Neuron-Macrophage co culturen te activeren van macrofagen afscheidende moleculaire factoren met Neurite uitgroei activiteit

Samenvatting

Het huidige protocol presenteert experimentele procedures ter stimulering van gekweekte macrofagen te worden begiftigd met capaciteit om moleculaire factoren ter bevordering van de uitgroei van de neurite vrij te geven. Behandeling van kamp tot de neuron-macrofaag co culturen induceert de macrofagen produceren geconditioneerde medium dat sterke neurite uitgroei activiteit bezit.

Samenvatting

Er zijn sterke aanwijzingen dat macrofagen het herstel of de reparatie van gewonde zenuwstelsel kunnen deelnemen. Hier beschrijven we een protocol waarin macrofagen zijn aangezet te produceren geconditioneerd medium (CM), dat neurite uitgroei bevordert. Volwassen achterwortelganglia ganglion (DRG) neuronen zijn acuut losgekoppeld en verguld. Nadat de neuronen stabiel vastgemaakt zijn, zijn peritoneale macrofagen mede gekweekte op een cel cultuur invoegen die op hetzelfde goed worden bedekt. Dibutyryl die cyclisch AMP (db-cAMP) wordt toegepast op de co culturen gedurende 24 uur, waarna de celcultuur invoegen waarin de macrofagen wordt verplaatst naar een ander goed voor het verzamelen van CM voor 72 uur. De CM vanaf de co culturen behandeld met db-cAMP, wanneer toegepast op een afzonderlijke volwassen DRG neuron cultuur, vertoont robuuste neurite uitgroei activiteit. De CM verkregen uit de db-kamp-testgroep culturen die bestaat uit één celtype alleen, DRG neuron of peritoneale macrofaag, deed niet neurite uitgroei activiteit vertonen. Dit geeft aan dat de interactie tussen neuronen en macrofagen is onmisbaar voor de activatie van macrofagen afscheidende moleculaire factoren met neurite uitgroei activiteit in CM. Dus zullen onze co cultuur paradigma ook nuttig zijn te onderzoeken intercellulaire signalering in de neuron-macrofaag interactie te stimuleren de macrofagen te worden begiftigd met een pro-regeneratieve fenotype.

Inleiding

Een aantal studies hebben getracht te verbeteren CNS axon regeneratie na de verwondingen van het ruggenmerg of de hersenen. Ontstekingsreacties, onvermijdelijk bij de verwondingen in het zenuwstelsel, worden traditioneel verondersteld deel te nemen aan secundaire pathologische processen die leiden tot de schadelijke resultaten^1,2. Methylprednisolon waarin kan worden onderdrukt ontstekingsreacties is immers de enige erkende therapie voor acute ruggenmerg letsel³. Echter, meer recente studies hebben aangetoond dat de regeneratie of reparatie van gewonde zenuwstelsel^4,5,6door macrofagen, een representatieve inflammatoire celtype, kunnen deelnemen. Bijvoorbeeld Infiltrerend macrofagen na een lens letsel produceren pro-regeneratieve moleculen ter bevordering van de regeneratie van de retinale ganglion neuronen^7,8. Daarnaast verhoogd getransplanteerde DRG neuronen axon groei van de regio waar de macrofagen waren geactiveerd door zymosan⁹. Bovendien, de macrofagen op de site van de laesie kunnen leiden tot een groei-tolerante milieu voor gewonde perifere zenuwen¹⁰.

