Deze methode beschrijft de klonen, expressie en zuivering van recombinante Nsa1 voor structurele bepaling door middel van röntgendiffractie en small-angle X-ray scattering (SAXS), en is van toepassing voor de hybride structurele analyse van andere eiwitten die beide bevatten besteld en ontregelde domeinen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Het combineren van röntgendiffractie met kleine hoek X-Ray Scattering model ongestructureerde regio's van de Nsa1 van S. Cerevisiae
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Bepaling van de volledige structuur van ribosoom vergadering factor Nsa1 van Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is uitdagend vanwege de wanordelijke en protease labile C-terminus van het eiwit. Dit manuscript worden de methoden beschreven om te zuiveren van recombinante Nsa1 van S. cerevisiae voor structurele analyse door middel van röntgendiffractie zowel SAXS. Röntgendiffractie werd gebruikt om op te lossen van de structuur van het welgeordende N-terminale WD40 domein van Nsa1, en vervolgens SAXS werd gebruikt voor het oplossen van de structuur van de C-terminus van Nsa1 in oplossing. Verstrooiing oplossingsgegevens werd bijeengezocht uit full-length Nsa1 in oplossing. De theoretische verstrooiing amplitudes werden berekend op basis van de hoge resolutie kristalstructuur van het domein WD40, en dan een combinatie van vastlichaam en ab initio modellering geopenbaard de C-terminus van Nsa1. Met deze hybride aanpak werd de quaternaire structuur van de gehele proteïne gereconstrueerd. De methoden die hier worden gepresenteerd gelden over het algemeen voor de hybride structurele bepaling van andere eiwitten die bestaat uit een mix van gestructureerde en ongestructureerde domeinen.
Inleiding
Ribosomen zijn grote ribonucleoprotein machines die de essentiële rol van het vertalen van mRNA naar eiwitten in alle levende cellen verrichten. Ribosomen bestaan uit twee subeenheden die worden geproduceerd in een complex proces ribosoom biogenese1,2,3,4genoemd. Eukaryotische ribosoom vergadering, is afhankelijk van de steun van honderden essentiële ribosomal vergadering factoren2,3,5. Nsa1 (het Nop7 gekoppeld 1) is een eukaryote ribosoom vergaderi....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. recombinant eiwitproductie en zuivering van Nsa 1
- Nsa1 expressie plasmide ontwerp en klonen
- Verkrijgen of kopen van S. cerevisiae genomic DNA.
- PCR versterken de sequenties van de doelstelling van Nsa1 (Nsa1FL, residuen 1-463) en C-terminal afgekapt Nsa1 (Nsa1ΔC, residuen 1-434) met passende inleidingen gebruikend genomic DNA van S. cerevisiae en een smelttemperatuur van geïsoleerd ongeveer 60 ° C met een tijd van de uitbreiding van 1-2 min. De volgende inleidingen werden gebruikt om het versterken van de Nsa1:
SC_Nsa1_FLFw:CGCCAAAGGCCTATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGTGGATAG
SC_Nsa1_FLRv:AATGCAGCGGCCGC....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Nsa1 was PCR versterkt van S. cerevisiae genomic DNA en subcloned in een vector met een N-terminal 6 x-Histidine affiniteit label, gevolgd door MBP en een TEV protease-site. Nsa1 werd omgevormd tot E. coli BL21(DE3) cellen en hoge opbrengst van eiwit expressie werden verkregen na inductie met IPTG en groei bij 25 ° C's nachts (figuur 1A). Nsa1 was affiniteit-gezuiverd op geïmmobiliseerdet kobalt affiniteit hars, gevolgd door MBP decolleté me.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Met behulp van dit protocol, werd recombinante Nsa1 van S. cerevisiae gegenereerd voor structurele studies door middel van röntgendiffractie zowel SAXS. Nsa1 was goed opgevoede in oplossing en gekristalliseerd in meerdere kristal vormen. Tijdens de optimalisatie van deze kristallen, werd ontdekt dat de C-terminus van Nsa1 gevoelig voor aantasting van het protease was. De hoge resolutie, orthorhombisch kristal vorm kan alleen worden gedupliceerd met C-terminal truncatie varianten van Nsa1, waarschijnlijk omdat de.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Diffractie gegevens werden verzameld in Zuidoost-regionale samenwerking toegang Team (SER-kat) 22-ID en 22-BM straallijnen op de geavanceerde Photon bron (JBS), Argonne National Laboratory. De SAXS gegevens verzameld over de SIBILLEN beamline op het voorschot licht bron (ALS), Lawrence Berkeley National Laboratory. We bedank het personeel op de SIBILLEN beamline voor hun medewerking aan externe gegevens verzamelen en verwerken. Wij zijn dankbaar aan de National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) massaspectrometrie onderzoeks- en steungroep voor hulp het eiwit domeingrenzen bepalen. Dit werk werd ondersteund door het Amerikaanse nationale Instituut van ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Moleculaire Kloning van Nsa1 | |||
