Een eenvoudige methode voor High Throughput chemische Screening in Caenorhabditis Elegans

Samenvatting

Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor het snel produceren van honderden nematode groei media agar, 96-Wells cultuur platen met een consistent aantal Caenorhhabditis elegans per putje. Deze culturen zijn nuttig voor de fenotypische screening van hele organismen. Hier richten we ons op met behulp van deze culturen op scherm chemicaliën voor Pro-levensduur effecten.

Samenvatting

Caenorhabditis elegans is een nuttig organisme voor het testen van chemische effecten op de fysiologie. Hele organisme klein molecuul schermen bieden aanzienlijke voordelen voor het identificeren van biologisch actieve chemische structuren die complexe fenotypen zoals levensduur kunnen wijzigen. Hier beschreven is een simpel protocol voor het produceren van de honderden van cultuur van de 96-wells-platen met vrij constant aantallen C. elegans in elk putje. Vervolgens opgegeven we het gebruik van deze culturen naar scherm duizenden chemicaliën voor effecten op de levensduur van de nematode C. elegans. Dit protocol maakt gebruik van het temperatuur gevoelige steriele muizenstammen, agar plaat voorwaarden en eenvoudige dier behandeling ter vergemakkelijking van de productie van de snelle en hoge doorvoer van gesynchroniseerde dierlijke culturen voor screening.

Inleiding

Hier is een protocol beschreven die is ontwikkeld voor hoge throughput screening van chemische verbindingen voor effecten op Caenorhabditis elegans levensduur. Het protocol zelf is gemakkelijk aan te passen aan andere fenotypische schermen, met inbegrip van studies met behulp van verslaggever C. elegans stammen. Dit protocol werd met succes gebruikt ter identificatie van een roman biologisch actieve verbinding, NP1 (nitrofenyl-piperazine 1), dat sterk zich uitstrekt van de levensduur van C. elegans door middel van een dieet beperking mechanisme. NP1 en een karakterisering van het effect op de levensduur, met inbegrip van een beschrijving van de genetische trajecten in het spel, was eerder elders¹beschreven. Dat verslag ook een beschrijving van de resultaten van een grootschalige toepassing van het scherm bevat. Hier beschrijven we in veel gedetailleerder de methodologie en de setup van het scherm zelf, dat is schaalbaar voor zowel klein - en grootschalige toepassingen.

Het doel dat tot de oprichting van het protocol hier beschreven leidde was het ontwikkelen van een C. elegans cultuur platform dat is toegestaan voor de snelle screening van grote chemische bibliotheken voor roman biologisch actieve verbindingen. Terwijl chemische schermen hebben verricht voorafgaand aan de ontwikkeling van dit protocol, dit waren voornamelijk kleinschalige en/of kandidaat-type benaderingen^2,3. Inderdaad, de meeste van de schermen in het lab op tientallen verbindingen uitgevoerd gebruikt stress weerstand testen, met hits vertoond voor levensduur effecten⁴. Deze studie willen in plaats daarvan rechtstreeks scherm voor levensduur effecten. Opmerkelijk is, waren er enkele beschrijvingen in de wetenschappelijke literatuur op het moment van uitvoeren van grootschalige chemische schermen met C. elegans. Inderdaad, in vergelijking met andere soorten schermen^5,6,7, grootschalig chemische onderzoek met behulp van C. elegans leek onder-dienst.

Er waren twee beschrijvingen van grote schaal chemische schermen in C. elegans die werden gebruikt als een basis om deze aanpak te ontwikkelen. De eerste daarvan was een elegante studie van Peter Roy's laboratorium met behulp van chemische schermen te identificeren van verbindingen die de ontwikkeling van dieren kon erover. De studie daarna gevolgd met een voorwaartse mutagenese scherm te identificeren van de genetische doelstellingen van deze chemische stoffen⁸. Het protocol beschreven in deze studie gebruikt 24-well pates, die was gewoon onwerkbaar zijn voor de specifieke behoeften van deze studie (beperkte hoeveelheden van de chemische stof in de bibliotheek en de beperkt beschikbare incubator space). De andere studie was Michael Petrascheck van innovatieve en ambitieuze kleine-molecuul scherm voor levensduur verlenging van chemicaliën^9,10. Deze studie gebruikt 384-Wells-platen en vloeibare culturen. Het andere belangrijkste kenmerk van dit scherm is het gebruik van FUDR (5-fluorodeoxyuridine) voor de chemisch remming van de productie van nakomelingen. Na aanzienlijke afweging van het protocol beschreven in deze studie werden zowel chemische sterilisatie en vloeibare culturen van C. elegans vermeden.