Ons werk ook sterke aanwijzingen dat macrofagen tot de capaciteit van axon regeneratie in aangrenzende neuronen bijdragen kunnen geboden. We hebben aangetoond dat de activering van de macrofagen in de achterwortelganglia, bevatten (DRG) zijn essentieel in de verbeterde regeneratief vermogen van DRG sensorische neuronen na een voorbehandeling perifere zenuwen letsel¹¹. Vergelijkbaar onderzoek werd onafhankelijk gemeld uit een ander laboratorium¹². We toonden ook aan dat intraganglionic injectie van dibutyryl cyclisch ADENOSINEMONOFOSFAAT (db-kamp), die een bekende molecule is tot vergroting van de capaciteit van axon regeneratie¹³, de activering van macrofagen veroorzaakt. Het deactiveren van macrofagen afgeschaft de effecten van db-kamp op neurite uitgroei activiteit. Volgende werken geïdentificeerd letsel-geïnduceerde expressie van CCL2 in de neuronen als een signaal aan het stimuleren van macrofagen met een pro-regeneratieve fenotype^14,15.

Op basis van de bovengenoemde experimentele resultaten, hebben we een in vitro model lijkt op de moleculaire gebeurtenissen die zich voordoen in de DRG na een conditioneringscycli letsel model^11,14opgericht. In dit model wordt db-cAMP toegepast op het neuron-macrofaag co culturen opwekken intercellulaire signalering dat leidt tot de activering van de macrofagen met een pro-regeneratieve fenotype. Hier beschrijven we gedetailleerde protocollen waarmee we kunnen genereren macrofagen die afscheiden van moleculaire factoren ter bevordering van neurite uitgroei (Figuur 1). Deze experimentele model illustreert een concept dat macrofagen kunnen worden gestimuleerd of geïnduceerde ter ondersteuning van axon regeneratie na de verwondingen aan zenuwstelsel. Ons model zal ook nuttig zijn bij het bestuderen van de mechanismen in de intercellulaire signalering die leidt tot de activering van de pro-regeneratieve macrofagen zijn.

Protocol

Alle experimenten met dieren werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité van Ajou University School of Medicine.

