Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Controle van cel naar cel transmissie van Prion-achtig eiwit-aggregaten in Drosophila Melanogaster

7.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56906

⸱

12 maart 2018

 , 
1Department of Biological Sciences, University of the Sciences

In dit artikel

Samenvatting

Vergaren van bewijs ondersteunt het idee dat de pathogene eiwit-aggregaten neurodegeneratieve ziekten verspreiden tussen cellen met prion-achtige eigenschappen gekoppeld. Hier beschrijven we een methode waarmee visualisatie van cel naar cel verspreiding van prion-achtige aggregaten in de model-organisme, Drosophila melanogaster.

Samenvatting

Aggregatie van eiwitten is een centraal element van de meeste neurodegeneratieve ziekten, met inbegrip van de ziekte van Alzheimer (AD), de ziekte van Parkinson (PD), de ziekte van Huntington (HD) en Amyotrofische laterale sclerose (ALS). Eiwit-aggregaten zijn nauw verbonden met het neuropathologie in deze ziekten, hoewel het exacte mechanisme waardoor afwijkend eiwit aggregatie normale cellulaire homeostase verstoort is niet bekend. Opkomende gegevens sterke ondersteuning biedt voor de hypothese dat pathogene aggregaten in AD, PD, HD, en ALS hebben veel overeenkomsten met prionen, die alleen-eiwit infectieuze agentia die verantwoordelijk zijn voor de overdraagbare spongiforme encefalopathieën. Prionen repliceert zelf templating de conversie van native-gevouwen versies van hetzelfde eiwit, waardoor verspreiding van het fenotype van aggregatie. Hoe prionen en prion-achtige eiwitten in AD, PD, HD en ALS beweging van de ene cel naar de andere is momenteel een oppervlakte van intensief onderzoek. Hier, wordt een Drosophila melanogaster model waarmee toezicht prion-achtig, cel-naar-cel indiening van mutant huntingtin (Htt) aggregaten HD gekoppeld beschreven. Dit model maakt gebruik van krachtige hulpmiddelen voor het manipuleren van transgenic expressie in veel verschillende weefsels en Drosophila en maakt gebruik van een fluorescently-tagged cytoplasmatische eiwit rechtstreeks verslag prion-achtige overdracht van mutant Htt aggregaten. Nog belangrijker is, kan de aanpak die we hier beschrijven worden gebruikt voor identificatie van nieuwe genen en trajecten die bemiddelen verspreiding van eiwit-aggregaten tussen verschillende cel typen in vivo. Informatie die is opgedaan met deze studies zal uitbreiden het beperkte begrip van de pathogene mechanismen die ten grondslag liggen aan neurodegeneratieve ziekten en nieuwe mogelijkheden voor therapeutische interventie te onthullen.

Inleiding

Het prion-hypothese stelt dat het infectieuze agens verantwoordelijk voor de overdraagbare spongiforme encefalopathieën (bijvoorbeeldziekte van Creutzfeldt - Jakob bij de mens, scrapie bij schapen, chronische verspillen ziekte bij herten en elanden en "gekke-koeienziekte" bij runderen ) is uitsluitend samengesteld uit eiwit en verstoken van nucleïnezuren1. In prionziekten neemt het cellulaire prion-eiwit (PrPC) een niet-inheemse, stabiele vouw (PrPSc) dat is hoogst beta blad-rijke en kan zichzelf verspreiden door omzetten en het werven van monomeer PrPC moleculen in stabiele amyloid aggregaten. PrPSc aggregaten via dit zelfreplicerende mechanisme te verspreiden tussen verschillende cellen van een organisme en zelfs tussen individuele organismen2.

Eiwit misfolding en aggregatie is ook een centraal element van de meeste neurodegeneratieve ziekten (ziekte van Alzheimer (AD), de ziekte van Parkinson (PD), de ziekte van Huntington (HD) en Amyotrofische laterale sclerose (ALS))3. Vorming van intra - of extra - cellular geaggregeerde eiwit assemblages in deze ziekten is nauw verbonden met de cytotoxiciteit4 en vordert langs zeer reproduceerbaar zijn en ziekte-specifieke paden door de hersenen over tijd5, 6. deze patronen van verspreiding suggereren dat pathogene aggregaten die zijn gekoppeld aan deze aandoeningen prion-achtige eigenschappen hebben. Krachtige steun bestaat nu voor prion-achtige indiening van aggregaten gekoppeld aan AD, PD, HD en ALS - ze verspreiden van cel naar cel en sjabloon de conformationele verandering van het monomeer vormen van hetzelfde eiwit in eerder onaangetast cellen7, 8.

De meerderheid van de studies die onderzoeken prion-achtige verspreiding van eiwit-aggregaten tot nu toe zijn uitgevoerd met zoogdiercellen cultuur modellen, waar aggregaten transfer in het cytoplasma van naïeve cellen van de extracellulaire ruimte of van een andere cel cytoplasma9,10,11,12,13,14,15, of door injecteren aggregaat-bevattende materiaal in de hersenen van de muis en het toezicht op statistische uiterlijk buiten de injectie site16,17,18,19,20,21,22, 23. meer recentelijk, transgene dieren zijn gebruikt om aan te tonen dat de intracellulaire aggregaten naar andere cellen binnen intact hersenen24,25,26,27verspreiden, 28,29,30. Hier beschrijven we een methode voor directe visualisatie van statistische overdracht tussen afzonderlijke cellen in het intact brein van Drosophila melanogaster. Drosophila modellen van HD/polyglutamine (polyQ) ziekten werden aanvankelijk ontwikkeld voor bijna twee decennia geleden31,32 en veel waardevolle inzichten in de pathogene mechanismen die ten grondslag liggen aan deze aandoeningen hebben verstrekt 33. HD is een erfelijke neurodegeneratieve stoornis veroorzaakt door een autosomaal dominante mutatie in het gen dat voor het eiwit huntingtin (Htt)34 codeert. Deze mutatie leidt tot uitbreiding van een stuk van de polyQ in de buurt van Htt van N-terminus boven een pathogene drempel van ~ 37 glutamines, waardoor de eiwitten aan misfold en statistische35,,36. Wild-type Htt eiwitten met < 37 glutamines in deze strook bereiken hun inheemse vouwen, maar kan worden opgewekt om statistische na direct fysiek contact met een Htt statistische "zaad"12,27,37. We benutten dit homotypic, genucleëerde aggregatie van wild-type Htt als een uitlezing voor prion-achtige overdracht en cytoplasmatische toetreding van mutant Htt aggregaten van oorsprong uit andere cellen.

