (of bij 4 ° C) worden gehouden.
   2. Ontdooien buis van 50 x werkoplossing PAAC bij 4 ° C, en vervolgens verdund 50 x in koude DMEM/F12. Voeg 750 µL per putje van verdunde PAAC aan een 6WP. Incubeer plaat voor ten minste 1 uur bij 37 ° C.
      Opmerking: PAAC platen kunnen worden opgeslagen voor 1 week bij 4 ° C, door inwikkeling van de plaat na 1 h incubatieperiode. Warme plaat tot 37 ° C vóór gebruik.
5. Anti-lijm (AA) platen voorbereiden differentiatie cultuur
   Opmerking: Gebruik platen voor stappen 3.1-4.1.
   1. Maken van 5 mg/mL Poly (2-hydroxyethylmethacrylaat) (poly-HEMA) oplossing in 95% Ethanol. O/n schudden bij 37 ° C, totdat een duidelijke oplossing wordt verkregen. Winkel op RT.
      Opmerking: Filtering door een 0,22 µm filter onopgeloste poly-HEMA kunt verwijderen.
   2. Poly-HEMA aan de cultuur plaat toevoegen, zodat het betrekking heeft op de bodem van elke put. Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 2 dagen en inspecteren van de plaat om ervoor te zorgen volledige verdamping van vloeistof/uniform coating van putten. AA platen kunnen worden verpakt en opgeslagen op RT.
6. Poly-L-Ornithine/Laminin (PLO/LAM) platen voorbereiden differentiatie cultuur
   Opmerking: Gebruik platen voor stappen 4.2-4.4.
   1. Coat het oppervlak van putten, met behulp van 20 µg/mL PLO opgelost in steriele PBS. Incubeer de plaat o/n bij 37 ° C. PLO gecombineerd en spoel van 3 keer met PBS.
      Opmerking: (Optioneel) Incubated plaat met de PLO kan worden verpakt en opgeslagen bij 4 ° C totdat het nodig is.
   2. Jas van de oppervlakten van de PLO beklede putten, met behulp van 10 µg/mL LAM opgelost in steriele PBS. Incubeer gedurende ten minste 2 uur bij 37 ° C of o/n bij 4 ° C. Verwijderen van LAM en wassen wells 2-3 x met PBS, dan Voeg onmiddellijk geschikte voedingsbodem en/of cellen.
      Opmerking: (Optioneel) verwijderd LAM oplossing kan worden opgeslagen bij 4 ° C en maximaal 2 keer opnieuw gebruikt. (Belangrijk) Laat niet LAM-gecoate oppervlakken te drogen; om te voorkomen dat dit onmiddellijk vergroten met PBS of geschikte voedingsbodem.
       

2. protocol 1: Feeder-vrije hPSC cultuur

Opmerking: hESCs werden verkregen uit een niet-commerciële organisatie (lijn H01, Zie Tabel van materialen). Drie hiPSC control lijnen (hvs51, 60, en 88) werden gegenereerd door het herprogrammeren van fibroblasten van drie gezonde menselijke patiënten (fibroblasten waren afgeleid van anonieme, niet-identificeerbare donoren en daarom vrijgesteld van goedkeuring van de IRB)^{10, 17}.