Hoewel FUDR wijd in C. elegans levensduur experimenten gebruikt wordt, waren er bezorgdheid dat de FUDR leiden onverwachte drug-interacties tot kan, of die FUDR zelf kan enig effect op levensduur hebben. Onlangs is deze laatste zorg gevalideerd, ten minste op bepaalde concentraties en in het bijzonder bij 25 ° C¹¹. Om te omzeilen het probleem van contaminatie van de nakomelingen, C. elegans stam TJ1060 werd gebruikt, die herbergt twee onafhankelijke temperatuur gevoelig mutaties (spe-9 (hc88) ik; rrf-3(b26)II) dat afschaffing van de productie van zaadcellen en hebben aangetoond dat nuttig massa culturen van synchrone populaties¹². Deze stam was volledig steriel bij 25 ° C, maar zal produceren nakomelingen wanneer gekweekt bij 15-20 ° C. Deze studie gebruikt conventionele kweekomstandigheden, met wormen kruipen op het oppervlak van de agar, zoals resultaten van vloeibare culturen niet altijd kunnen worden gereproduceerd met conventionele agar platen zijn. Terwijl dit verschijnsel niet volledig wordt begrepen, is gebleken dat wormen in vloeibare reageren naar DR (dieet beperking) op een andere manier dan wormen gekweekt op standaard media^{13,14 gekweekt}. Het is daarom aannemelijk dat vloeibare media sommige DR mimetics die anders zouden worden geïdentificeerd met het scherm kan maskeren.

Gelet verrekend op agar kweekomstandigheden, werden verschillende opties voor het scoren van de prestaties van putten in deze test beschouwd. Terwijl verschillende geautomatiseerde of imaging gebaseerde testen beschikbaar waren, noodzaakten zij overname en implementatie van de technisch uitdagende apparaten, waarvan de meeste onbetaalbaar werden. Terwijl bestudering van deze opties, was het essentieel om te verwijzen naar eerdere schermen van de levensduur van alle soorten. Uiteindelijk, deze studie gebruikt een scoring methode aangepast vanuit de Siu Sylvia Lee Lab hele genoom RNAi scherm voor levensduur fenotypen¹⁵. In het bijzonder alle levensduur platen werden opgericht op dezelfde manier, maar alleen de negatieve controles werden gecontroleerd. Zodra de negatieve controle platen werden bevestigd te hebben in de buurt van volledige sterfte, gescoord test platen met de hand. In dit grote scherm werden positieven bevestigd door het opnieuw testen met vers bereide chemicaliën, met behulp van drievoud herhalingen van de primaire positieven.

Protocol

1. voorbereiding van de Buffers

1. De pond-Bouillon
   1. Gebruik van vooraf gemengde korrels (Zie Materialen tabel) en volg fabrikant protocol voor voorbereiding.
2. Nematode groei Media (NGM) Agar
   1. Meng 23 g agar, 3 g NaCl, 2,5 g bacto pepton, en gedeïoniseerd water te 0.972 L. autoclaaf en laat koel tot 60 ° C, dan Voeg 25 mL van de 1 M kalium (KPO₄) fosfaatbuffer (pH 6.0), 1 mL van de 1 M magnesium-sulfaat (MgSO₄) , 1 mL 1 M calciumchloride (CaCl₂), en 1 mL van 5 mg/mL cholesterol (in ethanol).
3. Hypochlorietoplossing
   1. Meng 5 mL van 5 M KOH, 4 mL oplossing van natriumhypochloriet (6%) en gedeïoniseerd H₂O tot een totaal volume van 50 mL.
4. S basale
   1. Meng 5 g NaCl, 1 g K₂HPO₄, 6 g KH₂PO₄en -geïoniseerd water tot 1 L, vervolgens autoclaaf.

2. bereiding van geconcentreerde E. coli (OP50)

Opmerking: Deze stap concentreert zich van 1 L voor de oplossing van een verzadigde E. coli in 25 mL S basale buffer.

1. Inoculeer 5 mL gesteriliseerde met autoclaaf de pond-Bouillon (stap 1.1) met een enkele kolonie van E. coli (OP50 stam) en incubeer gedurende 4-6 uur bij 37 ° C met schudden (250 rpm). 0,1 mL van deze oplossing gebruiken om te enten 1 L voor LB in een erlenmeyer van 2 L. Incubeer de 1 L flacons 's nachts (12-16 h) bij 37 ° C met schudden (250 rpm).
2. Centrifugeer 1 L overnachting culturen in flessen van 500 mL centrifuge voor 5 min op 10.000 x g- en 4 ° C tot de bacteriën pellet en decanteren weg overige media. Resuspendeer de pellet in 25 mL S basale (stap 1.4). Bewaren bij 4 ° C.

3. bereiding van NGM cultuur platen

1. Afzien voor massacultuur platen gebruikt voor de productie van grote aantallen wormen, 30 mL gesmolten (60 ° C) NGM agar (stap 1.2) in een laminaire flow kabinet op 10 cm cultuur platen met een geautomatiseerde vloeistof verstrekking apparaat of een serologische pipet. Laat droog 's nachts.
2. Pipetteer 2 mL van geconcentreerde OP50 op elk bord van 10 cm, verspreid volledig de agar oppervlak om door te bedekken kantelen en draaien van de plaat, laat platen te drogen. Opslaan platen bij 4 ° C voor maximaal 2 weken.
3. Voor hoge-doorvoer assay cultuur platen gebruikt voor screening, gebruiken een geautomatiseerde 8 kanaals dispenser als u wilt afzien van 0,15 mL gesmolten NGM agar in ieder putje van een 96 goed plaat in een laminaire flow-kast. Wees voorzichtig om zeker putten zijn verstoken van bubbels, zoals deze staat zal stellen gravende van wormen die de bepaling in dat goed in gevaar zal brengen. Laat droog 's nachts. Opslaan platen bij 4 ° C voor maximaal 2 weken.