De mechanismen te bepalen door welke prion-achtige aggregaten kan reizen tussen cellen leiden tot de identificatie van nieuwe therapeutische doelen voor ongeneeslijke neurodegeneratieve ziekten. Wij profiteren van de snelle levenscyclus, gebruiksgemak en genetische werkwillig van Drosophila melanogaster definiëren van moleculaire mechanismen voor cel-naar-cel verspreiding van mutant Htt aggregaten. Onze experimentele strategie maakt gebruik van twee binaire expressiesystemen beschikbaar in Drosophila, de gevestigde Gal4-specifieke upstream activerend sequentie (Gal4-UAS) systeem38 en de onlangs ontwikkelde QF-QUAS systeem39. Deze twee onafhankelijke koppelmechanisme kunt beperken van uitdrukking van de mutant en wild-type Htt-transgenen tot afzonderlijke cel populaties binnen de dezelfde vliegen40. Met behulp van deze aanpak, onderzoeken we prion-achtige verspreiding van mutant Htt door monitoring van de herverdeling van cytoplasmatische wild-type Htt uit haar normaal diffuus, oplosbare staat aan een geaggregeerde staat, een rechtstreeks gevolg van fysiek contact met een pre-gevormde mutant Htt statistische "zaad." Conversie van wild-type Htt door mutant Htt kan worden bevestigd met behulp van biochemische of biofysische technieken die verslag van eiwit-eiwitinteractie, zoals fluorescentie resonantie energie transfer (FRET)9,27,41 .

Nog belangrijker is, kunnen we ook toegang tot een groot aantal genetische hulpmiddelen in Drosophila te identificeren van genen en/of trajecten die prion-achtige verspreiding van eiwit-aggregaten bemiddelen. We hebben onlangs deze aanpak gebruikt om te onthullen een sleutelrol voor de cel-oppervlakte scavenger-receptor, Draper42,43, bij de overdracht van mutant Htt aggregaten van neuronale axonen aan nabijgelegen fagocytische glia in de Drosophila centraal zenuwstelsel (CNS)27. Zo kan de genetische en imaging-gebaseerde aanpak die wij hier beschrijven belangrijke fundamentele biologische informatie over een ziekte-relevante fenomeen in de eenvoudig te gebruiken maar krachtige modelorganisme, Drosophilaonthullen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. koppelen van Gal4 - en QF-gemedieerde Htt transgenic expressie in Drosophila

  1. Verzamelen en/of genereren van transgene Drosophila melanogaster lijnen met weefsel-specifieke Gal4 of QF "stuurprogramma's", evenals regels met wild-type of mutant Htt transgenen stroomafwaarts van de Gal4-UAS38 of QF-QUAS39. Ervoor zorgen dat de eiwitten die van deze transgenen worden uitgedrukt gesmolten aan fluorescerende eiwitten of epitoop-gelabeld voor differentiatie van de mutant en wild-type Htt transgenic producten in de dezelfde vliegen. Zie Figuur 1.
    Opmerking: We gebruiken meestal exon 1 fragmenten van de menselijke Htt gene27. Transgene vliegen kunnen echter in plaats daarvan worden gegenereerd om uit te drukken van langere Htt fragmenten of andere genen, indien gewenst.
  2. Plan de genetische strategie zodanig dat mutant en wild-type Htt-transgenen zal worden uitgedrukt in verschillende, niet-overlappende cel populaties.
    1. Als expressie overlapping optreedt, zal mutant en wild-type Htt eiwitten gesynthetiseerd in dezelfde cellen mede statistische en prion-achtige gebeurtenissen detecteren en voorkomen. Om dit te vermijden, gebruik het Gal4 en QF specifieke repressors, Gal80 en QS40, respectievelijk (Figuur 1). Ontwikkelingsachterstand-gecontroleerde Gal4 en/of QF stuurprogramma's te selecteren kan help wilt beperken tot expressie van mutant Htt post mitotische cellen, het elimineren van de mogelijkheid die celdeling kan bijdragen aan het totale verspreiding van cel naar cel.
  3. Met behulp van kweken standaardvoorwaarden, stuurman de vliegen voor het genereren van nakomelingen die uitdrukking geven aan mutant Htt via QF (of Gal4) in een "donor" celpopulatie en wild-type Htt via Gal4 (of QF) in een "afnemer"-celpopulatie. Zie afbeelding 1 voor een schema toont een mogelijke genetische combinatie.
    Opmerking: De QF- en Gal4 's die werden gebruikt voor het genereren van de gegevens weergegeven in de figuren 1-4 en in onze vorige publicatie27 omvatten de DA1 olfactorische receptor neuron (ORN) bestuurder, Or67d-QF, en de pan-gliale driver, repo-Gal4.
  4. Genereren van controle vliegen parallel die uitdrukking geven aan wild-type Htt in beide populaties cel QF - en Gal4-label.
  5. Nakomelingen van het gewenste genotype te verzamelen, en leeftijd van de dieren zo nodig.