1. HPSCs feeder-vrije cultuur handhaven
   1. Na het ontdooien en hPSCs op PAAC platen in hPSC medium plating (zie stap 2.2), hPSCs bij 37 ° C met 5% CO₂handhaven. Vernieuwen hPSC medium dagelijks (zie stap 2.3), behalve de dag na ontdooien of passaging en cellen onder de Microscoop onderzoeken (doelstellingen: 2.5x/0.06, 5 x / 0,12 Ph0, 10 x / 0,25 Ph1) te observeren de groei stem en identificeren van potentiële gebieden van differentiatie (Figuur 3 , upper linkerdeelvenster ziet u voorbeeld van differentiatie).
   2. Passage hPSCs elke 3-4 dagen, of wanneer cultuur bereikt > 80% samenvloeiing. Als minder dan 5% van de cellen tentoonstelling differentiatie, gebruik normale hPSC passaging methode (zie stap 2.4), de zachte methode anderszins te gebruiken (zie stap 2.5). Wanneer niet langer nodig in cultuur, hPSCs kunnen worden bevroren voor lange termijn opslag (zie stap 2.6).
2. HPSCs in hPSC medium ontdooien
   1. Overdracht van de vereiste hoeveelheid hPSC medium steriele buizen voor het ontdooien proces (9 mL/cryogene buis) en aan de bereid PAAC plaat waarnaar ontdooide cellen. Een aanvulling op het medium in beide buisjes met 10 µM RI.
   2. Ophalen het cryotube LN₂ opslag en plaats rechtstreeks in een waterbad (37 ° C). Wanneer slechts een klein ijs kristal blijft, verwijderen uit het waterbad en breng de inhoud van de cryogene buis aan de buis voor het ontdooien van proces (total volume 10 mL). Centrifugeer de buis bij 290 x g gedurende 5 min op RT.
   3. Gebruik een serologische pipet voor het verwijderen van de PAAC oplossing van de putjes van de plaat van PAAC (zie stap 1.4) bedoeld om te ontvangen van cellen en toevoegen van hPSC medium met 10 µM RI.
      Opmerking: (belangrijk) niet aspirate PAAC oplossing met een zuignap naald, of het kan stollen en lijnen naar de vacuüm pomp verstoppen.
   4. Verwijder de bovendrijvende vloeistof uit de buis en resuspendeer de cellen in hPSC medium met 10 µM RI. De cellen aan de plaat van de bestemming op de verhouding van 1 cryogene buis/put van 6WP verspreiden. Incubeer bij 37 ° C met 5% CO₂, en niet vernieuwen medium voor 1 dag.
      Opmerking: Opstarten van cellen op 5% O₂ overleving van de cel kan verhogen.
3. Vernieuwen hPSC medium
   1. Warm de nodige hoeveelheid hPSC medium in een steriele buis op RT of in een waterbad; 2 mL/putje van 6WP wordt voorgesteld.
      Opmerking: (Optioneel): door toevoeging van een extra bedrag van hPSC medium, hPSCs kan blijven een extra dag zonder fris; echter niet toegestaan dit meer dan eenmaal per week.
   2. Gecombineerd het medium uit putten met hPSCs en verse hPSC medium toe te voegen.
   3. Cultuur van de hPSCs in een incubator bij 37 ° C en 5% CO₂.
4. Passage hPSCs in hPSC medium
   1. De vereiste hoeveelheid hPSC medium overbrengen in steriele buizen, voor passaging proces en voor de bereiding van PAAC plaat te ontvangen gepasseerd cellen. Een aanvulling op het medium voor de bestemming plaat met 10 µM RI. Warm de middellange buizen op RT of in een waterbad.
      Opmerking: Voorbereiding en behandeling variëren als met behulp van een alternatieve coating materiaal dan vermeld in de Tabel van materialen.
   2. Gebruik een serologische pipet voor het verwijderen van de PAAC oplossing van de putjes van de plaat van PAAC (zie stap 1.4) bedoeld om te ontvangen van cellen en toevoegen van hPSC medium met 10 µM RI.
      Opmerking: (belangrijk) niet aspirate de PAAC oplossing met een zuigkracht naald, aangezien het kan stollen en lijnen naar de vacuüm pomp verstoppen.
   3. Het medium uit putten met hPSCs gecombineerd te worden gepasseerd, wassen van cellen tweemaal met 0,5 mM EDTA, dan toevoegen van 0.5 mM EDTA en incubeer gedurende 2-5 minuten bij 37 ° C.
      Opmerking: 1 mL/putje van 6WP is een voldoende hoeveelheid van de EDTA voor wassen en incubatie.
   4. Controleren van de putten onder de Microscoop (doelstellingen: 2.5x/0.06, 5 x / 0,12 Ph0, 10 x / 0,25 Ph1). Als cellen beginnen te ontkoppelen, gecombineerd EDTA-oplossing en gratis gebruik van hPSC medium flush cellen.
      Opmerking: (belangrijk) zorg niet te verwijderen van de hele hPSC kolonies wanneer zuigen EDTA (wacht niet tot hele kolonies zijn loskoppelen). Niet leeggemaakt cellen meer dan 5 keer als dit kan schade toebrengen aan hPSCs en pluripotent beïnvloeden. Ook laat geen cellen staan in hPSC medium met RI voordat blozen cellen uit putten, als ze opnieuw aan de plaat voldoen kunnen.
   5. HPSCs op basis van empirische bepaling (meestal gerelateerd aan de samenvloeiing, grootte van de kolonies en groeitempo op jaarbasis), overbrengen in putjes van de plaat van de bestemming met behulp van een splitsing verhouding van 1:4-1:16 (d.w.z., 1 goed van de oorspronkelijke plaat aan 4 putjes van de bestemming plaat). Incubeer bij 37 ° C met 5% CO₂, en niet vernieuwen medium voor 1 dag.
      Opmerking: Splitsen ratio's zo hoog als 1:16-1:20 mogelijk zijn ter voorkoming verdringing en verbetering van de verschijning van kolonies.
5. Passage hPSCs met behulp van de zacht-methode (G-methode)
   1. De vereiste hoeveelheid hPSC medium overbrengen in steriele buizen, voor het passaging proces en voor de bereiding van PAAC plaat te ontvangen gepasseerd cellen. Een aanvulling op het medium voor de bestemming plaat met 10 µM RI. Warme middellange buizen op RT of in waterbad bij 37 ° C.
   2. Gebruik serologische pipet te verwijderen PAAC oplossing van putjes van de plaat PAAC bedoeld (zie stap 1.4) om te ontvangen van de cellen en toevoegen hPSC medium met 10 µM RI.
      Opmerking: (belangrijk) niet aspirate PAAC met het een zuiging naald, of het kan stollen en lijnen naar de vacuüm pomp verstoppen.
   3. Gecombineerd worden overgedragen door de putjes met hPSCs om te worden gepasseerd, en wassen van de cellen tweemaal gebruik van 0.5 mM EDTA. Op de tweede wash, wachten 30 s voordat zuigen EDTA, vervolgens 1 mL PBS toe en incubeer gedurende 4-9 minuten bij 37 ° C. Terwijl we wachten, bereiden een steriele buis met 4 mL PBS.
      Opmerking: 1 mL/putje van 6WP is voldoende hoeveelheid EDTA voor wassen.
   4. Controleren van de putten onder Microscoop (doelstellingen: 2.5x/0.06, 5 x / 0,12 Ph0, 10 x / 0,25 Ph1). Als cellen beginnen te ontkoppelen, tikt u zorgvuldig op de zijkanten van de plaat om te helpen de vrije kolonies. Wanneer > 50% van de kolonies zijn vrij zwevend, gebruik een serologische 5 mL-pipet kolonies in 1 mL PBS overbrengen naar de buis met 4 mL PBS (niet triturate).
      NOTITIE: (belangrijk) Aangezien het doel is om schoon te maken hPSC cultuur, controleren om te bepalen of gedifferentieerde cellen blijven gekoppeld aan de plaat. Ook is het niet nodig om de passage van alle kolonies in een goed gebruik van dit proces, dus kolonies die aangesloten blijven kunnen worden achtergelaten.
   5. Wacht 5-10 min op RT voor cellen zich te vestigen in de buis (doen niet centrifugeren). Gecombineerd PBS uit de buis, als u niet wilt verwijderen van de vaste hPSCs verzorgen. Zorgvuldig resuspendeer de cellen in hPSC medium (doen niet triturate), en de overdracht van de cellen aan de plaat van de bestemming met behulp van een splitsing verhouding van 1:4-1:16. Incubeer bij 37 ° C met 5% CO₂, en niet vernieuwen medium voor 1 dag.
6. Bevriezen naar beneden hPSCs
   1. Afhankelijk van de samenvloeiing, met 1 goed van hPSCs, op 2-3 dagen (maximaal) in cultuur, vullen van flacons van 1-2 cryopreservatie voor opslag in LN,₂.
   2. Aan het einde van de passaging (stap 2.5), gebruik 500 µL of 1 mL van hPSC medium overbrengen cellen uit 1 goed van 6WP tot 1 of 2 cryopreservatie flesjes, respectievelijk (500 µL/injectieflacon). Voeg aan elke buis, 500 µL van 2 x bevriezing middellange met hPSC medium, 20 µM RI, en 20% DMSO.
      Opmerking: (Optioneel) cellen kunnen overgedragen worden direct in 1 x medium bij 1 mL/injectieflacon bevriezing.
   3. Plaats de cryogene buizen in een cryogene container (met isopropanol) vooraf gekoeld tot 4 ° C, en winkel onmiddellijk bij-80 ° C.
   4. Op de volgende dag, door de cryogene buizen te overbrengen in een tank₂ LN voor langdurige opslag.