| pMBP2 parallel vector | Sheffield et al, Protein Expression and Purification 15, 34-39 (1999) | We used a modified version of pMBP2 which included an N-terminal His-tag (pHMBP) | |
| S. cerevisiae genomisch DNA | ATCC | 204508D-5 | |
| Primer voor het klonen van Nsa1 | |||
| SC_Nsa1_FLFw | IDT | CGC CAA AGG CCT ATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGT GGATAG | |
| SC_Nsa1_FLRv | IDT | AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTT GCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGC AGC | |
| SC_Nsa1_DeltaCFw | IDT | GGGCGCCATGGGATCCATGAGG TTACTAGTCAGCTGTGTGG | |
| SC_Nsa1_DeltaCRv | IDT | GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC CTTCCTTTTTTGCTTCCC | |
| Recombinant Eiwitproductie en Zuivering van Nsa1 | |||
| Escherichia coli BL21 (DE3) Star Cells | Invitrogen | C601003 | |
| pMBP- NSA1 en verschillende afkortingen | Lo et al., 2017 | ||
| Selenomethionine | Molecular Dimensions | MD12-503B | |
| IPTG, Dioxaan-Vrij | Promega | V3953 | |
| EDTA Vrije Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 4693159001 | |
| Natriumchloride | Caledon Laboratory Chemicals | 7560-1-80 | |
| Magnesiumchloride hexahydraat | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Tris Buffer, 1 M pH7.5 | KD Medical | RGF-3340 | |
| Glycerol | Invitrogen | 15514-029 | |
| beta-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| 1M Imidazool, pH 8.0 | Teknova | I6980-06 | |
| Talon Affinity Resin | Clonetech | 635503 | |
| Amicon Ultra 15 mL Centrifugal Filter (MWCO 10K) | Millipore | UFC901024 | |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 Prep Grade Gel Filtratiekolom | GE-Healthcare | 28989335 | |
| TEV Protease | Bereidt door NIEHS Protein Expression Core | Expressieplasmide verstrekt door NCI (Tropea et al. Methods Mol Biology, 2009) | |
| 4-15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | BioRad | 456-8056 | |
| Kristallisatie, Proteolytische Screening | |||
| Crystal Screen | Hampton Research | HR2-110 | |
| Crystal Screen 2 | Hampton Research | HR2-112 | |
| Salt Rx | Hampton Research | HR2-136 | |
| Index Screen | Hampton Research | HR2-144 | |
| PEG/Ion Screen | Hampton Research | HR2-139 | |
| JCSG+ | Molecular Dimensions | MD1-37 | |
| Wizard Precipitant Synergy | Molecular Dimensions | MD15-PS-T | |
| Swissci 96-well 3-druppel UVP sitting drop platen | TTP Labtech | 4150-05823 | |
| 3inch Breed Crystal Clear Sealing Tape | Hampton Research | HR4-506 | |
| Proti-Ace Kit | Hampton Research | HR2-429 | |
| PEG 1500 | Molecular Dimensions | MD2-100-6 | |
| PEG 400 | Molecular Dimensions | MD2-100-3 | |
| HEPES/natriumhydroxide pH 7.5 | Molecular Dimensions | MD2-011- | |
| Natriumcitraat tribasic | Molecular Dimensions | MD2-100-127 | |
| 22 mm x 0.22 mm Siliconized Coverslides | Hampton Research | HR3-231 | |
| 24 Well Plates met afdichting (VDX Plate met Sealant) | Hampton Research | HR3-172 | |
| 18 mM Gemonteerde Nylon Loops (0.05 mm tot 0.5 mM) | Hampton Research | HR4-945, HR4-947, HR4-970, HR4-971 | |
| Seed Bead Kit | Hampton Research | HR2-320 | |
| Magnetische Crystal Caps | Hampton Research | HR4-779 | |
| Magnetische Cryo Wand | Hampton Research | HR4-729 | |
| Cryogene Foam Dewar | Hampton Research | HR4-673 | |
| Crystal Puck System | MiTeGen | M-CP-111-021 | |
| Full Skirt 96 well Clear Plate | VWR | 10011-228 | |
| AxyMat Sealing Mat | VWR | 10011-130 | |
| Apparatuur | |||
| UVEX-m | JAN Scientific, Inc. | ||
| Nanodrop Lite Spectrophotometer | Thermo-Fisher | ||
| Mosquito Robot | TTP Labtech | ||
| Software/Websites | |||
| HKL2000 | Otwinoski en Minor, 1997 | ||
| Phenix | Adams et al., 2010 | ||
| Coot | Emsley et al., 2010 | ||
| ATSAS | Petoukhov et al., 2012 | https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/ | |
| Scatter | Rambo en Tainer, 2013 | ||
| Pymol | The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8 Schrödinger, LLC. | ||
| BUNCH | Petoukhov en Svergun, 2005 | ||
| CRYSOL | Svergun et al, 1995 | ||
| PRIMUS | Konarev et al, 2003 | ||
| EOM | Tria et al, 2015 |
Referenties
- Thomson, E., Ferreira-Cerca, S., Hurt, E. Eukaryotic ribosome biogenesis at a glance. J Cell Sci. 126 (Pt 21), 4815-4821 (2013).
- Woolford, J. L. Jr, Baserga, S. J. Ribosome biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 195 (3), 643-681 (2013).
- Kressler, D., Hurt, E., Bas....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
