Methodenartikel

Een preklinische muismodel van osteosarcoom definiëren de extracellulaire vesikel-gemedieerde communicatie tussen Tumor en mesenchymale stamcellen

DOI:

10.3791/56932

⸱

6 mei 2018

 ,  , 
1Neuro-oncology Research Group, VU Medical Center, 2Exosomes Research Group, Department of Pathology, VU Medical Center

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Directe inspuiting van kanker afkomstige extracellulaire blaasjes (EVs) leidt tot een herprogrammering van beenmerg, ter ondersteuning van de progressie van de tumor; het is echter onduidelijk welke cellen bemiddelen dit effect. Hierin beschrijven we een stapsgewijze protocol om te onderzoeken EV-gemedieerde tumor-mesenchymale stamcellen (MSC) interacties in vivo, onthullen een cruciale rol voor EV-opgeleide MSCs in metastase.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Communicatie in het tumor bijdragen resident of aangeworven mesenchymale stamcellen (MSCs) tot maligne progressie in meerdere soorten van kanker. Onder invloed van specifieke Milieusignalen, kunnen deze volwassen stamcellen paracrine bemiddelaars leidt tot versnelde tumorgroei en uitzaaiing vrijkomen. Het definiëren van de Overspraak tussen tumor en MSCs is van primair belang voor het begrijpen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de progressie van kanker en identificeren van nieuwe doelstellingen voor therapeutische interventie.

Kankercellen produceren grote hoeveelheden extracellulaire blaasjes (EVs), die diep van invloed kunnen zijn op het gedrag van de doelcellen in de tumor communicatie of op verre locaties. Tumor EVs omsluiten functionele biomoleculen, met inbegrip van inflammatoire RNAs en (onco) eiwitten, die stromale cellen opleiden kunnen om het metastatische gedrag van kankercellen of deel te nemen aan de vorming van vooraf metastatische niche. In dit artikel beschrijven we de ontwikkeling van een preklinische kanker muismodel waarmee specifieke evaluatie van de EV-gemedieerde Overspraak tussen tumor en de mesenchymale stamcellen. Eerst beschrijven we de zuivering en karakterisering van het EVW tumor-uitgescheiden en de beoordeling van de internalisering van de EV door MSCs. We maken dan gebruik van een multiplex kraal gebaseerde immunoassay te evalueren van de wijziging van het MSC cytokine-expressie profiel geïnduceerd door kanker EVs. Tot slot, we illustreren de generatie van een bioluminescente orthotopic xenograft muismodel van osteosarcoom die de tumor-MSC interactie recapituleert, en Toon van de bijdrage van MSCs EV-opgeleid tot tumor groei en metastase vorming.

Ons model biedt de mogelijkheid om te definiëren hoe kanker EVs vorm een tumor-ondersteunende omgeving, en te beoordelen of de blokkade van de EV-gemedieerde communicatie tussen tumor en MSCs voorkomt kanker progressie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De tumor communicatie neemt actief deel aan de meeste, zo niet alle, aspecten van tumorvorming en kanker progressie, met inbegrip van metastase vorming en de ontwikkeling van resistentie tegen therapeutics1. Dit onderstreept de noodzaak van preklinische orthotopic kanker Muismodellen waarmee dissectie van de complexe tumor-stroma-interacties in de niche van de tumor.

Onder de vele cellulaire componenten van de communicatie van de tumor bijdragen mesenchymale stamcellen (MSCs) sterk tot kanker progressie in meerdere soorten kanker zoals kanker van de borst, prostaatkanker, hersentumoren, multiple myeloom en Osteosarcoom2 ,3,4,5,6,7. MSCs zijn multipotente stamcellen, die zich in verschillende volwassen en foetale weefsels bevinden, met inbegrip van het beenmerg, adipeus weefsel, placenta, navelstrengbloed en anderen8,9. In antwoord op kanker gegenereerde inflammatoire signalen, MSCs migreren naar tumor websites integreren in de communicatie van de tumor en uiteindelijk in kanker-ondersteunende cellen10onderscheiden. Deze kanker-geassocieerde MSCs bieden essentiële factoren (dat wil zeggen, groeifactoren, chemokines cytokines en immunosuppressieve bemiddelaars) voor de tumor progressie handelt zowel op tumorcellen en op de omliggende stroma2, 3 , 11 , 12 , 13. terwijl de tumor-bevordering van gevolgen van kanker-geassocieerde MSCs zijn onderzocht in talrijke modellen van de kanker, de mechanismen waardoor tumorcellen MSCs herprogrammeren om de vorm van een kanker-bevordering van niche slecht worden begrepen. Hier beschrijven we de generatie van een orthotopic xenograft model waarmee specifiek de studie van de pro-tumorigene interactie tussen bot kankercellen en MSCs via extracellulaire blaasjes (EVs).