3. protocol 2: 3D "Organoid" differentiatie

1. Opstelling van differentiatie met gemodificeerde G-methode van de passaging van hPSCs
   1. De vereiste hoeveelheid NMM voor het aantal bestemming wells overbrengen in een steriele buis. Aanvulling met 4 ng/mL FGF2 en 10 µM RI. Warm de medium buis op RT of in waterbad bij 37 ° C.
      Opmerking: Afhankelijk van de samenvloeiing van de putjes ontstaan, hPSCs zijn geconcentreerd tijdens de distributie naar de bestemming plaat in een 2:1 of 3:1 verhouding (dat wil zeggen, 2 putten van de oorspronkelijke plaat aan 1 goed van de bestemming-plaat), met een volume van de einde van 2.5 mL per putje van 6WP.
   2. Gecombineerd het medium uit putten met hPSCs te differentiëren en wassen van de cellen tweemaal gebruik van 0.5 mM EDTA. Op de tweede wash, wachten 30 s voordat zuigen EDTA, vervolgens 1 mL PBS toe en incubeer gedurende 4-9 minuten bij 37 ° C. Terwijl we wachten, bereiden een steriele buis met 4 mL PBS.
      Opmerking: 1 mL/putje van 6WP is voldoende hoeveelheid EDTA voor wassen. (Belangrijk) Het verdient de voorkeur te gebruiken hPSCs die langer dan 3 dagen in cultuur na de laatste passage, en ten minste 1-2 gangen na het ontdooien waren.
   3. Controleren van de putten onder de Microscoop (doelstellingen: 2.5x/0.06, 5 x / 0,12 Ph0, 10 x / 0,25 Ph1). Als cellen beginnen om los te maken, gratis de cellen door zacht te onttrekken aan de zijkanten van de plaat. De cellen overbrengen in een buis met 4 mL PBS met een 5 mL-pipet.
      Opmerking: (belangrijk) licht spoelen en verpulvering is toegestaan om te breken van kolonies en verzamelen losse cellen, maar het negeren van cellen die gekleefd aan de plaat blijven.
   4. Het toestaan van de buis te zitten voor 10 min op RT, voor de scheiding van de zwaartekracht. Optioneel, centrifugeer de cellen licht (niet groter dan 200 x g bij RT, gedurende 5 minuten) indien nodig.
   5. Aspirate de PBS uit de buis, als u niet wilt verwijderen van de vaste hPSCs, verzorgen resuspendeer de cellen in NMM met 4 ng/mL FGF2 en 10 µM RI, en vervolgens distribueren naar de AA beklede plaat in een 2:1 of 3:1 verhouding. Incubeer bij 37 ° C met 5% CO₂, en niet het medium vernieuwen voor 3 dagen, tenzij vereist (zie stap 3.2.1).
      Opmerking: (Optioneel) voor het gemak van de overdracht van cellen, een deel van het kweekmedium toevoegen aan putjes van de plaat van bestemming vóór verdeling en resuspendeer de cellen in een kleiner volume. Ook kan hPSCs worden gekleurd en geteld om te definiëren van de exacte begin celdichtheid. Het eindvolume in de bestemming plaat moet echter 2,5 mL/putje van 6WP.
2. Handhaven van vrij zwevende differentiatie cultuur bij 37 ° C (5% CO₂)
   1. Check de platen elke dag voor veranderingen in middelgrote kleur, opeenhoping van dode cellen, samendoen en aanhankelijkheid aan goed bodems.
      1. Optioneel: Ongeacht het medium wijziging schema, vernieuwen (met inbegrip van de eerste 3 dagen van no verfrissend) het medium als bleek heeft gele, en volg instructies voor middellange verandering/vernieuwen (stap 3.3). Als de meerderheid van de cellen dode weergegeven, volg de instructies voor middellange verandering/vernieuwen met zwaartekracht scheiding (stap 3.4).
         Opmerking: Vorming van EBs en groei in de grote cel aggregaten worden verwacht, maar cellen en cel aggregaten kunnen samen klomp in grote massa's niet te wijten aan persoonlijke groei/proliferatie. Indien dit wordt waargenomen, is lichte verpulvering te breken van de massa's toegestaan. Als cellen beginnen zich te houden aan het oppervlak van de AA-plaat, kan de resterende inhoud van putten drijvende worden rechtstreeks overgedragen naar nieuwe putten of overgedragen tijdens het proces van middellange verandering/vernieuwen. Probeer niet om over te brengen van cellen die aan de plaat hebben gehouden.
   2. Op dag 3, omzetten in het medium NMM met 4 ng/mL FGF2. Vernieuw het medium om de andere dag.
   3. Op dag 7, omzetten in het medium NMM met 1 µM Retinoic Acid (RA), 100 ng/mL FGF8B en 4 ng/mL FGF2. Vernieuw het medium om de andere dag.
      Opmerking: (belangrijk) RA is lichtgevoelig. RA cultuur monsters beschermen tegen licht.
   4. Op dag 14, omzetten in het medium NMM met 100 ng/mL FGF8B, 100 ng/mL FGF4 en 20 ng/mL FGF2. Vernieuw het medium om de andere dag.
   5. Op dag 17, omzetten in het medium NMM met 100 ng/mL FGF8B. Vernieuw het medium om de andere dag.
   6. Op dag 21, omzetten in het medium NMM met 100 ng/mL hersenen afgeleide Neurotrophic Factor (BDNF) en 10 ng/mL gliale afgeleide Neurotrophic Factor (GDNF). Vernieuw het medium om de andere dag.
   7. Op dag 28, omzetten in het medium NMM met 100 ng/mL BDNF en 10 ng/mL GDNF, 3 ng/mL SAG, 100 ng/mL Neurotrophic Factor 3 (NT3) en 25 mM KCl. Refresh het medium om de andere dag.
   8. Op dag 35, verzamelen de 3D organoids voor analyse.
3. Verandering/vernieuwen differentiatie medium voor 3D cultuur
   1. De vereiste hoeveelheid NMM met de geschikte onderdelen (Zie de stappen 3.2.2-3.2.7 voor component schema) overbrengen in een steriele buis. Warm in een waterbad bij 37 ° C.
   2. Tip van de plaat en schud zachtjes tot de cellen aan de onderrand van de putten regelen. Zorgvuldig verwijderen van 2 mL van een oud medium met behulp van een precisiepipet serologische, vermijden van verwijdering van de cellen, en voeg vervolgens 2 mL verse voedingsbodem. Incubeer bij 37 ° C met 5% CO₂.
      Opmerking: (belangrijk) het einde moet 2,5 mL/putje van 6WP. Als verdamping optreedt, kan niet verwijderen van 2 mL van oude medium als dit verder van de celculturen uitdrogen zou; in plaats daarvan, het toevoegen van extra medium.
4. Verandering/vernieuwen differentiatie medium met zwaartekracht scheiding
   1. De vereiste hoeveelheid NMM met de geschikte onderdelen overbrengen in een steriele buis. Warm in een waterbad bij 37 ° C.
   2. De inhoud van de putten overbrengen in een steriele buis, en laat de buis te zitten voor 10 min op RT, voor de scheiding van de zwaartekracht.
   3. Gebruik een pipet oud medium verwijderen uit de buis, het verzorgen niet te verwijderen geregeld cellen, resuspendeer in NMM met geschikte onderdelen, en vervolgens distribueren naar de nieuwe AA-gecoate putten. Incubeer bij 37 ° C met 5% CO₂.
      Opmerking: (Optioneel) voor gemak, een gedeelte van gestolde voedingsbodem kan worden toegevoegd aan de bestemming wells voorafgaand aan distributie, met differentiatie van cellen geresuspendeerde in een lager volume. Het einde volume moet 2,5 mL/putje van 6WP.

