Met behulp van een uitgebreide Immunoprecipitation verrijking systeem ter identificatie van het profiel van een endogene posttranslationele wijziging voor Target eiwitten

Summary

Het onderzoeken van meerdere, kunnen endogene posttranslationele modificaties voor een eiwit-doelstelling zeer uitdagend. De hier beschreven technieken gebruiken een geoptimaliseerde lysis buffer en filter systeem ontwikkeld met specifieke PTM-targeting, affiniteit matrices te sporen van de acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3 en tyrosine fosforylering wijzigingen voor een doel eiwit met behulp van een enkele, gestroomlijnde systeem.

Abstract

Het is nu goed gewaardeerd dat posttranslationele modificaties (PTMs) een integrale rol spelen in het reguleren van de structuur en de functie, die essentieel zijn voor een bepaald eiwit rol zowel fysiologisch en pathologisch van een eiwit. Verrijking van PTMs is het vaak nodig bij het onderzoeken van de PTM status van een doel-eiwit, omdat PTMs vaak van voorbijgaande aard zijn en relatief laag in overvloed. Vele valkuilen worden aangetroffen als verrijkend voor een PTM van een doel-eiwitten, zoals buffer onverenigbaarheid, is het doel eiwit antilichaam niet IP-compatibele, verlies van PTM signaal, en anderen. De graad van moeilijkheid wordt vergroot bij het onderzoeken van meerdere PTMs zoals acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3 en tyrosine fosforylering voor een bepaald doel-eiwit. Bestuderen van een combinatie van deze PTMs kan noodzakelijk zijn als Overspraak tussen PTMs overwegend en essentieel voor eiwit-verordening is. Deze PTMs worden vaak bestudeerd in verschillende lysis buffers en met unieke remmer composities. Om het proces te vereenvoudigen, unieke denatureren lysis werd een systeem ontwikkeld dat effectief isoleert en behoudt deze vier PTMs; waardoor onderzoek van potentiële overspraak in een enkele lysis-systeem. Een uniek filtersysteem werd ontworpen om te verwijderen besmetten genomic DNA van de lysate, die een problematische bijproduct van de denaturering van buffers. Robuuste affiniteit matrices gericht op elk van de vier PTMs werden ontwikkeld in samenspraak met de buffersysteem om de verrijking en de detectie van de endogene Staten van deze vier PTMs te maximaliseren. Deze uitgebreide PTM detectie toolset stroomlijnt het proces van het verkrijgen van belangrijke informatie over of een eiwit is gewijzigd door een of meer van deze PTMs.

Introduction

Posttranslationele modificaties (PTMs) zijn sterk gereguleerde wijzigingen aan een proteïne, waarbij de wijziging wordt toegevoegd of verwijderd op een specifieke wijze. PTMs zijn vaak dynamische, voorbijgaande veranderingen die aanzienlijk veranderen de eiwitstructuur, interacties met partner eiwitten, ruimtelijke lokalisatie en uiteindelijk waardoor de eiwitten voor het uitvoeren van verschillende functies^{1,2 , 3 , 4}. PTMs zijn zo overvloedig dat ze het aantal unieke eiwit vormen (of proteoforms) van ongeveer 30.000 genproducten tot meer dan een miljoen proteoforms^{5,6 stijgen}. Het identificeren van PTMs en definiëren hun effect op een doel-proteïne is kritisch naar het begrip van het eiwit van fysiologische en pathologische functies^{7,8,9,10, 11,12,13,14}. Werken op select eiwitten zoals tubuline, p53 en epidermale groeifactor receptor (EGFR) de regelgevende taken van PTMs^15,16,17hebben toegelicht. Deze studies aan het licht gebracht dat de verordening van deze eiwitten ontstaat door meerdere PTMs, en in veel gevallen deze wijzigingen werken in concert ter bevordering van een specifieke functie. Nieuwe studies hebben aangetoond dat zowel de negatieve als de coöperatieve PTM Overspraak kan plaatsvinden op diverse verschillende eiwitten^{18,19,20,21,22, 23,24,25}. Echter zijn de PTM profielen van de meerderheid van eiwitten opgebouwd uit verschillende studies die hebben gebruikt verschillende modellen en unieke omstandigheden. Een geoptimaliseerde systeem te onderzoeken van meerdere PTMs in één systeem zou zeer gunstig inzicht te krijgen in de potentiële PTM Overspraak voor een doel-eiwit.

Een uitdaging met het onderzoek naar PTMs in één systeem is dat er specifieke PTMs worden onderzocht met behulp van verschillende lysis buffers. Bijvoorbeeld het gebruik van buffers zoals RIPA of NP-40 die vaak worden gebruikt voor fosforylatie of ubiquitination onderzoeken mogelijk onvoldoende voor het bestuderen van een labiele PTM zoals kleine ubiquitin-achtige modifier (SUMO) ylation²⁶. Bovendien, niet-denaturering buffers niet toereikend zijn om eiwitinteractie distantiëren, en kunnen leiden tot valse positieve PTM identificatie²⁷. Onderzoek naar PTMs in een denatureren lysis-buffermengsel kan zijn voorkeur, en het is aanzienlijk beter bij het isoleren van eiwitten uit alle cellulaire compartimenten²⁸, zal de meeste eiwitinteractie distantiëren, zal remmen proteasen die veranderen van PTM Staten, zoals deSUMOylases ²⁶; echter de denaturering van buffers kan de integriteit van specifieke affiniteit reagentia zoals ubiquitin bindend domein gebaseerde tools²⁷compromis. Ontwikkeling van een systeem van de lysis van de denaturering-achtige om te bestuderen van meerdere PTMs van een proteïne in een affiniteit reagens-compatibel systeem zou zeer nuttig zijn voor PTM Overspraak onderzoeken.

