Methodenartikel

Het combineren van röntgendiffractie met kleine hoek X-Ray Scattering model ongestructureerde regio's van de Nsa1 van S. Cerevisiae

DOI:

10.3791/56953

⸱

10 januari 2018

 ,  , 
1Signal Transduction Laboratory, National Institutes of Environmental Health Sciences, Department of Health and Human Services, National Institutes of Health

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze methode beschrijft de klonen, expressie en zuivering van recombinante Nsa1 voor structurele bepaling door middel van röntgendiffractie en small-angle X-ray scattering (SAXS), en is van toepassing voor de hybride structurele analyse van andere eiwitten die beide bevatten besteld en ontregelde domeinen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bepaling van de volledige structuur van ribosoom vergadering factor Nsa1 van Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is uitdagend vanwege de wanordelijke en protease labile C-terminus van het eiwit. Dit manuscript worden de methoden beschreven om te zuiveren van recombinante Nsa1 van S. cerevisiae voor structurele analyse door middel van röntgendiffractie zowel SAXS. Röntgendiffractie werd gebruikt om op te lossen van de structuur van het welgeordende N-terminale WD40 domein van Nsa1, en vervolgens SAXS werd gebruikt voor het oplossen van de structuur van de C-terminus van Nsa1 in oplossing. Verstrooiing oplossingsgegevens werd bijeengezocht uit full-length Nsa1 in oplossing. De theoretische verstrooiing amplitudes werden berekend op basis van de hoge resolutie kristalstructuur van het domein WD40, en dan een combinatie van vastlichaam en ab initio modellering geopenbaard de C-terminus van Nsa1. Met deze hybride aanpak werd de quaternaire structuur van de gehele proteïne gereconstrueerd. De methoden die hier worden gepresenteerd gelden over het algemeen voor de hybride structurele bepaling van andere eiwitten die bestaat uit een mix van gestructureerde en ongestructureerde domeinen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ribosomen zijn grote ribonucleoprotein machines die de essentiële rol van het vertalen van mRNA naar eiwitten in alle levende cellen verrichten. Ribosomen bestaan uit twee subeenheden die worden geproduceerd in een complex proces ribosoom biogenese1,2,3,4genoemd. Eukaryotische ribosoom vergadering, is afhankelijk van de steun van honderden essentiële ribosomal vergadering factoren2,3,5. Nsa1 (het Nop7 gekoppeld 1) is een eukaryote ribosoom vergadering factor die vereist is voor de productie van de grote ribosomal subeenheid6, en is bekend als WD-repeat met 74 (WDR74) in hogere organismen7. WDR74 heeft aangetoond dat vereist is voor de vorming van de blastocyst in muizen8en de promotor van de WDR74 is vaak gemuteerd in kanker cellen9. De functie en de precieze mechanismen van Nsa1/WDR74 in ribosoom vergadering zijn echter nog steeds grotendeels onbekend. Om te beginnen te ontdekken van de rol van Nsa1/WDR74 tijdens de rijping van de eukaryote ribosoom, werden meerdere structurele analyses uitgevoerd, waaronder röntgendiffractie en kleine hoek X-ray scattering (SAXS)10.

Middel van röntgendiffractie, nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie, elektronenmicroscopie en SAXS zijn alle belangrijke technieken voor de studie van macromoleculaire structuur. Grootte, vorm, beschikbaarheid en stabiliteit van macromoleculen invloeden de structurele biologie methode waarvoor een bepaalde macromolecule beste zal worden geschikt, maar het combineren van meerdere technieken door middel van een zogenaamde "hybride"-aanpak wordt steeds een steeds nuttig hulpmiddel11. Met name zijn röntgendiffractie en SAXS krachtige en complementaire methoden voor structurele bepaling van macromoleculen12.

Kristallografie biedt hoge resolutie atomaire structuren, variërend van kleine moleculen aan grote cellulaire machines zoals het ribosoom, en heeft geleid tot talrijke doorbraken in het begrip van de biologische functies van eiwitten en andere macromoleculen13. Bovendien, harnassen structuur gebaseerde drug design de kracht van kristalstructuren voor moleculaire docking door rekenmethoden, een kritische dimensie toe te voegen aan ontdekking en ontwikkeling van de drug14. Ondanks haar brede toepasbaarheid zijn flexibele en ongeordende systemen uitdagend om te beoordelen door kristallografie aangezien crystal verpakking kan worden belemmerd of elektron dichtheid kaarten mogelijk onvolledige of van slechte kwaliteit. SAXS is daarentegen een oplossingsgerichte en lage resolutie structurele aanpak staat om flexibele systemen, variërend van wanordelijke loops en termini intrinsiek ongeordende eiwitten12,15,16te beschrijven. Gezien het feit dat het is compatibel met een breed scala van deeltje grootte12, kunt SAXS werken synergetisch met kristallografie uit te breiden het bereik van biologische vragen die kunnen worden aangepakt door structurele studies.