4. voorbereiding van temperatuur gevoelig (ts) steriele C. Elegans massa culturen

1. Om te beginnen van culturen, met behulp van een 'worm pick' (een glazen pipet met een bijgevoegde platina-draad of een vervaardigde worm Kies) onder een Microscoop ontleden, overdracht 20 eieren (TJ1060 stam: spe-9 (hc88) ik; rrf-3(b26)II) op massacultuur plate(s) bereid in stap 3.1. Vervolgens, incubeer platen bij 20 ° C voor 6 dagen (mogelijk meer dan één generatie van groei, zoals u zich richt op voor de verzameling van de nakomelingen van de 20 eieren verplaatst).
2. Aanwezigheid van gravid volwassenen (eieren in de baarmoeder aanwezig) met een ontleden Microscoop visueel te bevestigen. De gravid volwassenen verzamelen door verstrekking van 2-3 mL S basale op het bord met behulp van een precisiepipet glas. Swirl de vloeistof rond de plaat met de hand, en vervolgens de vloeistof in een tube van 15 mL met behulp van een precisiepipet glas verzamelen.
3. Spin naar beneden de buis (1.000 x g voor 1,5 min bij 20 ° C) naar pellet wormen en gecombineerd uit supernatant. Voeg 10 mL hypochlorietoplossing (stap 1.3) naar de worm pellet en snel schud de buis met de hand in de richting van een top-to-bottom voor 5 s. Incubate gedurende 5 minuten, schudden elke 2,5 min.
4. Nogmaals, de spin naar beneden de buis (1.000 x g voor 1,5 min); de pellet moet geelbruin. Gecombineerd uit het supernatant. Voeg toe 10 mL hypochlorietoplossing aan de ei-pellet en krachtig schud de buis. Incubeer 1-3 min, met af en toe schudden, en terwijl het toezicht uiterlijk met de ontleden Microscoop. Visueel bevestigen alleen eieren blijven, en gaat u verder met de volgende stap.
5. Draai naar beneden de buis (1.000 x g voor 1,5 min) en gecombineerd uit het supernatant. De pellet moet wit met geen bruine verkleuring.
   Opmerking: Na de verwijdering van de hypochlorietoplossing, het is cruciaal voor het gebruik van steriele technieken en buffers, sinds besmetting (bacteriële en schimmelinfecties, in het bijzonder) kan ruïneren het experiment, verspilling van kostbare tijd en reagentia. Deze studie gebruikt een gefilterde laminaire flow-kast en verplaatst vloeistoffen met alleen steriele pipetten en tips.
6. Open de tubes in een steriele ruimte. De pellet 3 keer met S basale, spinnen bepaald (1.000 x g voor 1,5 min) en aspirating weg het supernatant telkens wassen. Resuspendeer de pellet ei in 2-3 mL S basale. Deze eieren kunnen nu worden gebruikt voor een nachtelijke arcering in de buffer voor het verzamelen van L1 larve (stap 5).

5. C. Elegans broedeieren in Buffer om synchrone culturen (voorbereiding L1 larvale C. Elegans )

1. Decanteer de ei pellet en buffer in een petrischaal steriele glas met een deksel. Spoel de resterende eieren uit de buis in een schotel met behulp van een serologische precisiepipet met 2-3 mL S basale. Voeg 5 mL van basale S om te verlichten van de verdringing, dit kan het aanmoedigen van broedeieren, zoals licht schudden (20 rpm met een buikdanseres roteerschudapparaat). Na een nacht bebroeden bij 20 ° C, om eieren te Luik (16-24 uur). Alle hatchlings zal arresteren in de 1^st larvale stadium (L1) te wijten aan gebrek aan voedsel.
   Opmerking: Anekdotisch bewijs geeft aan dat verse bereidingen van de L1 (16-36 uur na de eicelpunctie) de meest synchrone populaties van volwassen wormen genereren.
2. Verzamelen L1s in een tube van 15 mL met een serologische pipet. Spin down L1s in een centrifuge (1.000 x g voor 1,5 min), gecombineerd weg het supernatant en herhaal tot alle L1s zijn verzameld van broedeieren platen, terwijl 10 mL S basale voor de volgende stap.
3. Uit de buis met L1s, micropipet uit 0,01 mL (onmiddellijk na het mengen) en afzien van het op een unseeded (geen E. coli) NGM plaat. Het aantal L1s op de plaat. Herhaal 10 keer en het verkrijgen van een gemiddelde voor het aantal L1s in elk aliquot. In het algemeen verwachten tussen 1-3 L1s per µL (bij het starten met 1 massacultuur plaat met 20 eieren).
4. Vastgesteld met een serologische pipet wat de omvang van S basale houden van de L1s. Vervolgens met de vastgestelde gemiddelde aantal wormen per 0,01 mL, verkregen in de vorige stap, om een schatting van het totale aantal L1s te extrapoleren. In het algemeen verwachten tussen 10.000-30.000 L1s (per massacultuur plaat met 20 eieren).
5. Voor het gebruik van deze cultuur in 96-Wells assay, Verdun de L1-schorsing tot 1 L1 per µL in een fles steriel ronde media, dan gaat u verder met stap 7. Als deze cultuur wordt gebruikt voor het genereren van extra C. elegans massa van culturen, dan gaat u verder met stap 6.