Hoewel denatureren buffers belangrijke voordelen ten opzichte van niet-denaturering buffers hebben voor het onderzoek naar PTMs, ze kunnen minder vaak gebruikte vanwege hun aanzienlijke nadelen, zoals incompatibiliteit met conventionele eiwit testen, aanzienlijke genomic deoxyribonucleic acid (DNA) verontreiniging en verstoring van immunoprecipitation (IP) reagentia²⁹. Deze nadelen kunnen leiden tot langere voorbereidingstijd en mogelijke schade aan target eiwitten wanneer scheren genomic DNA. Twee veelgebruikte methoden wilt schuintrekken DNA omvatten spuit lysis en ultrasoonapparaat²⁹. Beide methoden vereisen uitgebreide optimalisatie en ontbreekt het vaak aan precieze reproduceerbaarheid. Alternatieve methoden voor het verwijderen van genomic DNA omvatten de toevoeging van DNAses; echter hiervoor kunnen aanvullende optimalisatie en wijzigingen in de samenstelling van de buffer. Uiteindelijk, een eenvoudige en reproduceerbare methode om te verwijderen van genomic DNA besmetting zou zinvol zijn bij het werken met de denaturering van lysis buffers voor PTM onderzoeken.

Het doel van deze techniek is het ontwikkelen van een systeem om te isoleren en onderzoeken ubiquitination (Ub), tyrosine fosforylering (pY), SUMOylation 2/3 (SUMO 2/3) en acetylation (Ac) PTMs in één systeem beter onderzoeken PTM Overspraak voor een doel-eiwit. Dit detectiesysteem PTM werd gebruikt om te onderzoeken snel het endogene PTM-Profiel van verschillende doel eiwitten in een enkel systeem. Nieuw inzicht in de potentiële Overspraak was geïdentificeerde^30,31. Over het geheel genomen de hier beschreven techniek verbetert op bestaande methoden te onderzoeken PTMs en PTM Overspraak op drie verschillende manieren: 1) een unieke denatureren buffer werd ontwikkeld dat isoleert van eiwitten uit alle cellulaire compartimenten, terwijl nog steeds compatibel met PTM affiniteit reagentia, 2) een uniek filtersysteem werd ontwikkeld dat snel genomic DNA besmetting verwijderd gedenatureerde lysates met hoge reproduceerbaarheid en vereist geen gespecialiseerde apparatuur, en 3) de robuuste affiniteit kralen, lysis systeem, en remmende reagentia stroken; Dus, het vereenvoudigen van het isolement van deze vier PTMs voor een doel-eiwit om te maximaliseren PTM verrijking, en potentiële Overspraak efficiënt te onderzoeken.

Protocol

1. de monstervoorbereiding: De cultuur van de cel

1. Vier 150 mm platen van A431 cellen in de Dulbecco bewerkt Eagle's medium (DMEM), aangevuld met 10% foetale runderserum groeien.
   1. De A431 cellen groeien tot 50% confluentie.
   2. Serum beperken de vier platen van A431 cellen met serumvrij DMEM gedurende 24 uur.
   3. Behandelen twee platen van A431 cellen met 33,3 mg/mL epidermale groeifactor voor 1 h. laten de andere twee platen onbehandeld.
      Opmerking: Cel groei en behandeling voorwaarden hieronder geven een voorbeeld; Deze methode is echter toepassing op veel verschillende soorten cellen en behandeling voorwaarden.
2. Voorbereiden blastR lysis en verdunning buffers met remmers (tabel 1). Combineer 2.895 mL lysisbuffermengsel blastR met 15 µL van tyrosine fosfatase-remmer, 30 µL van deubiquitinase en deSUMOylase-remmer, 30 µL van histone deacetylase (HDAC) remmer en 30 µL van proteaseinhibitor cocktail.
   1. Combineer 9.65 mL van blastR verdunning buffer met 50 µL van tyrosine fosfatase-remmer, 100 µL van deubiquitinase en deSUMOylase-remmer, 100 µL van histone deacetylase (HDAC) remmer en 100 µL van de proteaseinhibitor cocktail.
      Opmerking: Zie Tabel van materialen voor informatie over de samenstelling en Inhibitor van de omwenteling van de buffer.
3. Giet af de voedingsbodems en plaats de cellen op het ijs. Vervolgens wassen de cellen tweemaal met 10 mL 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
   1. Verwijder zo veel PBS mogelijk voorafgaand aan toe te voegen blastR lysis-buffermengsel maximaliseren van lysis van de cel.
      Opmerking: Zie Tabel van materialen voor de samenstelling van de buffer.
4. Voeg 600 µL van blastR lysis buffer voor elke 150 mm plaat. Het bedrag van de buffer is gebaseerd op verwachte eiwit opbrengst (tabel 2).
   1. Lyse de cellen met behulp van een cel schraper. De lysate zal worden als gevolg van lysis van de nucleaire viskeuze.
5. Gebruik een fijngesneden 1 mL pipet tip de ruwe lysate overbrengen naar een blastR-filter dat is geplaatst in een collectie-tube van 15 mL (Figuur 1). Hier, wordt een tube van 15 mL falcon gebruikt.
6. Gebruik een meegeleverde filter plunjer volledig comprimeren het filter blastR en verzamelen de lysate doorstroom, met inbegrip van alle bubbels, in een tube van 15 mL (Figuur 1).
7. Optioneel: Overdracht verduidelijkt lysate een tube van 1,5 mL microcentrifuge en een centrifuge de lysate op ongeveer 10.000 x g voor 1 min bij 4 ° C.
   1. Het supernatant overbrengen in een nieuwe falcon-tube van 15 mL.
8. Verdun de geklaarde lysate met blastR verdunning buffer tot een eindvolume van 3 mL voor elke 150 mm plaat. Het eindvolume is gebaseerd op verwachte eiwit opbrengst (tabel 2).
   Opmerking: Deze stap is belangrijk aangezien de buffer van de definitieve samenstelling gevolgen voor de IP-reactie striktheid hebben zal.
9. Kwantificeren eiwitconcentratie (sectie 2).