Nsa1 is geschikt voor een structurele aanpak van hybride omdat het bevat een goed gestructureerde WD40 domein gevolgd door een functionele, maar flexibele C-terminus die niet vatbaar voor röntgendiffractie methoden. Hier volgt een protocol voor het klonen, expressie en zuivering van S. cerevisiae Nsa1 voor hybride structurele bepaling door middel van röntgendiffractie en SAXS. Dit protocol kan worden aangepast om te bestuderen van de structuren van de andere eiwitten die bestaan uit een combinatie van bevolen en ongeordende regio's.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. recombinant eiwitproductie en zuivering van Nsa 1

  1. Nsa1 expressie plasmide ontwerp en klonen
    1. Verkrijgen of kopen van S. cerevisiae genomic DNA.
    2. PCR versterken de sequenties van de doelstelling van Nsa1 (Nsa1FL, residuen 1-463) en C-terminal afgekapt Nsa1 (Nsa1ΔC, residuen 1-434) met passende inleidingen gebruikend genomic DNA van S. cerevisiae en een smelttemperatuur van geïsoleerd ongeveer 60 ° C met een tijd van de uitbreiding van 1-2 min. De volgende inleidingen werden gebruikt om het versterken van de Nsa1:
      SC_Nsa1_FLFw:CGCCAAAGGCCTATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGTGGATAG
      SC_Nsa1_FLRv:AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTTGCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGCGC
      SC_Nsa1ΔcFw:GGGCGCCATGGGATCCATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGTGG
      SC_Nsa1ΔcRv: GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAACCTTCCTTTTTTGCTTCCC
    3. Nsa1 in de Escherichia coli (E. coli) expressie vector pHMBP met een N-terminal subclone 6 X-Histidine label gevolgd door de Maltose bindend proteïne (MBP) en een tabak Etch Virus (TEV) protease-site met behulp van standaard kloontechnieken17 .
    4. Gebruik DNA rangschikkend om te verifiëren dat de Nsa1 in het frame met de N-terminal zijn-MBP tag werd gekloond.
  2. Nsa1 eiwit expressie
    1. De expressie plasmid(s) omvormen tot een geschikt E. coli expressie stam met een T7 promotor-gebaseerd systeem. Plaat van de transformants op LB agar platen met 100 µg/mL ampicilline en Incubeer de plaat omgekeerd 's nachts bij 37 ° C.
    2. Enten van een cultuur van de 50 mL voor LB met 100 µg/mL ampicilline van de transformatie-plaat, en 's nachts groeien met schudden bij 200 t/min bij 37 ° C.
    3. Enten van 3 x 1000 mL voor LB in Fernbach kolven met 100 µg/mL ampicilline met 15 mL van de overnachting cultuur en groeien met schudden bij 200 t/min bij 37 ° C.
      Opmerking: Voor de oplossing van de structuur van eiwitten, opneming van de selenomethionyl (SeMet) kan worden bereikt door de groeiende cellen in M9 minimaal medium dat wordt aangevuld met SeMet en een mengsel van het aminozuur voor de remming van methionine productie vóór inductie, in tegenstelling tot de LB-media 18.
    4. Induceren uitdrukking van Nsa1 wanneer de OD600 ~0.8 door toevoeging van isopropyl β-D-1 thiogalactopyranoside (IPTG bereikt) op een eindconcentratie van 1 mM, gevolgd door incubatie bij 25 ° C's nachts met schudden bij 200 omwentelingen per minuut.
    5. Oogsten van cellen door centrifugeren bij 4 ° C gedurende 15 minuten staan bij 5,050 x-g.
      Opmerking: Cellen kunnen worden opgeslagen op lange termijn bij-80 ° C of onmiddellijk gebruikt voor eiwitreiniging.
  3. Nsa1 eiwitreiniging
    1. Resuspendeer de cellen in 25 mL lysisbuffermengsel (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 10% glycerol, 10 mM MgCl2) vooraf gekoeld bij 4 ° C met een EDTA-vrije protease inhibitor tablet.
    2. Lyse cellen met het ultrasoonapparaat bij 4 ° C (tijd 7 min, 2 s op cyclus, 2 s uit cyclus; amplitude: 70%).
    3. Verduidelijken lysate door centrifugeren bij 26,900 x g gedurende 45 min bij 4 ° C.
    4. Toepassing verduidelijkt lysate aan een kolom van zwaartekracht stroom geladen met 10 mL geïmmobiliseerdet kobalt affiniteit hars, vooraf zijn geëquilibreerd met Lysis-buffermengsel.
    5. Laat het supernatant voorbij de hars door zwaartekracht stroom bij 4 ° C te wassen de hars tweemaal met 100 mL lysisbuffermengsel.
    6. Elueer Nsa1 met 20 mL elutie buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, van 500 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 5% glycerol en 200 mM imidazol).
    7. Neem 15 μl van het eluaat en draaien op een 4-15% SDS-pagina gel om te verifiëren dat het eiwit van de affiniteit hars (figuur 1A) wordt geëlueerd.
    8. Verwijder de MBP tag door TEV protease spijsvertering. 1 mL van TEV protease19 (1 mg/mL stockoplossing) toevoegen aan de Nsa1 affiniteit hars elutie en het bij 4 ° C na een nacht bebroeden.
    9. Concentraat MBP gekloofd Nsa1 naar ~ 5 mL met behulp van een centrifugaal filter met een moleculair gewicht cut off van 10 kDa.
    10. MBP-gekloofd Nsa1 van toepassing op een gel-filtratie-kolom, vooraf geëquilibreerd in buffer (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 5% glycerol en 1 mM β-mercaptoethanol) (figuur 1B).
    11. Analyseren van kolom breuken uit gel filtratie om te verifiëren dat MBP gekloofd en van Nsa1 gescheiden door 15 μL monsters uit te voeren op een 4-15% SDS-pagina gel (figuur 1B).
    12. Breuken met Nsa1 combineren en concentreren op 8 mg/mL met behulp van een centrifugaal filter met een moleculair gewicht van cut off van 10 kDa.
    13. De eiwitconcentratie bepalen door het meten van de absorptie bij 280 nm in een spectrofotometer met behulp van het uitsterven coëfficiënt 42530 M-1cm-1. Eiwit direct gebruiken voor Proteolytische screening en kristallisatie proeven.