EVW zijn cruciale bemiddelaars van de intercellulaire communicatie tussen tumor en stromale cellen14. EVW voeren functionele biomoleculen van de cel van oorsprong, met inbegrip van eiwitten, lipiden en regelgevende RNAs. Eenmaal uitgebracht in de extracellulaire ruimte, deze blaasjes kunnen worden overgenomen door de omringende cellen of naar verre locaties via het bloed of de lymfatische circulatie, en diep target cel gedrag kunnen beïnvloeden. 15 , 16 , 17 bijvoorbeeld opname van kanker EVs door stromale fibroblasten kan resulteren in myofibroblast differentiatie ondersteunen angiogenese en tumor groei in vivo18,19, internalisering door endothelial versnellen cellen kunnen tumor angiogenese stimuleren en verhogen de vasculaire permeabiliteit16,20, en interactie met immune cellen zou kunnen leiden tot onderdrukking van de antitumorale immuunrespons21.

We onlangs aangetoond, met behulp van een bioluminescente orthotopic xenograft muismodel van osteosarcoom, dat tumorcellen vrij hoge hoeveelheden van het EVW die MSCs prompt te verwerven van een pro-tumorigene en pro-metastatische fenotype. Dit effect is te wijten aan een dramatische verandering in de MSC cytokine-expressie profiel (hierna aangeduid als "MSC onderwijs"), en kan worden voorkomen door de administratie van een therapeutische Interleukine-6 receptor (IL-6R) antilichaam7. Ons werk aangetoond dat kanker EVs cruciale modulatoren van MSC gedrag, waardoor een reden voor communicatie-gerichte benaderingen Osteosarcoom progressie halt toe te roepen. Hierin beschrijven we een stapsgewijze protocol om te onderzoeken de EV-gemedieerde tumor-MSC interactie in vivo. Dit model is bedoeld om: 1) specifiek de kanker EV-geïnduceerde veranderingen van MSC gedrag definiëren in de communicatie van de tumor, 2) evalueren hoe deze interactie bijdraagt aan tumor botgroei en metastase vorming en 3) studie of verstoren de EV-gemedieerde Overspraak in vivo voorkomt dat de progressie van kanker.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Menselijk vetweefsel voor isolatie van de mesenchymale stamcellen verkregen is van de Vakgroep plastische chirurgie van het Tergooi ziekenhuis (Hilversum, Nederland) na goedkeuring door de ethische commissie van institutionele en schriftelijke geïnformeerde toestemming. GFP-positieve obesitas MSCs werden verkregen van de afdeling medische en chirurgische wetenschappen voor kinderen en volwassenen (Universiteit van Modena en Reggio Emilia).

Dierproeven zijn uitgevoerd volgens de Nederlandse wet op de dierproeven, en het protocol is goedgekeurd door de Commissie op dierlijke proefneming van de Vrije Universiteit medisch centrum, Amsterdam, Nederland.

1. isolatie van extracellulaire blaasjes Tumor-uitgescheiden.