2. eiwitten Quantitation Assay

Opmerking: Gebruik een standaard colorimetrische eiwit kwantificatie test om te bepalen eiwit kwantificatie. Hier, is kwantificatie van eiwit bepaald met behulp van precisie rode geavanceerde eiwit bepaling.

1. 1 mL van precisie rode geavanceerde assay eiwitreagens aan elk van de twee 1 mL cuvettes toevoegen.
2. Mix 10 µL van blastR lysis-buffermengsel en 40 µL van blastR verdunning buffer in een schone 1,5 mL microcentrifuge buis op ijs.
   Opmerking: Dit zal worden gebruikt voor het lezen van de lege eiwitSteekproef.
3. 20 µL van het mengsel van de buffer lysis/verdunning (uit stap 2.2) aan de eerste cuvette en mix toevoegen door twee tot drie keer omkeren.
4. Voeg 20 µL van de verdunde cel lysate (van experiment) naar de tweede cuvette, mengen zoals hierboven.
5. Monsters voor 1 minuut bij kamertemperatuur incuberen.
6. Lege spectrofotometer met de lysis/verdunning buffer mix monster (uit stap 2.3).
7. Meet de extinctie van de lysate monster (uit stap 2.4) op 600 nm.
8. Bepaal de lysate eiwitconcentratie als volgt;
   monster lezen OD₆₀₀ x 5 = eiwitconcentratie in mg/mL
   Opmerking: OD lezingen onder de 0,05 of boven 0,5 liggen dicht bij de capaciteit van de lineaire bereik van de bepaling van eiwit. Voor lezingen > 0,5, monsters kunnen worden verdund. Voor lezingen < 0,05, meer lysate kunnen worden toegevoegd aan de precisie rode geavanceerde assay eiwitreagens (maximaal 50 µL). Zie tabel 3 voor multiplicatoren spectrofotometer lezingen omzetten in mg/mL lysate eiwitconcentratie. Als er onvoldoende eiwit in één plaat, is het aanbevolen om het gebruik van 2 of meer platen per IP. In dit geval zal de platen in de serie, het overbrengen van de oorspronkelijke 300 µL van lysis buffer tussen platen worden geoogst.
9. Op basis van eiwitconcentratie, Verdun monster met een mix van de buffer (1 deel lysis van de blastR: 4 delen blastR verdunning) naar een gewenste eindconcentratie (meestal 1 mg/mL).
10. Module bevriezen aliquots van monsters die niet onmiddellijk zal worden gebruikt.
    1. Winkel monsters op 70 ° C.
    2. Gaat u verder met sectie 3.

3. Immunoprecipitation (IP) Assay

Opmerking: Affiniteit kraal concentraties, lysate concentraties en incubatie tijden worden aanbevolen richtsnoeren en uniek voor elke doelgroep eiwitten en specifieke PTM onderzocht kunnen worden.