figure-protocol-1
Figuur 1 . Genetische aanpak voor gekoppelde uitdrukking van mutant en wild-type Htt transgenen met behulp van de binaire expressiesystemen QF-QUAS en Gal4-UAS. "Cel A," een mCherry-gelabeld mutant Htt eiwit met een stuk van de pathogene-lengte polyQ (Q91) wordt uitgedrukt met behulp van een QF-stuurprogramma dat zich bevindt stroomafwaarts is van een weefsel-specifieke promotor een ("PA"). In "cel B," wordt een YFP-gelabeld wild-type Htt met een normale polyQ stretch (Q25) uitgedrukt via een Gal4 stuurprogramma gecontroleerd door weefsel-specifieke promotor B ("PB"). In de figuren 2-4, Or67d-QF werd gebruikt om te rijden QUAS-HttQ91-mCherry expressie in DA1 ORNs en repo-Gal4 werd gebruikt voor het uitdrukken van UAS-HttQ25-YFP in alle glia27. Nog belangrijker is, wordt HttQ91-mCherry slechts uitgedrukt in cellen QF-uiten op grond van de volgorde van de QUAS stroomopwaarts van de transgenic geplaatst. HttQ25-YFP zich ook alleen via Gal4, die specifiek de UAS herkent. Als overlappingen in de distributie van het weefsel van de QF en Gal4 chauffeurs wordt gedetecteerd, kan transgenen codering QS in cellen uiten van Gal4 en Gal80 in cellen QF-uiting worden ingevoerd. Toevoegen van fluorescente proteïne tags op wild-type en mutant Htt zorgt voor differentiatie van de twee eiwitten tijdens beeldvorming en de mogelijkheid voor het meten van de FRET tussen passende donor/acceptor paren (bijvoorbeeldGVB/YFP of YFP/mCherry). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

2. micro-dissectie en fixatie van volwassen Drosophila hersenen

Opmerking: Deze procedure dissectie van een eerdere publicatie44is gewijzigd en kan worden gebruikt voor te bereiden op hersenen imaging directe fluorescentie signaal van Htt-belichting fluorescerende eiwit fusies. Wijzigingen in de procedure die kan worden gemaakt voor immunokleuring de hersenen worden besproken in de volgende sectie.