  1. EV-verarmd foetale boviene Serum (FBS) bereiden door centrifugeren FBS bij 70.000 x g's nachts (16 uur), geen rem, bij 4 ° C met behulp van een ultra swingende emmer rotor (verwacht 1 h voor vertraging). Zorgvuldig verzamelen het supernatant (EV-verarmd FBS) zonder de pellet te verstoren. De EV-verarmd FBS filteren met een 0,22 µm filter.
  2. Bereiden kweekmedium EV-uitgeput door aanvulling van de Iscove bewerkt Dulbecco Medium (IMDM) met 100 U/mL penicilline, 100 µg/mL streptomycine, 2 mM glutamine (1 x P/S/G) en 5% FBS EV-uitgeput.
  3. Zaad van 3 x 106 143 cellen in 175 cm2 kolven en hen in een kweekvloeistof EV-uitgeput in een incubator bij 37 ° C en 5% CO2cultuur. Als de cellen zijn 80-90% heuvels (meestal na 36 h tot 48 h), verzamelen het supernatant 8 x 175 cm2 flacons (28 mL/kolf) voor EV-isolatie.
  4. Vooraf duidelijk het supernatant van de cel voor het verwijderen van cellen en cel puin door differentiële centrifugeren (centrifugeren het supernatant van de vorige draai telkens) overeenkomstig de onderstaande voorschriften:
    1. Centrifugeer het supernatant tweemaal bij 500 x g gedurende 10 minuten.
    2. Centrifugeer het supernatant tweemaal bij 2000 x g gedurende 15 minuten.
    3. Centrifugeer het supernatant tweemaal bij 10.000 x g gedurende 30 min.
    4. Alle centrifugations bij 4 ° C met maximale acceleratie en vertraging snelheidsstanden uitvoeren Na elke stap zorgvuldig verzamelen het EV-bevattende supernatant, ongeveer 1 mL achterlatend. Ga onmiddellijk om te stap 1.5 of winkel de vooraf gewiste geconditioneerd medium bij-80 ° C tot EV isolatie.
  5. EVs isoleren door centrifugering van het vooraf gewiste geconditioneerde medium eenmaal bij 70.000 x g gedurende 1 h, rem, bij 4 ° C in ultra-centrifuge buizen (eindvolume 38.5/tube mL) met behulp van een ultra swingende emmer rotor traag.
  6. Verwijder voorzichtig het supernatant, waardoor ongeveer 1 mL achter, resuspendeer de EV-bevattende pellets in het resterende volume, bundelen ze allemaal in één ultracentrifuge buis, en toevoegen-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) tot complete buis vulling (eindvolume 38.5 mL).
  7. Centrifugeer nogmaals bij 70.000 x g gedurende 1 uur bij 4 ° C, zonder rem (verwacht 1 h voor vertraging). Verwijder de bovendrijvende vloeistof zonder verstoring van de pellet voorzichtig en 100-200 µL achterlaten.
  8. Resuspendeer de EV-pellet en het uiteindelijke volume aan 200 µL met PBS (gestandaardiseerd voor alle EV-isolatie). De EV-voorbereiding onmiddellijk gebruik of Bewaar bij-80 ° C tot gebruik22.
    Opmerking: EVs kunnen worden opgeslagen tot 6 maanden bij-80 ° C.

2. EV karakterisering.

Gezuiverde EVs kunnen worden gevisualiseerd door Transmissie Electronenmicroscopie (TEM)23.

  1. Mix EV preps met een gelijk volume 4% paraformaldehyde in fosfaatbuffer.
  2. Jas 200 mesh Formvar-koolstof-coated nikkel TEM rasters met 5 µL van EV schorsing gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Fixeren van de EV monsters op TEM grids met 1% Glutaaraldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer (pH 7.0), contrast met uranyl oxalaat (pH 7.0) en insluiten in een mengsel van 4% uranyl acetaat en 2% methylcellulose in een verhouding van 1:9 op ijs.
  4. Verwijder grids met roestvrij stalen lussen en vlek het overtollige vocht met filtreerpapier om een juiste dikte van de methyl cellulose.
  5. Na het drogen, rasters met een transmissie-elektronenmicroscoop onderzoeken en fotograferen met een digitale camera die is gekoppeld aan de bijbehorende afbeelding software.

3. onderwijs van MSCs door tumor afkomstige EVs.

  1. Bereiden van MSC kweekmedium beogen alpha-minimum essentiële medium (alpha-MEM) met 4% EV-verarmd menselijke Lysate bloedplaatjes (hPL)24, heparine (10 U/mL) en 1 x P/S/G.
    Opmerking: EV-verarmd hPL is verkregen na de in punt 1.1 beschreven procedure.
  2. Zaad 1.4 x 106 adipeus afkomstige MSCs per 75 cm2 kolf en cultuur hen in EV-verarmd MSC-kweekmedium in een incubator bij 37 ° C en 5% CO2.
  3. Wanneer cellen bereiken de samenvloeiing van de 70% toe te voegen 143 Osteosarcoom - of controle van menselijke fibroblasten (hf)-EVs, 10 µL EV voorbereiding/cm2 van cultuur kolf. Incubeer gedurende 24 uur en voeg evenveel van het EVW voor extra 6 uren. Opmerking: Menselijke fibroblasten worden gekweekt in de Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM) 10% FBS en EVs zijn geïsoleerd zoals beschreven in sectie 1.
  4. Verzamelen van het supernatans dat MSC, centrifugeer 1 x bij 500 x g gedurende 5 min bij 4 ° C (met maximale acceleratie en vertraging snelheidsstanden), overbrengen naar een nieuwe buis en opslaan van de gewiste supernatant bij-80 ° C om toekomstige cytokine analyse (sectie 5).
  5. Voor in vivo experimenten (punt 6), GFP-positieve MSCs25 opvoeden zoals beschreven in de punten 3.1 tot 3.3, verzamelen van de cellen en resuspendeer hen in PBS op een eindconcentratie van 106 cellen per 100 µL. Houd cellen op ijs tot injectie.