1. Omkeren voorraad reagens buizen met Ub affiniteit kralen, pY affiniteit kralen, SUMO 2/3 affiniteit kralen en Ac affiniteit kralen meerdere malen om ervoor te zorgen dat de kralen zijn volledig geresuspendeerde in de buis.
2. Voor elk IP-assay, aliquoot kraal schorsing in aparte 1,5 mL microcentrifuge buizen op ijs (IP-buis). Hier, 20 µL van ubiquitin affiniteit kralen, 30 µL van phosphotyrosine affiniteit kralen, 40 µL van SUMOylation 2/3 affiniteit kralen of 50 µL van acetylation affiniteit kralen toevoegen aan afzonderlijke 1,5 mL microcentrifuge buizen op ijs.
   Opmerking: Zie tabel 4 voor de aanbevolen hoeveelheid kraal schorsing te gebruiken voor elke kraal affiniteit.
3. Omkeren voorraad reagens buizen met ubiquitination IP-controle kralen en kralen van IgG controle meerdere malen om ervoor te zorgen dat de kralen zijn volledig geresuspendeerde in de buis.
4. Aliquot controle kralen per besturingselement reactie om niet-specifieke binding (controle IP-buis). Hier, 20 µL van Ub controle kralen, 30 µL van pY controle kralen, 40 µL van SUMO 2/3 controle kralen of 50 µL van Ac control kralen toevoegen aan afzonderlijke 1,5 mL microcentrifuge buizen op ijs.
   Opmerking: Zie tabel 4 voor de aanbevolen hoeveelheid kraal schorsing te gebruiken voor elk soort affiniteit kraal.
5. Een kleine hoeveelheid lysate (20 µL) uit te voeren aan een westelijke vlek lysate controle-invoer opslaan. Voeg 5 µL van 5 x monster buffer en kook bij 95 ° C gedurende 5 min.
   Opmerking: Zie Tabel van materialen voor de samenstelling van de buffer.
6. Voeg toe lysate naar elk IP-buis en controle IP-buis. 1 mg lysate werd hier gebruikt per IP en controle reactie, resulterend in een totaal van 8 IP-reacties.
   Opmerking: 1,0 mg lysate per assay wordt aanbevolen als uitgangspunt. De hoeveelheid lysate vereist zal variëren afhankelijk van de overvloed van gemodificeerde doel eiwit.
7. Incubeer de buizen op een roterend platform van eind over bij 4 ° C gedurende 2 uur. Hier werd een ATR buis rotator gebruikt bij snelheid 22.
8. Kralen verzamelen door centrifugeren bij 3000-5000 x g gedurende 1 minuut bij 4 ° C.
9. Gecombineerd uit zoveel supernatant mogelijk zonder verstoring van de kralen.
10. Wassen kralen in 1 mL blastR was Buffer (remmers zijn niet nodig in dit stadium) gedurende 5 minuten op een 4 ° C roteren van platform.
11. Kralen verzamelen door centrifugeren bij 3000-5000 x g gedurende 1 minuut bij 4 ° C.
12. Gecombineerd uit zoveel supernatant mogelijk zonder verstoring van de kralen.
13. Herhaal de stap wassen (stappen 3.10-3.12) twee keer.
14. Na de definitieve wash, volledig verwijderen buffer supernatant. Minimale verstoring van de kraal pellet is aanvaardbaar (tot een verlies van 5%). Residuele bovendrijvende vloeistof verwijderen met behulp van een boete droeg eiwit laden tip.
15. Voeg 30 µL van kraal elutie buffer en resuspendeer de kralen door zachtjes te tikken/flicking de kant van de buis. Gebruik een pipet niet in dit stadium.
    Opmerking: Zie Tabel van materialen voor de samenstelling van de buffer.
16. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
17. Spoel zachtjes elke kraal-suspensie op een 1,5 mL microcentrifuge spin kolom die in een tube van 1,5 mL microcentrifuge is geplaatst.
    Opmerking: Het is aanbevolen om het einde off van de overdracht Pipetteer tip voor zachtere overdracht snip.
18. Centrifugeer bij 9000-10.000 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur aan de IP-monster verzameld.
19. 2 µL van 2-mercaptoethanol toevoegen aan elk monster en meng goed.
    Opmerking: Het is handig om snap het deksel uit de kolom van de spin en gebruik dit om de dop van de tube collectie voor verdere verwerking.
20. Leg monsters in een bad van water van 95 ° C voor 5 min. verzamelen monster door centrifugeren bij 10.000 x g gedurende 1 minuut op RT.
21. Indien nodig, monsters bij-70 ° C worden opgeslagen en stoppen hier, of gaan met SDS-pagina, overdracht en westelijke vlekkenanalyse (afdeling 4).

4. westelijke vlekkenanalyse: Identificatie van de proteïne van belang

1. Afzonderlijke monsters door natrium dodecyl sulfaat van polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE) en transfer naar een Polyvinylideenfluoride (PVDF) fluoride membraan, volgens standaard laboratorium protocollen³².
2. Het gebruiken van een primair antilichaam voor het detecteren van de post-translationally gewijzigde versies van de proteïne van belang. Hier, werd PD-L1 antilichaam gebruikt voor het detecteren van post-translationally gemodificeerde PD-L1.
3. Ultrasensitive Chemoluminescentie detectie reagens wordt gebruikt voor detectie.
   Opmerking: De chemiluminiscent reagens gebruikt moet worden gebruikt in combinatie met een HRP-gelabeld secundair antilichaam die kunnen detecteren of het primaire antilichaam.
4. Een volume van 2 mL chemiluminescent reagens wordt gebruikt per mini-gel en middelgrote overdracht membraan (ongeveer 8 x 7 cm) gebruiken.
   1. Na incubatie met passende secundair antilichaam (60 min op RT wordt aanbevolen), de vlek 6 x 10 min wassen in 30 mL tris-gebufferde zoutoplossing-tween-20 (TBST).
      Opmerking: Zie Tabel van materialen voor de samenstelling van de buffer.
   2. Onmiddellijk vóór gebruik, meng 1 mL chemiluminescent reagens A met 1 mL chemiluminescent reagens B (voldoende voor een 8 x 7 cm membraan).
   3. Voeg chemiluminescent reagens wordt gebruikt aan membraan en incubeer met zachte rockende op RT voor 1-5 min vóór visualisatie van eiwit signaal met x-ray film of charge - coupled apparaat (CCD) camera imaging.
      Opmerking: Kortere incubatietijd tijden in het chemiluminescent reagens kunnen nodig zijn voor zeer overvloedig eiwitten zijn.

Results

Het vermogen van deze hulpprogramma's te onderzoeken van PTM Overspraak door effectief opsporen van deze 4 PTMs is deels afhankelijk van de unieke lysis buffersysteem. De blastR denatureren buffer isoleert effectief eiwitten uit alle cellulaire compartimenten ook aan andere denatureren buffers, die zorgt voor een compleet eiwit Profiel (figuur 2A). Daarnaast behoudt het zeer labiele PTM signalen zoals SUMO 2/3, die is snel verminderd in niet-denaturering buffers zoals radioimmunoprecipitation assay (RIPA) (figuur 2B). Nog belangrijker is, wanneer op de juiste manier verdund, heeft het geen invloed op de integriteit van de affiniteit reagentia zoals andere denatureren buffers (b.v., Laemmli buffer).