6. grote schaal synchrone cultuur voorbereiding

Opmerking: L1 oplossingen kunnen worden gebruikt om te snel verhogen worm populaties.

1. Voor het genereren van grote worm getallen met een oplossing van L1, afzien tot 5.000 L1s op elk gewenste aantal massacultuur platen. Verzamelen van gravid volwassenen 2,5 dagen later (20 ° C), zoals beschreven in stappen 4.1-2, en ga naar stap 4.3 voor het verzamelen van de eieren.
2. Zoals het anekdotische geconstateerd dat herhaald hypochloriet collectie kan stress de onderworpen bevolking, splitsen populaties door eieren plukken voor vermeerdering vóór het onderwerpen van de resterende bevolking hypochloriet behandelingen, zo dat meerdere generaties van de bevolking zijn niet herhaaldelijk onderworpen aan hypochloriet oplossing behandeling.

7. installatie van Assay 96-wells-platen

1. Laat de platen van de assay (bereid in stap 3.3) tot kamertemperatuur. Dan, in een laminaire flow kabinet, voeg 5 µL van geconcentreerde OP50 (bereid in stap 2.2) aan elk putje. Als voorheen, gebruiken een geautomatiseerde 8 kanaals dispenser.
2. Voeg 10 µL van L1 schorsing aan elk putje met behulp van een geautomatiseerde 8 kanaals dispenser. Dit zal opleveren op gemiddelde 10 wormen per putje, aangezien zij in de opschorting op 1 L1 per µL aanwezig zijn. Ter bevordering van gelijke verdeling van de L1s van de drijfmest, afzien van een fles van de ronde media actief gemengd met een matig langzaam draaiende L1s roer bar.
3. Afdekplaat met deksel, vak batches van platen, en Incubeer bij 25 ° C gedurende 2 dagen.

8. behandeling van de 1 ^st dag volwassen C. elegans met chemicaliën

1. Verwijderen van chemische bibliotheek platen uit de vriezer, en laat de platen tot kamertemperatuur voordat u verdergaat.
   Opmerking: Chemische bibliotheek platen zoals hier beschreven zijn 96 goed platen met discrete verbindingen in elk putje, die allemaal zijn op dezelfde concentratie en ontbonden in DMSO. Deze bibliotheken doen geen gebruik maken van de buitenste kolommen, en dus elke plaat heeft een maximum van 80 verschillende chemicaliën. In het protocol beschreven hier, is de concentratie van de bibliotheek 10 mM. Het is belangrijk om te overwegen oplosmiddel effecten op fenotypen. Terwijl deze studie bij een concentratie van 0,5% DMSO schermen, werd dit niveau nooit overschreden in deze testen levensduur en lage doorvoersnelheid testen, waar het is meer waarschijnlijk te halen van een samengestelde stockoplossing concentratie. Dit protocol niet meer dan 0,25%, een niveau waarop levensduur wijzigingen niet¹⁶, ten minste in de stam van de N2 komen.
2. Voorzichtig schudden plaat op 60 rpm op een microplate-shaker voor 1 min onmiddellijk voorafgaand aan het gebruiken.
3. Met behulp van een geautomatiseerde 96-Wells vloeibare handler, overdracht 0,75 µL van samengestelde (of DMSO) van de plaat van de bibliotheek aan de assay-plaat. De diepte van de pipet tijdens vloeibare levering aan de assay plaat wordt zorgvuldig gecontroleerd zodanig dat de uiteinden van de Pipet van de vloeibare handler zijn het leveren van het 0,75 µL volume aan de ~ 15 µL van vloeistof op het oppervlak van de agar (met wormen en geconcentreerde OP50 van stappen 7.1 -2) en doet niet doorboren de agar oppervlak in de put. Gebruik geen handleiding 8 of 12 meerkanaals pipetten behalve in zeer kleine schermen (< 10 platen), aangezien zij verhogen van kunnen fout en vaak leiden tot prikken van het oppervlak van de agar, waarin de bepaling in het gedrang brengt.
4. Bereiden chemische bibliotheek negatieve controle platen met DMSO (dimethylsulfoxide), ervan uitgaande dat de bibliotheek wordt getest wordt DMSO als het oplosmiddel gebruikt. 1 plaat van de negatieve controle voor elke 5 testen platen, tot 10 negatieve controle platen maken. Indien mogelijk, ook het maken van een plaat van de positieve controle (NP1,¹ op 20 mM, voor een definitieve bepaling concentratie van 0,1 mM, is van kracht voor dit doel; Zie vertegenwoordiger resultaten afdeling). Voeg geen chemicaliën (test of besturingselement) aan de 2 buitenste kolommen van de platen, zoals ze vooral gevoelig voor uitdroging zijn.