4. protocol 3: Alternatieve 2D differentiatie cultuur

1. Starten en onderhouden van cultuur met behulp van de stappen volgens sectie 3 voor 3D protocol via dag 12
   1. Volg stappen 3.1-3.2.3 en verandering/vernieuwen medium per stap 3.3 en 3.4.
2. Overschakelen naar en te onderhouden als 2D enkelgelaagde cultuur
   1. Op dag 13 van differentiatie, volg de instructies voor verandering/vernieuwen medium met zwaartekracht scheiding (stap 3.4), alleen het verspreiden van de cellen/aggregaten aan PLO/LAM beklede plaat (zie stap 1.6) met een volume van het einde van 2.5 mL/goed van 6WP.
      Opmerking: Het medium kan worden aangevuld met 10 µM RI tijdens het eerste laagje om te helpen de naleving en het voortbestaan van de cellen. (Belangrijk) Het is wenselijk te gelijkmatig op de cellen in de putjes, lage dichtheid of verdringing op de platen te voorkomen, en om de passage (zie stap 4.4) zo nodig. De gewenste grootte van de PLO/LAM gecoate platen (dat wil zeggen, 6WP, 12WP, enz.) moet empirisch worden bepaald, gebaseerd op het tarief van de proliferatie voor de cellijn en doel van het product. Instructies krijgt volumes voor 6WP, en kunnen worden omgezet door halvering voor elke verdubbeling van goed nummer (dat wil zeggen, 2 mL/putje voor 6WP, 1 mL/goed voor 12WP, enz.)
   2. Op dag 14, omzetten in het medium NMM met 100 ng/mL FGF8B, 100 ng/mL FGF4 en 20 ng/mL FGF2. Vernieuw het medium om de andere dag zoals beschreven in stap 4.3.
   3. Op dag 17, omzetten in het medium NMM met 100 ng/mL FGF8B. Vernieuw het medium om de andere dag zoals beschreven in stap 4.3.
   4. Op dag 21, door de middellange tot NMM met 100 ng/mL BDNF en 10 ng/mL GDNF te wijzigen. Vernieuw het medium om de andere dag zoals beschreven in stap 4.3.
   5. Op dag 28, omzetten in het medium NMM met 100 ng/mL BDNF en 10 ng/mL GDNF, 3 ng/mL SAG 100 ng/mL NT3 en 25 mM KCl. vernieuwen het medium om de andere dag zoals beschreven in stap 4.3.
   6. Op dag 35, verzamelen van cellen voor analyse, of te handhaven in hetzelfde medium als stap 4.2.5 voor uitgebreide cultuur (potentiële limiet niet getest).
3. Verandering/vernieuwen differentiatie medium voor 2D cultuur
   1. De vereiste hoeveelheid NMM met geschikte onderdelen (Zie de stappen 4.2.2-4.2.5 voor component schema) overbrengen in een steriele buis. Warm in een waterbad bij 37 ° C.
   2. Het medium uit putten gecombineerd, voeg vervolgens 2 mL nieuw medium. Incubeer bij 37 ° C met 5% CO₂.
      Opmerking: (Optioneel) het einde volume kan worden gehouden bij 2,5 mL/goed voor 6WP, met behulp van een precisiepipet verwijderen van 2 mL van een oud medium en het toevoegen van 2 mL verse voedingsbodem. Reserveren van een gedeelte van de oude kan medium in de putten, en voorkomen dat cellen van contact met de lucht, verminderen schok aan de cellen tijdens verandering stappen.
4. Passage 2D differentiatie cultuur
   1. De vereiste hoeveelheid NMM met de geschikte onderdelen (Zie de stappen 4.2.2-4.2.5 voor component schema) overbrengen in steriele buizen, voor het passaging proces en, afzonderlijk, ter voorbereiding van de PLO/LAM beklede plaat voor het ontvangen van cellen gepasseerd. Een aanvulling op het medium voor de bestemming plaat met 10 µM RI. Warm de middellange buizen op RT, of in een waterbad bij 37 ° C. Op onderdelen wilt besparen, is het mogelijk om NMM alleen gebruiken voor het wassen van cellen tijdens de passaging.
      Opmerking: (belangrijk) als producten worden gebruikt in calcium beeldbewerking experimenten, zorgen naar passage cellen tussen 2 tot 6 dagen vóór het einde van de differentiatie.
   2. Gecombineerd het medium uit putten te worden gepasseerd. 300 µL per putje van dissociatie trypsine gebaseerde agent toevoegen (Zie Tabel of Materials), swirl plaat te dekken wells, dan onmiddellijk verwijderen de dissociatie-agent.
   3. Toestaan dat de plaat te zitten voor 2 min op RT, dan los van de cellen door te onttrekken op de zijden van de plaat. Voeg 600 µL per putje gedefinieerde trypsine remmer (DTI) en de cellen in DTI overbrengen in een steriele buis met 5 mL NMM.
   4. Centrifugeer de buis bij 290 x g gedurende 15 minuten op RT. Aspirate het medium en voeg een andere 5 mL NMM op de buis.
   5. Centrifugeer de buis bij 290 x g gedurende 15 minuten op RT. Aspirate het medium en resuspendeer de cellen in het passende medium met RI.
   6. Verdelen van de cellen op de plaat van de PLO/LAM met behulp van een splitsing verhouding van 1:1-1:12, afhankelijk van de eerste samenvloeiing, proliferatie tarief en differentiële oorsprong aan de plaat van de bestemming, grootte en onderhouden bij 37 ° C met 5% CO₂.