Een belangrijke hindernis bij het werken met denatureren buffers is de mogelijkheid om effectief verwijderen van genomic DNA besmetting. De conventionele methode voor het verminderen van de viscositeit is wilt schuintrekken van het DNA met behulp van een naald van de spuit of sonicating van het monster. Figuur 3A toont genomic DNA besmetting in A431 cel lysate na behandeling met BlastR filter, naald van de spuit of ultrasoonapparaat. Er is bijna volledige verwijdering van genomic DNA met behulp van de filter van de BlastR, die niet het geval is met behulp van een conventionele spuit-naald of ultrasoonapparaat. Genomic DNA besmetting heeft grote invloed op eiwit migratie door middel van een SDS-acrylamide gel; behandeling met het BlastR-filter verwijdert echter genomic DNA, resulterend in goede eiwit migratie (figuur 3B). Gewijzigde migratie veroorzaakt door genomic DNA besmetting kan aanzienlijk beïnvloeden interpretatie western blots; bijvoorbeeld kan het vlekkerig EGFR patroon gezien in de ongefilterde lysate worden onnauwkeurig geïnterpreteerd als uitdrukking van de toegenomen ten opzichte van het gefilterde monster (Figuur 3 c).

Door gebruik te maken van deze geoptimaliseerde PTM verrijkings- en detectie systeem, kan men snel bepalen als een doel-eiwit wordt gewijzigd door een of meer PTMs. onderzoek van de PD-L1 PTM profiel werd onlangs uitgevoerd met behulp van deze techniek, en de resultaten bleek dat PD-L1 ubiquitinated, geacetyleerd, en tyrosine phosphorylated in reactie op EGF (Figuur 4). Nog belangrijker is, deze gegevens gerapporteerd endogene PD-L1 PTM veranderingen, die vertegenwoordigd een klein percentage van de totale PD-L1 geïdentificeerd.

Figuur 1: genomic DNA van de cel lysate filteren met BlastR filter. (A) afbeelding van BlastR filter. (B) Lysate is geladen in het filter dat werd geplaatst in een tube van 15 mL collectie. (C) de plunjer wordt geplaatst in de spuit en lysate is doorgegeven door het filter van compressie. (D) verzamelen lysate, met inbegrip van alle bubbels door volledige compressie. (E) gefilterd lysate.

Afbeelding 2: vergelijking van BlastR lysis-buffermengsel naar alternatieve lysis buffers. Figuur 2A aangepast van Horita et al. 2017. de de Biosci. Rep. ³¹ (A) A431 cellen werden lysed met RIPA, mPER, BlastR, IP-lysis, denaturering (1% SDS), en Laemmli lysis buffers. Alle denatureren lysates had genomic DNA verwijderd met behulp van BlastR filter. Isolatie van proteïnen van de membraan, cytoplasmatische, mitochondriaal, en nucleaire markeringen werden bepaald met behulp van antilichamen tegen de respectieve compartiment marker proteïnen. (B) de A431 cellen werden met BlastR, RIPA en 1% SDS denatureren buffer lysed. Lysates waren immunoprecipitated met SUMO 2/3 of besturingselement IgG affiniteit kralen. Monsters werden gescheiden door SDS-PAGE en geanalyseerd door westelijke vlek met behulp van een SUMO 2/3-horseradish peroxidase (HRP) antilichaam. Vertegenwoordiger vlekken van N≥3 onafhankelijke experimenten worden weergegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3: BlastR lysis filter is effectief in het verwijderen van genomic DNA. (A) A431 cellen werden lysed met een denatureren lysis-buffermengsel. Genomic DNA werd verwijderd of schuingetrokken met BlastR filter, naald van de spuit of ultrasoonapparaat 5, 10, 20 of 30 seconden. 2% van de lysate werd geanalyseerd door ethidiumbromide, agarose gelelektroforese. (B) Lysate uit A431 cellen lysed met een denatureren buffer was ofwel ongefilterd of hierop wilt filteren met de filter van de BlastR. Monsters werden gescheiden met SDS-pagina en gevisualiseerd met behulp van Coomassie vlek. (C) duplicaat monsters uit B werden gescheiden door SDS-PAGE, overgedragen aan PVDF, en EGFR eiwit werd onderzocht met behulp van een antilichaam EGFR. Representatieve blots uit N ≥3 onafhankelijke experimenten worden weergegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4: detectie voor het EGF-geïnduceerde posttranslationele modificaties voor PD-L1. Figuur overgenomen van Horita et al. 2017. neoplasia³⁰(A). Serum-beperkte A431 cellen werden beide ongestimuleerde (UT) of gestimuleerd met EGF gedurende één uur voorafgaand aan cellysis met BlastR lysis-buffermengsel. WVA werd geanalyseerd voor PD-L1 niveaus (rijstroken 1,2). Ubiquitin bindende kralen (UBA01) werden gebruikt om IP-ubiquitinated eiwitten (rijstroken 3,4). Phosphotyrosine bindende kralen (APY03) werden gebruikt om IP-tyrosine-phosphorylated eiwitten (rijstroken 5,6). SUMO 2/3 bindende kralen (ASM24) werden gebruikt om IP-SUMOylated 2/3 eiwitten (rijstroken 7,8). Acetyl lysine bindende kralen (AAC01) werden gebruikt om IP-geacetyleerd eiwitten (rijstroken 9,10). IgG bindende controle kralen werden gebruikt om IP-aspecifieke bindende proteïnen (rijstroken 11,12). Monsters werden gescheiden door SDS-PAGE en geanalyseerd door westelijke vlek met behulp van een antilichaam PD-L1. Een representatieve vlek uit N ≥3 onafhankelijke experimenten wordt weergegeven. Witte sterretjes werden gebruikt voor het markeren van PD-L1 pY en Ac eiwit bands. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Berekeningen voor BlastR lysis-buffermengsel
	1,0 mL	2,0 mL	5,0 mL	10,0 mL
BlastR Lysis buffer	965 ΜL	1930 ΜL	4.825 mL	9.650 mL
Tyrosine fosfatase Inhibitor	5 ΜL	10 ΜL	25 ΜL	50 ΜL
de-ubiquitinase/de-sumoylase-remmer	10 ΜL	20 ΜL	50 ΜL	100 ΜL
HDAC-inhibitor	10 ΜL	20 ΜL	50 ΜL	100 ΜL
Proteaseinhibitor cocktail	10 ΜL	20 ΜL	50 ΜL	100 ΜL
Berekeningen voor BlastR verdunning buffer
	4,0 mL	8.0 mL	20,0 mL	40.0 mL
BlastR Lysis buffer	3.86 mL	7.72 mL	19.3 mL	38.6 mL
Tyrosine fosfatase Inhibitor	20 ΜL	40 ΜL	100 ΜL	200 ΜL
de-ubiquitinase/de-sumoylase-remmer	40 ΜL	80 ΜL	200 ΜL	400 ΜL
HDAC-inhibitor	40 ΜL	80 ΜL	200 ΜL	400 ΜL
Proteaseinhibitor cocktail	40 ΜL	80 ΜL	200 ΜL	400 ΜL