9. het drogen van culturen

1. Droog wilt verwijderen vloeistof uit het oppervlak van de agar, platen in de laminaire flow kabinet voor 4-8 h. Het is essentieel dat deze platen volledig worden gedroogd maar niet verdroogde doen geworden. Zoals sommige platen zal langer duren om te drogen dan anderen, alle platen in de gaten en verwijderen zodra ze droog zijn. Bevestigen drogen door zorgvuldige visuele controle van de individuele putjes van de plaat.
   Opmerking: Afhankelijk van factoren die het tarief van de uitlaat van het kabinet, de tijd die hiervoor nodig moet worden empirisch bepaald. Deze drogen stap kun je ongeveer 4-8 h voor een volledige kabinet.
2. Platen met doorzichtige folie afdichting, zet dan op de deksels van de plaat.
3. De bepaling van de 96-wells-platen voor 45 spin s bij 1.000 x g.
4. Winkel platen omgekeerd bij 25 ° C.

10. scoren C. Elegans culturen voor lange levensduur

1. Negatieve controle platen tot controleren > 95% sterfte wordt waargenomen. Platen per week gedurende de eerste twee weken en dagelijks daarna controleren. Caenorhabditis cohorten van de hetzelfde stam en soorten kunnen beduidend verschillend levensduur weergeven door proef¹⁷.
   Opmerking: Voor de bepaling van de levensduur hier beschreven, met TJ1060 dieren gekweekt bij 25 ° C, 95% sterfte in deze populaties opgetreden van volwassene dag 16-20.
2. Wanneer negatieve controleputjes worden geacht te hebben bereikt de > 95% markeren, spin down alle assay 96-wells-platen voor 45 s op een tafelblad centrifuge met een microplate aangepast rotor (250 x g voor 45 s bij 20 ° C).
3. Score van alle putjes in de platen van de controle. Dit wordt gedaan door tellen en registreren van het aantal levend en dode dieren in elk putje. Dode wormen kunnen van levend wormen worden onderscheiden door hun gebrek aan beweging. Verkeer in levend wormen veroorzaken door het neerzetten van de 96 goed plaat van ongeveer 7 cm op het ontleden Microscoop oppervlak terwijl u door het oculair voor elke evoked respons. Dode wormen zal niet reageren en nabijgelegen lab mates niet het repetitieve lawaai kunnen waarderen.
4. Voor de test platen, tellen en registreren alleen putten met levende wormen. Wanneer een levende worm wordt waargenomen, tellen alle levend en dode dieren in dat goed, samen met de goed positie en plaat.
   Opmerking: Het is vaak handig te scoren opnieuw de platen na > 99% van de negatieve controle wormen dood zijn. Dit is in grote schaal schermen, het beste punt om te doen de eerste scoren. In beide gevallen score/re-score zoals hierboven beschreven

11. opnieuw testen van verbindingen

1. Bij het testen van slechts een klein aantal kandidaat-stoffen (< 320 verbindingen), zoals met een hertest of een kandidaat-scherm (Zie representatieve resultaten), beperken de bepaling de 32 centrale putjes in een poging om te minimaliseren van de effecten van de mogelijke plaat. Dit laat de 2 putten in het dichtst bij de rand van de plaat onbehandelde maar toch met agar, voedsel en wormen.

Resultaten

We beginnen met het bestuderen van representatieve resultaten van dit protocol voor 96-Wells levensduur testen in dienst. In het eerste voorbeeld was de methode gebruikt om het scherm door middel van 30.000 chemicaliën om succesvol identificeren van chemische stoffen die verlengen de levensduur van C. elegans, en omvat ook de resultaten van de follow-up hertest scherm van de best presterende chemicaliën met behulp van de hetzelfde protocol. Deze resultaten werden eerder beschreven¹. Het tweede voorbeeld wordt hetzelfde protocol in een kleinschaliger scherm van kandidaat-verbindingen.

Grote scherm en hertesten: Het grote scherm 30.000 verbindingen testen werd uitgevoerd in één enkele dosis, in tweevoud. Elke chemische stof werd dan ook getest in twee putjes met een verwachte totale dierenpopulatie van 20. Om dit te bereiken, werden drie discrete verzamelingen van 10.000 verbindingen (in tweevoud) over een periode van ~ 3 maanden ter dekking van de gehele 30.000 verbindingen gescreend. Dit werd gedeeltelijk gedaan om ervoor te zorgen een beheersbare hoeveelheid handmatige scoren aan het eind van de test en vereist een totaal van 260 van de bepaling van de 96-wells-platen in elk van de sets. In bibliotheek voorraad platen bevatte slechts 80 wells samengestelde; een kopie van 10.000 verbindingen maakt 125 assay platen. Deze studie gebruikt 2 replicatieonderzoeken met 10 negatieve controle platen in elke set. Om te verhogen doorvoer, werden platen gescoord wanneer negatieve controle populaties werden beoordeeld om ervaren te hebben ~ 99% sterfte. Alle test putjes werden vervolgens onderzocht voor levende wormen.

