Method Article

Karakterisering van tumorcellen met behulp van een medische draad voor het vastleggen van de circulerende tumorcellen: een 3D aanpak gebaseerd op immunofluorescentie en DNA vis

DOI:

10.3791/56936

⸱

December 21st, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Biosciences Laboratory, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, 2Associazione Annastaccatolisa Onlus, 3Nuclear Medicine Unit, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We presenteren een nieuwe aanpak karakteriseren van tumorcellen. We immunofluorescentie gecombineerd met DNA TL -in-situ-hybridisatie te evalueren van cellen gevangen genomen door een functionalized medische draad staat in vivo verrijken CTCs rechtstreeks uit bloed van de patiënt.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Circulerende tumorcellen (CTCs) worden geassocieerd met slechte overleving bij gemetastaseerde kanker. Hun identificatie, genotypering en fenotypering kon leiden tot een beter begrip van de heterogeniteit van de tumor en de selectie van patiënten voor gepersonaliseerde behandeling aldus te vergemakkelijken. Dit wordt echter belemmerd vanwege de zeldzaamheid van CTCs. Presenteren we een innovatieve aanpak voor bemonstering van een hoog volume van het bloed van patiënten en het verkrijgen van informatie over aanwezigheid, fenotype en gene translocatie voor CTCs. De methode combineert immunofluorescentie kleuring en DNA TL -in-situ-hybridisatie (DNA-vis) en is gebaseerd op een functionalized medische draad. Deze draad is een innovatief apparaat waarmee de in vivo Isolatievan CTCs vanuit een groot volume van perifeer bloed. Het volume van de bloed gescreend door een 30-min-administratie van de draad is ongeveer 1,5-3 L. Om aan te tonen de haalbaarheid van deze aanpak, epitheliale cel adhesie molecuul (EpCAM) expressie en de chromosomale translocatie van de ALK-gen waren vastbesloten in cellijnen van niet-kleincellige longkanker kanker (NKCLK) die zijn gevangen genomen door de functionalized draad en gekleurd met een benadering van de vis immuno-DNA. Onze grootste uitdaging was voor het uitvoeren van de test op een 3D-structuur, de functionalized draad, en om te bepalen van immuno-fenotype en vis signalen op dit ondersteunen met behulp van een conventionele fluorescentie Microscoop. De resultaten wijzen erop dat vangen CTCs en analyseren van hun fenotype en chromosomale omlegging kon potentieel een nieuwe metgezel diagnostische aanpak vertegenwoordigen en een innovatieve bieden strategie ter verbetering van gepersonaliseerde behandelingen van kanker.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CTCs vormen een belangrijke stap voor kanker cel verspreiding1. Hun aanwezigheid in het perifere bloed van patiënten is gekoppeld (metastatische) terugval en ziekte progressie2,3. CTC isolatie en karakterisatie van het bloed van kankerpatiënten is een soort niet-invasieve vloeibare biopsie. In de afgelopen jaren, is het steeds duidelijker dat het toezicht op de voortgang en de reactie van tumoren op verschillende behandelingen met behulp van dit soort analyse belangrijke klinische informatie4,5 biedtgeworden. Vloeibare biopsie is nuttiger als chirurgie niet haalbaar is of wanneer de primaire tumor weefsel is niet beschikbaar, dat wil zeggen, voor niet-biopsiable laesies. Deze aanpak is dus veelbelovend in specifieke kanker instellingen zoals metastatische NKCLK, waar de aanwezigheid van CTCs is aangetoond dat het hebben van een negatieve prognostische rol6. NKCLK is een tumor die vooral gerichte therapeutische benaderingen7,8,9 profiteert , ontworpen om te reageren op specifieke moleculen (moleculaire targets) bekend betrokken te worden bij de groei, progressie, en verspreiding van de ziekte. Vandaar, het opsporen van specifieke doelen tijdens de progressie van de ziekte nodig is. CTC onderzoek is een zeer interessant diagnostische benadering te detecteren en te controleren van de drug doelen zonder de behoefte aan primaire of metastatische weefsels. Bijvoorbeeld, wordt de detectie van ALK gene translocaties in NKCLK cellen geassocieerd met gevoeligheid voor crizotinib, een specifieke gerichte therapie10. Echter, op dit moment de detectie van ALK translocaties wordt uitgevoerd alleen op boete-naald aangeblazen of kleine biopten; Dientengevolge, zonder een tumor is weefsel ALK analyse niet mogelijk. CTCs zijn een potentiële alternatief voor tumor weefsel gebaseerde onderzoeken en vertegenwoordigen een zeer veelbelovende metgezel diagnostische aanpak.

Ondanks hun potentieel belang nog CTCs steeds een onderwerp van groot debat tussen onderzoek, voornamelijk vanwege hun zeldzaamheid (1-10 cellen/mL van perifeer bloed11). Huidige vloeibare biopsie methoden maken gebruik van een beperkte hoeveelheid bloed (dat wil zeggen, 1-30 mL)12,13, maar dit leidt tot een situatie van suboptimaal gevoeligheid voor de detectie van CTCs. Vandaar, onderzoek gerechtvaardigd is te vinden benaderingen en ontwikkelende apparaten voor het uitvoeren van vloeibare biopsieën CTC-gericht op een grotere hoeveelheid perifeer bloed.