  1. De volgende materialen verzamelen en plaatsen op het ijs: fosfaat gebufferde zoutoplossing met 0,03% Triton X-100 (PBS/T); microcentrifuge buizen met 970 µL van 4% paraformaldehyde (PFA) kleefpoeders oplossing bereid door toevoeging van 200 µL 20% PFA aan 770 µL PBS/T; een helder glas schotel met goed; een wegwerp overdracht Pipetteer; twee ontleden pincet (één nr.3 en één nr. 5).
  2. Anesthetize van de volwassen vliegen met behulp van CO2 en deze overbrengen naar één putje van de glazen schotel op ijs.
  3. Voeg met behulp van een pipet overdracht, een kleine hoeveelheid (~ 500 µL) van koude PBS/T aan het putje met de vliegen ook over een lege put. Vermijd teveel bubbels introduceren, als zij met de dissectie interfereren kunnen.
  4. Zet de glazen schotel op een vlakke ondergrond onder een Microscoop ontleden en de vergroting aan te passen totdat de vlieg lichaam het gezichtsveld vult en in focus is.
  5. Plaats een paar zwanenhals lichtbronnen zodat licht is het verlichten van beide zijden van de glazen schotel. Een gevouwen lab weefsel onder de glazen schotel te negeren lichaam delen/cuticula tijdens de dissectie verankeren.
  6. Met behulp van de verlostang nr.3 in de niet-dominante hand, Pipetteer een enkele vlieg in de goed met PBS/T. immobiliseren de vlieg door grijpen houden van haar buik met de ventrale zijde naar boven.
  7. Houden van de vlieg volledig ondergedompeld in PBS/T, verwijder het vliegen hoofd met de verlostang nr. 5 in de dominante hand. Plaats een tip van deze verlostang onder de epidermis in de kleine ruimte grenzend aan de proboscis aan de ene kant van het hoofd vliegen. Beveilig de grip op het hoofd door het knijpen van de verlostang om greep van het oog van beide kanten.
  8. Het vliegen hoofd uit zijn lichaam verwijderen door trekken de twee verlostang uit elkaar. Vervreemding van het vliegen lichaam op een lab weefsel gepositioneerd in de buurt. Druk op de dominante hand verlostang blijven zodat het vliegen hoofd niet verloren is.
  9. Een tip van de positie van de verlostang nr.3 in de niet-dominante hand in de zelfde kleine ruimte onder de epidermis aan de andere kant van de proboscis. Eenmaal geplaatst, knijpen de verlostang om greep van de ogen op dezelfde locatie aan beide zijden van het hoofd.
  10. Zodra de grip op de epidermis veilig is, Trek voorzichtig aan de Tang uit elkaar op 180°. Deze actie zal splitsen de hoofd cuticle zonder beschadiging van de hersenen. Gooi cuticula residu op een lab weefsel.
    1. Hoewel ideaal, kan de hoofd cuticle niet volledig verwijderd in één stap. In dit geval, verwijder de cuticula stuk-voor-stuk totdat de hersenen volledig is blootgesteld. Wees voorzichtig niet te beschadigen de hersenen door het vermijden van rechtstreeks contact met de pincet.
  11. Verwijder de ontleed hersenen uit de PBS/T door grijpen ahold van een bijgevoegde luchtpijp, of door het aspirating van de hersenen in de ruimte tussen de uiteinden van de verlostang door capillaire actie.
    Nota: Luchtpijp verwijdering is facultatief, als het de neiging om niet verhullen de antennal lobben op het voorste oppervlak van de hersenen waar we meestal beeld. Echter als de luchtpijp met beeldvorming interfereren, verwijdert u deze zorgvuldig zodat de hersenen niet door deze manipulatie is beschadigd.
  12. Breng de vliegen hersenen in een van de microcentrifuge-buizen met kleefpoeders oplossing op ijs. Zorg ervoor dat de hersenen de verlostang losgekoppeld en wordt ondergedompeld in de kleefpoeders oplossing.
  13. Zodra alle van de hersenen hebben zijn ontleed, onderwerpen aan een "korte-fix" door het plaatsen van de gesloten buizen op een nutator voor ~ 5 min bij kamertemperatuur in het donker.
    Opmerking: Deze stap korte fixatie zorgt ervoor dat de hersenen zijn gemakkelijker te hanteren in opeenvolgende stappen niet voldoen aan de zijkanten van de microcentrifuge buis.
  14. De meerderheid van de kleefpoeders oplossing met een pipet P1000 Verwijder en verwerp het.
    1. Vermijd zuigen hersenen uit de buis tijdens dit en alle latere wassen stap. De P1000 ingesteld op een lager volume (bv, 650 µL) en verwijder het supernatant in twee stappen. Daarnaast houdt de microcentrifuge buizen in overeenstemming met een lichtbron (bijvoorbeeld overhead lichten) terwijl zuigen om het brein beter te visualiseren.
  15. Voeg 1 mL verse PBS/T aan de hersenen. Snel wassen (< 1 min) in het donker, gecombineerd de bovendrijvende vloeistof uit de hersenen, en gooi deze weg.
  16. Herhaal het wassen met PBS/T in het donker bij kamertemperatuur volgens het volgende schema: 2 snelle (< 1 min) wast, 1 X 5 min, 3 X 20 min en 1 X 1 h wassen. Secure toppen op microcentrifuge buizen en plaats de buizen op een nutator tussen de wasbeurten.
    1. Als DAPI kleuring wordt gewenst, vervangen de laatste 1 h-wassen met 1 X 30 min incubatie met 250 ng/mL DAPI verdund in PBS/T, gevolgd door 2 X snel en 1 X 20 min wast.
  17. Na de laatste wash, verwijder de meerderheid van de buffer supernatans dat wassen, verzorgen niet te storen van de hersenen, en 30 µL van antifade reagens glycerol gebaseerde toevoegen aan de hersenen. Incubeer bij 4 ° C in het donker zonder verkeer voor ten minste 1 uur en maximaal 24 uur.

3. wijzigingen in sectie 2 voor immunokleuring volwassene hersenen

Opmerking: Gebruik dit protocol voor imaging-niet-belichting fluorescerende eiwitten of voor TL proteïne fusies met zwakke fluorescentie.

  1. Verhoging van de concentratie van Triton X-100 in PBS/T door 10-fold (PBS + 0,3% Triton X-100) voor elke stap. Dit zorgt ervoor dat genoeg afwasmiddel aanwezig te permeabilize van celmembranen en antilichamen tegen toegang van intracellulaire ruimten.
  2. Bevestigen van de hersenen in 4% PFA in PBS/T gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Na het uitvoeren van alle de wasbeurten, Incubeer de hersenen in vers bereide buffer met blokkerend (PBS/T + 5% normale geit serum (NGS)) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
  4. Verwijderen en verwijderen van de buffer met blokkerend. Voeg 0,5 mL van primair antilichaam oplossing per buis als een master mix bereid door verdunning van primaire antilichamen al naargelang het verse blokkeerbuffer (Zie Tabel van materialen voor de gebruikte antilichamen en verdunningen). Incubeer de hersenen in primaire antilichamen op een nutator gedurende ten minste 24 uur bij 4 ° C in het donker.
  5. Verwijder het primaire antilichaam-oplossing van de hersenen met behulp van een P1000 en reserveren in een verse buis. Voeg 1 mL PBS/T aan de hersenen wassen.
    Opmerking: De gereserveerde primair antilichaam-oplossing kan worden achtergelaten bij 4 ° C voor maximaal vier weken. We hebben met succes gerecycleerd primaire antilichamen maximaal twee keer in latere experimenten.
  6. Snel wassen van de hersenen (< 1 min) in PBS/T, gecombineerd het supernatant van hersenen en negeren. Deze snelle wassing nogmaals herhalen.
  7. Blijven wassen met 1 mL PBS/T bij kamertemperatuur volgens het volgende schema: 1 X 5 min, 3 X 20 min en 1 X 1 h wassen. Veilige toppen op microcentrifuge buizen en plaats de buizen op een nutator tijdens wasbeurten.
  8. Na de laatste wash, de meerderheid van het PBS/T supernatant verwijderen en Voeg 0,5 mL secundair antilichaam oplossing als een master mix bereid door verdunning van de antilichamen al naargelang het verse blokkeerbuffer (Zie Tabel van materialen voor de gebruikte antilichamen en verdunningen). Incubeer hersenen in secundaire antilichamen gedurende 24 uur bij 4 ° C in het donker.
  9. Herhaaldestappen wassen in stappen 3.5, 3.6 en 3.7 na incubatie met secundaire antilichamen.
  10. Na de definitieve wash, verwijderen van de meerderheid van de buffer wassen en ervoor te zorgen dat alle hersenen zich aan de onderkant van de buis bevinden. Voeg toe 30 µL antifade reagens aan de hersenen. Incubeer bij 4 ° C in het donker zonder verkeer voor 16-24 uur.

