Methodenartikel

Kwantificering van endogene auxine en cytokinine tijdens stengellid cultuur van Ipecac

DOI:

10.3791/56902

⸱

15 maart 2018

 ,  , 
1Graduate School of Life Sciences, Toyo University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onvoorziene scheuten kunnen worden opgewekt op overslagfaciliteiten segmenten van ipecac zonder phytohormone behandeling. Om te beoordelen phytohormone dynamiek tijdens onvoorziene schieten vorming, we gemeten endogene auxine en cytokinine in overslagfaciliteiten segmenten door LC-MS/MS.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onvoorziene schieten formatie is een belangrijke techniek voor de verspreiding van economisch belangrijke gewassen en voor de regeneratie van transgene planten. Phytohormone behandeling is vereist voor de inductie van onvoorziene scheuten in de meeste soorten. Of onvoorziene scheuten kunnen worden opgewekt wordt bepaald door het evenwicht tussen auxine en cytokinine (CK) niveaus. Veel moeite gaat in het bepalen van de optimale concentraties en combinaties van fytohormonen in elk weefsel gebruikt als explantaten en bij elke plantensoorten. In Braakwortel, kunnen echter onvoorziene scheuten worden opgewekt op overslagfaciliteiten segmenten in een kweekvloeistof zonder phytohormone behandeling. Hierdoor is de inherente plasticiteit van ipecac voor celdifferentiatie worden geëvalueerd. Om onvoorziene scheuten in Braakwortel, gekweekt we overslagfaciliteiten segmenten bij 24 ° C onder de 15 µmol m−2 s−1 van licht in een donkere cyclus van 14-h licht/10-h op phytohormone-gratis B5 medium voor 5 weken met 0,2% gellan tandvlees verhard. Om te onderzoeken phytohormone dynamiek tijdens onvoorziene schieten vorming, we gemeten endogene indool-3-azijnzuur en CKs in de segmenten door vloeibare chromatografie-tandem massaspectrometrie LC-MS/MS. Met deze methode kunt analyse van endogene indool-3-azijnzuur en CKs niveaus op een eenvoudige manier. Het kan worden toegepast om te onderzoeken van de dynamiek van endogene auxine en CK tijdens organogenese bij andere plantensoorten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gottlieb Haberlandt (1854-1945) voorgesteld het concept van "totipotent", door welke plant kunnen cellen verdelen, differentiëren en regenereren van hele planten zelfs na hun voorafgaande differentiatie in specifieke celtypes in volwassen planten1. In de weefselkweek, wordt of plant regeneratie kan worden opgewekt, of niet bepaald door de combinatie en de concentratie van exogenously toegepaste fytohormonen in het groeimedium. Skoog en Miller gevonden dat onvoorziene scheuten kunnen worden opgewekt uit tabak eelt op kweekmedium dat een hoge verhouding van CKs tot auxines, overwegende dat de bijwortels kon worden geïnduceerd op medium met een lage verhouding2. Sinds dat zoeken, is weefselkweek wijd verbeid gebruikt voor de verspreiding van economisch belangrijke gewassen en voor de regeneratie van transgene planten3. Onvoorziene scheuten kunnen worden opgewekt uit weefsels dan schieten apicale meristeem, zoals bladeren, wortels en groeispurt. Phytohormone behandeling is vereist voor de inductie van onvoorziene scheuten in meeste plantensoorten. Echter, de optimale concentratie en de combinaties verschillen per soort en onder weefsels als explantaten gebruikt. Dus, veel moeite gaat in het bepalen van de optimale concentraties en combinaties van fytohormonen voor experimenten.

Carapichea ipecacuanha (Brot.) L. Andersson (Braakwortel) is een medicinale plant die alkaloïden zoals emetine en Phosphatidylethanolamine, vooral in de wortels4 bevat. Root extracten worden gebruikt als een braakmiddel, een slijmoplossend en een amoebicide5. Hoewel Braakwortel natuurlijk in de tropische regenwouden van Brazilië groeit, het is terughoudend om zaden in cultuur, en de kiemkracht tarief vermindert tijdens de opslag van het zaad in Japan, met haar kouder klimaat6. In plaats daarvan, het is vermeerderd door weefselkweek, in die onvoorziene schieten formatie op de groeispurt is de meest efficiënte methode7,8. Interessant, kunnen onvoorziene scheuten worden opgewekt in deze soort zonder phytohormone behandeling8.