Een alternatieve apparaat, een functionalized medische draad (Zie Tabel of Materials), is ontwikkeld om bloed bemonstering beperkingen te overwinnen en het verkrijgen van een meer representatieve analyse van CTCs. Deze functionalized draad is een CE-gekeurd medische apparaat dat CTCs rechtstreeks uit de bloedbaan van kanker patiënten1 vangt. Het is samengesteld uit een 16-cm lange roestvrij staaldraad (Figuur 1a) met een 2-cm lange functionalized tip bekleed met een 0,2 µm-dikke laag van goud. De laag wordt op zijn beurt gedekt door een polycarboxylate van 1 tot en met 5 µm dik hydrogel stratum covalent gekoppeld aan antilichamen gericht tegen de EpCAM, een van de meest uitgesproken antigenen op het oppervlak van CTCs14. Het functionalized uiteinde van de draad wordt binnengebracht in een ader van de arm van de patiënt en blijft in positie voor minstens 30 min. Deze aanpak kan Isolatievan CTCs in vivo rechtstreeks in het perifere bloed, en scherm ongeveer 1,5-3.0 L van bloed (ongeveer 300-fold meer dan het volume dat wordt gebruikt voor alternatieve benaderingen)1.

Pantel et al. de werkzaamheid van deze aanpak in het isoleren van CTCs rechtstreeks in de aders van de arm van long kanker patiënten15aangetoond. Zij verzorgden draad immunofluorescentie kleuring ter identificatie van CTCs met conventionele antilichamen gericht tegen EpCAM en pan-cytokeratin en CD45 voor leukocyten detectie. De draad werd onderzocht onder een optische fluorescentie Microscoop15. De auteurs aangetoond dat het apparaat in staat te isoleren CTCs was, maar ze deed geen therapie-gerelateerde doelstellingen, zoals de ALK translocaties niet onderzoeken.

De onderhavige methode is gericht op het identificeren van vermeende CTCs in cellijnen van de NKCLK op basis van de phenotypical parameters, b.v., EpCAM positiviteit en de aanwezigheid van moleculaire biomarkers, bijvoorbeeld de ALK status (Figuur 1b). Deze 3 dagen durende procedure combineert een matiemaatschappij draad en immunofluorescentie kleuring met DNA fluorescentiein-situ-hybridisatie (DNA vis), met de naam Immuno-DNA-vis. Gezien het feit dat CTCs zeldzame entiteiten, is het voordeel van dit protocol dat CTCs op de zelfde draad in termen van zowel immunophenotypic functies en DNA herschikkingen kunnen worden gekarakteriseerd.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Immuno-DNA vis op een 2D dekglaasje aan