Tabel 1: Lysis en verdunning Buffer voorbereiding grafiek. Grafiek verstrekken van concentraties van remmers toe te voegen voor een bepaalde lysis en verdunning buffervolume bij de voorbereiding van buffers voor lysis van de cel.

Gehalte aan andere melkeiwitten plaat	De aanbevolen BlastR Lysis-buffermengsel volume	Aanbevolen BlastR verdunning buffervolume
< 1 mg	Combineren van eiwit uit meerdere platen	Te maken van 1,5 mL eindvolume
1-2 mg	300 ΜL	Te maken van 1,5 mL eindvolume
2-4 mg	600 ΜL	3 mL eindvolume maken
4-6 mg	900 ΜL	Om het eindvolume 4.5 mL

Tabel 2: BlastR Lysis/verdunning Buffer grafiek. Verstrekken van grafiek aanbevolen lysis en verdunning buffer volumes bij het verkrijgen van lysate.

Volume van cel lysate toegevoegd aan 1 ml reagens Precision Red eiwit Assay (µL)	Multiplier te gebruiken met monster lezen OD600
10	10
20	5
30	3.3
40	2.5
50	2

Tabel 3: Multiplicatoren spectrofotometer lezingen omzetten in mg/mL Lysate. Grafiek conversie getallen te verlenen aan aide met berekening van de eiwitconcentratie.

affiniteit kralen	volume van de kraal drijfmest/IP (mL)
Ubiquitination	20
Phosphotyrosine	30
SUMOylation 2/3	40
Acetylation	50
controle kralen	volume van de kraal drijfmest/IP (mL)
Ubiquitination controle kralen	20
Phosphotyrsoine controle kralen	30
SUMOylation 2/3 controle kralen	40
Acetylation controle kralen	50

Tabel 4: Aanbevolen Volume van kralen/IP grafiek. Verstrekken van grafiek aanbevolen hoeveelheden van affiniteit parels te gebruiken per IP-reactie.

Discussion

Eerste benaderingen gebruikt om te bepalen of een doel-proteïne is gewijzigd door een PTM kunnen worden uitgevoerd met behulp van het doel eiwit specifieke antilichaam voor IP, gevolgd door westelijke vlek met een antilichaam PTM (bv., anti-acetyl lysine), of met behulp van een antilichaam PTM voor IP, gevolgd door westelijke vlek met de doelgroep eiwit specifiek antilichaam^30,31,33. Hoewel beide benaderingen theoretisch werken, heeft gebruik makend van een doel-eiwit-specifieke antilichaam meer potentiële valkuilen, zoals het antilichaam niet IP compatibel worden kan of grote PTM wijzigingen de antilichaam erkenning site op het doel eiwit^{34 blokkeren kunnen ,35}. Het voordeel van de PTM affiniteit kralen is dat het antilichaam of bindende domeinen specifiek de PTM van belang herkennen; Dus, aangebrachte wijzigingen in het doel-eiwit moeten niet meer wijzigen erkenning door de affiniteit kralen. Als voorbeeld, PD-L1 Ub werd geïdentificeerd met de hier beschreven techniek, en zowel endogene mono - en poly-Ub werd waargenomen (Figuur 4). Een recente publicatie door Lim et al. in vitro Ub technieken om te onderzoeken PD-L1 Ub gebruikt, en het resultaat was erg vergelijkbaar met de resultaten die worden weergegeven in Figuur 4³⁶. Interessant, traden ze ook IP met een antilichaam PD-L1 te verrijken PD-L1 uit cel lysate, waar Ub was overexpressie en MG-132 is toegevoegd aan het verbeteren van het signaal. De Ub-patroon was niet robuust en zeer verschillend zijn van het in vitro Ub patroon. Onderzoek van endogene PD-L1 Ub in cel cultuur modellen werd niet in de Lim et al.uitgevoerd. verslag aan het verschil tussen hun cultuur en in vitro celgegevens verduidelijken.