2. kristallisatie en Proteolytische Screening van Nsa 1

  1. Sparse Matrix Crystal Screening van Nsa1
    1. Centrifugeer 500 μL van de voorraad van de 8 mg/mL van Nsa1 bij 16.000 x g bij 4 ° C gedurende 10 minuten.
    2. Setup kristallisatie proeven met behulp van een robot kristallisatie en sparse matrix crystal schermen. Vul het reservoir van 96 goed laden met 30 μl van de individuele kristallen scherm reagentia van sparse matrix kristallisatie schermen. Vergadering druppels Setup met de robot door het mengen van 250 nL van de goed oplossing met 250 nL van de eiwit-oplossing.
    3. Zegel van de kristallisatie platen met tape en hen uit te broeden bij 25 ° C.
    4. Inspecteer de platen om de twee dagen voor de eerste 2-3 weken met een stereomicroscoop.
    5. Controleer of potentiële kristallen hits bevatten eiwitten met een UV-Microscoop.
      Opmerking: Voor Nsa1 twee verschillende kristallen vormen (kubieke en orthorhombisch, figuur 2A) werden verkregen binnen 1 week uit de volgende schermen: JCSG + voorwaarde B11 (1,6 M Natriumcitraat TRIBASISCH uitdrogen, pH 6,5) en Wizard Precipitant synergie scherm blok 2 voorwaarde C11 (20.1%(v/v) PEG 1500 13.4%(v/v) PEG 400, 0,1 M Tris HEPES/natriumhydroxide, pH 7.5).
  2. Proteolytische Screening
    Opmerking: Tijdens de kristallisatie optimalisatie, werd ontdekt dat de orthorhombisch kristallen van Nsa1 ontstond als gevolg van Proteolytische splijten en de kristallen kon niet worden gedupliceerd met behulp van de full-length proteïne. Met behulp van een combinatie van beperkte proteolyse gekoppeld aan massaspectrometrie, werd vastgesteld dat de C-terminus van Nsa1 gevoelig voor proteolyse was en verwijdering van de C-terminal staart vereist voor latere reproductie van de orthorhombisch kristal vorm was ( Nsa1ΔC).
    1. Bereiden van 1 mg/mL protease stamoplossingen van de volgende proteasen α-Chymotrypsine, trypsine, elastase, papaïne, subtilisin en endoproteinase Glu-C.
    2. 1:10, 1:100 en 1:1000 verdunningen van elk 1 mg/mL protease aandeel maken met verdunning Buffer (10 mM HEPES, pH 7.5, 500 mM natrium chloride).
    3. Pipetteer 1 μL van protease voorraad (1:10, 1:100 en 1:1000) in 9 μL aliquots van eiwitten (1 mg/mL) voor elke protease worden vertoond.
    4. Incubeer de oplossing bij 37 ° C gedurende 1 uur.
    5. Zet de reactie stop door het toevoegen van 10 μL van 2 x SDS-pagina monster buffer en warmte de reactie bij 95 ° C gedurende 5 min.
    6. Analyseer de geklaard door hen uit te voeren op een 4-15% SDS-pagina gel (figuur 2B).
    7. Identificeren protease resistente domeinen van het target-eiwit door analyse van de Spectrometrie van de massa van het in-gel.
    8. Verwijder de protease-onstabiele regio's uit het doel eiwit door het creëren van afgeknotte expressie constructies en na het protocol van het klonen, expressie en zuivering hierboven beschreven.
  3. Kristallisatie optimalisatie
    1. Bereiden of verkrijgen van stamoplossingen van de volgende eerste kristallisatie reagentia: 1,6 M Natriumcitraat TRIBASISCH uitdrogen pH 6,5, 100%(v/v) PEG 400, 50%(v/v) 1500 PEG, 1 M HEPES/natriumhydroxide, pH 7.5.
    2. Bereiden van een stamoplossing van Nsa1FL en Nsa1ΔC bij 8 mg/mL zoals hierboven beschreven.
    3. Optimaliseren van de Nsa1 kubieke kristallen (Nsa1FL).
      1. Bereiden een scherm 24-well raster met putten met 500 µL met een verloop van 1-1.6 M van Natriumcitraat met pH 6,5 van een stamoplossing van 1.6 M Natriumcitraat TRIBASISCH met pH 6,5.
      2. Meng 1 µL van eiwit met 1 µL van goed oplossing en plaats het mengsel in een dia gesiliconiseerd dekking. Zorgvuldig omkeren de dia dekking bovenop de vooraf ingevette goed en zorgen voor het goed is afgedicht, maar zorg niet verstoren de daling of breken van de dia deksel. Herhaal dit proces totdat de lade wordt gevuld en sla bij 25 ° C.
        Opmerking: Kleine kubieke kristallen moeten verschijnen in 2-7 dagen.
      3. Bereiden een microseed voorraad van de kubieke kristallen. Gebruik een gemonteerde nylon lus ~ 10 kleine kubieke kristallen overbrengen naar een 1,5 mL micro-centrifuge buis met een kleine hiel en 50 µL van 1.6 M Natriumcitraat TRIBASISCH wit pH 6,5.
      4. Vortex de 1,5 mL micro-centrifuge buis op hoge snelheid (~ 3000 rpm) voor 1 min.
      5. Een aantal 10-fold seriële verdunningen van het uitgangsmateriaal met 1,6 M Natriumcitraat TRIBASISCH en vortex maken het mengsel grondig voor 5 s.
      6. Vullen elkaar goed aan een raster van 24-well, scherm met 500 µL van 1.6 M Natriumcitraat TRIBASISCH pH 6,5.
      7. Het optimaliseren van de microseeding-voorwaarden door het opzetten van druppels met verschillende verhoudingen van eiwit met de oplossingen van het uitgangsmateriaal (figuur 3A). Grotere kubieke kristallen van diffractie van hoge kwaliteit moeten worden weergegeven in 2-5 dagen (Figuur 3 c).
    4. Optimaliseren van de orthorhombisch kristallen (Nsa1ΔC)
      1. Het scherm van een raster met 500 µL in elk putje met 24 verschillende omstandigheden (figuur 3B) bereiden van stamoplossingen van 50%(v/v) PEG 1500 en 100%(v/v) PEG 400. Naast gradiënten van PEG 1500 en PEG 400, moet elk goed ook bevatten 0,1 M HEPES/natrium hydroxide pH 7.5.
      2. Meng 1 µL van eiwit-oplossing met 1 µL van goed oplossing op een dia gesiliconiseerd dekking. Zorgvuldig wordt omkeren de dia dekking bovenop de vooraf ingevette goed en zorgen voor het goed verzegeld. Herhaal dit proces totdat de hele lade is ingevuld. Opslaan van de schaaltjes bij 25 ° C.
        Opmerking: Nsa1 orthorhombisch kristallen moeten verschijnen in 2-7 dagen.
      3. Verder de orthorhombisch kristallen te optimaliseren door microseeding als beschreven voor de kubieke kristallen (stappen 2.3.3.3 naar 2.3.3.7) met behulp van 500 µL van 20.1%(v/v) PEG 1500, 13.4%(v/v) PEG 400 en 0,1 M HEPES/natrium hydroxide pH 7.5 als de oplossing goed.
        Opmerking: Nsa1 SeMet kristallen moeten worden geoptimaliseerd analoog aan de inheemse kristallen.