  1. Dekglaasje aan voorbereiding en aanhanger cel zaaien
    Opmerking: Als volgt alle onder de motorkap van een laminaire stroming onder steriele omstandigheden.
    1. Het dekglaasje aan onderdompelen in 100% ethanol te ontsmetten.
      Opmerking: We gebruiken 12 mm × 12 mm siliconen-ondersteunde kwadraat coverslips (alle reagentia worden vermeld in de Tabel van de materialen).
    2. Plaats de coverslips in een petrischaal (diameter 100 mm). Met behulp van de droge gedwongen luchtstroom voor 5 min.
    3. Wash de petrischaal met 15 mL steriele 1 × Dulbecco van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
    4. Wassen van de petrischaal met 10 mL van volledige medium (Zie tabel 1).
    5. Zaad Adherente cellen (ongeveer 1,650,000 cellen in 10 mL van medium, geteld door FACS analyse) door zachtjes laten vallen van de celsuspensie op de petrischaal te verkrijgen van uniforme cel beplating (ongeveer 30.000 cellen/cm2).
      Opmerking: Voor ~ 70% samenvloeiing, aanhanger cellen moeten worden gekweekt op coverslips voor ten minste 48 uur.
  2. Fixatie en permeabilization
    Let op: Aceton is een ontvlambare vluchtige stof irriterend. Gebruik alleen aceton-resistente kunststof of glazen containers (geen PVC of PVDF).
    Opmerking: Voer deze stappen uit onder een chemische zuurkast.
    1. Verwijder het kweekmedium met behulp van een wegwerp zuigen Pipetteer.
    2. Wassen van de petrischaal met 1 × PBS.
    3. Wassen met pincet, de coverslips door dompelen hen in een bekerglas van glas met 5 mL van de 1 × PBS.
    4. Droog de coverslips op vloeipapier.
    5. Fix de cellen op het dekglaasje aan door het onder te dompelen in een 100% aceton oplossing gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT).
    6. Verwijder het dekglaasje aan door pincet. Droge dekglaasje aan met behulp van een geforceerde luchtstroom voor 5 min.
      Opmerking: Het protocol kan worden onderbroken op dit punt. Het dekglaasje aan moet worden opgeslagen bij-20 ° C.
  3. Immunofluorescentie dag 1
    Opmerking: Deze fase omvat een overnachting (O/N)-incubatie (~ 16 h).
    1. De coverslips in 1 × PBS tweemaal wassen.
    2. Drop 100 µL van antilichaam verdunning buffer (Zie tabel 1 voor details) op het dekglaasje aan en incubeer gedurende 30 min op RT.
      Opmerking: Volume van de oplossing moet worden aangepast op basis van het dekglaasje aan oppervlak om te dekken van de gehele dekglaasje aan en voorkomen van het risico van overloop.
    3. Voorbereiden van de mix (tabel 1) van de antilichaam met behulp van een 1:20 verdunning van monoclonal primair antilichaam geconjugeerd met fluorescerende en antilichaam verdunning buffer, zoals gespecificeerd in het gegevensblad door de fabrikant opgegeven.
      Opmerking: Het is sterk aangeraden om te gebruiken van monoclonal antilichamen geconjugeerd met thermostable fluorescerende. Als een niet-thermostable fluorescerende wordt gebruikt, kan de temperatuur tijdens de stappen van de DNA-vis van het protocol gebruikt beschadigen de fluorescerende en doven van de fluorescerende emissies. In dit protocol hebben we gekozen voor een EpCAM-FITC-antilichaam (1:20 verdunning), die toonde geen significante problemen met de gebruikte temperatuur.
    4. Spoel de coverslips tweemaal in 1 × PBS.
    5. Plaats coverslips cel-kant omhoog in een vochtige kamer en neerzetten 100 µL van de antilichaam-mix op het dekglaasje aan.
      Opmerking: Volume van de oplossing moet worden aangepast op basis van het dekglaasje aan oppervlak te dekken van de gehele dekglaasje aan en verminderen het risico van overloop.
    6. Incubeer O/N (~ 16 h) in het donker bij 4 ° C.
  4. Immunofluorescentie dag 2
    1. Antilichaam-incubatie blokkeren door het wassen van de coverslips in 1 × PBS tweemaal.
      Opmerking: Winkel de coverslips ondergedompeld in 100 µL van 1 × PBS bij 4 ° C in een kamer met constante vochtige omgeving in het donker totdat de vis test wordt uitgevoerd.
  5. 2D DNA-vis-dag 2
    Let op: Speciale aandacht moet worden besteed aan de hoge temperatuur van de instrumenten en de vochtige kamer.
    1. Stel de kruising oven en droge hitte oven (~ 3 h voordat het protocol van DNA-vis). De kruising oven op 75 ° C ingesteld, de droge hitte oven bij 37 ° C en koelen de 0.4 × SSC oplossing (pH = 7,0 ± 0,1) (Zie tabel 1voor SSC recept) tot 4 ° C.
      Opmerking: de status van de pH van vis buffers is kritisch: pH = 7,0 ± 0,1.
    2. Spoel het dekglaasje aan driemaal in ijskoude 0.4 × SSC oplossing.
    3. Droog het dekglaasje aan onder een chemische zuurkast gedurende 10 minuten in het donker.
    4. Vortex voor 10 s en het uitvoeren van een snelle spin down (op maximale snelheid) van de sonde van de muur van de sonde-buis.
    5. Leg het dekglaasje aan cel-zijde naar beneden op een daling van 5 µL van vis sonde op een dia en de zegel alle van de randen van het dekglaasje aan met rubber-cement.
      Let op: De volgende twee stappen omvatten hoge temperaturen. Draag beschermende handschoenen.
    6. Zet de dia in een donkere, vochtige ruimte in de kruising oven gedurende 8 minuten op 75 ° C voor volledige denaturatie van de DNA.
    7. De vochtige kamer binnentreden in de droge hitte oven op 37 ° C O/N.
  6. 2D DNA-vis-dag 3
    1. Instellen van het waterbad bij 72 ° C en een dia-kleuring pot met 0.4 × SSC buffer plaats in (tabel 1). Na 30 min, Controleer de temperatuur van de 0.4 × SSC buffer, die bij 72 moet ± 1 ° C.
    2. Bereiden van twee glazen bekers: één met 2 × SSC + 0,05% tween-buffer (pH = 7,0 ± 0,1) (tabel 1) en een tweede met gedestilleerd water.
    3. De vochtige kamer Verwijder uit de oven, verwijder voorzichtig het rubber-cement van de dia en het loskoppelen van het dekglaasje aan met een pincet.
    4. Wassen van het dekglaasje aan door dompelen in 0.4 × SSC gedurende 2 minuten bij 72 ° C.
    5. Wassen van het dekglaasje aan door dompelen in 2 × SSC + 0,05% tween-buffer voor 30 s.
    6. Spoel het dekglaasje aan in gedestilleerd water.
    7. Droog de coverslips onder een chemische zuurkast gedurende 10 minuten in het donker.
    8. Monteer het dekglaasje aan in vloeibare montage medium met 1,5 µg/mL 4´, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) te counterstain totale DNA. Leg het dekglaasje aan cel-zijde naar beneden op een daling van 5 µL van montage medium op een dia, drukt u op de pincet op het dekglaasje aan om de lucht uit, en verzegelen met nagellak.
      Opmerking: Montage Mediuminhoud moet worden aangepast op basis van de grootte van het oppervlak van het dekglaasje aan.
  7. 2D Microscoop observatie en analyse
    Opmerking: Afbeeldingen kunnen worden verkregen met verschillende Microscoop systemen.
We gebruikten een conventionele fluorescente microscoop begiftigd met een standaard commerciële software voor Beeldacquisitie (Tabel van materialen).
  1. Verwerven van beelden met behulp van een digitale camera van 12-bits en 20 × / 0.50 NB en 40 × / 0,65 nb doelstelling met passende filters voor rood (excitatie: 599 nm, emissie: 588 nm), groen (excitatie: 509, emissie: 524), en blauw (excitatie: 367 nm, emissie: 452 nm) sondes.
  2. Analyseren van beelden met behulp van software-instrument van keuze.
    Opmerking: We gebruikt om te evalueren van de immunofluorescentie kleuring en de lokalisatie van de ALK-sonde, ImageJ. Dia's kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C in het donker voor een maximum van 3 weken. Voor langdurige opslag, zouden we suggereren met behulp van specifieke montage medium voor langdurige opslag.