4. EV internalisering Assay.

Label om te visualiseren EV ICT door MSCs, EVs met een linker groen-fluorescerende kleurstof (GFLD) (Los verkrijgbaar) volgens protocol van de fabrikant:

  1. Kort, voeg 180 µL verdunningsmiddel aan de 200 µL EV prep. Verdunnen 1 µL van GFLD kleurstof in 50 µL verdunningsmiddel, en 20 µL van verdunde kleurstof toe te voegen aan de verdunde EV prep.
  2. Zacht mengen door pipetteren en incubeer gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
  3. Voeg 5 mL 0,1% BSA in PBS, ultra-centrifuge buizen overbrengen en vul de buis met PBS (eindvolume 38.5 mL/buis).
  4. Centrifugeer 1 x bij 70.000 x g gedurende 1 uur bij 4 ° C, zonder rem (verwacht 1 h voor vertraging). Zorgvuldig Verwijder het supernatant en resuspendeer de gelabelde EV-pellet in een eindvolume van 200 µL (het volume met PBS).
  5. De gelabelde EVs toevoegen aan de MSC cultuur of bewaar ze bij-80 ° C. Na een incubatieperiode van overnachting, beoordelen vesikel internalisering door fluorescentie microscopie en stroom cytometry7.

5. beoordeling van MSC Cytokine-expressie profiel.

  1. Voor multiplex kwantificering van Interleukine-8 (IL-8), interleukine-1β (IL-1β), Interleukine-6 (IL-6), interleukine-10 (IL-10), tumor necrose factor (TNF) en interleukine - 12p 70 (IL - 12p 70) eiwitniveaus in de MSC geconditioneerd medium (zie stap 3.4), gebruiken een verkrijgbare cytometrische kraal matrix (KBA) voor menselijke inflammatoire cytokines na instructies van de fabrikant.
  2. Kort, meng de antilichaam-geconjugeerde vangen kralen en toe te voegen aan alle assay buizen. De standaard verdunningen van cytokine of de geconditioneerde middellange monsters toevoegen aan de buizen.
  3. Voeg het detectie-reagens en incubeer 3 uur op RT.
  4. Wassen van de kralen met de meegeleverde wassen-oplossing. De monsters met behulp van een cytometer van de stroom meten en analyseren van gegevens volgens de instructies van de fabrikant.

6. generatie van een Orthotopic Xenograft muismodel van osteosarcoom.