1. cultuur voorbereiding van gedissocieerde volwassen DRG Neuron

1. Vóór de oprichting van de cultuur, jas vooraf een 6-well plaat met poly-D-lysine en laminin. Na een 6-well plaat met 0,01% poly-D-lysine bij 37° C gedurende 2 uur of bij 4° C een nacht bebroeden. Vervolgens wassen de plaat twee keer met gedestilleerd water.
2. Incubeer de plaat met laminin-oplossing bij een concentratie van 3 µg/mL gedurende 2 uur bij kamertemperatuur, en daarna wassen de plaat twee keer met gedestilleerd water. Droog de plaat bij kamertemperatuur op zijn minst gedurende 1 uur.
3. Een muis in een transparante CO₂ kamer aangesloten op een gecomprimeerde CO₂ gasfles euthanaseren. De huid over de wervelkolom met een chirurgisch mes incise en de paravertebral spieren bilateraal om bloot van de wervel botten te ontleden. Verwijder de Vertebrale botten zorgvuldig met een smalle-tipped chirurgische rongeur totdat de DRG volledig worden blootgesteld.
   Opmerking: Volwassen DRG neuronen worden verkregen van volwassen C57BL6 mannelijke muizen leeftijd van 8 weken tot 12 weken oud.
4. Verwijder de DRG bilateraal uit de S1 helemaal tot op het niveau van de C1 met behulp van iridectomy schaar en pincet boete-tipped onder een Microscoop ontleden. Probeer te snijden de wortels volledig uit DRG om te minimaliseren van besmetting van cellen van Schwann en fibroblasten.
5. Bewaar de ontleed DRG in een 60 mm petrischaal met 5 mL van de koude Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM) op ijs totdat alle de DRG worden verzameld.
   Opmerking: Het is cruciaal voor het ontleden van de DRG zo spoedig mogelijk. De collectie van alle DRG van één muis moet niet langer duren dan 30 min. 30 min na de euthanasie, stoppen met het verzamelen van de DRG en gaat u verder met de volgende stap, zelfs als er nog DRG.
6. De DRG overbrengen in een 1,5 mL Eppendorf buis met behulp van een blauwe pipette uiteinde (1000 µL) met een licht-donkerscheiding einde. Verwijder de DMEM na een snelle spin voor enkele seconden met behulp van een mini centrifuge. Voeg 1 mL DMEM met 125 U/mL type XI collagenase en de buis gedurende 90 minuten met een zachte rotatie (35-40 rpm) met behulp van een shaker twister in een incubator 37 ° C te incuberen. Immobiliseren de buis op de verdieping van de Schudbeker met behulp van de tape.
7. Negeren collagenase-bevattende DMEM en voeg 1 mL verse DMEM. Wacht tot de drijvende DRG helemaal naar beneden naar de bodem zinken, en verwijder de DMEM met het weefsel puin. Herhaal deze stap wassen ten minste zes keer.
   Opmerking: Probeer niet te Verwijder het supernatant volledig. Wees voorzichtig niet te verwijderen elke DRG met het supernatant DMEM.
8. De DRG overbrengen in een conische tube van 15 mL met behulp van een blauwe pipette uiteinde (1000 µL) met een licht-donkerscheiding einde. Daarna Pipetteer zachtjes op en neer minstens 15 keer gebruik van een blauwe tip (1000 µL) om een homogeen celsuspensie. Vermijd bubbels te maken en proberen niet te raken van de onderkant van conische buis met een pipet tip.
9. Centrifugeer de buis bij 239 x g gedurende 3 min en zorgvuldig Verwijder het supernatant met zwevend puin. Voeg vervolgens 1 mL van Neurobasal medium aangevuld met B27 (2,0% v/v) en resuspendeer de pellet cel door zachtjes op en neer 5 tot 10 keer pipetteren.
10. De celsuspensie passeren door een zeef van 70-µm cel overlay op de top van een conische tube van 50 mL. 2 min wacht, en giet Neurobasal/B-27 medium op de zeef met behulp van een pipet controller.
11. Alle verzamelde DRG neuronen (een totaal van ongeveer 2 x 10⁶ DRG neuronen van één muisklik) op twee putjes van 6-well plaat plaat. Deutsche Reichsbahn neuronen van een volwassen muis dekken twee putten in een 6-well-plate. Plaats de plaat dan in een CO₂ incubator bij 37 ° C totdat de macrofaag mede culturen.

2. co cultuur van P secund peritoneale macrofagen op A cel cultuur invoegen

Opmerking: Stellen de co culturen 4 uur na het eerste laagje van de gedissocieerde DRG neuronen

1. Primaire peritoneale macrofagen zijn bereid uit volwassen C57BL6 mannelijke muizen leeftijd van 8 weken tot 12 weken oud. Een dier in een CO₂ kamer euthanaseren. Incise de buikhuid tactvol, bloot het buikvlies en Vermijd het buikvlies om te voorkomen dat een lekkage van vloeistof lavage snijden.
2. Het buikvlies met behulp van een injectiespuit met een naald 22G doorprikken en 10 mL ijskoud fosfaatgebufferde salin (PBS) injecteren in de peritoneale holte. Zachtjes masseren het buikvlies voor 1-2 min. Vervolgens trek de naald uit de PBS via de naald punctie site uitstotings en verzamelen de lavage vloeistof in een conische buis van 50 mL.
   Opmerking: Vóór gebruik, zet de spuit op het ijs om de kou van de PBS.
3. Centrifugeer de lavage vloeistof bij 239 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C tot pellet de cellulaire componenten. Resuspendeer de pellet met 3 mL lysis-buffermengsel van de rode bloedcellen (RBC) gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer dan de celsuspensie weer bij 239 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Resuspendeer de pellet met 3 mL PBS en centrifugeer de celsuspensie weer als u wilt verwijderen van alle resterende RBC lysis-buffermengsel.
   Opmerking: Zorg ervoor dat de RBC lysis-buffermengsel volledig is verwijderd. Anders kunnen resterende RBC lysis-buffermengsel giftig is voor de gekweekte macrofagen.
4. Resuspendeer de Ingehuld cellen in 1 mL medium Neurobasal/B-27. Plaat de helft van alle verzamelde macrofagen (een totaal van 3 × 10-⁶ van 6 x 10⁶ cellen) op een cultuur van de cel invoegen met behulp van het effectieve deel van 4.2 cm², die wordt geplaatst op de top van de waterput van gedissocieerde DRG.
   Opmerking: Tijdens de periode van co cultuur, macrofagen worden gekweekt in Neurobasal/B-27 neuron kweekmedium. Voldoende voortbestaan van macrofagen onder deze voorwaarde werd bevestigd.