2. Immuno-DNA vis op draad

  1. Cel spike-lijningang op draad (3D-ondersteuning)
    Opmerking: Prejudiciële set-up houdt een nauwkeurige selectie van aanhanger cellen lijnen op basis van EpCAM-positiviteit. De draad is matiemaatschappij met anti-EpCAM antilichamen, zodat alleen EpCAM-positieve cellen zijn gekleurd.
    Opmerking: Raak het functionalized deel van de draad om te voorkomen dat schade niet.
    Opmerking: Alle stappen moeten worden uitgevoerd onder de motorkap van een laminaire flow onder steriele omstandigheden.
    1. Resuspendeer de gehele inhoud van de kolf van een T75 (80% samenvloeiing) in een 5 mL flesje met 4 mL van volledige medium; voor een enkele spike worden ongeveer 2.000.000 cellen aanbevolen om te maximaliseren van de hechting van de cellen op de draad.
    2. Verwijder de draad van de glazen verpakkingen.
    3. Dompel het functionalized gouden deel van de draad in de flacon, ervoor te zorgen dat de draad-stop een waterdichte geschikt voor de flacon is. Zegel met laboratorium film.
      Opmerking: Het gebruik van de tube 5 mL wordt aanbevolen te voorzien in een juiste match tussen de draad-stop en de flacon.
    4. Incubeer gedurende 30 min. bij RT in een buis rotator (0-120 hoek).
    5. Spoel de draad driemaal in 1 × PBS oplossing met behulp van 3 verschillende schone flesjes.
  2. Fixatie en permeabilization
    Let op: Aceton is een brandbare stof die kan de luchtwegen irriteren. Gebruik alleen aceton-resistente kunststof of glazen containers (geen PVC of PVDF).
    Opmerking: Voer deze stappen uit onder een chemische zuurkast.
    1. Het drogen van de draad.
    2. Vaststellen van de cellen door dompelen de draad in aceton 100%-oplossing gedurende 10 minuten op RT. gebruik een tube van 5 mL.
      Opmerking: De draad-stop mogen niet in aanraking komen de fixeerspray.
    3. Luchtdroog de draad voor 5 min op RT.
      Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. De draad moet worden opgeslagen bij-20 ° C. Wanneer de draad voor langdurige opslag verpakking, plaatst u de draad-stop naast het functionalized uiteinde en zorgvuldig steek de draad in de opslag glazen buis, verzorgen niet te beschadigen de functionalized tip. Sluit het glas van de opslag en op te slaan (verticaal of horizontaal) bij-20 ° C.
  3. Immunofluorescentie dag 1
    Opmerking: Deze fase omvat een incubatie O/N (~ 16 h).
    1. Wassen tweemaal in 1 × PBS oplossing met behulp van 5 mL-buis.
    2. Incubeer de draad in antilichaam verdunning buffer voor 30 min op RT met 5 mL-buis.
    3. Bereiden 150 µL van antilichaam mix met een verdunning van monoclonal primair antilichaam geconjugeerd met fluorescerende in antilichaam verdunning buffer, zoals gespecificeerd in het gegevensblad. Bijvoorbeeld EpCAM-FITC antilichaam werd gebruikt met een 1:20 verdunning.
    4. Een tip p200 gebruiken voor het uitvoeren van incubatie, als volgt: pak de draad van de draad-stop en zachtjes steek de draad door het grotere gat van de tip. Sluit het unfunctionalized uiteinde eerst en langzaam Trek de draad door de opening onder kleiner totdat het gouden deel net voorbij het grotere gat is.
    5. Zachtjes laten vallen 150 µL van het mengsel van antilichamen (bijvoorbeeld anti-EpCAM_FITC antistof 1:20 verdund) in de tip. Om te voorkomen dat de kans op vorming van de zeepbel, draai zachtjes de draad totdat het functionalized deel is volledig gestort.
    6. Seal-up van het gat van de tip. Verpakken van laboratorium film rond het gat kan helpen.
    7. Incubeer verticaal O/N (~ 16 h) in het donker bij 4 ° C.
  4. Immunofluorescentie dag 2
    1. Antilichaam-incubatie blokkeren door het wassen van de draad tweemaal in 1 × PBS.
    2. De draad in de draad-stop opnieuw in te voegen.
      Opmerking: Winkel in 1 X bij 4 ° C in een 5 mL PBS ampul totdat de vis test wordt uitgevoerd.
  5. 3D DNA-vis-dag 2
    Let op: Speciale aandacht moet worden besteed aan de hoge temperatuur van de instrumenten en de vochtige kamer.
    1. Stel de kruising oven en droge hitte oven (~ 3 h voordat het protocol van DNA-vis). De kruising oven op 75 ° C ingesteld, de droge hitte oven bij 37 ° C, en cool de 0.4 × SSC oplossing (pH = 7,0 ± 0,1) tot 4 ° C.
      Opmerking: De status van de pH van vis buffers is van cruciaal belang en moet 7,0 ± 0,1.
    2. De draad 3 keer wassen in ijskoude 0.4 × SSC oplossing.
      Opmerking: Houd de draad in het donker te voorkomen van fluorescerende photobleaching tijdens de volgende procedures.
    3. Droge gedurende 10 minuten in het donker onder de zuurkast.
    4. Vortex en draai de sonde voor 5 s.
    5. 10 µL van de sonde vallen theglass slangen. Bedek met laboratorium film.
    6. Draai de slangen als volgt: de microtube wikkel in een droge, absorberend, papieren put in een 50 mL-buis, en spin kort.
    7. Zorgvuldig plaatst de gedroogde draad in de microtube en invoegen van de draad-stop. Zegel met rubber-cement.
      Let op: De volgende twee stappen omvatten hoge temperaturen.
Draag beschermende handschoenen.
  • Zet de draad in een donkere, vochtige ruimte in de kruising oven gedurende 8 minuten op 75 ° C tot het verkrijgen van volledige denaturatie van het DNA.
  • De vochtige kamer verhuizen naar een droge hitte oven bij 37 ° C O/N.
  • 3D DNA-vis-dag 3
    1. Zet een pot met 0.4 × SSC oplossing in een waterbad kleuring dia en vastgesteld op 72 ° C.
    2. Controleer de temperatuur 0,4 × SSC oplossing totdat zij 72 tot ± 1 ° C.
    3. Bereiden van twee glazen bekers, één met 2 × SSC + 0,05% Tween (pH = 7,0 ± 0,1) oplossing en de tweede met gedestilleerd water.
    4. Verwijder de vochtige kamer uit de oven van de droge hitte, verwijder voorzichtig het rubber-cement van de draad-stop met behulp van pincet, en nemen de draad.
      Opmerking: Trek voorzichtig de ongecoate uiteinde van de draad via de IN-stop, voorzichtig om niet te beschadigen de functionalized tip.
    5. Dompel de draad in de 0.4 × SSC oplossing gedurende 2 minuten bij 72 ° C.
    6. Wassen van de draad in 2 × SSC + 0,05% tween-oplossing voor 30 s op RT.
    7. Wassen van de draad in gedistilleerd water op RT.
    8. Droog de draad onder de zuurkast gedurende 10 minuten in het donker.
    9. Voorbereiden van een stamoplossing van de DAPI 1.43 µm in 2 mL zuiver 1 × PBS.
    10. Incubeer het functionalized uiteinde van de draad met DAPI oplossing in een 2 mL flesje gedurende 1 uur in het donker op RT.
    11. Spoel de draad tweemaal in 1 × PBS en drogen.
  • 3D Microscoop observatie en analyse
    1. Plaats de draad in de houder van de draad. Steek voorzichtig de functionalized tip via het ingangspunt van de speciale houder, totdat de tip overeenkomt met het koppelingspunt. Wees voorzichtig niet te beschadigen de functionalized tip (Figuur 1a).
    2. Plaats de speciale houder in het werkgebied van de Microscoop. De focus van de microscoop met behulp van een lens van 20 × aanpassen. Eerst grof richten op de speciale steun en pas vervolgens fijn op cellen die het licht in de DAPI-kanaal weergegeven.
    3. Alleen gestoken focus de cellen centraal in de lens.
      Opmerking: Afbeeldingen kunnen worden verkregen met verschillende Microscoop systemen. In deze instelling gebruiken we een conventionele fluorescente microscoop begiftigd met een standaard commerciële software voor Beeldacquisitie.
    4. Verwerven van beelden met behulp van een digitale camera van 12-bits en 20 × / 0.50 NB en 40 × / 0,65 nb doelstelling met passende filters voor rood (excitatie: 599 nm, emissie: 588 nm), groen (excitatie: 509, emissie: 524), en blauw (excitatie: 367 nm, emissie: 452 nm) sondes.
      Opmerking: Afbeeldingen kunnen worden gevisualiseerd met behulp van verschillende hulpmiddelen en software. We gebruiken ImageJ immunofluorescentie kleuring en lokalisatie van de ALK-sonde te evalueren.
      Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. De draad moet worden opgeslagen bij-20 ° C. Wanneer de draad voor langdurige opslag verpakking, plaatst u de draad-stop naast het functionalized uiteinde en zorgvuldig steek de draad in de opslag glazen buis, verzorgen niet te beschadigen de functionalized tip. Sluit het glas van de opslag en op te slaan (verticaal of horizontaal) bij-20 ° C.