Onderzoeken of een eiwit is gewijzigd door een PTM kan lastig zijn, vanwege de lage overvloed en³⁸van de^37,van voorbijgaande aard, en vaak vereist verrijking via IP. Effectieve IP van PTMs vereist optimalisatie van verschillende belangrijke stappen en reagentia, zoals lysis buffers en affiniteit reagentia. Bij het onderzoeken van meerdere PTMs van een doel-eiwit, verhoogt de vereiste optimalisatie waarschijnlijk. Met behulp van het systeem van de lysis van de blastR is een cruciale stap in dit protocol, zoals het onderhoudt robuuste IP-vermogen, terwijl het toelaten van PTM detectie van de pY, SUMO 2/3, Ub en Ac PTMs in één systeem. Deze techniek wordt geoptimaliseerd voor de tijd en middelen vereist om te bepalen of een specifiek streefcijfer proteïne is gewijzigd door deze vier PTMs en potentieel geeft een beter beeld van PTM Overspraak ten opzichte van het vergelijken van PTM resultaten uitgevoerd met behulp van meerdere lysis van de systemen. Onderzoek van het blastR systeem van de lysis van de compatibiliteit met alternatieve PTMs, zoals glycosylatie, werd uitgevoerd; echter, het is niet onderzocht uitputtend voor alle soorten PTMs.

Overvloedige genomic DNA kan interfereren met eiwit metingen met behulp van hetzij colorimetrische of nanodrop methoden, invloed op de migratie van eiwitten in een SDS acrylamide gel en voorkomen van eiwitten en affiniteit matrix interactie tijdens IP-testen. De hier beschreven methode maakt gebruik van een speciale filter om effectief verwijderen van genomic DNA besmetting, dat een andere kritische stap van dit protocol is. Nadruk wordt gelegd op dit punt, viscositeit tests werden uitgevoerd voor en na blastR filter behandeling en de resultaten toonden een vermindering van een hoge viscositeit tot de viscositeit van water (gegevens niet worden weergegeven). Deze verandering in de viscositeit werd gesteund door de resultaten in Figuur 3, waaruit blijkt dat bijna alle van de genomic DNA had verwijderd. Nog belangrijker is, is DNA niet geschoren met deze methode, zoals elke sheared DNA zal niet worden onderschept door het filter (gegevens niet worden weergegeven). Dit hulpprogramma is superieur aan conventionele methoden, zoals ultrasoonapparaat of spuit-DNA-scheren, omdat het vereist geen gespecialiseerde apparatuur, zeer reproduceerbaar, en verwijdert het DNA in plaats van het scheren. Bovendien, het zal niet degraderen eiwit in de lysate, die zich kan voordoen met behulp van conventionele methoden²⁹. Met behulp van het filter duurt 5-30 seconden per monster vergeleken met alternatieve methoden waar effectieve verdeling van DNA kan enige tijd duren (d.w.z., spuit schuintrekken) en kan leiden tot voorbeeld heterogeniteit zoals DNA verontreinigingen in de lysate blijven. Uitgebreide analyse van het filteren van de lysate pre- en post-blastR werd uitgevoerd, en geen waarneembaar verschil in het profiel van eiwit werd waargenomen door Coomassie, doelgroepen gerichte westerse, of totale en doelgroepen gerichte PTM analyses; Dus, de integriteit van het eiwit-profiel kan niet zijn getroffen door de genomic DNA worden uitgefilterd. Uiteindelijk, dit filtersysteem is heilzaam voor een westerse of IP-applicatie waar genomic DNA is aanwezig en kan van invloed zijn op de interpretatie van de eiwit-analyse.

Het is belangrijk op te merken dat er is potentieel voor valse negatieve detectie met behulp van deze techniek, die wijten zijn gedeeltelijk aan affiniteit kraal verzadiging, bindende site interferentie of PTM maskeren te kan. Bijvoorbeeld, kan een bepaald doel-eiwit worden gewijzigd door Ac op een zeer laag niveau; het kan dus niet worden geïsoleerd door pan-acetyl lysine affiniteit kralen die hebben al verzadigd door meer overvloedig doel Ac gemodificeerde eiwitten. Lopende studies worden uitgevoerd voor de beoordeling van de detectiegrenzen van de affiniteit reagentia die in dit protocol wordt gebruikt, maar een recente publicatie suggereert dan ook een zeer robuuste detectiegrens. De gegevens bleek dat deze techniek kon identificeren slechts 17 geacetyleerd doel eiwitmolecules per cel³¹. Nog steeds, specifieke omstandigheden zoals cell type specificiteit, voorbijgaande PTMs in antwoord op specifieke stimuli, of maskeren van PTMs als gevolg van eiwit interactie kan alle leiden tot vals-negatieve resultaten. Dit zijn de mogelijke valkuilen van deze techniek, evenals de meeste PTM IP methoden. Het is dus aangeraden resultaten met behulp van meerdere benaderingen te bevestigen.