4. de whole Brain montage

  1. Plaats een glasplaatje Microscoop onder een Microscoop ontleden en een label met identificatiegegevens.
    Opmerking: Als alternatief, de hersenen kunnen gemonteerd worden rechtstreeks op een glas cover voor toegang tot beide kanten van de hersenen tijdens de beeldvorming. Een protocol met een beschrijving van deze procedure montage geweest eerder gepubliceerde45.
  2. Verwijderen van de hersenen uit elke buis van de microcentrifuge met behulp van een afgestompte Pipetteer tip (bereid met een scheermesje te verwijderen van de bodem ~ 1 cm van een 1-200 µL tip) en ze vervolgens overbrengen naar het midden van de dia. Overdragen als kleine antifade reagens met de hersenen mogelijk.
  3. Gebruik pincet om de positie van de hersenen in de gewenste richting (bijvoorbeelddorsale richting de bovenkant van de dia en de voorste oppervlak naar boven voor de antennal kwab imaging). Bij het oriënteren van de hersenen, rekening houden met het licht weg van de Microscoop voor imaging hen moet worden gebruikt.
  4. Verwijder overtollige antifade reagens van de dia met behulp van de puntige hoek van een gevouwen lab weefsel zonder verstoring van de hersenen. Laat de dia zitten voor ~ 5-10 min in het donker te staan de hersenen aan de dia te houden.
  5. De vliegen hersenen omringen met vier kleine stukjes gebroken cover glas geplaatst aan elke kant van de hersenen om te vormen van een plein dat ~ 19 mm x 19 mm. plaats een van de randen van een glas cover 22 x 22 mm No. 1.5 net buiten een van deze kleine stukjes glas , en zachtjes lager het dekglaasje aan over de hersenen om te voltooien de brug-mount.
  6. Langzaam afzien verse antifade reagens om te vullen de oppervlakte onder het dekglaasje aan, voorzichtig niet te verstoren het dekglaasje aan of de hersenen. Veeg de overtollige antifade met behulp van de puntige hoek van een gevouwen lab weefsel zonder direct contact met het dekglaasje aan.
  7. Voeg een druppel helder, sneldrogende nagellak aan elk van de vier hoeken van het dekglaasje aan. Laten drogen voor ~ 10 min. Dan, zegel de vier randen van het dekglaasje aan met nagellak op volledig omsluiten de hersenen.
  8. Beeld hersenen onmiddellijk, of bewaren bij 4 ° C tot klaar.
    1. Als imaging intrinsieke fluorescentie van Htt-belichting fluorescerende eiwit fusies, het imago van de hersenen binnen 24 uur voor het beste signaal.