    • Results

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Met behulp van de hierboven beschreven procedure kan een vis van Immuno-DNA-test uitvoeren op CTCs (of andere gelijkwaardige cellen) verrijkt door de functionalized draad. Vóór de oprichting van dit protocol, was de verenigbaarheid van de twee technieken vastbesloten (immuno-fluorescentie met vis) op standaard 2D ondersteunt. Twee verschillende NKCLK cellijnen, uiting van EpCAM (verplicht zich te houden aan de draad in combinatie met antilichamen tegen EpCAM) werden geselecteerd. Ze hebben een verschillende status van de ALK, wat handig is om te testen verschillende startende omstandigheden. De eerste, NCI-H1975, hebben wild type (WT) ALK genen, terwijl de tweede, NCI-H3122, wordt gekenmerkt door ALK translocaties.

    Een ALK gene pauze demontage detectiesysteem voor de vis-assay werd gebruikt. Het systeem bestaat uit twee sondes, een (oranje) kwekers in de proximale regio binnen de ALK op 2p 23 en één (groen) kwekers distale aan ALK. Op 2D ondersteunt mits Immuno-DNA vis welomschreven signalen voor zowel antilichaam en sonde (Figuur 2). In het bijzonder cellijnen beide toonde welomschreven EpCAM membraan lokalisatie. Bovendien sonde signalen verscheen heldere en scherpe: NCI-H1975 cellen toonde overlappende oranje en groene sondes, bevestiging van de status van wildtype van ALK gen (Figuur 2a, b). Daarentegen toonde NCI-H3122 cellen overlappende signalen en één groene stippen, als gevolg van een schrapping van ALK gen (Figuur 2 c, d). Wanneer de vis Immuno-DNA test werd uitgevoerd op de 3D ondersteuning matiemaatschappij draad, antilichaam en sonde signalen waren over het algemeen minder gedefinieerde dan op de 2D steun. EpCAM kleuring was zichtbaar. ALK sonde signalen waren minder gedefinieerd maar nog steeds het gevolg van de verwachte ALK status (Figuur 3). Resultaten toonden aan dat immunofluorescentie kleuring zich niet met DNA vis signalen bemoeien. De sondes gekruist specifiek met hun doelstellingen. NCI-H3122 cellijn toonde een afwijkende ALK gene status (Figuur 3b), in tegenstelling tot NCI-H1975, met een wild type ALK gen (Figuur 3a).

