Het huidige protocol presenteert experimentele procedures ter stimulering van gekweekte macrofagen te worden begiftigd met capaciteit om moleculaire factoren ter bevordering van de uitgroei van de neurite vrij te geven. Behandeling van kamp tot de neuron-macrofaag co culturen induceert de macrofagen produceren geconditioneerde medium dat sterke neurite uitgroei activiteit bezit.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Neuron-Macrophage co culturen te activeren van macrofagen afscheidende moleculaire factoren met Neurite uitgroei activiteit
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Er zijn sterke aanwijzingen dat macrofagen het herstel of de reparatie van gewonde zenuwstelsel kunnen deelnemen. Hier beschrijven we een protocol waarin macrofagen zijn aangezet te produceren geconditioneerd medium (CM), dat neurite uitgroei bevordert. Volwassen achterwortelganglia ganglion (DRG) neuronen zijn acuut losgekoppeld en verguld. Nadat de neuronen stabiel vastgemaakt zijn, zijn peritoneale macrofagen mede gekweekte op een cel cultuur invoegen die op hetzelfde goed worden bedekt. Dibutyryl die cyclisch AMP (db-cAMP) wordt toegepast op de co culturen gedurende 24 uur, waarna de celcultuur invoegen waarin de macrofagen wordt verplaatst naar een ander goed voor het verzamelen van CM voor 72 uur. De CM vanaf de co culturen behandeld met db-cAMP, wanneer toegepast op een afzonderlijke volwassen DRG neuron cultuur, vertoont robuuste neurite uitgroei activiteit. De CM verkregen uit de db-kamp-testgroep culturen die bestaat uit één celtype alleen, DRG neuron of peritoneale macrofaag, deed niet neurite uitgroei activiteit vertonen. Dit geeft aan dat de interactie tussen neuronen en macrofagen is onmisbaar voor de activatie van macrofagen afscheidende moleculaire factoren met neurite uitgroei activiteit in CM. Dus zullen onze co cultuur paradigma ook nuttig zijn te onderzoeken intercellulaire signalering in de neuron-macrofaag interactie te stimuleren de macrofagen te worden begiftigd met een pro-regeneratieve fenotype.
Inleiding
Een aantal studies hebben getracht te verbeteren CNS axon regeneratie na de verwondingen van het ruggenmerg of de hersenen. Ontstekingsreacties, onvermijdelijk bij de verwondingen in het zenuwstelsel, worden traditioneel verondersteld deel te nemen aan secundaire pathologische processen die leiden tot de schadelijke resultaten1,2. Methylprednisolon waarin kan worden onderdrukt ontstekingsreacties is immers de enige erkende therapie voor acute ruggenmerg letsel3. Echter, meer recente studies hebben aangetoond dat de regeneratie of reparatie van gewonde zenuwstelsel4
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimenten met dieren werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité van Ajou University School of Medicine.
1. cultuur voorbereiding van gedissocieerde volwassen DRG Neuron
- Vóór de oprichting van de cultuur, jas vooraf een 6-well plaat met poly-D-lysine en laminin. Na een 6-well plaat met 0,01% poly-D-lysine bij 37° C gedurende 2 uur of bij 4° C een nacht bebroeden. Vervolgens wassen de plaat twee keer met gedestilleerd water.
- Incubeer de plaat met laminin-oplossing bij een concentratie van 3 µg/mL gedurende 2 uur bij kamertemperatuur, en daarna wassen de plaat twee keer met gedestilleerd....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
We beschrijven een protocol dat macrofagen staat afscheidende moleculaire factoren met neurite uitgroei activiteit kan genereren. De macrofaag CM verkregen uit de co culturen behandeld met db-cAMP resulteerde in robuuste neurite uitgroei wanneer toegepast op een apart DRG neuron cultuur (figuur 2A). In vergelijking, deed CM verkregen van de PBS-behandelde co culturen niet neurite uitgroei induceren in onze 15-h cultuur duur (figuur 2B
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Er zijn verschillende kritische stappen voor de generatie van dit systeem co cultuur. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de muis DRG neuronen en peritoneale macrofagen vers worden bereid en gezond. Wij hebben ervaren verminderde neurite activiteit van de uitgroei van de CM de dissectie van alle de DRG toen meer dan 30 min. Bovendien, de besmetting van bloedbestanddelen in peritoneale macrofagen ook geleid tot een daling van neurite uitgroei activiteit in de CM. Om te ontlokken robuuste neuron-macrofaag interactie .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit protocol wordt ondersteund door een subsidie van de NRF-2015R1A2A1A01003410 van het ministerie van wetenschap, ICT en de Planning van de toekomst, Republiek Korea.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Cell culture insert transparante PET-membraan 0,4μm poriëngrootte | Corning, Falcon | 353090 | Transparante PET-membraan met 0,4-μm poriëngrootte, voor 6-well plate |
| 70-μm nylon cel-strainer | Corning, Falcon | 352350 | |
| 8-well kweekschuif | Biocoat | 354632 | met een uniforme toepassing van Poly-D-Lysine |
| Rode bloedcel lyse buffer | Qiagen | 158904 | |
| Collageenase van Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C9407-100MG | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 21103-049 | Bevat 1% glutamax en 1% peniciline-streptomycine |
| B-27 supplement, serumvrij | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 17504-044 | extracellulaire oplossing |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 35050-061 | |
| Penicilline-streptomycine | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | |
| Laminine | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | 23017-015 | |
| Adenosine 3', 5'-cyclisch monofosfaat, N6,O2'-dibutyryl-, natriumzout | Merck Millipore Corporation, Calbiochem | 28745 | |
| 10% Normaal Geitenserum | Thermo Fisher Scientific | 16210072 | |
| Triton-X-100 | Daejung Chemical and Metal Co | 8566-4405 | |
| Anti β III tubuline (Tuj-1) | Promega Corporation | G7121 | Muis monoklonaal antilichaam |
| Geiten anti-Muis IgG (H+L) secundair antilichaam | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | A11005 | |
| Hemacytometer | Marienfeld-Superior | N/A | |
| Cel kweek CO2 incubator | Panasonic | N/A | |
| Dissectie stereomicroscoop | Carl Zeiss | Stemi DV4 | |
| Twist shaker | FINEPCR | Tw3t | |
| Tabelcentrifuge | Sorvall | N/A | |
| Confocale microscoop | Olympus America Inc | IX71 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | VWR International, Hyclone | SH30919.03 | |
| Friedman Pearson Rongeurs | FST (Fine Science Tools) | 16021-14 | Roestvrij staal, 14cm, gebogen, enkele gewrichtsactie |
| Fijne schaar - Tungsten Carbide & ToughCut | FST (Fine Science Tools) | 14558-11 | scherp, gekarteld |
| Dumont #7 Forceps | FST (Fine Science Tools) | 11272-30 | Dumoxel, 0,07 x 0,04mm, gebogen |
| Vannas Veerschaar | FST (Fine Science Tools) | 15000-00 | recht, 3mm snijkant, scherp |
| Qualitron DW-41 Micro-Centrifuge | Artisan Technology Group | DW-41 | Input Voltage: 115VAC |
Referenties
- Donnelly, D. J., Popovich, P. G. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Exp Neurol. 209 (2), 378-388 (2008).
- Festoff, B. W., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