3. röntgendiffractie gegevensverzameling en Nsa 1 structuur oplossing

  1. Cryo-bescherming van kristallen en röntgendiffractie gegevensverzameling
    1. Voor de orthorhombisch kristallen (Nsa1ΔC), bereid een cryoprotectant-oplossing van 1 mL met 22.5%(v/v) PEG 1500, 15%(v/v) PEG 400 en 0,1 M HEPES/natrium hydroxide pH 7.5.
    2. Vul een schuim Dewar met vloeibare stikstof, en vooraf een kristal puck koel. Wees voorzichtig bij het werken met vloeibare stikstof en Draag beschermende handschoenen en bril.
    3. Voorzichtig omkeren de dia van de dekking van de kristallisatie putje met kristallen op het podium van een stereomicroscoop.
    4. Pipetteer 2 µL van de cryoprotectant-oplossing op een nieuwe dia die dekking.
    5. Een gemonteerde nylon lus van de juiste grootte voor het kristal hechten aan een magnetische cryo roede.
    6. Met de hulp van de stereomicroscoop, snel overbrengen in een kristal de cryoprotectant-oplossing met de gekoppelde cryo-lus.
    7. Laat het kristal equilibreer gedurende 5 min in de cryoprotectant-oplossing.
    8. Met de hulp van de stereomicroscoop, snel lus van het kristal van de cryoprotectant oplossing en duik-freeze in vloeibare stikstof.
    9. Wachten op de vloeibare stikstof rond de lus om te stoppen met het koken en laat vervolgens de lus van de toverstaf in een bepaalde locatie binnen de crystal puck.
    10. Kubieke Nsa1FL kristallen hoeft niet te worden cryoprotected en kan worden rechtstreeks flitser bevroren (na stappen 3.1.8-3.1.9 hierboven).
    11. Zegel van de crystal-puck met cryo's en transfer naar een verzending stok in een vooraf gekoeld dewar. Bewaren van kristallen in de pucks/dewars tot het verzamelen van gegevens.
    12. Als het verzamelen van gegevens op een synchrotron, schip kristallen naar de synchrotron met behulp van een droge verzender.
    13. Röntgendiffractie gegevens na standaardtechnieken20verzamelen.
      Opmerking: Voor Nsa1 native en SAD (single-golflengte anomalous dispersion) datasets werden verzameld bij 100 K op de SER-CAT lichtbundel lijn 22-ID en 22-BM van de geavanceerde Photon bron bij het Argonne National Laboratory (Chicago, IL). SAD Nsa1 dataset werd verzameld op λ = 0.97911 Å. Gegevens werd opgenomen met een 1 s blootstellingstijd en 0,5 ° oscillaties. De mosaicity van deze kristallen was meestal ongeveer 0.3°.
    14. Proces en schaal het röntgendiffractie beelden voor het genereren van reflectie bestanden voor iedere gegevensverzameling in de juiste ruimtegroep.
      Opmerking: Nsa1 diffractie datasets werden verwerkt met HKL200021. De Nsa1 kubieke kristallen werden verwerkt in de ruimte groep P21, 3 en de orthorhombisch kristallen werden verwerkt in de ruimte groep P212121.
  2. Nsa1 structuur oplossing.
    Opmerking: Er zijn verschillende kristallografie softwarepakketten die kunnen worden gebruikt op te lossen en verfijnen van kristalstructuren, met inbegrip van Phenix en CCP422,23. Hier volgt het protocol voor Nsa1 structuur oplossing met behulp van de Phenix software suite22.
    1. Analyseren de Native en SAD geschaald datasets met phenix.xtriage22.
    2. Het oplossen van de structuur van Nsa1 met Phenix.autosol met behulp van de trieste piek reflectie bestand22,24. Input voor het uitvoeren van het programma van AutoSol, het aantal selenomethionine sites (sites = 9), het bestand fasta opeenvolging van Nsa1ΔC, en de golflengte gebruikt voor triest gegevensverzameling (λ = 0.97911 Å).
      Opmerking: Uit de Nsa1 SAD dataset, phenix.autosol moeten zitten kundig voor de experimentele fasen bepalen en bouwen de meeste van het model.
    3. Handmatige aanpassingen aan het model met Coot25, gevolgd door verfijning van phenix.refine22,26.
    4. De structuur van het hoge-resolutie inheemse orthorhombisch kristal en het kubieke kristal oplossen door moleculaire vervanging met behulp van de Phaser27,28.
    5. Inspecteer na succesvolle structuur oplossing, het model en de dichtheid van de electron kaart in Coot25.
    6. Bouwen en verfijnen van de structuren door het uitvoeren van iteratieve rondes van verfijning in phenix.refine22,26 en modelbouw in de Meerkoet25.