Chemische stoffen in putten met een live-worm heetten hits. Chemische stoffen in putten met meer dan 1 worm levend waren ook genaamd hits, en bovendien alle wormen in die putjes (leven en dood) werden geteld voor het genereren van een eenvoudige score (percentage levend score; het aantal levend wormen gedeeld door het aantal dode wormen). Elke chemische stof in de bibliotheek kan dus worden gesteld om een hit tweemaal en die klappen kon, maar misschien niet, scores die banden met hen hebben. 512 verschillende chemicaliën heetten hits (ten minste) van het scherm van 30.000 stoffen. Het scherm werd uitgevoerd met de bedoeling identificatie van krachtige en/of robuuste (reproduceerbare) Pro-levensduur effecten. Deze twee verschillende eigenschappen kunnen verschillende gevolgen hebben. Krachtige chemische stoffen kunnen drastisch verhogen van levensduur, in welk geval we zouden verwachten van een hoog percentage van wormen in van die chemische stof goed te leven. Robuuste chemicaliën, zou beide replicatieonderzoeken worden verwacht levende wormen hebben. De hit-lijst is gerangschikt op basis van deze criteria. 179 van de chemicaliën leverde hoge percentage levend scores, of werden getroffen in beide wordt gerepliceerd en werden daarom gekozen voor opnieuw testen. De meeste van de resterende chemicaliën die waren genoemd hits, maar niet geselecteerd voor het opnieuw testen, bevatte slechts een enkele worm leeft in een van de repliceren putten.

Opnieuw testen van de hits was uitgevoerd, soortgelijk aan het primaire scherm behalve met 3 replicatieonderzoeken (verwachte totale dierenpopulatie van 30), en voorzichtig kwantificering van de levensduur van de dieren in de platen onbehandeld controlegewas. Deze wijzigingen werden toegevoegd om hulp bij het vergelijken van de test- en putten. 179 van de chemische hits werden opnieuw besteld, verdund tot 10 mM, en verhuisde naar 96 goed platen. Alleen de binnenste 24 putten werden gebruikt voor de hertest assay (huidige versies van dit protocol zou hebben gebruikt de innerlijke 32 putten zoals beschreven in de sectie protocol voor hertest schermen) en de verbindingen werden opnieuw getest in drievoud met zes negatieve controle assay platen behandeld met DMSO oplosmiddel. Een negatieve controle plaat werd regelmatig gescoord voor totale overleving(Figuur 1). Bij ongeveer 95% van de controledieren dood waren, alle platen werden volledig gescoord (alle behandelde levende en dode wormen werden geteld).

Als u de hits vanuit de hertest resultaten, werd een licht-donkerscheiding gedaan op de gemiddelde percentage levend score van de negatieve controle + 2 standaarddeviaties (SD). Voor de test putjes, gemiddeld procent levend (op het moment van scoren) scores werden berekend door het gemiddelde van het percentage levend score drie replicatieonderzoeken voor elk putje. Voor deze bijzondere assay, werden negatieve controle wells gemiddelde percentage levend scores berekend als het gemiddelde van drie replicatieonderzoeken voor 48 putten (2 sets van drievoudige negatieve controle platen). De SD gebruikt om te bellen van hits uit de hertest chemische set was dat de SD over de 48 negatieve controle gemiddeld percentage levend scores. Met behulp van deze strategie, deze studie gevonden 57 hits uit de hertest bibliotheek van 179 verbindingen, aan te tonen dat een totaal van 32% van de hertest chemische stoffen positief getest (Figuur 1B). Weggooien van de gemiddelde percentage levend scores voor de negatieve controle en test putjes aangegeven dat de test putjes presteerde beter dan de controleputjes (Figuur 1C).

Kandidaat-scherm: Kleinschalige schermen kunnen worden uitgevoerd op een wijze vergelijkbaar met de hierboven beschreven hertest. Hier beschrijven we de resultaten van een kandidaat-scherm met 139 verbindingen. Deze kandidaten werden geassembleerd als structuren waarschijnlijk ter bevordering van de duurzaamheid. Voor dit scherm uitgevoerd we 5 wordt gerepliceerd van de platen van de test op twee verschillende doses (50 µM en 100 µM). Bovendien, we gebruikten 8 negatieve controle platen, met een enkele positieve controle (NP1)-plaat met twee verschillende doses; 50 µM en 100 µM.

Negatieve controle platen werden gecontroleerd totdat ~ 90% van de dieren dood waren. Op dat moment werden putten gescoord door het tellen van levende en dode wormen in alle controleputjes en test putjes die levende wormen. Het percentage levend op het moment van scoren werden gebruikt om het gemiddelde percentage levend scores voor elk putje te berekenen. Voor de negatieve controles had 32 putten percentage levend scores uit 8 wordt gerepliceerd. Voor de positieve controles waren er 4 goed scoort gemiddeld over 4 replicatieonderzoeken voor elke dosis. Hits heetten voor putten met een gemiddeld percentage levend score dat groter dan de gemiddelde was negatieve controle procent levend score + 2 SD. Deze cutoff links 14 honkslagen van de kandidaat-scherm en alle van de negatieve controle putten uitgesloten. Dat cutoff ook inclusief alle van de positieve controle putten getrakteerd op 100 µM en 50% van de positieve controle getrakteerd op 50 µM. Deze resultaten worden gepresenteerd hier zoals weggegooid gemiddeld percentage levend scores voor zowel de 50 µM(Figuur 2)en de 100 µM (Figuur 2B) test schermen.