  1. Kunnen muizen in de zes weken oude, vrouwelijke, de Athymic naakt-Foxn1nu om te acclimatiseren gedurende minstens één week vóór het begin van de experimentele procedures.
  2. Paracetamol een dag vóór de chirurgische ingreep en als peri-operatieve analgesie toevoegen aan het drinkwater. Verdun "paracetamol oplossing voor kinderen" (Zie Tabel van materialen) met water om een eindconcentratie van 2 mg/mL. Op basis van de inname van een gemiddelde water van 150 mL/kg/dag, en een gemiddeld lichaamsgewicht van 20 g, deze dosering is voldoende om te bereiken een dosering van 6 mg/mouse/dag (300 mg/kg/dag).
  3. Doorgaan pijnstillende behandeling tot 24 uur na de operatie, of langer indien de dieren tekenen van pijn vertonen.
  4. Op de dag van de chirurgische ingreep, verzamelen van gekweekte luciferase-positieve (Fluc) 143 cellen (voorheen gegenereerd door lentivirale transductie) door centrifugatie bij 300 x g gedurende 10 minuten en resuspendeer de cellen bij een concentratie van 2 x 10,5 cellen/µL in PBS. De celsuspensie op ijs blijf tot 6 uur.
  5. Autoclaaf chirurgische apparatuur. Bereiden en schoonmaken van het werkgebied en plaats de gesteriliseerde schaar en pincet op steriele lakens. Twintig minuten vóór de chirurgische ingreep (stap 6,8), injecteren de dieren subcutaan met buprenorfine (0,05 mg/kg, verdund in een zoutoplossing 0,9%) als pijnstiller met 0,5 mL insuline spuiten (29-gauge naald).
  6. Net voor de anesthetizing van elk dier, een 10 µL spuit te vullen met ten minste 1 µL van de geconcentreerde (Fluc) 143 celsuspensie (zie stap 6.4).
  7. Anesthetize van het dier met Isofluraan inademing verdoving (2-3% in zuurstof). Controleer het niveau van verdoving door teen-knijpen van het dier. Wanneer het dier niet reageert op de knijpen, dat wil zeggen, die het is diep verdoofd, past u de zalf op de ogen om te voorkomen dat droogte tijdens anesthesie.
  8. Plaats het dier op zijn rug met het hoofd in een verdoving masker en met de benen richting de exploitant. Buig de linkerknie. Veeg de huid met 70% ethanol en toepassen van lidocaïne (2%) met een katoen-tip 3 keer als lokale pijnstiller.
  9. Gebruik een steriele chirurgische mes om een kleine incisie (ongeveer 5 mm) op de huid net onder de knie het onderbeen bloot te stellen. Boor een gaatje in het scheenbeen, ongeveer 2 mm onder de knie met behulp van een 0.8 mm micro twist drill. Wees voorzichtig niet te boren door beide cortices van de tibia.
  10. Injecteren 1 µL celsuspensie (ongeveer 2 x 105 cellen) langzaam (in ongeveer 5 seconden) in het gat met behulp van een naald 26-gauge. Sluit het gat met een druppel van weefsel lijm om te voorkomen dat terugvoer van de schorsing.
  11. Sluit de huid met monofilamenten hechtingen en één druppel van weefsel lijm. Laat het dier herstel in een goed verwarmde omgeving (gebruik een warmte lamp). Laat geen dieren zonder toezicht totdat ze hebben herwonnen voldoende bewustzijn te handhaven sternale ligcomfort. Pas nadat de dieren zijn volledig hersteld van anesthesie, terugsturen naar hun eigen kooien.
  12. Twee dagen na inoculatie van de tumor, injecteren EV opgeleid of naïef GFP-positieve MSCs (106 cellen in 100 µL PBS, zie stap 3.5) intraveneus met een 0,5 mL insuline spuit in de trant van de staart van de muizen.
  13. Volg tumorgroei door bioluminescentie imaging26 tweemaal per week. Te dien einde, de muizen i.p. te injecteren met 150 µL D-luciferine (30 mg/mL) met een insuline spuit. Tien minuten na de injectie, plaatst u de dieren in de Bioluminescentie imaging systeem en meet de foton-flux gegenereerd door tumorcellen.
  14. Daarnaast meet de diameter van de primaire bot-tumor met een remklauw. Het volume van de tumor (in mm3) wordt geschat door breedte x lengte2 x 0,5.
  15. Opmerking: Humane eindpunten worden gedefinieerd als de diameter van de tumor > 15 mm of gewichtsverlies > 15%.

7. beoordeling van de Long knobbeltje nummer

  1. Wanneer een van de dieren bereikt het humane eindpunt gedefinieerd in stap 6.14 (in ongeveer 3-4 weken), het experiment beëindigen en verzamelen en analyseren alle relevante weefsels.
  2. Tien min vóór euthanization, injecteren 150 µL D-luciferine (30 mg/mL) met een 0,5 mL insuline spuit.
  3. Anesthetize van de dieren met Isofluraan inademing verdoving (zie stap 6.7). Bevestig de diepte van de verdoving door de afwezigheid van reactie van de muis op de teen-knijpen. De muizen door cervicale dislocatie27euthanaseren.
  4. Verzamelen van de longen, de lever, de milt en de nieren met behulp van gesteriliseerde schaar en pincet. Het wassen van de organen in PBS te verwijderen sporen van bloed en leg ze op een petrischaal.
  5. Plaats de petrischaal met de organen in de Bioluminescentie imaging systeem. Het signaal van de Bioluminescentie aan beide zijden van de organen meten. Duik onmiddellijk na het meten, de orgels in 4% formaline te fixeren ze (24-72 uur, bij RT) voor toekomstige histologische analyse.
  6. Verwerken van de verkregen foto's met de juiste imaging software door handmatige drempelmethode. Het aantal lung nodules op elke foto. Tel het totale aantal Long knobbeltjes aan beide zijden van de longen.