    figure-results-1
    Figuur 1 : Draad, schematische rangschikking van ALK pauze demontage sondes, regeling van verwachte patronen van ALK omlegging en speciale houder matiemaatschappij. (een) rode dozen Markeer de drie hoofdonderdelen van de draad: matiemaatschappij tip, draad-stop, en un-functionalized tip. De functionalized tip is het meest gevoelige deel van de draad en moet niet worden aangeraakt tijdens behandeling om mobiele-detachement of schade te voorkomen. (b) de groene en rode sondes respectievelijk binden aan sequenties bedrijven stroomopwaarts en stroomafwaarts van de loci van ALK gen (aan de linkerkant). Aan de rechterkant, worden illustratieve patronen van ALK regelingen weergegeven. Rode en groene co lokalisatie signalen op normale cellen; gescheiden signalen van de groene en rode geven een ALK gene chromosoom break (translocatie van ALK gen) en een groen-oranje colocalization signaal (afwijkende cel-1). Een rood signaal en twee groene signalen geven aan het verlies van één rood signaal, suggereren een chromosomale translocatie en een schrapping (afwijkende cel-2). (c) draad houder; rode vakken markeren gebieden waar zorg nodig is bij de behandeling van de draad tijdens de analyse van de microscopie. De draad kunt ondergaan een 360 °-analyse door te draaien aan de rotator. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

    figure-results-2
    Figuur 2 : Immuno-DNA vis assay op 2D steun (dekglaasje aan). (een, b) Zwak positieve cellen NCI-H1975 voor EpCAM. EpCAM FITC signalen waren merkbaar. De oranje en groene sondes van de ALK pauze-uit elkaar overlappen, bevestiging van de status van de WT van ALK gen in cellijn van NCIH1975. Cellen weer te geven van meer dan twee gepaarde signalen waren aanwezig als gevolg van hun aneuploïdie. (c, d) In de hoge cellijn van NCIH3122 EpCAM-uiten waren immunofluorescentie signalen helder, die werd versterkt in cel kruispunten. VIS analyses bevestigde verwijderingen van de ALK-gen, typisch voor deze cellijn. Rode pijlen geven aan enkele groene sondes (zonder overeenkomstige oranje sondes), als gevolg van de ALK gene schrapping. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

    figure-results-3
    Figuur 3: Immuno-DNA vis assay met behulp van de functionalized draad als 3D-ondersteuning. (een) vertegenwoordiger afbeelding van NCI-H1975 cellen op de draad. Hoewel de 3D-vorm van de cellen op de draad te maken moeilijk te verwerven volledig in-nadrukbeelden, is EpCAM signaal goed zichtbaar in alle cellen. (b) vertegenwoordiger afbeelding van NCI-H3122 cellen op de draad. ALK sondes toonde gene schrapping (rode pijlen), zoals eerder gezien op de 2D steun. De zichtbare achtergrond signalen waren meest waarschijnlijk te wijten aan de aanwezigheid van de polymeer laag. Echter beïnvloedde het aanzienlijk niet cel identificatie of fluorescentie analyse. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

    BufferSamenstellingOpmerkingVoorraden
    Cel volledige kweekmediumRPMI 1640 + 2 mM Glutamine + 5-10% foetale runderserum (FBS).RPMI: 4 ° C; Glutamine, FBS:-20 ° C
    Antilichaam Diluition Buffer1% BSA, 0,3% Triton X-100 in 1 x PBSRT. Seal met laboratorium film.
    20 x SSC oplossing3 M natriumchloride, 300 mM Trinatriumcitraat citraat, opgelost in ddH20Filter oplossing en pH 7.0 +/-0,1 met HCl =RT. Seal met laboratorium film.
    0,4 x SSC oplossingVerdun voorraad 20 x SSC in gedistilleerd H2OFilter oplossing en pH 7.0 +/-0,1 met HCl =RT.
    Zegel met laboratorium film. 2 x SSC + 0,05% Tween-20 Solution Verdun voorraad 20 x SSC in gedestilleerd H2O + 0,05% Tween-20 Filter oplossing en pH 7.0 +/-0,1 met HCl = RT. Seal met laboratorium film. DAPI oplossing 30 nM Verdun voorraad 1,43 µM in 1 x PBS -20 ° C in donkere staat klaar om te gebruiken aliquote

    Tabel 1: Oplossingen recepten.