5. beeldvorming en kwantificeren van Prion-achtige indiening van aggregaten

  1. Het imago van de gemonteerde hersenen met behulp van een confocal microscoop te zijn uitgerust met een 40 X of 60/63 X olie doelstelling voor het verzamelen van z-delige beelden door de regio van de hersenen waar de geselecteerde stuurprogramma's Gal4 en QF worden uitgedrukt (Figuur 2A, B).
    1. Excite de fluorescente proteïne fusies of immunolabeled eiwitten met behulp van de juiste lasers (bijvoorbeeld488 nm voor GFP/YFP/FITC of 552 nm voor mCherry/Cy3). Detectie windows instellen dat opname maximale fluorescent signaal terwijl het elimineren van kanaal cross-talk met behulp van een spectrale detectiesysteem of band/lange pass emissie filters specifiek voor elke fluorophore.
      Opmerking: Zijn attente wanneer imaging eiwit-aggregaten. Het is gemakkelijk voor pixels in het midden van elk aggregaat te verzadigd raken, met name in grotere aggregaten. Proberen te minimaliseren verzadiging in de afbeelding, maar bewust van het risico van verlies van signaal uit kleinere geaggregeerde soorten (Figuur 2B, C, D). Teveel verzadiging zal toenemen met de achtergrond van de afbeelding, waardoor het moeilijker om te identificeren van geïsoleerde puncta. Test verschillende beeldvormende instellingen optimaliseren alvorens de laatste beelden in elke gegevensverzameling.
  2. Analyseren van de gegevens door het kwantificeren van de individuele puncta ofwel handmatig door te verplaatsen door middel van afzonderlijke z-segmenten (zoals Figuur 2C en Figuur 4A) of na het renderen van de confocal segmenten in 3 dimensies (Figuur 3 A, B).
    Opmerking: Dit kan gebeuren in beeld J of andere beeld processing software.
    1. Als de aggregaten zijn goed gescheiden, maar er is minimale achtergrond fluorescentie, gebruiken de software van de analyse van de afbeelding systematisch identificeren, kwantificeren en analyseren van de aggregaten als afzonderlijke "objecten" of "oppervlakten" in een 3D reconstructie van de confocal stack ( Figuur 3 B).
      Opmerking: Software beschreven acties zijn specifiek voor het instrument en de software die hier wordt gebruikt (Zie de Tabel van de materialen).
      1. Visualiseer een confocal z-serie in de 3D-weergavemodus. De "Analyse" wizard kunt identificeren van individuele plekken in een geselecteerde kanaal (bijvoorbeeld het rode kanaal voor HttQ91-mCherry in Figuur 3 aggregaten). Pas de drempelmethode en filters voor nauwkeurig alle ongelijkmatig middelgrote aggregaten als afzonderlijke objecten in de afbeelding.
      2. Inschakelen "Split objecten" onder "Binaire verwerking voorfilter" om te scheiden van de nauw aggregaten die aberrantly door het algoritme van de software worden samengevoegd. Merk op dat het totale aantal objecten en hun bijbehorende metingen wordt gemeld onder "Metingen."
        Opmerking: Deze methode voor de kwantificering van mutant Htt aggregaten is niet vatbaar voor het immunokleuring protocol, omdat het midden van amyloïde aggregaten, is ondoordringbaar aan antilichamen. Dientengevolge, de aggregaten verschijnen op de Microscoop als ring-achtige structuren, en software van de analyse van de afbeelding niet te nauwkeurig identificeren en te onderscheiden van deze individuele "spots".
    2. Kwantificeren van wild-type Htt aggregaten door handmatig verplaatsen via de z-stack en scoren van wild-type Htt aggregaten, ervoor te zorgen dat er geen aggregaten zijn dubbel-scoorde als ze in meer dan één verschijnen segment (Figuur 4A).
      Opmerking: Deze handleiding kwantificering benadering kan worden gebruikt wanneer het aantal aggregaten in elke confocal stack redelijk (b.v.20-50 is). Het is ook nuttig wanneer de software van de analyse van de afbeelding kan niet individuele puncta van omliggende signaal in hetzelfde kanaal (b.v.signaal van diffuse wild-type Htt in nabijgelegen cellen onderscheiden) (Figuur 2B, C en Figuur 4 A). kwantificeren van de wild-type Htt aggregaten kan ook lastig omdat vele normale structuren in de hersenen punctate (bijvoorbeeldcel processen en synapsen lijken). Co lokalisatie van wild-type en mutant Htt-signalen kan worden gebruikt als een selectiecriterium; het is echter mogelijk dat sommige mutant Htt "zaden" lager is dan de limiet van de opsporing van de confocal. Een eiwit dan Htt die niet in de ontvangende cellen (bijvoorbeeldGFP samenvoegen doet) kan worden gebruikt om het label ongerelateerde punctate structuren in de hersenen.
  3. Gebruik de software van de analyse van de afbeelding verdere karakterisering van individuele aggregaten uitvoeren. Bijvoorbeeld, bepalen de grootteverdeling van de aggregaten (Figuur 3C), percentage mede lokalisatie tussen de mutant en wild-type Htt eiwitten (Figuur 4,A), of direct meten met behulp van de FRET (eiwit-eiwitinteractie Figuur 4 B).
    1. Bepaal de grootteverdeling van individuele puncta met behulp van een plek of oppervlakte detectie algoritme waarmee nauwkeurig alle zichtbare aggregaten in een bepaald kanaal. Gebruik van de software van de analyse van het beeld te nemen relevante metingen van de vlekken of oppervlakken, bijvoorbeeld het verkrijgen van 'totale diameter' (Fig. 3 C), 'volume' of 'intensity' informatie 'Metingen' in de software "Analyse" wizard beschreven in stap 5.2.1.