4. SAXS gegevensverzameling, verwerking en modelleren

  1. SAXS gegevensverzameling
    Opmerking: SAXS gegevens werden opgenomen voor full-length S. cerevisiae Nsa1 bij de geavanceerde lichtbron, op de high-throughput SIBILLEN beamline 12.3.1 bij het Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA29.
    1. Zuiveren van Nsa1FL volgens het protocol zoals hierboven beschreven. 24 uur vóór de verzending van Nsa1FL aan de beamline, eiwit overreden door een gel filtratie kolom geëquilibreerd vooraf in de buffer A.
    2. Bundelen van breuken met Nsa1 en bepalen de eiwitconcentratie, zoals eerder is beschreven.
    3. Bereiden van 30 μl aliquots van een reeks van de concentratie van Nsa1 van 1 op 6.2 mg/mL met buffer A.
    4. 20 μl van elke reeks van de concentratie van Nsa1 overbrengen in een duidelijke volledige rok 96 goed microplate samen met buffer A alleen besturingselementen.
      Opmerking: SAXS gegevens worden verzameld op verdunde oplossingen met behulp van verschillende concentraties van gezuiverde monster aggregatie, Inter deeltje walging, en effecten van straling schade te voorkomen.
    5. Verzegel de microplate met een siliconen afdichting mat en schip 's nachts bij 4 ° C tot de beamline.
    6. Bewaren de microplate bij 4 ° C tot gegevensverzameling.
    7. Onmiddellijk vóór het verzamelen van gegevens, draai de plaat bij 3200 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C luchtbellen te verwijderen van potentiële aggregaten.
    8. SAXS recordgegevens.
      Opmerking: Voor Nsa1, SAXS gegevens werden opgenomen voor de buffer vóór en na elke reeks van eiwit concentratie. Drieëndertig opeenvolgende scans van 0.3 s werden verzameld voor Nsa1FL over een reeks van concentratie (1 op 6.2 mg/mL) bij 10 ° C.
    9. Buffer aftrekken voor SAXS gegevens uitvoeren
      Opmerking: Voor Nsa1 buffer aftrekken was automatisch gedaan bij de beamline maar buffer aftrekken kan ook worden uitgevoerd met behulp van de software van de vermindering van de gegevens zoals Scatter30 en de ATSAS suite31. Buffer aftrekken is een cruciaal onderdeel van gegevensanalyse SAXS en zorg moet worden genomen om ervoor te zorgen dat de buffer die wordt gebruikt voor aftrekken identiek aan de eiwit monster buffer is.
    10. Gemiddelde scant de opeenvolgende 33 om een *ave.dat-bestand voor elke concentratie te maken.
      Opmerking: Overlay de 33 opeenvolgende frames te vergelijken van de curven. Wijzigingen in de verstrooiing bochten na verloop van tijd is vaak een indicatie van de schade door straling. Uitsluiten dat deze frames gemiddeld. Gemiddeld van de opeenvolgende scans van Nsa1 werd automatisch uitgevoerd in de beamline SIBILLEN.
  2. SAXS gegevensverwerking en vergelijking van concentratie serie
    Opmerking: Er zijn verschillende softwarepakketten die kunnen worden gebruikt om SAXS gegevens te analyseren. Voor Nsa1 in de straal van traagheidsstralen en functies van paarsgewijse afstand verdelingen werden bepaald met behulp van PRIMUS32 en Gnom33 van de ATSAS 2.7.2 suite31 en vergeleken in alle concentraties van het eiwit om ervoor te zorgen dat er was geen straling schade of concentratie-afhankelijke Inter deeltje interacties10.
    1. Open een terminal shell en ga naar de directory met de SAXS gegevens.
    2. De PRIMUS32 GUI van binnen de terminal shell te starten.
    3. Binnen de PRIMUS GUI, laden de verstrooiing curven (* ave.dat).
    4. AutoRg te bepalen van de straal van Gyration (Rg) en verstrooiing intensiteit, I(0), voor elke verstrooiing curve gebruiken (* ave.dat).
    5. Genereren van Kratky percelen voor elke verstrooiing curve (* ave.dat), om te evalueren van de mate van compactheid.
    6. AutoGNOM33 te gebruiken voor het berekenen van de paarsgewijse verdelingsfunctie (ook wel genoemd P(r)) voor elke verstrooiing curve (* ave.dat). Voer een begin Dmax ≈ 3 * Rg en optimaliseren van de D-max waarde te verkrijgen van een vloeiende curve van de P(r). Tijdens de optimalisatie van D-max, ervoor zorgen dat de berekende P(r) functie is in overeenstemming met de experimentele verstrooiing curve door het controleren van de gerapporteerde χ2 waarde en visueel beoordelen de totale aanpassen aan de verstrooiing curve.
    7. Berekenen van het molecuulgewicht van de Nsa1 uit de verstrooiing krommen met behulp van het volume van de correlatie34.
    8. Vergelijk de structurele parameters voor elke concentratie om ervoor te zorgen dat er geen schade door straling of concentratie-afhankelijke effecten zijn.
      Opmerking: Effecten van de concentratie kunnen zich manifesteren als een toenemende Rg en Dmax in verband met een toenemende eiwitconcentratie. Voorwaarts verstrooiing I(0) gedeeld door de concentratie van het monster moet ook constant blijft over de eiwit concentratie serie.
  3. SAXS Modeling