Tot slot alle platen werden opnieuw scoorde op een laat tijdstip, die overeenkwam met een tijd toen meer dan 99% van de negatieve controle behandelde dieren waren dood. Deze resultaten aangegeven dat de positieve controle putten veel uitgaande uitgevoerd de negatieve controle en test putjes (Figuur 2C). Terwijl de test putjes enigszins beter dan de negatieve controles waren. Dit laatste resultaat is beïnvloed door de vermelding dat veel van de test putjes leek te vertonen ten opzichte van de controle-behandeling (tabel 1), waardoor deze eenvoudig interpretatie verstorende toxiciteit. Dit was te verwachten, omdat de kandidaat-bibliotheek een ware scherm van chemische stoffen met een onbekende biologische activiteit in C. elegans, was terwijl de hertest scherm was in wezen vooraf gescreend voor verbindingen die niet giftig waren. Aangezien dit primaire scherm voor verbindingen die levensduur verlengd was, moeten aanzienlijk giftige chemicaliën niet hebben in de hertest ingesteld.

Figuur 1 : Vertegenwoordiger voortvloeit uit een hoge doorvoersnelheid scherm en opnieuw testen
(A) nabestaanden curve van een plaat van de vertegenwoordiger van de negatieve controle gebruikt in de hertest assay. Deze curve was opgebouwd uit alle levende en dode wormen te scoren in de 24 putten gebruikt in deze test 4 keer in de 18 dagen van de test. Besturingselementen als u wilt dat ~ 5% overlevende dieren werden beoordeeld op dag 18 van volwassenheid, en alle controle test en platen werden vervolgens ook gescoord. (B) tabel Samenvatting van de resultaten van het scherm en de hertest. (C) Binning van de putten gemiddeld percentage levend scores voor zowel controle en test voorwaarden uit het scherm opnieuw testen. Voor besturingselementen, zijn scores uit 48 putten elk bestaande uit het gemiddelde van 3 wordt gerepliceerd. Testresultaten zijn van 179 putten elk bestaande uit de gemiddelde score van drie wordt gerepliceerd. Figuur 1 is opgenomen van een eerdere publicatie¹. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2 : Vertegenwoordiger voortvloeit uit een kandidaat-scherm
(A) Binning van de resultaten uit de 50 µM kandidaat-scherm. De 139 resultaten van de test-well vertegenwoordigen de gemiddelde percentage levend score uit 5 wordt gerepliceerd. De 32 resultaten van de negatieve controle bestaan van gemiddelde percentage levend scores uit 8 wordt gerepliceerd. De 4 resultaten van de positieve controle bestaan uit gemiddeld percentage levend scores 4 wordt gerepliceerd (16 totaal wells met NP1 op 50 µM). (B) Binning van de resultaten van het scherm van de kandidaat-100 µM. Alles is gelijk aan (A), behalve dat de test putjes en positieve controles werden getrakteerd op 100 µM concentraties. De dezelfde negatieve controle platen staan in zowel (A en B). (C) vertegenwoordiger vloeit voort uit de platen opnieuw te scoren op een relatief extreme laat tijdstip. Positieve controles dramatisch presteerde beter dan alle anderen, als alleen goed voor de procent van putjes met levende wormen op dit punt van tijd, die is bevooroordeeld tegen test wells, zoals beschreven in de hoofdtekst en tabel 1. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

	Weggooien van gemiddelde percentage levend Scores
Gegroepeerde Scores	Alle dode (0)	1-10	11-20	21-30	31-40	> 41
Hertesten
# van (-) controle	16	31	1	0	0	0
# Test putjes (50µM)	46	69	50	8	3	3
Kandidaat-scherm
# van (-) controle	0	11	21	0	0	0
# van (+) bepalen (50µM)	0	0	2	2	0	0
# van (+) bepalen (100µM)	0	0	0	0	2	2
# Test putjes (50µM)	94	22	21	2	0	0
# Test putjes (100µM)	86	25	21	6	1	0

Tabel 1: Vertegenwoordiger voortvloeit uit het weggooien van de verschillende schermen
Hier presenteren we het weggooien van de gemiddelde percentage levend scores voor de twee schermen (hertest en kandidaat-lidstaten). In het scherm hertest de piek is vergelijkbaar met de negatieve controle met het opnieuw test presteren beter dan de negatieve controle dramatisch aan de rechterkant (langlevende) kant van de tafel. Dit duidt op de aanwezigheid van meerdere Pro-levensduur stoffen aanwezig zijn in de set opnieuw testen. In de kandidaat-scherm zien we dat de piek alle dode categorie, is terwijl er ook een duidelijk signaal aan de rechterkant van de tabel. Dit duidt op de aanwezigheid van Pro-levensduur verbindingen in de kandidaat-set, maar ook duidt op de aanwezigheid van aanzienlijke toxiciteit onder de kandidaat-set van verbindingen.