8. histologische analyse

  1. Voor histologisch analyse van de weefsels van de longen:
    1. De organen van formaline-vaste inbedden in paraffine en 6 µm weefsel dia's voor te bereiden.
    2. Deparaffinate het longweefsel dia's en het uitvoeren van antigeen ophalen door ze te koken gedurende 15 min. in 0,01 M citraat buffer (pH 6).
    3. Incubeer de dia's horizontaal bij kamertemperatuur met anti-menselijke vimentin 1:150 van het antilichaam (200 µg/mL) verdund in antilichaam-oplosmiddel (Los verkrijgbaar) en vervolgens met het secundaire, HRP-gelabeld antilichaam (0,5 mg/mL, verdunning 1:500). De weefsels met 3'-diaminobenzidine (DAB) en Haematoxyline teller kleuring vlekken.
    4. Observeer de gekleurd weefsel dia's met behulp van een optische Microscoop, gekoppeld aan de corresponderende camera en de software van de afbeelding.
  2. Om te beoordelen van de aanwezigheid van GFP-positieve MSCs in muis zijn verbeend:
    1. Decalcify de zijn verbeend in ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) 0,24 M, pH 7,2-7.4. Vernieuwen EDTA-buffer om de andere dag tot botten flexibel geworden (ongeveer 1 week).
    2. Zijn verbeend uitdrogen en infiltreren ze met parafin. Het zijn verbeend (met inbegrip van osteosarcoom weefsel) in de paraffineblokken insluiten.
    3. Gebruik een microtoom te bereiden 6 µm paraffine secties. Plaats de paraffine secties in glas dia's. Na het drogen, dia's 's nachts bij kamertemperatuur worden opgeslagen.
    4. Uitvoeren van warmte-gemedieerde antigeen ophalen met behulp van citraat buffer (zie 8.1.2) en de weefsels met anti-GFP antilichaam (hele antiserum) vlek in een verdunning van de 1:900 in antilichaam-verdunningsmiddel. Counterstain de weefsels met 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
    5. Observeer de weefsel dia's met een fluorescentie Microscoop gekoppeld aan de corresponderende imagingsoftware.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In deze studie verkenden we het vermogen van osteosarcoom-uitgescheiden EVW te voeden MSCs naar een pro-tumorigene en pro-metastatische fenotype. We laten zien dat Osteosarcoom cellen release exosome-achtige EVs die door MSCs zijn geïnternaliseerd. Wij de wijziging van het MSC cytokine-expressie profiel geïnduceerd door kanker EVs gemeten en geëvalueerd van het effect van de EV-opgeleide MSCs op de tumorgroei en metastase vorming. De algemene vertegenwoordiging van het studie-ontwerp is g...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tumor-uitgescheiden extracellulaire blaasjes (EVs) kunnen wijzigen en de Fysiologie van lokale en verre mesenchymale cellen voor het genereren van een tumor-ondersteunende omgeving. Hier beschrijven we de generatie van een preklinische muismodel van osteosarcoom waarmee dissectie van de EV-gemedieerde interacties tussen tumorcellen en mesenchymale stamcellen cellen (MSCs) in vivo. We laten zien dat systemische injectie van menselijke tumor EV opgeleide MSCs in muizen die Osteosarcoom xenografts sterk groei en me...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.R. Baglio werd gesteund door een fellowship door Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) medegefinancierd door de Europese Unie. Bovendien heeft dit project ontvangen financiering van de Europese Unie Horizon 2020 programma voor onderzoek en innovatie onder de Marie Sklodowska-Curie-Subsidieovereenkomst geen 660200 (S.R. Baglio).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Equipment