3. behandeling van Db-Camp en verzameling van Macrophage CM

Opmerking: Beginnen met de behandeling van de db-kamp 4 h na de neuron-macrofaag co culturen.

1. Voeg 2 µL van 100 µM db-cAMP oplossing aan de neuron-macrofaag co culturen. Voeg een gelijk volume PBS voor een controle-experiment.
2. Vul een lege goed met 1 mL macrofaag kweekmedium in de dezelfde 6-well plaat na 24 uur. De cel cultuur invoegen in het neuron-macrofaag co culturen overbrengen in de lege put met macrofaag kweekmedium. Houd de cellen onder de zelfde voorwaarde voor 72 h zonder het wijzigen van het medium.
   Opmerking: We toevoegen dat alleen 1 mL macrofaag kweekmedium tijdens CM collectie om geconcentreerd CM. Tijdens de CM-collectie, indien nodig, wij toegevoegd meer volledig bedekt de macrofagen binnen het invoegen.
3. Centrifugeer de macrofaag CM bij 239 x g gedurende 5 min om de cellulaire componenten te verwijderen na 72 uur. Het supernatant passeren een 0,2-µm filter te verwijderen van alle resterende cellulaire puin. De verzamelde CM bij-70 ° C bewaren tot gebruik.

4. Neurite uitgroei Assay met verzamelde CM

1. Vóór de oprichting van een apart volwassen DRG neuron cultuur, jas vooraf de dia van een 8-well kamer volgens dezelfde procedure beschreven in 1.1 en 1.2.
2. Gedissocieerde volwassen DRG neuronen in Neurobasal medium aangevuld met B27 verkrijgen met behulp van dezelfde methoden beschreven van 1.3 tot 1.10. Plaat 5 x 10⁴ cellen per putje op de dia die vooraf gecoate 8-well kamer.
3. Plaats de kamer dia in een incubator 37 ° C gedurende 2 uur, waardoor de cellen om te koppelen aan de onderkant. Vervang vervolgens het kweekmedium met de ontdooide CM dat is voorverwarmd bij 37 ° C.
   Opmerking: Wees voorzichtig niet te raken van de onderkant van de dia 8-well kamer bij het verwijderen van het kweekmedium en het toevoegen van de verzamelde CM.
4. 15 h na het eerste laagje, verwijderen van het medium en de cellen met PBS keer wassen. Vervolgens Breng 200 µL van ijskoude 4% paraformaldehyde-oplossing in de putjes en Incubeer de cellen met de paraformaldehyde-oplossing voor 20 min bij 4 ° C
   Opmerking: De DRG neuron cultuur voor neurite uitgroei assay moet juist beperkt blijven tot 15u. Onder deze voorwaarde is er geen merkbare neurite uitgroei.
5. Spoel driemaal met PBS ijskoud en voer blokkeren met 10% normale geit serum (NGS) met 0,1% Triton-X voor 30 min. Incubeer de vaste cellen met primair antilichaam (anti-Tuj-1) oplossing verdund met 10% NGS (bij een concentratie van 1 µg/mL) voor 4 uur op de kamer temperatuur of 's nachts bij 4 ° C.
6. Spoel driemaal met PBS en vervolgens Incubeer de cellen met secundair antilichaam (geit-anti-muis) oplossing gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. Vervolgens spoel tweemaal met PBS en monteren de cultuur dia met een dekglaasje aan (24 × 50 mm) met behulp van montage oplossing.
7. Het nemen van beelden met behulp van een fluorescentie Microscoop te visualiseren neurite uitgroei.