      Opmerking: In Figuur 3Crapporteren we de verdeling van de diameter voor alle HttQ91-mCherry puncta geïdentificeerd in een enkele DA1 glomerulus.
    2. Bepaal de percentage mede lokalisatie tussen HttQ25-YFP en HttQ91-mCherry-aggregaten door manueel het bewegen van segment-door-delige via een confocal z-schoorsteen (meest accurate methode). Maar wees voorzichtig niet te tellen elke aggregaten tweemaal. Om dit te voorkomen, alleen tellen aggregaten in een bepaalde z-segment als het vlak van de focus door het midden van het aggregaat (Figuur 4A).
    3. Bereken FRET efficiëntie voor geïnduceerde HttQ25-YFP-aggregaten met colocalized HttQ91-mCherry-signaal via de acceptor photobleaching methode.
      1. Eerst, elimineren potentiële cross-talk tussen YFP en mCherry kanalen door middel van detectie windows voor alleen-mCherry en dit is een alleen-YFP signalen die geen signaal in het andere kanaal produceren. Met behulp van deze instellingen, een 'voor foto' van individuele HttQ25-YFP puncta en hun bijbehorende HttQ91-mCherry-signaal ( Figuur 4B).
      2. Vervolgens, photobleach de mCherry signaal door de rode laser aan te passen (b.v., 552 nm) tot 100% intensiteit en scannen totdat het signaal verdwenen is. Terugkeren naar de instellingen die worden gebruikt voor de 'voor foto', en neem een 'na foto' van de dezelfde puncta (Figuur 4B).
      3. Bereken fluorescentie intensiteit metingen voor elke punctum vóór en na photobleaching met behulp van de software van de analyse van de afbeelding.
      4. FRET-efficiëntie berekenen door af te trekken YFP donor fluorescentie gemeten in de 'voor foto' (YFPeerste) van YFP donor fluorescentie in de 'na foto' (YFPdefinitief). Deze waarde deelt door YFPlaatste, en vermenigvuldig met 100.
        Opmerking: FRET efficiëntie kan worden berekend pixel-bij-pixel of algemeen voor elke HttQ25-YFP-aggregaat (Figuur 4B). Acceptor photobleaching is een bijzonder nuttige techniek voor het berekenen van de efficiëntie van de FRET wanneer het signaal van de mCherry die is gekoppeld aan elke punctum HttQ25-YFP is voldoende hoog om te produceren detecteerbare YFP dequenching na mCherry photobleaching.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De hier beschreven methoden produceren betrouwbare gegevens demonstreren prion-achtige overdracht van Htt eiwit-aggregaten uit één cel bevolking naar de andere in de intact vlieg CNS. Conversie van wild-type Htt van diffuse naar punctate wordt waargenomen door directe fluorescentie van deze YFP fusieproteïne in ontvangende glia als gevolg van HttQ91-mCherry expressie in donor ORNs (Figuur 2A-C en Figuur 4...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Als het aantal patiënten die lijden aan neurodegeneratieve aandoeningen stijgen blijft, is er dringend behoefte aan het begrip van de moleculaire pathogenese van deze ziekten te vergroten zodat beter therapieën kunnen worden ontwikkeld. Hier beschrijven we methoden waarmee voor het toezicht op prion-achtige transmissie van pathogene eiwit-aggregaten tussen verschillende soorten cellen in de model-organisme, Drosophila melanogaster. Onlangs hebben we deze methodologie gebruikt om aan te tonen van prion-achtige tr...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij danken de leden van de Kopito, Luo en Pearce labs voor de vele nuttige discussies tijdens de ontwikkeling van deze methoden. Wij danken ook Brian Temsamrit voor kritische lezing van dit manuscript. Dit werk werd gesteund door fondsen van de Universiteit van de wetenschappen en de W.W. Smith Charitable Trusts.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), 10X, pH 7.4ThermoFisher ScientificAM9625Verdun tot 1X
Triton X-100Sigma-AldrichT9284-1L
KimwipesThomas Scientific2904F24
20% paraformaldehyde (PFA)Electron Microscopy Sciences15713-S
Normaal Geitenserum (NGS), gefilterdLampire Biological Laboratories7332500Op delen en invriezen bij ontvangst
Kip anti-GFPAves LabsGFP-1020Gebruik bij 1:500 verdunning
Konijn anti-DsRedClontech632496Gebruik bij 1:2000 verdunning; kan DsRed-gebaseerde fluorescente eiwitten herkennen (bijv. mCherry, mStrawberry, tdTomato, etc.)
Muis anti-BruchpilotDevelopmental Studies Hybridoma Banknc82Gebruik bij 1:100 verdunning; zal actieve pre-synaptische structuren door het vliegse hersenen labelen
FITC anti-kipThermoFisher ScientificSA1-7200Gebruik bij 1:250 verdunning
Alexa Fluor 568 anti-konijnLife TechnologiesA11011Gebruik bij 1:250 verdunning
Alexa Fluor 647 anti-muis antilichaamLife TechnologiesA21235Gebruik bij 1:250 verdunning
Slowfade Gold Antifade ReagensLife TechnologiesS36936
Microscoopglazen (25 x 75 x 1.0 mm)Fisher Scientific12-550-143
Dekglas (22 x 22 mm)Globe Scientific1404-15
Dumont Biology Grade Pincet, Stijl 3Ted Pella503gebruik in niet-dominante hand
Dumont Biology Grade Pincet, Stijl 5Ted Pella505gebruik in dominante hand
LAS X beeldanalysesoftwareLeica
Imaris beeldanalysesoftwareBitplane