Ultra CentrifugeBeckmanOptima L-90K
Rotor SW32TiBeckman369650Verwezen naar in het manuscript als ultra-swinging bucket rotor
Transmission electron microscopeZeissEM109Of soortgelijk TEM
Digital cameraNikonDMX 1200FOf soortgelijke camera
Imaging software TEM NikonACT-1
Fluorescence microscopeZeissImager.D2Of soortgelijke Fluorescerende microscoop
Imaging software FMZeissZEN Blue
IncubatorNuaire4750E
CentrifugeHettickROTANTA 460R
-80 FreezerThermo electro corporationn.a.
FACSBDBD FACScaliburOf soortgelijk flow cytometer
DrillFermFCT-300Met 0,8 mm boor
HSS micro twist drills, 0,8 mmProxxon28 8520,8 mm boor
IVIS cameraXenogenIvis LuminaVerwezen naar in het manuscript als bioluminescentiecamera. Xenogen maakt nu deel uit van Perkin Elmer
Living image software2.60Xenogen / Igor Porn.aXenogen maakt nu deel uit van Perkin Elmer
10 µL SyringeHamiltonNeuros Model 1701 RN
Needle: Hamilton RN Needle for Syringe, 26 Gauge, Pointstyle AS, custom length 2 cmHamiltonn.a.
CaliperMitutoyoG08004463
AutoclaveAstelln.a.
Heat LampPhilipsn.a.
Culture media
Fetal Bovine SerumHycloneRYG35912
Platelet Lysaten.a.n.a.
IMDM mediumLonzaBE12-722F
alpha-MEM mediumLonzaBE02-002F
DMEM mediumLonzaBE12-614F
pen/strep/glutamineGIBCO10378-016
heparinLEO012866-08
Trypsin/EDTA (10x)GIBCO15400-054
Cells
adipose deriverd MSCsn.a.n.a.
GFP-positive MSCsn.a.n.a.
human fibroblastsn.a.n.a.
143B cellsATCCCRL-8303
FLUC-143B cellsATCCCRL-8303Transduced
Disposables
Culture flasks 175 cm2CELLSTAR660175
50 mL tubesGreiner bio-one210261
Freeze tubesThermoscientific377224
Ultra-Clear tubesBeckman344058Verwezen naar in het manuscript als ultra-centrifuge tubes
0,22 µm filterMillexSLGV033RS
200 mesh Formvar-carbon-coated nickel gridsEMS (Electron Microscopy Sciences)
0.5 mL insulin syringes with 29G NeedleTerumoU-100 
Petri dishSigma - AldrichP7612
Filter paper Thermo fisher Scientific50363215
Reagents / kits
paraformaldehydeAlfa Aeser43368.9M
PBSBraun220/12257974/110
glutaraldehydeEMS (Electron Microscopy Sciences)16300
uranyl oxalateEMS (Electron Microscopy Sciences)22510
urany acetateEMS (Electron Microscopy Sciences)22400
methyl celluloseEMS (Electron Microscopy Sciences)1560
PKH67Sigmamini67-1ktVerwezen naar in het manuscript als GFLD
BSASigmaA8412
CBA - human inflammatory cytokine kitBD551811
Formaldehyde 37%VWR104003100
Carbon Steel surgical bladesSwann-Morton206Verwezen naar in het manuscript als chirurgisch mes
anti-human vimentin antibodySanta Cruzsc-6260Clone V9
Antibody diluentDAKOS0809
HRP-labeled anti mouse IgG antibodyLife Technologies32230
DAB-kitDAKOK500711
hematoxyllinSigmaGHS232
EDTA-buffern.a.n.a.
Citrate buffern.a.n.a.
rabbit polyclonal anti-GFP antibodyAbcamn.a.Ab290
DAPI Life TechnologiesD1306
Paracetamol, 120 mg / 5 ml syrupBayern.a.Sinaspril, paracetamol oplossing voor kinderen
Isoflurane 1000 mg/gVumc pharmacyn.a.
buprenofine hydrochloride, 0,3 mg/mlIndivior UK Limitedn.a.
lidocaine-HCL 2%Vumc pharmacyn.a.
70% ethanolVWR93003.1006
Tissue glueDerma+Flex, geformuleerd medisch cyanoacrylaatVygonLB604060
Eyedrops: Vidisec Carbogel, 2 mg/mlBausch+Lombn.a.
D-luciferin, potassium saltGold BiotechnologyLUCK-1
Glass slidesThermo scientific630-0954