Results

Visueel overzicht van verminderde groei Factor 2D- en 3D-cerebellaire differentiatie protocollen
Figuur 1 toont de algemene tijdlijn voor de 2D- en 3D-cerebellaire differentiatie protocollen, identificeren van extrinsieke factoren en tijd van plating. De typische vooruitgang voor hPSCs 3D cerebellaire differentiatie ondergaan wordt afgebeeld in Figuur 2: met hESC lijn H01 beginnen als kolonies in feeder-vrije cultuur op dag 0 (linkerbovenhoek van de figuur); ondergaan EB vorming door dag 2 (bovenste midden); groeien tot grotere cel aggregaten met herkenbaar lumen na neurale inductie met RA en FGF8 op dag 14 (rechtsboven); vorming van aggregaten van verschillende grootte en vorm op dag 28 (lager links); ontwikkelen in complexiteit met verschillende structuren van een enkele aggregaat aangegeven op dag 28 (lagere midden); en met voortgezet morfologische veranderingen aan de dezelfde structuren ten dage 35 (rechtsonder). De typische vooruitgang voor hPSCs 2D cerebellaire differentiatie ondergaan wordt afgebeeld in Figuur 3: met hESC lijn H01 als kolonies in feeder-vrije cultuur op dag 0 (linkerbovenhoek van de figuur, met de cirkel onder vermelding van gedifferentieerde cellen onder hESC kolonies) ; ondergaan EB vorming door dag 2 (bovenste midden); groeien tot grotere cel aggregaten met herkenbaar lumen na neurale inductie met RA en FGF8 op dag 13 (rechtsboven); prolifererende als Adherente cellen na beplating op dag 14 (lager links); en dan als een monolayer van cellen met een meer complex/oudere morfologie ten dage 35 onder lage (lagere midden) en hoge vergroting (rechtsonder).

3D producten vertonen Markers en structuren van vroege Neuroepithelium
Figuur 2 (lagere linker afbeelding) en Figuur 4 tonen de heterogeniteit van 3D statistische morfologie gezien tijdens het kweken, als gevolg van uiteenlopende groei en/of rijping tarieven, evenals de stochastische samenvoegen of splitsen van aggregaten. Ondanks de heterogeniteit produceert elke differentiatie aggregaten exposeren vroege neurale en neuronale markers, met inbegrip van cerebellaire submodule marker ZIC1, zoals aangegeven door immunocytochemie (ICC) kleuring in Figuur 5. Nog belangrijker, blijkt Figuur 5 en Figuur 6 dat een eenvoudige 3D-cultuur, met verminderde groeifactoren, geschikt voor het genereren van aggregaten met complexe structuren gerelateerd aan de ontwikkeling van de hersenen zoals de vroege neuroepithelium en rhombic lip.

2D producten vertonen cerebellaire merkers en functionele Neuronale activiteit
Terwijl 2D culturen kunnen niet complexe 3D-structuren reproduceren, zijn ze geschikt voor het genereren van cellen exposeren vroege neurale en neuronale markers, met inbegrip van cerebellaire submodule cel marker ZIC1, zoals aangegeven door ICC kleuring in Figuur 7. Gen expressie analyse via RT-PCR, ondersteunt zoals te zien in Figuur 8, ICC kleuring resultaten, hoewel de aanwezigheid van vroege submodule cel markering ATOH1 variabel tussen experimenten en lijnen is. Calcium imaging is gemakkelijker in 2D cultuur behandeld. Zoals te zien in Figuur 9, aanvullende Video 1en aanvullende Video 2, Toon elektrisch gestimuleerd cellen calcium vluchtelingenstromen die kenmerkend voor neuronale afvuren patronen zijn, suggereren generatie van functionele neuronen.