Wijzigingen zoals glycosylatie en fosforylering is gebleken om te concurreren voor soortgelijke aminozuren^39,40, en andere PTMs zoals ubiquitination en fosforylering is aangetoond dat ze werken achter elkaar om te regelen van een eiwit functie^17,41. Recent werk op de neuropathologische eiwit Tau gewezen op het belang van PTM Overspraak, waar-hyper Tau fosforylatie en Tau SUMOylation elkaar^{42 versterkt}. Bovendien, deze groep toonde dat SUMOylation van Tau voorkomen poly-Ub en latere Tau aantasting, eventueel leiden tot samenvoeging. Dit is enkel één van vele voorbeelden van regelgevende PTM overspraak en het nut van deze techniek voor het verlichten van het belang van PTMs en hun Overspraak bij het reguleren van de belangrijke eiwitten in gezondheid en ziekte zal helpen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell lysis/genomic DNA removal and analysis
1x phosphate buffered saline (PBS)	common buffer		Recipe: NaCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4
BlastR lysis buffer	Cytoskeleton Inc.	BLST01	Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives
Radioimmunoprecipitation assay buffer (RIPA)	common buffer		Recipe: Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Igepal
Mammalian protein extraction reagent (mPER)	Thermofisher	78503	Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives
Immunoprecipitation (IP) Lysis	Pierce	87787	Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives
1% sodium dodecyl sulfate (SDS) denaturing buffer	common buffer		Recipe: PBS, SDS, EDTA, EGTA
Laemmli	common buffer		Recipe: Tris-HCl, SDS, glycerol, bromophenol blue
BlastR dilution buffer	Cytoskeleton Inc.	BDB01	Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives
Protease Inhibitor Cocktail	Cytoskeleton Inc.	PIC02
N-Ethylmaleimide (NEM) & N,N,N′,N′-Tetrakis(2-pyridylmethyl)ethylenediamine (TPEN)	Cytoskeleton Inc.	NEM09BB
Trichostatin A (TSA) & Nicotinamide	Cytoskeleton Inc.	TSA01
Activated Sodium Orthovanadate (Na3VO4)	Cytoskeleton Inc.	PYI01
cell scrapers	Costar	3008
BlastR Filter	Cytoskeleton Inc.	BLR02
BD Insulin syringe needle	BD	08290-3284-11
sonicator (Branson Sonifier)	Branson	Sonifier 450
Precision Red Advanced Protein Reagent	Cytoskeleton Inc.	ADV02
1 mL cuvettes	Fisher	14955127
Spectrophotometer (Genesys20)	Thermofisher	4001	Other spectrophotomers can be used to measure protein concentration
Agarose	Fisher	BP1356-500
1kb Deoxyribonucleic acid (DNA) ladder	NEB	N3232L
DNA gel box	Thermofisher	7312 B1A
Tris/Borate/EDTA (TBE) buffer	common buffer		Recipe: Tris-HCl, Boric Acid, EDTA
PTM Immunoprecipitation
Phosphotyrosine beads	Cytoskeleton Inc.	APY03-beads
Ubiquitination beads	Cytoskeleton Inc.	UBA01-beads
SUMOylation 2/3 beads	Cytoskeleton Inc.	ASM24-beads
Acetylation beads	Cytoskeleton Inc.	AAC04-beads
Phosphotyrosine control beads	Cytoskeleton Inc.	CIG01-beads
Ubiquitination control beads	Cytoskeleton Inc.	CUB02-beads
SUMOylation 2/3 control beads	Cytoskeleton Inc.	CIG01-beads
Acetylation control beads	Cytoskeleton Inc.	CIG02-beads
BlastR wash buffer	Cytoskeleton Inc.	BWB02	Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives
Bead elution buffer	Cytoskeleton Inc.	BEB01	Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives
microcentrifuge	Eppendorf	5417	Other microcentrifuges can be used
tube rotator	ATR	RKVSD	Other end-over-end tube rotators can be used
protein loading tips	VWR	37001-150
spin columns	Cytoskeleton Inc.	SPN22
heat block 95 °C	Benchmark	BSH1002
SDS-PAGE/Transfer/Western analysis
5x sample buffer	common buffer		recipe: Bromophenol blue, dithiothreitol (DTT), Glycerol, SDS, Tris-HCl
novex wedge well 4-20% Tris-gly gels	Invitrogen	XP04200BOX	The large wedgewells are excellent for loading large volumes
1x Running buffer	common buffer		recipe: Tris-HCl , Glycine, SDS
seeblue protein ladder	Life Technologies	LC5625
electrophoresis cell	Invitrogen	Xcell surelock electrophoresis cell	Other electrophoresis cells can be used, however these are compatible the novex wedgewell gels
power supply	Biorad	PowerPac HC	Other power supplies can be used
1x Transfer buffer	common buffer		recipe: Tris-HCl, glycine, methanol
Transfer cell	Biorad	mini trans-blot cell	Other transfer cells can be used
Immobilon- P membranes (PVDF)	millipore	IPVH 304F0
non-fat milk	thrive	813503015095
Tris buffered saline with tween (TBST)	common buffer		recipe: Tris-HCl, NaCl, Tween 20
Chemiluminescent Detection Reagent	Cytoskeleton Inc.	CLRA/CLRB
Cell growth and treatment
Dulbecco's Modified Eagle's medium	ATCC	30-2002
Fetal bovine serum	ATLAS	F-0500-A
Epidermal growth factor	Cytoskeleton Inc.	CN02-A
150 mm cell culture plates	Corning	430599