Discussie

Wij hebben hier een eenvoudige methode voor het kweken van C. elegans in 96-wells-platen beschreven. We beschrijven deze culturen voor gebruik in de chemische screening en tests van de levensduur, maar ze kunnen worden gebruikt voor vele soorten testen. Terwijl multi goed kweekomstandigheden voor chemische screening eerder gerapporteerde^{8 zijn}, verschilt met inbegrip van voor levensduur analyse¹⁰, de hier beschreven test op verschillende manieren. De levensduur test hier beschreven maakt gebruik van 96-wells-platen, afhankelijk van steriele mutanten (in plaats van chemische sterilisatie), agar kweekomstandigheden gebruikt, maakt gebruik van eenvoudige vloeistof verwerken als u wilt verplaatsen van wormen, en is handmatig scoorde op het eindpunt. De verschillende benaderingen gebruikt in deze bepaling kunnen worden van hulp aan onderzoekers op zoek naar screeningmethoden die deze voorwaarden bevatten.

Cruciale elementen bij dit protocol midden hoofdzakelijk op de kwaliteit van de platen geproduceerd voor de assay. Eerst, bij het maken van platen is het noodzakelijk dat de agar oppervlak vrij van bubbels en andere onvolkomenheden is. Deze variaties in het oppervlak van de agar leiden bijna altijd tot gravende en verlies van de put. Ten tweede, dit protocol is gebaseerd op het drogen uit vloeistoffen gestort tijdens de setup en drogeren stadia. Het is essentieel dat deze vloeistoffen zijn volledig verwijderd, maar de agar doet niet Word uitgedroogd. Anekdotische, het lijkt erop dat wormen in putten die niet volledig zijn gedroogd (zwemmen in vloeistof) langer leven dan goed gedroogde wells, terwijl overdreven drogen van de platen tot uitdroging en barsten van de agar, wat leidt leidt tot worm gravende en verlies. Een ander cruciaal element van dit protocol is het handhaven van steriele omstandigheden. Zoals met elke levensduur assay, er een heleboel werk is betrokken bij de opstelling van de plaat, en veel kansen en tijd bestaan voor assay verpest verontreiniging te vestigen en te groeien op de platen.

Terwijl de bepaling van de levensduur hier beschreven handig voor screening van verbindingen in C. elegans is, is het beperkt tot bepaalde genetische achtergronden, omdat het berust op een temperatuur gevoelig (ts) steriele stam; We gebruikten de TJ1060, die hoge steriliteit doordringendheid heeft. Dit beperkt de stammen beschikbaar voor screening met deze methode. Andere aanpak met inbegrip van ts steriele mutaties oversteken naar de gewenste achtergrond of met behulp van chemische sterilisatie. We hebben niet geprobeerd chemische sterilisatie met deze test, maar het moet mogelijk zijn. Mogelijke hindernissen omvatten de sterilisator brengen met de wormen, op het juiste moment en in de juiste dosis. Het protocol beschreven gebruikt hier een vloeistof dispenser die is snel, maar lijkt niet af te zien van volwassenen effectief. Dus, deze wormen ontwikkelen op de platen en daarom moeten worden behandeld met de sterilisatie chemische op de platen. Bepalen van de optimale dosis en tijdstip zou belangrijk zijn voor succes. Alternatieve strategieën omvatten een verstrekking methode die volwassenen kunt verplaatsen. In het verleden hebben we gevonden dat machines kunnen identificeren en sorteren van volwassenen zijn meestal veel trager dan de eenvoudige vloeibare handlers, die homogene slurries van zwevende larve kunnen afzien.

In het algemeen, we gebruiken deze methode snel scherm chemicaliën en behandelingen voor grote positieve effecten op de levensduur. De methode is met name effectief bij gebruik in combinatie met meerdere doses, hoge nummers worden gerepliceerd en nauwgezette monitoring van negatieve controles die zijn altijd worden onderhouden en afgewisseld tussen de platen van de test. Positieve controles zijn ook handig bij het ontwerpen en implementeren van de schermen die worden beschreven in dit manuscript. Echter, om een effectieve positief, de controle zou moeten worden vrij krachtig en/of uiterst robuust. Wanneer het scherm werd oorspronkelijk geïmplementeerd, kon een voldoende krachtige en robuuste stof niet worden geïdentificeerd. Momenteel zijn er vele verslagen in de literatuur 'veroudering' van waarschijnlijke kandidaten voor de positieve controles nuttig in de schermen die hier worden beschreven. Zoals beschreven in de kandidaat-scherm sectie de verwachte resultaten van dit manuscript en in Figuur 2 en tabel 1, is de samengestelde NP1 een effectieve positieve controle voor dit scherm. Wij bevestigen over het algemeen positieve treffers van deze schermen met standaard levensduur testen op 3 mm cultuur platen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
LB Broth Miller Granules	VWR
Unispense	Wheaton Science Products		automated fluid dispensing apparatus
96 well assay plate; COSTAR 3370	Corning
Multidrop 384; automated 8 channel dispenser	Thermo Fisher Scientific
manufactored worm pick	Genesee Scientific
Belly Dancer Orbital Shaker	Stovall Life Science inc.
microplate shaker; MTS 2/4 Digital	IKA Works, inc.
automated 96-well liquid handler; Biomek FX Liquid Handler	Beckman Coulter
automated 96-well liquid handler; Bench Top Pipettor	Sorenson Bioscience, inc.
manual 8 or 12 multi-channel pipettes	we use rainin…
transparent 96 well film cover; TempPlate RT Optical Film	USA Scientific
table top centrifuge; Centrifuge 5810 R	Eppendorf