Onvoorziene scheuten worden gevormd op de epidermis in de apicale regio van overslagfaciliteiten segmenten zonder callusing, maar niet in de basale regio9. Dit verschil geeft aan weefsel polariteit in overslagfaciliteiten segmenten, die waarschijnlijk is onder phytohormonal verordening. De Braakwortel cultuur systeem maakt het mogelijk een unieke gelegenheid om veranderingen in de endogene phytohormone analyseren tijdens onvoorziene schieten vorming. Hier introduceren wij onze werkwijze voor de analyse van de endogene niveaus van één auxine (indool-3-azijnzuur (IAA)) en vier CKs (isopentenyl adenine (iP), isopentenyl adenine riboside (iPR), trans-Zeatine (tZ), en trans-Zeatine riboside (tZR)) in overslagfaciliteiten segmenten met behulp van LC-MS/MS.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opmerking: Ipecac (C. ipecacuanha) werd gebruikt in deze studie omdat het vergemakkelijkt de analyse van endogene fytohormonen.

1. groei omstandigheden voor het opwekken van onvoorziene scheuten van Ipecac

  1. Phytohormone-gratis B5 medium aangepast aan de pH 5.710bereiden en toevoegen van 0,2% gellan tandvlees. Steriliseren in autoclaaf.
  2. Giet 25 mL van de gesteriliseerde met autoclaaf medium in een steriele petrischaal (90 × 20 mm).
  3. 8-mm overslagfaciliteiten segmenten van ipecac plantjes met een chirurgische scalpel met een mes nr. 22 op een steriele acryl plaat knippen, en plaats op het medium (Figuur 1).
  4. Cultuur op phytohormone-gratis B5 medium bij 24 ° C onder de 15 µmol m−2 s−1 van licht in een donkere cyclus van 14-h licht/10-h voor 5 weken.
  5. Identificeren van de regio's ik (apicaal) tot en met IV (basale) in elk segment (Figuur 1B). Het aantal onvoorziene scheuten > 0.3 mm lengte in elke regio onder een Microscoop eenmaal per week.

2. extractie en zuivering van fytohormonen

  1. Een 5-mm Zirkonia parel in elk van de vier 2-mL monster buisjes plaatsen
  2. De segmenten in regio's gesneden I tot en met IV (elk 2 mm in lengte) met behulp van een chirurgische scalpel op een steriele acryl plaat.
  3. Verzamelen van acht segmenten van elke regio in aparte monster buizen (10-30 mg vers gewicht).
  4. Weeg, en vervolgens het bevriezen van de monsters in vloeibare stikstof.
  5. Crush de bevroren monsters met behulp van een kraal gebaseerde homogenizer.
  6. Opschorten van de geplette monsters in 1 mL acetonitril met 500 pg van elke interne standaard van auxine en CKs (d5-IAA d5- tZ, d5- tZR, d6- iP, d6- iPR) met behulp van een vortex-mixer.
  7. Houd bij 4 ° C gedurende 1 h, dan Centrifugeer bij 3.500 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  8. Het wassen van de pellet in 80% (v/v) acetonitril met 1% (v/v) azijnzuur. Centrifugeer nogmaals op 3.500 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Combineer het supernatant (uit stap 2.7 en 2.8) in een wegwerp glazen buis.
  9. Toevoegen van 600 µL water met 1% (v/v) azijnzuur aan elke gecombineerde supernatant en verdampen van de met behulp van een vacuüm concentrator acetonitril.
  10. Equilibreer hydrofiele lipofiele-evenwichtige (HLB) kolom patronen door het toepassen van elk 1 mL acetonitril, methanol en water met 1% (v/v) azijnzuur.
  11. Toepassing één monsteroplossing per geëquilibreerd HLB cartridge.
  12. Het wassen van de cartridges met 1 mL water met 1% (v/v) azijnzuur.
  13. Elueer alle hormonen met 2 mL 80% (v/v) acetonitril met 1% (v/v) azijnzuur in een glazen buis.
  14. Verdampen de acetonitril in het eluaat extract in water met 1% (v/v) azijnzuur met behulp van een vacuüm concentrator verkrijgen.
    Let op: Dit niet volledig drogen.
  15. Gemengde modus, sterke catie-uitwisseling (MCX) kolom cartridges equilibreer door het toepassen van 1 mL acetonitril, 1 mL methanol, 0,5 mL 0,1 M HCl en 1 mL water met 1% (v/v) azijnzuur.
  16. Toepassing één monsteroplossing per geëquilibreerd MCX cartridge.
  17. Het wassen van de cartridges met 1 mL water met 1% (v/v) azijnzuur.
  18. IAA Elueer met 2 mL 30% (v/v) acetonitril met 1% (v/v) azijnzuur in een glazen buis.
  19. Het wassen van de cartridges met 2 mL 80% (v/v) acetonitril met 1% (v/v) azijnzuur.
  20. Wassen van de cartridges met 2 mL en 1 mL water met 5% waterige ammoniak.
  21. Elueer de CKs met 2 mL 60% (v/v) acetonitril met 5% waterige ammoniak in een glazen buis.
  22. Damp het oplosmiddel van elk hormoon breuk met behulp van een vacuüm concentrator en bewaren op −30 ° C tot de LC-MS/MS-analyse.