    Discussion

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    In dit document, voor de eerste keer, een methode die combineren immunofluorescentie kleuring en DNA vis, voor gebruik met de functionalized draad werd voorgesteld. De methode is aangeroepen Immuno-DNA vis. Deze techniek werd ontwikkeld voor de gelijktijdige identificatie van vermeende CTCs op een 3D draad op basis van phenotypical parameters, zoals positiviteit aan EpCAM (geval 1), en om het opsporen van moleculaire veranderingen, zoals de ALK gene status) in geval 2). De gelijktijdige identificatie van de twee gebeurtenissen kan de detectie van hun co lokalisatie. Vandaar kan deze aanpak worden aangepast om te identificeren en te karakteriseren CTCs ontvangen van het bloed van kankerpatiënten. De potentiële effecten van de genitaal-componenten en leukocyten op de kleuring procedure interfereren meestal niet met de procedure. In het bijzonder gegevens gemeld in de literatuur aangegeven dat genitaal-componenten en leukocyten geen invloed op de immunofluorescentie kleuring van de cellen die zijn gekoppeld aan de draad, de kritieke stap te identificeren van de werkelijke CTCs1,15.

    De helderheid van de fluorescentie van Immuno-DNA vis is iets minder uitgesproken dan dat van een traditionele immunophototyping assay en het resultaat van de hoge temperaturen die nodig zijn voor de bepaling van de vis is. Het is echter nog steeds merkbaar immunofluorescentie kleuring. Een zwak signaal is bijvoorbeeld nog steeds aantoonbaar in de lage EpCAM-uiten cellijn, NCIH1975. De hoge temperatuur die nodig zijn voor de bepaling van de vis is de belangrijkste limiterende factor bij het kiezen van de juiste fluorescerende verbonden met het antilichaam. In dit protocol, moeten antilichamen worden gekoppeld aan een thermostable fluorescerende om de DNA denaturatie temperatuur tolereren. Bijvoorbeeld, wordt phycoerythrin, een hittegevoelige fluorescerende, niet aanbevolen in deze instelling vanwege aantasting van het fluorescerende veroorzaakt door hoge temperatuur. Fluoresceïne-isothiocyanaat is een goede keuze en vaak voorkomende fluorescerende werkzaam op vis sondes. Het signaal van de autofluorescence Immuno-DNA vis is zeer slecht op standaard 2D ondersteunt. Op de steun van de draad veroorzaken de polymeer laag een lichte autofluorescence signaal, met name op het rode kanaal. In tegenstelling tot de 2D achtergrond, een aspecific achtergrond signaal is waarneembaar op de draad, maar heeft geen aanmerkelijke gevolgen hebben voor identificatie of cel karakterisering van de kernen.

    Microscoop evaluatie van de draad is veel meer vermoeiend dan op een 2D drager te wijten aan de grenzen van een optische Microscoop in het lezen van het oppervlak van een cilindrische-vormige 3D-structuur. Echter kan dit probleem worden verholpen door het roteren van de houder van de draad en het verwerven van de beelden die zijn voornamelijk gelokaliseerd langs de middellijn van de draad. De houder van de draad toelaat een 360 °-rotatie van de draad. Zodra gericht op de kernen, houden fluorescentie-kanaal moet worden gewijzigd niet noodzakelijkerwijs de focus op het doelgebied. Om deze reden is het essentieel om de focus op het doelgebied van inner-cel.

    Deze techniek kan worden aangepast om te detecteren en karakteriseren van cellen op verschillende soorten 3D ondersteunt. Het kan ook zijn kunnen gebruiken verschillende antilichamen en vis sondes. Wanneer kiezen voor het gebruik van verschillende antilichamen, zijn fluorescerende thermostabiliteit en het niveau van de expressie van het target-antigeen op de celmembraan belangrijke factoren te overwegen. Intra-cytoplasmatische antigenen kunnen ook worden gekleurd. Wanneer met behulp van verschillende vis sondes, is het belangrijk om te controleren de gegevensblad-specificaties voor de denaturatie procedure en voor te bereiden cellen de vis assay dienovereenkomstig.

    Disclosures

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

    Materials

    List of materials used in this article
    NameCompanyCatalog NumberComments
    EthanolCarlo Erba# 414605
    Tween 20BIO RAD# 1706531
    PBS (Phosphate Buffered Saline) Medicago# 09-9400-100
    AcetoneSigma Aldrich# 534064-500ML
    BSASigma Aldrich# A7906
    Triton X-100 DetergentBIO RAD# 1610407
    RUBBERCEMENTRoyal Talens# 95306500
    Vysis 20X SSC (66g)Abbott Molecular Inc. # 30-804850powder to be resuspended in distilled H2O, as recommended
    RPMI 1640Gibco# 31870-025
    FBS (Fetal Bovine Serum)Gibco# 10270-098
    L-Glutamine (200mM)Gibco# 25030-024
    Penicillin-StreptomycinGibco# 15140-122
    H20MilliPore
    XT ALK BAMetaSystems Probes# D-6001-100-OG
    DAPI, FluoroPure gradeInvitrogen# D21490
    SlowFade Diamond Antifade Mountant with DAPILife Technologies# S36973
    EpCAM-FITC (clone: HEA-125)Mitenyi# 130-080-301
    Micro tubes M-Tube18Gilupi Nanomedizin
    Detektor CANCER01 EpCAMGilupi NanomedizinFunctionalized wire
    STAR FROST Microscope SlidesKnittel GLÄSERVS1117# 076FKB
    SecureSlip Silicone Supported CoverglassGRACE BIO-LABS# 104112
    ZEISS Fluorescent Microscope Axioskop ZEISS
    Nikon NIS-Elements BR 4.11.00 64 bit softwareNikonBR 4.11.00
    Nikon DS-QiMc 12 bit digital cameraNikonDS-QiMc