    Opmerking: Om te bepalen van de positie van de C-terminus van Nsa1FL, de Nsa1 kristal structuur10 (VOB 5SUM) en de SAXS verstrooiing krommen werden gebruikt voor het uitvoeren van een combinatie van vastlichaam en ab initio modellering, met behulp van de programma's bos 35 en Ensemble optimalisatie methode (EOM)36 van de ATSAS software suite31. Het domein van de WD40 van Nsa1 werd behandeld als een star lichaam, terwijl de C-terminus van Nsa1 samen met verschillende ongeordende lussen van het domein WD40 werden gemodelleerd aanpassen aan de experimentele SAXS gegevens.
    1. De input VOB-bestanden te genereren. Het VOB-bestand moet worden opgesplitst telkens residuen verdwenen uit de belangrijkste keten zijn en het VOB-bestand niet bevatten meerdere conformaties, liganden, of water moleculen.
    2. Voer het programma Pre_BUNCH35 voor te bereiden het invoerbestand VOB bos (pre_bunch.pdb). De volgorde van het target-eiwit (*.seq), het aantal domeinen/PDBs gegenereerd in 4.3.1, input en elk van de afzonderlijke VOB-bestanden gegenereerd boven.
    3. Bereken de amplitudes van de verstrooiing voor elke individuele VOB-bestand met behulp van het programma CRYSOL37. Input het afzonderlijke VOB-bestand en de experimentele SAXS verstrooiing curve (*.dat) uit te voeren CRYSOL. Hierdoor genereert u een bestand amplitudes (* .alm).
    4. Voer het programma bos35 om het model van het domein van de WD40 van Nsa1 tegen de SAXS gegevens met behulp van een gecombineerde rigide lichaam en ab initio aanpak. Ingang van het VOB-bestand van Pre_BUNCH (pre_bunch.pdb), de experimentele SAXS verstrooiing curve (*.dat) en de individuele amplitude (* .alm) bestanden voor elke gedeeltelijke VOB bestand gegenereerd door CRYSOL.
    5. Vergelijk de χ2 waarde van de eerste VOB (5SUM) met die van de ab initio model gegenereerd door bos met behulp van de experimentele SAXS gegevens.
      Opmerking: Een succesvol model van het bos moeten een aanzienlijk lagere χ2 waarde dan het eerste model. De theoretische verstrooiing van het bos-model moet ook goed beschrijven de experimentele gegevens zoals beoordeeld door visuele inspectie van de overlay tussen de theoretische verstrooiing van het model van de bos de SAXS gegevens en de waarde2 χ (Figuur 4, Center-gasleiding).
    6. Handmatig controleren de output bestanden uit bos in Pymol38 overlay van de kristalstructuur met het model gegenereerd door bos en de SAXS envelop (Figuur 4, centrum pijpleiding).
    7. BOS opnieuw 10 - 20 keer voor het genereren van onafhankelijke modellen om te bevestigen dat de modellen vergelijkbaar zijn.
      Opmerking: Voor de Nsa1 was er een aantal χ2 waarden van ~ 1 tot 3 van 20 onafhankelijke loopt.
    8. Ensemble Modeling
      Opmerking: als een optionele benadering bos EOM36 of minimale Ensemble Zoek39 (MES) uitvoert. EOM en MES gebruiken ensemble benaderingen, die geschikt zijn voor eiwitten met flexibele domeinen/regio's die in meerdere conformaties.
      1. Voer het programma EOM36 met behulp van de online server van ATSAS. Input voor het uitvoeren van EOM, de VOB-bestanden uit 4.3.1, de volgorde van de doel-eiwit (*.seq), en de experimentele SAXS gegevens (*.dat).
      2. Vergelijk de χ2 waarden van het begin VOB (5SUM) met die van het ensemble gegenereerd door EOM met behulp van de experimentele SAXS gegevens.
        Opmerking: Een succesvolle EOM ensemble moeten een aanzienlijk lagere χ2 waarde dan het eerste model. De theoretische verstrooiing van het ensemble moet ook goed beschrijven de experimentele gegevens zoals beoordeeld door visuele inspectie van de overlay tussen de theoretische verstrooiing van het ensemble de SAXS gegevens en de waarde2 χ (Figuur 4, rechts pijpleiding). Men moet ook de χ2 waarden uit bos en EOM te bepalen welk model beste beschrijft de experimentele SAXS gegevens vergelijken.
      3. Handmatig controleren het conformeren van de Verkiezingswaarnemingsmissie in Pymol38 te bedekken de kristalstructuur met het conformeren gegenereerd door de Verkiezingswaarnemingsmissie (Figuur 4). Opmerking het totale aantal conformeren en de Fractie van de bezetting voor elke conformer dat aan de verstrooiing curve bijdraagt. Voor meer rigide moleculen, zoals Nsa1, moet het aantal conformeren klein (1-5) (Figuur 4, juiste pijpleiding)36.
      4. Re-run EOM meerdere malen om consistente resultaten.
        Opmerking: Voor de Nsa1 het aantal conformeren was meestal 3 tot en met 4 met χ2 waarden variërend van 0.1 tot 0.3.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nsa1 was PCR versterkt van S. cerevisiae genomic DNA en subcloned in een vector met een N-terminal 6 x-Histidine affiniteit label, gevolgd door MBP en een TEV protease-site. Nsa1 werd omgevormd tot E. coli BL21(DE3) cellen en hoge opbrengst van eiwit expressie werden verkregen na inductie met IPTG en groei bij 25 ° C's nachts (figuur 1A). Nsa1 was affiniteit-gezuiverd op geïmmobiliseerdet kobalt affiniteit hars, gevolgd door MBP decolleté me...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van dit protocol, werd recombinante Nsa1 van S. cerevisiae gegenereerd voor structurele studies door middel van röntgendiffractie zowel SAXS. Nsa1 was goed opgevoede in oplossing en gekristalliseerd in meerdere kristal vormen. Tijdens de optimalisatie van deze kristallen, werd ontdekt dat de C-terminus van Nsa1 gevoelig voor aantasting van het protease was. De hoge resolutie, orthorhombisch kristal vorm kan alleen worden gedupliceerd met C-terminal truncatie varianten van Nsa1, waarschijnlijk omdat de...