3. LC-MS/MS analyse van IAA en CKs

  1. Los van elk hormoon uittreksel in een buis met 600 µL van methanol en breng de oplossing over in een schroef flacon voor de volledige terugvordering van de nek. Damp het oplosmiddel met behulp van een vacuüm concentrator.
  2. Los de IAA breuk in 20 µL 30% (v/v) acetonitril, en de CK breuken in 20 µL water met 1% (v/v) azijnzuur in schroef nek volledige terugvordering flesjes.
  3. Analyseer de monsters in positieve ion-modus op een triple-vierpolige MS systeem uitgerust met een systeem van HPLC.
    Opmerking: We stellen de HPLC-voorwaarden zoals vermeld in tabel 1.
    1. Voor de IAA elutie, gebruiken een binaire verloop van 5% - 50% oplosmiddel B meer dan 7 min, dan verhogen door 98% oplosmiddel B en houd voor 1 min en vervolgens equilibreer gedurende 2 min op 5% oplosmiddel B door nest injectie.
    2. Voor de CK elutie, gebruiken een binaire helling van 2% - 40% oplosmiddel B meer dan 5 min, 40% - 70% oplosmiddel B in 7 min, dan verhogen door 95% oplosmiddel B Houd voor 1 min en vervolgens equilibreer gedurende 2 min op 2% oplosmiddel B door injectie nesten.
    3. Instellen van de electrospray ionisatie (ESI)-MS parameters van ion bron zoals vermeld in tabel 2.
  4. Gebruik de meerdere reactie controle (MRM) overgang voor kwantificering van elke analyt vermeld in tabel 3.
  5. Endogene IAA en CK niveaus tegen een standaard curve van de verhouding van labelloze deuterium-geëtiketteerden normen te kwantificeren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Op de 1st -week, had geen onvoorziene scheuten gevormd. Tijdens de week van 2nd verscheen de kleine scheuten. Op de 3rd en 4th weken, schiet vooral in de apicale regio's (I en II) het aantal toegenomen(Figuur 2). Op de 5th -week, het aantal van scheuten was ongeveer 7 in regio ik en 5 regio II (Figuur 2B). In tegenstelling, werden alleen een ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ter identificatie van de verdeling van fytohormonen betrokken is in de organogenese, het is belangrijk om het gebruik van plantaardig materiaal waarin organogenese kan worden waargenomen op de drager van de phytohormone-vrij, omdat wanneer fytohormonen exogenously worden toegepast op explantaten voor inducerende scheuten of wortels, beïnvloeden ze de hele explant, waardoor het moeilijk is om te evalueren van de inherente plasticiteit van planten in de celdifferentiatie en organogenese. Onvoorziene scheuten kunnen worden ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen conflicten van interesse hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij zijn dankbaar aan Mr. Akira Murakami van de Vakgroep Toegepaste biowetenschappen, Toyo Universiteit en Mr. Koudai Taniguchi van het Gunma Agricultural Technology Center voor hun technische bijstand. Wij zijn ook dank aan Professor Shosaku Kashiwada en Dr. Uma Maheswari Rajagopalan, Toyo Universiteit voor hun suggesties. Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door het Research Center for Life en milieuwetenschappen, Toyo Universiteit.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
[2H5]indole-3-azijnzuurOlchemlm Ltd031 1531Interne standaard voor LC-MS/MS
[2H5]trans-zeatineOlchemlm Ltd030 0301Interne standaard voor LC-MS/MS
[2H5]trans-zeatine ribosideOlchemlm Ltd030 0311Interne standaard voor LC-MS/MS
[2H6]N6-isopentenyl adenineOlchemlm Ltd030 0161Interne standaard voor LC-MS/MS
[2H6]N6-isopentenyl adenosineOlchemlm Ltd030 0171Interne standaard voor LC-MS/MS
indole-3-azijnzuurWako098 00181standaard voor LC-MS/MS
trans-zeatineSIGMA-ALDRICHZ0876 5MGstandaard voor LC-MS/MS
trans-zeatine ribosideWako262 01081standaard voor LC-MS/MS
N6-isopentenyl adenineSIGMA-ALDRICHD7674 1Gstandaard voor LC-MS/MS
N6-isopentenyl adenosineACROS ORGANICS22648 1000standaard voor LC-MS/MS
acetonitril hypergrade voor LC-MS LiChrosolvMERCK1.00029.1000oplosmiddel voor LC-MS/MS
Water voor chromatografie LiChrosolvMERCK1.15333.1000oplosmiddel voor LC-MS/MS
HPLCSHIMADZUProminence
MSSciex3200QTRAP
Oasis HLB 30 mg/1 ccWatersWAT094225cartridgekolom
Oasis MCX 30 mg/1 ccWaters186000252cartridgekolom
schroefhals totaal herstelvialWaters186002805
blauw, 12 x 32mm schroefhalsdop en PTFE/siliconen septumWaters186000274
Acquity UPLC BEH C18, 2.1x100 mmWaters186002350UPLC kolom
Proshell 120 EC-C18, 2.1x50 mmAgilent699775-902UPLC kolom
Digitaal microscoopLeicaDHS1000
TissueLyser IIQIAGEN85300
Chirurgisch mesFeatherNo. 22
ScalpelhandgreepFeatherNo. 4
Savant SpeedVac/Refregerated dampvalThermo Fisher ScientificSPD111/RVT4104vacuüm concentrator
wegwerp glazen buis (13x100 mm)IWAKI9832-1310
Steriele petrischaalINA OPTICAI-90-20