    References

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. A novel method for the in vivo isolation of circulating tumor cells from peripheral blood of cancer patients using a functionalized and structured medical wire. Int. J. Oncol. 41 (4), 1241-1250 (2012).">Saucedo-Zeni, N., et al. A novel method for the in vivo isolation of circulating tumor cells from peripheral blood of cancer patients using a functionalized and structured medical wire. Int. J. Oncol. 41 (4), 1241-1250 (2012).
    2. Comparison of three different methods for the detection of circulating tumor cells in mice with lung metastasis. Oncol. Rep. , 1-8 (2017).">Xu, W., et al. Comparison of three different methods for the detection of circulating tumor cells in mice with lung metastasis. Oncol. Rep. , 1-8 (2017).
    3. Catch and Release: rare cell analysis from a functionalised medical wire. Sci. Rep. 7 (February), 43424(2017).">Chen, S., et al. Catch and Release: rare cell analysis from a functionalised medical wire. Sci. Rep. 7 (February), 43424(2017).
    4. Clinical and biological significance of circulating tumor cells in cancer. Mol. Oncol. 10 (3), 408-417 (2016).">Masuda, T., Hayashi, N., Iguchi, T., Ito, S., Eguchi, H., Mimori, K. Clinical and biological significance of circulating tumor cells in cancer. Mol. Oncol. 10 (3), 408-417 (2016).
    5. CTC enumeration and characterization: moving toward personalized medicine. Ann. Transl. Med. 2 (11), 108(2014).">Toss, A., Mu, Z., Fernandez, S., Cristofanilli, M. CTC enumeration and characterization: moving toward personalized medicine. Ann. Transl. Med. 2 (11), 108(2014).
    6. Prognostic significance of circulating tumor cells in non-small-cell lung cancer patients: a meta-analysis. PLoS One. 8 (11), e78070(2013).">Wang, J., Huang, J., Wang, K., Xu, J., Huang, J., Zhang, T. Prognostic significance of circulating tumor cells in non-small-cell lung cancer patients: a meta-analysis. PLoS One. 8 (11), e78070(2013).
    7. Gefitinib or Chemotherapy for Non?Small-Cell Lung Cancer with Mutated EGFR. N. Engl. J. Med. 362 (25), 2380-2388 (2010).">Maemondo, M., et al. Gefitinib or Chemotherapy for Non?Small-Cell Lung Cancer with Mutated EGFR. N. Engl. J. Med. 362 (25), 2380-2388 (2010).
    8. Crizotinib versus Chemotherapy in Advanced ALK -Positive Lung Cancer. N. Engl. J. Med. 368 (25), 2385-2394 (2013).">Shaw, A. T., et al. Crizotinib versus Chemotherapy in Advanced ALK -Positive Lung Cancer. N. Engl. J. Med. 368 (25), 2385-2394 (2013).
    9. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer. N. Engl. J. Med. 373 (17), 1627-1639 (2015).">Borghaei, H., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer. N. Engl. J. Med. 373 (17), 1627-1639 (2015).
    10. Clinical Experience With Crizotinib in Patients With Advanced ALK -Rearranged Non-Small-Cell Lung Cancer and Brain Metastases. J. Clin. Oncol. 33 (17), 1881-1888 (2015).">Costa, D. B., et al. Clinical Experience With Crizotinib in Patients With Advanced ALK -Rearranged Non-Small-Cell Lung Cancer and Brain Metastases. J. Clin. Oncol. 33 (17), 1881-1888 (2015).
    11. Diagnostic leukapheresis enables reliable detection of circulating tumor cells of nonmetastatic cancer patients. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (41), 16580-16585 (2013).">Fischer, J. C., et al. Diagnostic leukapheresis enables reliable detection of circulating tumor cells of nonmetastatic cancer patients. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (41), 16580-16585 (2013).
    12. Challenges in the enumeration and phenotyping of CTC. Clin. Cancer Res. 18 (20), 5711-5718 (2012).">Coumans, F. A. W., Ligthart, S. T., Uhr, J. W., Terstappen, L. W. M. M. Challenges in the enumeration and phenotyping of CTC. Clin. Cancer Res. 18 (20), 5711-5718 (2012).
    13. CCR 20th Anniversary Commentary: Paving the Way for Circulating Tumor Cells. Clin. Cancer Res. 21 (13), 2883-2885 (2015).">Allard, W. J., Terstappen, L. W. M. M. CCR 20th Anniversary Commentary: Paving the Way for Circulating Tumor Cells. Clin. Cancer Res. 21 (13), 2883-2885 (2015).
    14. The use of a new CellCollector to isolate circulating tumor cells from the blood of patients with different stages of prostate cancer and clinical outcomes - A proof-of-concept study. PLoS One. 11 (8), 1-14 (2016).">Theil, G., et al. The use of a new CellCollector to isolate circulating tumor cells from the blood of patients with different stages of prostate cancer and clinical outcomes - A proof-of-concept study. PLoS One. 11 (8), 1-14 (2016).
    15. Enumeration and Molecular Characterization of Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Novel In Vivo Device for Capturing Circulating Tumor Cells. Clin. Cancer Res. 22 (9), 2197-2206 (2016).">Gorges, T. M., et al. Enumeration and Molecular Characterization of Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Novel In Vivo Device for Capturing Circulating Tumor Cells. Clin. Cancer Res. 22 (9), 2197-2206 (2016).

    Reprints and Permissions

    Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

    Request Permission

    Tags

    Circulating Tumor CellsImmunofluorescence StainingDNA FISHFunctionalized WireEpCAM ExpressionALK Gene TranslocationNon Small Cell Lung CancerWidefield Fluorescence Microscopy3D Support AnalysisCytogenetic Alterations

    Related Articles