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  2. Karnoub, A. E., et al. Mesenchymal stem cells within tumour stroma promote breast cancer metastasis. Nature. 449 (7162), 557-563 (2007).
  3. Jung, Y., et al. Recruitment of mesenchymal stem cells into prostate tumours promotes metastasis. Nat Commun. 4, 1795(2013).
  4. Shahar, T., et al. Percentage of mesenchymal stem cells in high-grade glioma tumor samples correlates with patient survival. Neuro Oncol. 19 (5), (2016).
  5. Behnan, J., et al. Recruited brain tumor-derived mesenchymal stem cells contribute to brain tumor progression. Stem Cells. 32 (5), 1110-1123 (2014).
  6. Giallongo, C., et al. Granulocyte-like myeloid derived suppressor cells (G-MDSC) are increased in multiple myeloma and are driven by dysfunctional mesenchymal stem cells (MSC). Oncotarget. 7 (52), 85764-85775 (2016).
  7. Baglio, S. R., et al. Blocking tumor-educated MSC paracrine activity halts osteosarcoma progression. Clin Cancer Res. 23 (14), 3721-3733 (2017).
  8. Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
  9. Shi, Y., Du, L., Lin, L., Wang, Y. Tumour-associated mesenchymal stem/stromal cells: emerging therapeutic targets. Nat Rev Drug Discov. 16 (1), 35-52 (2017).
  10. Ridge, S. M., Sullivan, F. J., Glynn, S. A. Mesenchymal stem cells: key players in cancer progression. Mol Cancer. 16 (1), 31(2017).
  11. Luo, J., et al. Infiltrating bone marrow mesenchymal stem cells increase prostate cancer stem cell population and metastatic ability via secreting cytokines to suppress androgen receptor signaling. Oncogene. 33 (21), 2768-2778 (2013).
  12. Huang, W. -H., Chang, M. -C., Tsai, K. -S., Hung, M. -C., Chen, H. -L., Hung, S. -C. Mesenchymal stem cells promote growth and angiogenesis of tumors in mice. Oncogene. 32 (37), 4343-4354 (2013).
  13. Patel, S. A., Meyer, J. R., Greco, S. J., Corcoran, K. E., Bryan, M., Rameshwar, P. Mesenchymal stem cells protect breast cancer cells through regulatory T cells: role of mesenchymal stem cell-derived TGF-beta. J Immunol. 184 (10), 5885-5894 (2010).
  14. Becker, A., Thakur, B. K., Weiss, J. M., Kim, H. S., Peinado, H., Lyden, D. Extracellular vesicles in cancer: Cell-to-cell mediators of metastasis. Cancer Cell. 30 (6), 836-848 (2016).
  15. Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and protein that promote tumor growth and provide diagnostic biomarkers. Nat Cell Biol. 10 (12), 1470-1476 (2008).
  16. Peinado, H., et al. Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET. Nat Med. 18 (6), 883-891 (2012).
  17. Zomer, A., et al. In vivo imaging reveals extracellular vesicle-mediated phenocopying of metastatic behavior. Cell. 161 (5), 1046-1057 (2015).
  18. Webber, J., Steadman, R., Mason, M. D., Tabi, Z., Clayton, A. Cancer exosomes trigger fibroblast to myofibroblast differentiation. Cancer Res. 70 (23), 9621-9630 (2010).
  19. Webber, J. P., et al. Differentiation of tumour-promoting stromal myofibroblasts by cancer exosomes. Oncogene. 34 (3), 290-302 (2015).
  20. Zhou, W., et al. Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis. Cancer Cell. 25 (4), 501-515 (2014).
  21. Whiteside, T., Anastasopoulou, E., Voutsas, I., Papamichail, M., Perez, S., Nunes, D. Exosomes and tumor-mediated immune suppression. Expert Rev Mol Diagn. 15 (10), 1293-1310 (2016).
  22. Verweij, F. J., Van Eijndhoven, M. A. J., Middeldorp, J., Pegtel, D. M. Analysis of viral microRNA exchange via exosomes in vitro and in vivo. Methods Mol Biol. 1024, 53-68 (2013).
  23. Baglio, S. R., et al. Human bone marrow- and adipose-mesenchymal stem cells secrete exosomes enriched in distinctive miRNA and tRNA species. Stem Cell Res Ther. 6 (1), 127(2015).
  24. Naaijkens, B. A., et al. Human platelet lysate as a fetal bovine serum substitute improves human adipose-derived stromal cell culture for future cardiac repair applications. Cell Tissue Res. 348 (1), 119-130 (2012).
  25. Grisendi, G., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells as stable source of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand delivery for cancer therapy. Cancer Res. 70 (9), 3718-3729 (2010).
  26. Cosette, J., Abdelwahed, R. B., Donnou-Triffault, S., Sautès-Fridman, C., Flaud, P., Fisson, S. Bioluminescence-based tumor quantification method for monitoring tumor progression and treatment effects in mouse lymphoma models. J Vis Exp. (113), (2016).
  27. Carbone, L., et al. Assessing cervical dislocation as a humane euthanasia method in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 352-356 (2012).
  28. Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).
  29. Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
  30. Clayton, A., Mitchell, J. P., Court, J., Mason, M. D., Tabi, Z. Human tumor-derived exosomes selectively impair lymphocyte responses to interleukin-2. Cancer Res. 67 (15), 7458-7466 (2007).
  31. Wieckowski, E. U., Visus, C., Szajnik, M., Szczepanski, M. J., Storkus, W. J., Whiteside, T. L. Tumor-derived microvesicles promote regulatory t cell expansion and induce apoptosis in tumor-reactive activated cd8+ T lymphocytes. J Immunol. 183 (6), 3720-3730 (2009).
  32. Valenti, R., Huber, V., Iero, M., Filipazzi, P., Parmiani, G., Rivoltini, L. Tumor-released microvesicles as vehicles of immunosuppression. Cancer Res. 67 (7), 2912-2915 (2007).
  33. Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).
  34. Lin, L. Y., et al. Tumour cell-derived exosomes endow mesenchymal stromal cells with tumour-promotion capabilities. Oncogene. 35 (46), 6038-6042 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Secretie van extracellulaire blaasjestumor EV sEV zuiveringorthotope xenograftbioluminescentie imagingcytokuinexpressieMSC hominglongmetastaseEV opname

Gerelateerde artikelen