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Haberlandt, G. Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen. Sitzungsber. Math.-Naturwiss. Kl. Akad. Wiss. Wien. 111, 69-92 (1902).
  2. Skoog, F., Miller, C. O. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro. Symp Soc Exp Biol. 11, 118-130 (1957).
  3. Ganeshan, S., Caswell, K. L., Kartha, K. K., Chibbar, R. N. Transgenic plants and crops. Khachatourians, G. G., McHughen, A., Scorza, R., Nip, W. K. , CRC Press. Ch. 4 69-84 (2002).
  4. Teshima, D., Ikeda, K., Satake, M., Aoyama, T., Shimomura, K. Production of emetic alkaloid by in vitro culture of Cephaelis ipecacuanha. Plant Cell Rep. 7 (4), 278-280 (1988).
  5. Chatterjee, S. K., Nandi, R. P., Ghosh, N. C. Cultivation and utilixzation of medicinal plants. Regional Research Laboratory, Council of Scientific and Industrial Research. Atal, C. K., Kapur, B. M. , Jammu-Tawi, India. 295-301 (1982).
  6. Bajaj, Y. P. S. Biotechnology in Agriculture and Forestry 21, Medicinal and Aromatic Plants IV. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 87-103 (1993).
  7. Ideda, K., Teshima, D., Aoyama, T., Satake, M., Shimomura, K. Clonal propagation of Cephaelis ipecacuanha. Plant Cell Rep. 7 (4), 288-291 (1988).
  8. Yoshimatsu, K., Shimomura, K. Efficient shoot formation on internodal segments and alkaloid formation in the regenerates of Cephaelis ipecacuanha A. Richard. Plant Cell Rep. 9 (10), 567-570 (1991).
  9. Koike, I., Taniguchi, K., Shimomura, K., Umehara, M. Dynamics of endogenous indole-3-acetic acid and cytokinins during adventitious shoot formation in ipecac. J. Plant Growth Regul. , (2017).
  10. Gamborg, O. L., Miller, R. A., Ojima, K. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50 (1), 151-158 (1968).
  11. Watad, A. A., et al. Adventitious shoot formation from carnation stem segments: a comparison of different culture procedures. Scientia Hortic. 65 (4), 313-320 (1996).
  12. Ajithkumar, D., Seeni, S. Rapid clonal multiplication through in vitro axillary shoot proliferation of Aegle marmelos (L.) Corr., a medicinal tree. Plant Cell Rep. 17 (5), 422-426 (1998).
  13. Tiwari, V., Tiwari, K. N., Singh, B. D. Comparative studies of cytokinins on in vitro propagation of Bacopa monniera. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 66 (1), 9-16 (2001).
  14. Rao, M. S., Purohit, S. D. In vitro shoot bud differentiation and plantlet regeneration in Celastrus paniculatus Willd. Biol. Plant. 50 (4), 501-506 (2006).
  15. Sanikhani, M., Frello, S., Serek, M. TDZ induces shoot regeneration in various Kalanchoë blossfeldiana Poelln cultivars in the absence of auxin. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 85 (1), 75-82 (2006).
  16. Yoshimoto, K., et al. Autophagy negatively regulates cell death by controlling NPR1-dependent salicylic acid signaling during senescence and the innate immune response in Arabidopsis. Plant Cell. 21 (9), 2914-2927 (2009).
  17. Schaller, G. E., Bishopp, A., Kieber, J. J. The yin-yang of hormones: cytokinin and auxin interactions in plant development. Plant Cell. 27 (1), 44-63 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Cytokinine analyseLC MS MS methodeadventieve scheutvormingIpecac internodiumcultuurfytohormoondynamiekplantweefselkweekhormonkwantificeringGellan Gum mediumvacu mconcentrator

Gerelateerde artikelen