Figuur 1: tijdlijn van differentiatie protocol (vanaf dag 0 van differentiatie). Ononderbroken lijn vakken geven aan wanneer specifieke factoren worden toegevoegd aan het kweekmedium en stippellijn vakken geven aan plaat-coating voor optionele 2D wijziging. Voor FGF2, de pijl-omlaag verwijst naar lagere concentraties (4 ng/mL), en de pijl-omhoog naar hogere concentraties (20 ng/mL). Dit cijfer is gewijzigd van Holmes en Heine¹⁰. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2: vertegenwoordiger helderveld beelden van 3D protocol. hESC kolonies op d0, EBs op d2, aggregaten na inductie op d14, aggregaten van verschillende grootte en morfologie (genummerde 1-5) bij d28, een enkele aggregaat met unieke, herkenbare functies (aangegeven door brieven een-c) op d28, en zichtbare veranderingen in dezelfde functies op d35. Schaal bar = 100 µm. Dit cijfer is gewijzigd van Holmes en Heine¹⁰. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3: vertegenwoordiger helderveld beelden van 2D protocol. hESC kolonies een d0, EBs op d2, aggregaten na inductie op d13, na plating aggregaten op d14, na rijping op d35 zoals gezien op 5 x vergroting en 20 x vergroting. De witte cirkel in het bovenste linker paneel toont het gebied van gedifferentieerde cellen onder hESC kolonies. Schaal bar = 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4: helderveld afbeeldingen tonen van verschillende grootte en complexiteit in 3D cultuur. Aggregaten op (A)-dag 8 (hESCs), en (B) d35 (hiPSCs). De laatste afbeelding is samengesteld uit drie aparte beelden te tonen van de gehele aggregaat. Beide aggregaten kunnen zijn getroffen door het samenvoegen van kleinere aggregaten of verlies (af te breken) van structuren. Schaal bar = 200 µm. Dit cijfer wordt gepubliceerd van Holmes en Heine¹⁰. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 5: ICC beelden van 3D producten tonen relevante markers en structuren. Op cultuur d35, 3D producten vertonen: PAX6 (groen) en TBR2 (rood) door lumen van neurale rozet-achtige formatie (eerste rij); DCX (groen) en NeuN (rood) zich verbreidt vanuit de buitenrand ventriculaire zone (VZ)-zoals structuur (tweede rij); KIRREL2, een marker die zijn gekoppeld aan cerebellaire neuroepithelium (derde rij, links); en ZIC1 een markering gekoppeld aan cerebellaire submodule cellen (derde rij, rechts). Het experiment werd uitgevoerd meerdere keren gebruik van vier verschillende hPSC lijnen: hESC lijn H01 (n = 5), en iPSC lijnen hvs88 (n = 4), hvs60 (n = 3), en hvs51 (n = 1). Pijlen wijzen naar Rhombic lip (RL)-als structuur. Schaal bar = 100 µm. Dit cijfer wordt gepubliceerd van Holmes en Heine¹⁰. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 6: grote schaal ventriculaire zone-achtige structuur in 3D product. Op cultuur d35 is een aggregaat hESC afkomstige positief voor PAX6 (groen) en TBR2 (rood) geassocieerd met vroege neuronen gevonden binnen ventriculaire zones (VZs) en de subventriculaire zones (SVZs), in vivo. (Boven) Een sterretje (*) markeert de apicale zijde van een VZ-achtige regio langs de rand van het gedefinieerde aggregaat met haakjes die aangeeft diepte/verdeling van VZ / SVZs. (midden) samengevoegde signalen show verspreide delen van PAX6 +/ TBR2-cellen grootte naar de bovenste rechterkant van de VZ. (Onder) Hogere vergroting afbeelding van de sectie aangegeven door een rechthoek in het middelste deelvenster. Schaal bar = 100 µm. Dit cijfer is gewijzigd van Holmes en Heine¹⁰. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 7: ICC beelden van 2D producten tonen relevante markers. Op cultuur d35, 2D producten vertonen, uit hESCs (bovenste rij) en hiPSCs (onderste rij), positief voor cellen: submodule cel marker ZIC1 en trekkende cerebellaire neuron marker Label1 (kolom links); en neuronale marker neurofilament (NF) en Label1 (rechter kolom). Schaal bar = 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 8: RT-PCR 2D vanproducten. mRNA uitdrukking analyse van hESC lijn H01 (bovenste rij) en hiPSC lijn hvs60 (onderste rij) aan het einde van de 2D protocol toont producten met de Elektroforese van het gel voor: submodule cel marker ZIC1, submodule cel marker ATOH1, trekkende cerebellaire neuron marker Label1, object cel marker Calbindin (CALB), spanning-afhankelijke calcium kanaal CACNA1A (C-1A), CACNA1E (C-1E), gamma - aminoboterzuur (GABA) B receptor 1 (G-Br1), en huishouding gene EIF4G2).

Figuur 9: Calcium imaging/analyse van 2D producten. Op cultuur d35, werden hPSC differentiatie producten geregistreerd gedurende 2 minuten onder de Microscoop, na incubatie met fluor5 kleurstof. Bij 30 s, cellen werden elektrisch gestimuleerd voor 10 s op 10 Hz. (A) stilstaande beelden Toon hESCs bij 0 s (links) en na het begin van elektrische stimulatie op 30 s (rechts). Pijlen geven aan regio van belang (ROI) voor analyse van calcium toestroom. (B) grafische analyse weergegeven: verandering in de relatieve fluorescentie versus tijd voor ROI (wijzigen in fluorescentie = (F-F₀) / f₀, waar F₀ = (∑F_1-n) / n), met pieken van neuron-achtige voordoen vóór, tijdens, en na stimulatie. Zwarte balk geeft de lengte van elektrische stimulatie. Schaal bar (wit) = 50 µm. volledige opname voor hESC (zoals hier te zien) en een hiPSC lijn (niet afgebeeld) zijn beschikbaar in aanvullende Video 1 en aanvullende Video 2, respectievelijk. Opnames zijn in AVI-formaat, op 4 x snelheid. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Aanvullende Video 1: Calcium imaging video van 2D product uit hESC lijn H01. Op cultuur d35 kleurstof differentiatie producten uit hESC lijn H01 gedurende 2 minuten onder de Microscoop, na incubatie met fluor5 werden geregistreerd. Bij 30 s, cellen werden elektrisch gestimuleerd voor 10 s bij 10 Hz. de opnamen werden gemaakt op 2 frames/s, en verwerkt tot AVI video op ~ 7 frames/s, produceren een video duurt ~ 30 s, ~ 4 x snelheid. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Video 2: Calcium imaging video van 2D product uit hiPSC lijn hvs51. Op cultuur d35, werden differentiatie producten uit hiPSC lijn hvs51 geregistreerd gedurende 2 minuten onder de Microscoop, na incubatie met fluor5 kleurstof. Bij 30 s, cellen werden elektrisch gestimuleerd voor 10 s bij 10 Hz. de opnamen werden gemaakt op 2 frames/s, en verwerkt tot AVI video op ~ 7 frames/s, produceren een video duurt ~ 30 s, ~ 4 x snelheid. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Complexiteit en de kosten zijn relevante factoren voor stamcel onderzoekers wanneer kiezen of ontwikkelen van differentiatie protocollen. Dit is vooral waar als het is een open vraag voor hoeveel externe controle is vereist voor het genereren van de gewenste celtypes, of — vormen het anders — hoe bevoegde hPSCs zijn op het produceren van hun eigen ontwikkelings omgeving, als aan zichzelf overgelaten met voldoende voedingsstoffen. Invoering van extrinsieke factoren in vitro kan heel goed gewenste cel producten produceren, maar ze ook kunnen interfereren met de intrinsieke developmental capaciteiten cellen zou hebben tentoongesteld in vivo. Dergelijke overwegingen zijn belangrijk, met name als het doel gebruik van patiënt-afgeleide iPSCs voor ziekte modelleren is. Extensief gebruik van patronen en/of factoren die de groei kan ziekte fenotypen maskeren. De protocollen die in dit verslag beschreven volgen de trend van eerdere studies te verminderen van complexiteit, kosten en/of het gebruik van patronen van extrinsieke factoren^8,9.