Referenties

  1. Prusiner, S. B. Biology and genetics of prions causing neurodegeneration. Annu Rev Genet. 47, 601-623 (2013).
  2. Haïk, S., Brandel, J. P. Infectious prion diseases in humans: Cannibalism, iatrogenicity and zoonoses. Infect Genet Evol. 26, 303-312 (2014).
  3. Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting Proteostasis for Disease Intervention. Science. 319 (5865), 916-919 (2008).
  4. Stroo, E., Koopman, M., Nollen, E. A., Mata-Cabana, A. Cellular Regulation of Amyloid Formation in Aging and Disease. Front Neurosci. 11, 64(2017).
  5. Brundin, P., Melki, R., Kopito, R. Prion-like transmission of protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (4), 301-307 (2010).
  6. Jucker, M., Walker, L. C. Self-propagation of pathogenic protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nature. 501 (7465), 45-51 (2013).
  7. Stopschinski, B. E., Diamond, M. I. The prion model for progression and diversity of neurodegenerative diseases. Lancet Neurol. 16 (4), 323-332 (2017).
  8. Walker, L. C., Jucker, M. Neurodegenerative diseases: expanding the prion concept. Annu Rev Neurosci. 38, 87-103 (2015).
  9. Holmes, B. B., et al. Heparan sulfate proteoglycans mediate internalization and propagation of specific proteopathic seeds. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (33), 3138-3147 (2013).
  10. Munch, C., O'Brien, J., Bertolotti, A. Prion-like propagation of mutant superoxide dismutase-1 misfolding in neuronal cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (9), 3548-3553 (2011).
  11. Nonaka, T., et al. Prion-like properties of pathological TDP-43 aggregates from diseased brains. Cell Rep. 4 (1), 124-134 (2013).
  12. Ren, P. H., et al. Cytoplasmic penetration and persistent infection of mammalian cells by polyglutamine aggregates. Nat Cell Biol. 11 (2), 219-225 (2009).
  13. Trevino, R. S., et al. Fibrillar structure and charge determine the interaction of polyglutamine protein aggregates with the cell surface. J Biol Chem. 287 (35), 29722-29728 (2012).
  14. Volpicelli-Daley, L. A., et al. Exogenous alpha-synuclein fibrils induce Lewy body pathology leading to synaptic dysfunction and neuron death. Neuron. 72 (1), 57-71 (2011).
  15. Zeineddine, R., et al. SOD1 protein aggregates stimulate macropinocytosis in neurons to facilitate their propagation. Mol Neurodegener. 10, 57(2015).
  16. Ayers, J. I., Fromholt, S. E., O'Neal, V. M., Diamond, J. H., Borchelt, D. R. Prion-like propagation of mutant SOD1 misfolding and motor neuron disease spread along neuroanatomical pathways. Acta Neuropathol. 131 (1), 103-114 (2016).
  17. Clavaguera, F., et al. Brain homogenates from human tauopathies induce tau inclusions in mouse brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (23), 9535-9540 (2013).
  18. de Calignon, A., et al. Propagation of tau pathology in a model of early Alzheimer's disease. Neuron. 73 (4), 685-697 (2012).
  19. Eisele, Y. S., et al. Induction of cerebral beta-amyloidosis: intracerebral versus systemic Abeta inoculation. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (31), 12926-12931 (2009).
  20. Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338 (6109), 949-953 (2012).
  21. Meyer-Luehmann, M., et al. Exogenous induction of cerebral beta-amyloidogenesis is governed by agent and host. Science. 313 (5794), 1781-1784 (2006).
  22. Mougenot, A. L., et al. Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model. Neurobiol Aging. 33 (9), 2225-2228 (2012).
  23. Rey, N. L., et al. Widespread transneuronal propagation of alpha-synucleinopathy triggered in olfactory bulb mimics prodromal Parkinson's disease. J Exp Med. 213 (9), 1759-1778 (2016).
  24. Babcock, D. T., Ganetzky, B. Transcellular spreading of huntingtin aggregates in the Drosophila brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (39), 5427-5433 (2015).
  25. Kim, D. K., et al. Anti-aging treatments slow propagation of synucleinopathy by restoring lysosomal function. Autophagy. 12 (10), 1849-1863 (2016).
  26. Liu, L., et al. Trans-synaptic spread of tau pathology in vivo. PLoS One. 7 (2), 31302(2012).
  27. Pearce, M. M., Spartz, E. J., Hong, W., Luo, L., Kopito, R. R. Prion-like transmission of neuronal huntingtin aggregates to phagocytic glia in the Drosophila brain. Nat Commun. 6, 6768(2015).
  28. Pearce, M. M. Prion-like transmission of pathogenic protein aggregates in genetic models of neurodegenerative disease. Curr Opin Genet Dev. 44, 149-155 (2017).
  29. Pecho-Vrieseling, E., et al. Transneuronal propagation of mutant huntingtin contributes to non-cell autonomous pathology in neurons. Nat Neurosci. 17 (8), 1064-1072 (2014).
  30. Wu, J. W., et al. Neuronal activity enhances tau propagation and tau pathology in vivo. Nat Neurosci. 19 (8), 1085-1092 (2016).
  31. Jackson, G. R., et al. Polyglutamine-expanded human huntingtin transgenes induce degeneration of Drosophila photoreceptor neurons. Neuron. 21 (3), 633-642 (1998).
  32. Warrick, J. M., et al. Expanded polyglutamine protein forms nuclear inclusions and causes neural degeneration in Drosophila. Cell. 93 (6), 939-949 (1998).
  33. McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an In Vivo Model for Human Neurodegenerative Disease. Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).
  34. The Huntington's Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
  35. Bates, G. P., et al. Huntington disease. Nat Rev Dis Primers. 1, 15005(2015).
  36. Scherzinger, E., et al. Self-assembly of polyglutamine-containing huntingtin fragments into amyloid-like fibrils: implications for Huntington's disease pathology. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (8), 4604-4609 (1999).
  37. Chen, S., Berthelier, V., Yang, W., Wetzel, R. Polyglutamine aggregation behavior in vitro supports a recruitment mechanism of cytotoxicity. J Mol Biol. 311 (1), 173-182 (2001).
  38. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  39. Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141 (3), 536-548 (2010).
  40. Riabinina, O., Potter, C. J. The Q-System: A Versatile Expression System for Drosophila. Methods Mol Biol. 1478, 53-78 (2016).
  41. Costanzo, M., et al. Transfer of polyglutamine aggregates in neuronal cells occurs in tunneling nanotubes. J Cell Sci. 126 (16), 3678-3685 (2013).
  42. Freeman, M. R., Delrow, J., Kim, J., Johnson, E., Doe, C. Q. Unwrapping glial biology: Gcm target genes regulating glial development, diversification, and function. Neuron. 38 (4), 567-580 (2003).
  43. MacDonald, J. M., et al. The Drosophila cell corpse engulfment receptor Draper mediates glial clearance of severed axons. Neuron. 50 (6), 869-881 (2006).
  44. Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1 (4), 2110-2115 (2006).
  45. Tito, A. J., Cheema, S., Jiang, M., Zhang, S. A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains. J Vis Exp. (118), (2016).
  46. Roszik, J., Szöllosi, J., Vereb, G. AccPbFRET: an ImageJ plugin for semi-automatic, fully corrected analysis of acceptor photobleaching FRET images. BMC Bioinformatics. 9, 346(2008).
  47. Spires-Jones, T. L., Attems, J., Thal, D. R. Interactions of pathological proteins in neurodegenerative diseases. Acta Neuropathol. 134 (2), 187-205 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Mutante huntingtine aggregatenfluorescent eiwit taggingprotocol voor hersendissectieconfocale microscopie beeldvormingpuncta kwantificeringsanalysegenetische driversystemenfluorescentieresonantie energietransfer
Controle van cel naar cel transmissie van Prion-achtig eiwit-aggregaten in Drosophila Melanogaster
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.