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diffractie gegevens werden verzameld in Zuidoost-regionale samenwerking toegang Team (SER-kat) 22-ID en 22-BM straallijnen op de geavanceerde Photon bron (JBS), Argonne National Laboratory. De SAXS gegevens verzameld over de SIBILLEN beamline op het voorschot licht bron (ALS), Lawrence Berkeley National Laboratory. We bedank het personeel op de SIBILLEN beamline voor hun medewerking aan externe gegevens verzamelen en verwerken. Wij zijn dankbaar aan de National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) massaspectrometrie onderzoeks- en steungroep voor hulp het eiwit domeingrenzen bepalen. Dit werk werd ondersteund door het Amerikaanse nationale Instituut van gezondheid intramurale Research Program; Amerikaanse National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) (ZIA ES103247 naar R. E. S.) en de Canadese instituten van gezondheidsonderzoek (CIHR, 146626 tot M.C.P). Gebruik van de APS werd ondersteund door de ons Department of Energy, Office of Science, Office of Basic Energy Sciences onder Contract nr. W-31-109-Eng-38. Gebruik van de geavanceerde licht bron (ALS) werd gesteund door de directeur, Office of Science, Office van energie basiswetenschappen, van het US Department of Energy onder Contract nr. DE-AC02-05CH11231. Extra ondersteuning voor de SIBILLEN SAXS beamline afkomstig is van de National Institute of Health project MINOS (R01GM105404) en een High-End Instrumentation Grant S10OD018483. Wij zouden ook graag Andrea Moon en Dr. Sara Andres bedanken voor hun kritische lezing van dit manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Moleculaire Kloning van Nsa1
pMBP2 parallel vectorSheffield et al, Protein Expression and Purification 15, 34-39 (1999)We used a modified version of pMBP2 which included an N-terminal His-tag (pHMBP)
S. cerevisiae genomisch DNAATCC204508D-5
Primer voor het klonen van Nsa1
SC_Nsa1_FLFwIDTCGC CAA AGG CCT
ATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGT
GGATAG
SC_Nsa1_FLRvIDTAATGCAGCGGCCGCTCAAATTTT
GCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGC
AGC
SC_Nsa1_DeltaCFwIDTGGGCGCCATGGGATCCATGAGG
TTACTAGTCAGCTGTGTGG
SC_Nsa1_DeltaCRvIDTGATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC
CTTCCTTTTTTGCTTCCC
Recombinant Eiwitproductie en Zuivering van Nsa1
Escherichia coli BL21 (DE3) Star CellsInvitrogenC601003
pMBP- NSA1 en verschillende afkortingenLo et al., 2017
SelenomethionineMolecular DimensionsMD12-503B
IPTG, Dioxaan-VrijPromegaV3953
EDTA Vrije Protease Inhibitor CocktailSigma-Aldrich4693159001
NatriumchlorideCaledon Laboratory Chemicals7560-1-80
Magnesiumchloride hexahydraatSigma-AldrichM2670
Tris Buffer, 1 M pH7.5KD MedicalRGF-3340
GlycerolInvitrogen15514-029
beta-mercaptoethanolSigmaM6250
1M Imidazool, pH 8.0TeknovaI6980-06
Talon Affinity ResinClonetech635503
Amicon Ultra 15 mL Centrifugal Filter (MWCO 10K)MilliporeUFC901024
HiLoad 16/600 Superdex 200 Prep Grade Gel FiltratiekolomGE-Healthcare28989335
TEV ProteaseBereidt door NIEHS Protein Expression CoreExpressieplasmide verstrekt door NCI (Tropea et al. Methods Mol Biology, 2009)
4-15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein GelsBioRad456-8056
Kristallisatie, Proteolytische Screening
Crystal ScreenHampton ResearchHR2-110
Crystal Screen 2Hampton ResearchHR2-112
Salt RxHampton ResearchHR2-136
Index ScreenHampton ResearchHR2-144
PEG/Ion ScreenHampton ResearchHR2-139
JCSG+Molecular DimensionsMD1-37
Wizard Precipitant SynergyMolecular DimensionsMD15-PS-T
Swissci 96-well 3-druppel UVP sitting drop platenTTP Labtech4150-05823
3inch Breed Crystal Clear Sealing TapeHampton ResearchHR4-506
Proti-Ace KitHampton ResearchHR2-429
PEG 1500Molecular DimensionsMD2-100-6
PEG 400Molecular DimensionsMD2-100-3
HEPES/natriumhydroxide pH 7.5Molecular DimensionsMD2-011-
Natriumcitraat tribasicMolecular DimensionsMD2-100-127
22 mm x 0.22 mm Siliconized CoverslidesHampton ResearchHR3-231
24 Well Plates met afdichting (VDX Plate met Sealant)Hampton ResearchHR3-172
18 mM Gemonteerde Nylon Loops (0.05 mm tot 0.5 mM)Hampton ResearchHR4-945, HR4-947, HR4-970, HR4-971
Seed Bead KitHampton ResearchHR2-320
Magnetische Crystal CapsHampton ResearchHR4-779
Magnetische Cryo WandHampton ResearchHR4-729
Cryogene Foam DewarHampton ResearchHR4-673
Crystal Puck SystemMiTeGenM-CP-111-021
Full Skirt 96 well Clear PlateVWR10011-228
AxyMat Sealing MatVWR10011-130
Apparatuur
UVEX-mJAN Scientific, Inc.
Nanodrop Lite SpectrophotometerThermo-Fisher
Mosquito RobotTTP Labtech
Software/Websites
HKL2000Otwinoski en Minor, 1997
PhenixAdams et al., 2010
CootEmsley et al., 2010
ATSASPetoukhov et al., 2012https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/
ScatterRambo en Tainer, 2013
PymolThe PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8 Schrödinger, LLC.
BUNCHPetoukhov en Svergun, 2005
CRYSOLSvergun et al, 1995
PRIMUSKonarev et al, 2003
EOMTria et al, 2015