Op basis van resultaten gerapporteerd door Muguruma et al., en onze eigen recente studie, blijkt dat het mogelijk is te bereiken van differentiatie naar cerebellaire lot zonder gezamenlijke inspanningen te reproduceren in vivo voorwaarden, zoals eerdere studies hebben gedaan ^{1 , 2 , 3 , 4 , 8 , 10}. het intrigerende deel is dat de twee studies verschillende sets van groeifactoren gebruikt, suggereren dat noch set noodzakelijk waren, hoewel beide FGF2 gebruikt. We liepen aanvullende tests, waar FGFs selectief uitgesloten van het protocol, en toonde aan dat cellen geschikt waren voor het genereren van dezelfde producten zonder extrinsieke FGFs-¹⁰. Verschillen tussen onze studies waren gekwalificeerd door het feit dat we verschillende hPSC lijnen en cultuur-methoden gebruikt Neurale differentiatie met RA geïnduceerde en onderdelen opgenomen ter ondersteuning van de overleving van de cel van de submodule en rijping (BDNF, GDNF SAG en KCL)^{11 -14}. Daarnaast is het een minder complexe opstartmethode, ten opzichte van Muguruma et al., werkte. Hun protocol begon door het genereren van uniform EBs in 96WPs, die hen fysisch en chemisch geïsoleerd van elkaar. Het protocol hier had alle PSC's relatief druk samen in 6WPs tijdens EB vorming, waardoor ze vrij communiceren. Hoe dit kan hebben differentieel beïnvloed de fysische en chemische milieu van EBs en later organoids (met inbegrip van intrinsieke productie van signalering van verbindingen) is onbekend, en kan worden onderzocht. Ook, terwijl wij uitdrukking van tonen genen geassocieerd met — en zo suggestief van-cerebellaire oorsprong, gelegen binnen structuren morfologisch vergelijkbaar zijn met die gemeld door Muguruma et al., we kunnen niet uitsluiten generatie van neuronale-achtige structuren die zijn van niet-cerebellaire identiteit. Toekomstige studies, met behulp van een groot paneel van antistoffen zoals die gerapporteerd door Muguruma et al. (dat wil zeggen, ATOH1, CALB, etc.) wil dergelijke toewijzingen, en de vergelijking tussen producten van beide protocollen, meer overtuigend.

Binnen het 3D-protocol, het is belangrijk om te beginnen met en handhaven van een voldoende aantal cellen in een cultuur om voldoende aantallen eindproducten voor analyse. Gezien de aanzienlijke die-off vroeg in het protocol, we raden aan te beginnen met meer dan 500 EBs per putje tijdens de eerste 3 dagen in cultuur (Figuur 1). Dit moet niet moeilijk te bereiken bepaald kolonie maten voor hPSCs in feeder-vrije cultuur, maar misschien niet zo gemakkelijk voor degenen die nog steeds met behulp van feeder-afhankelijke methoden. Gezien het grote aantal cellen, is het belangrijk om op te letten voor kleurverandering in het medium (met vermelding van pH-veranderingen), en accumulatie van dode cellen. Beide moeten worden gecorrigeerd om te voorkomen dat instorting van de cultuur. Er kan ook worden samendoen van cellen en aggregaten in massieve structuren. Hoewel het nog steeds leiden aggregaten die kunnen worden geanalyseerd tot kan, zal product hoeveelheid sterk worden verminderd, zodat ze breken in kleinere aggregaten met zachte verpulvering nuttig kan zijn. Vermijd echter verontrustende normale aggregaten, die zelf kunnen groeien tot grote maten (Figuur 4). Als aggregaten te schaars geworden, is het raadzaam om te putten combineren zodat aggregaten niet volledig geïsoleerd zijn. Product variabiliteit (in aantal, de grootte en morfologie) is een bekende kwestie in 3D-celkweek, met inbegrip van voor die beginnen met geïsoleerde, uniforme EB vorming stappen, suggereren dat een minder complexe opstarten procedure (zoals het hier beschreven protocol protocollen ) zou praktischer^8,15. Terwijl deze heterogeniteit is iets wat onderzoekers nodig in gedachten te houden, met name tijdens de analyse, het gerapporteerde protocol gegenereerd producten consistent zijn met die gevonden in andere 3D protocollen^8,9,15. Op basis van grootte en morfologie, vallen zij binnen het bereik van neurale rozet aan cerebrale organoid, zoals beschreven in een recente review door Kelava en het huis Lancaster¹⁵, met de meeste montage van de classificatie van sferoïde. Bijzonder opmerkelijk zijn, zijn de aanwezigheid van 3D structuren suggestief van neurale rozetten met lumen, (sub) ventriculaire zones en rhombic-lip als kenmerken (Figuur 5 en Figuur 6) zoals aangegeven door andere groepen^{8 , 15 , 16 , 17}. Aangezien elk experiment ten minste één produceerde statistische met vermeende VZ/SVZs en cerebellaire-geassocieerde markeringen (ZIC1, KIRREL2), die zijn nuttig criteria voor het bepalen van het succes van een 3D differentiatie ons protocol, met RL-achtige functies bieden van extra ondersteuning. Uitbreiding van de lengte van cultuur afgelopen 35 dagen is niet getest, maar kan worden nagestreefd om te bepalen van de maximale omvang van groei, complexiteit en looptijd toegestaan door deze techniek.