Resultaten

We beschrijven een protocol dat macrofagen staat afscheidende moleculaire factoren met neurite uitgroei activiteit kan genereren. De macrofaag CM verkregen uit de co culturen behandeld met db-cAMP resulteerde in robuuste neurite uitgroei wanneer toegepast op een apart DRG neuron cultuur (figuur 2A). In vergelijking, deed CM verkregen van de PBS-behandelde co culturen niet neurite uitgroei induceren in onze 15-h cultuur duur (figuur 2B

Discussie

Er zijn verschillende kritische stappen voor de generatie van dit systeem co cultuur. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de muis DRG neuronen en peritoneale macrofagen vers worden bereid en gezond. Wij hebben ervaren verminderde neurite activiteit van de uitgroei van de CM de dissectie van alle de DRG toen meer dan 30 min. Bovendien, de besmetting van bloedbestanddelen in peritoneale macrofagen ook geleid tot een daling van neurite uitgroei activiteit in de CM. Om te ontlokken robuuste neuron-macrofaag interactie ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Cell culture insert transparante PET-membraan 0,4μm poriëngrootte	Corning, Falcon	353090	Transparante PET-membraan met 0,4-μm poriëngrootte, voor 6-well plate
70-μm nylon cel-strainer	Corning, Falcon	352350
8-well kweekschuif	Biocoat	354632	met een uniforme toepassing van Poly-D-Lysine
Rode bloedcel lyse buffer	Qiagen	158904
Collageenase van Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C9407-100MG
Neurobasal medium	Thermo Fisher Scientific, Gibco	21103-049	Bevat 1% glutamax en 1% peniciline-streptomycine
B-27 supplement, serumvrij	Thermo Fisher Scientific, Gibco	17504-044	extracellulaire oplossing
Glutamax	Thermo Fisher Scientific, Gibco	35050-061
Penicilline-streptomycine	Thermo Fisher Scientific, Gibco	15140-122
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P6407-5MG
Laminine	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen	23017-015
Adenosine 3', 5'-cyclisch monofosfaat, N6,O2'-dibutyryl-, natriumzout	Merck Millipore Corporation, Calbiochem	28745
10% Normaal Geitenserum	Thermo Fisher Scientific	16210072
Triton-X-100	Daejung Chemical and Metal Co	8566-4405
Anti β III tubuline (Tuj-1)	Promega Corporation	G7121	Muis monoklonaal antilichaam
Geiten anti-Muis IgG (H+L) secundair antilichaam	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen	A11005
Hemacytometer	Marienfeld-Superior	N/A
Cel kweek CO2 incubator	Panasonic	N/A
Dissectie stereomicroscoop	Carl Zeiss	Stemi DV4
Twist shaker	FINEPCR	Tw3t
Tabelcentrifuge	Sorvall	N/A
Confocale microscoop	Olympus America Inc	IX71
FBS (Fetal Bovine Serum)	VWR International, Hyclone	SH30919.03
Friedman Pearson Rongeurs	FST (Fine Science Tools)	16021-14	Roestvrij staal, 14cm, gebogen, enkele gewrichtsactie
Fijne schaar - Tungsten Carbide & ToughCut	FST (Fine Science Tools)	14558-11	scherp, gekarteld
Dumont #7 Forceps	FST (Fine Science Tools)	11272-30	Dumoxel, 0,07 x 0,04mm, gebogen
Vannas Veerschaar	FST (Fine Science Tools)	15000-00	recht, 3mm snijkant, scherp
Qualitron DW-41 Micro-Centrifuge	Artisan Technology Group	DW-41	Input Voltage: 115VAC