Het 2D-protocol gebruikt dezelfde niet-aanhanger EB vorming en neurale inductie proces als het 3D-protocol en zo de reacties hierboven ook toe te passen. Zodra verguld, kan een andere set van overwegingen moet worden beschouwd. De EBs moet snel houden voor cellen te verspreiden naar buiten op het bord. Als er problemen met naleving, toevoeging van RI (indien niet reeds gebruikt), verminderd volume medium of experimentele veranderingen in de concentratie van de PLO/LAM kunnen worden toegepast. Het is belangrijk dat cellen groeien te dichte of sparse (bij voorkeur volwassen tussen 20-80% confluentie) in de putten; dagelijkse controle en tijdige passaging is belangrijk, om te voorkomen dat over-confluentie of zwevende cellen. In tegenstelling tot het 3D protocol mag er geen significante die-off tijdens cultuur, hoewel er mogelijk gebieden van zwakke groei, of een vertraging van de proliferatie tarieven. Passaging is van invloed op de toestand van de rijping van cellen (bijvoorbeeld het verwijderen van cel processen en ontwikkelde netwerken tussen cellen) en moet in gedachten worden gehouden bij het naderen van de punten waar cellen zullen worden verzameld en geanalyseerd op een bepaalde manier. Bijvoorbeeld op calcium is imaging het zeer belangrijk aan passage cellen tussen 2 tot 6 dagen vóór de analyse. Te dicht bij passaging kan analyse betekenen cellen hebben geen tijd gehad om verbinding en/of volwassen, en te ver kan resulteren in cellen overbevolking, imaging bemoeilijken. Hoewel variabiliteit tussen de experimenten kan bestaan, komen resultaten overeen met die vermeld in de aanvankelijke 2D cerebellaire protocollen^1,2. ICC kleuring en gen expressie analyse bevestigen de aanwezigheid van cellen positief voor submodule cel marker ZIC1, terwijl het ook het identificeren van markeringen die zijn gekoppeld aan andere neurale en cerebellaire identiteiten (Figuur 7 en Figuur 8). Calcium imaging, waarbij de elektrische stimulatie van cellen geïncubeerd met fluor5 kleurstof, aangegeven functionele Neuronale activiteit (Figuur 9, aanvullende figuur 1en aanvullende figuur 2), hoewel het is niet bevestigd als deze submodule cellen waren. Het is betwistbaar dat doordat cellen meer tijd om te rijpen door de uitbreiding van de lengte van cultuur afgelopen 35 dagen, het bedrag van functionele Neuronale activiteit moet stijgen. Dit potentieel kan in de toekomst worden onderzocht.

Naast de lijnen van het onderzoek hierboven voorgestelde, zou het van belang om te bepalen van verschillen in product identiteiten (kwantiteit en kwaliteit) tussen de 2D- en 3D-protocollen. Het belang van Extrinsieke FGFs werd niet getest in het 2D protocol, en het zou zinvol zijn om te weten of gebrek aan 3D-structuur na beplating, en dus de bijbehorende signaalroutes, zou zorg 2D culturen meer of minder afhankelijk van die vroeg patronen verbindingen. Meer uitgeklede protocollen (bijvoorbeeldgeen RA, BDNF, SAG) zijn even plausibel lijnen voor verder onderzoek. Tot slot, toekomstige studies kunnen profiteren van nieuwe onderzoekstools beter karakteriseren (en beoordelen van de efficiëntie van de generatie van) mens-specifieke cerebellaire neuronale subtypen.

Met de bepaalde kanttekeningen in het achterhoofd, beide gemeld protocollen voor cerebellaire differentiaties, met producten die geschikt zijn voor verschillende doeleinden kunnen worden gebruikt. Ze kunnen dienen als praktische uitgangspunten voor onderzoekers uitvoering van de pilotstudies, testen van de levensvatbaarheid van de cellijnen voor dergelijke differentiaties, of als een basismodel voor andere soorten gerichte Neurale differentiatie.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12+Glutamax	Gibco	31331-028	glutamine fortified DMEM/F12
Neurobasal medium	Gibco	21103-049	neural basic medium
N2 supplement	Gibco	17502-048
B27 supplement	Gibco	17504001
Insulin	Imgen	PT468-B
L-glutamine	Gibco	25030-024
Non-essential Amino Acids (NEAA)	Gibco	11140-035
beta-mercaptoethanol	Gibco	21985-023
Poly-L-Ornithine	Sigma	P3655
Poly (2-hydroxyethyl methacrylate)	Sigma	P3932	aka Poly-Hema
Laminin	Sigma	L2020
E8 medium and supplement	Gibco	A1517001	hPSC medium and supplement
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122
Sodium Chloride	Sigma	S-5886
y-27632 (ROCK inhibitor)	SelleckChem	S1049-10mg
DMSO	Sigma	D-2650
Geltrex	Gibco	A1413302	hPSC-appropriate adherent coating (PAAC)
0,5M EDTA	Gibco	15575-020
0.2 um filter	VWR	28145-77
1.5 mL Eppendorf tube	VWR	525-0130
DMEM/F12	Gibco	21331-020
Ethanol	VWR	83804360
Parafilm	Sigma	PM996	wrap for culture plates
cryotubes	ThermoFisher	368632
TrypLE	Gibco	12563-029	trypsin-based dissociation agent
Defined Trypsin Inhibitor (DTI)	Gibco	R-007-100
FGF-2	Peprotech	100-18B
FGF-4	R&D Systems	100-31
FGF-8B	Peprotech	100-25
Retinoic Acid	Sigma	R2625
Brain Derived Neurotrophic Factor	Peprotech	450-02
Glial Derived Neurotrophic Factor	Peprotech	450-10
Potassium Chloride	Sigma	P5405
Neurotrophic Factor 3	Peprotech	450-03
Smoothened Agonist (SAG)	Cayman	11914	CAS 912545-86-9
Axiovert 40C microscope	Zeiss		Brightfield imaging microscope
Axiocam	Zeiss		Brightfield imaging - image aquisition
Eppendorf Centrifuge 5810	Eppendorf	521-0996	centrifuge for cell culture
PBS (gebufferde natrium oplossing)	Braun Medical	3623140
5 ml Serological pipets	VWR	612-4950
10 ml Serological pipets	VWR	612-4951
6-wells culture plates	VWR	734-2323
12-wells culture plates	VWR	734-2324
hESCs	WiCELL		line H01