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thomson, E., Ferreira-Cerca, S., Hurt, E. Eukaryotic ribosome biogenesis at a glance. J Cell Sci. 126 (Pt 21), 4815-4821 (2013).
  2. Woolford, J. L. Jr, Baserga, S. J. Ribosome biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 195 (3), 643-681 (2013).
  3. Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. A Puzzle of Life: Crafting Ribosomal Subunits. Trends Biochem Sci. , (2017).
  4. Tomecki, R., Sikorski, P. J., Zakrzewska-Placzek, M. Comparison of preribosomal RNA processing pathways in yeast, plant and human cells - focus on coordinated action of endo- and exoribonucleases. FEBS Lett. , (2017).
  5. Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. Driving ribosome assembly. Biochim Biophys Acta. 1803 (6), 673-683 (2010).
  6. Kressler, D., Roser, D., Pertschy, B., Hurt, E. The AAA ATPase Rix7 powers progression of ribosome biogenesis by stripping Nsa1 from pre-60S particles. J Cell Biol. 181 (6), 935-944 (2008).
  7. Hiraishi, N., Ishida, Y., Nagahama, M. AAA-ATPase NVL2 acts on MTR4-exosome complex to dissociate the nucleolar protein WDR74. Biochem Biophy Res Co. 467 (3), 534-540 (2015).
  8. Maserati, M., et al. Wdr74 is required for blastocyst formation in the mouse. PLoS One. 6 (7), e22516(2011).
  9. Weinhold, N., Jacobsen, A., Schultz, N., Sander, C., Lee, W. Genome-wide analysis of noncoding regulatory mutations in cancer. Nat Genet. 46 (11), 1160-1165 (2014).
  10. Lo, Y. H., Romes, E. M., Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. Structural Analysis Reveals Features of Ribosome Assembly Factor Nsa1/WDR74 Important for Localization and Interaction with Rix7/NVL2. Structure. 25 (5), 762-772 (2017).
  11. Lander, G. C., Saibil, H. R., Nogales, E. Go hybrid: EM, crystallography, and beyond. Curr Opin Struc Biol. 22 (5), 627-635 (2012).
  12. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Q Rev Biophys. 40 (3), 191-285 (2007).
  13. Jaskolski, M., Dauter, Z., Wlodawer, A. A brief history of macromolecular crystallography, illustrated by a family tree and its Nobel fruits. FEBS J. 281 (18), 3985-4009 (2014).
  14. Zheng, H., et al. X-ray crystallography over the past decade for novel drug discovery - where are we heading next? Expert Opin Drug Dis. 10 (9), 975-989 (2015).
  15. Kikhney, A. G., Svergun, D. I. A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins. FEBS Lett. 589 (19 Pt A), 2570-2577 (2015).
  16. Bernado, P., Mylonas, E., Petoukhov, M. V., Blackledge, M., Svergun, D. I. Structural characterization of flexible proteins using small-angle X-ray scattering. J Am Chem Soc. 129 (17), 5656-5664 (2007).
  17. Sheffield, P., Garrard, S., Derewenda, Z. Overcoming expression and purification problems of RhoGDI using a family of "parallel" expression vectors. Protein Expres Purif. 15 (1), 34-39 (1999).
  18. Doublie, S. Preparation of selenomethionyl proteins for phase determination. Methods Enzymol. 276, 523-530 (1997).
  19. Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods Mol Biol. 498, 297-307 (2009).
  20. Wlodawer, A., Minor, W., Dauter, Z., Jaskolski, M. Protein crystallography for aspiring crystallographers or how to avoid pitfalls and traps in macromolecular structure determination. FEBS J. 280 (22), 5705-5736 (2013).
  21. Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Macromolecular Crystallography, Pt A. 276, 307-326 (1997).
  22. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D. 66 (Pt 2), 213-221 (2010).
  23. Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallogr D. 67 (Pt 4), 235-242 (2011).
  24. Terwilliger, T. C., et al. Decision-making in structure solution using Bayesian estimates of map quality: the PHENIX AutoSol wizard. Acta Crystallographica Section D. 65, 582-601 (2009).
  25. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallogr D. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  26. Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallogr D. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
  27. McCoy, A. J. Solving structures of protein complexes by molecular replacement with Phaser. Acta Crystallogr D. 63 (Pt 1), 32-41 (2007).
  28. McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. J Appl Crystallogr. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).
  29. Dyer, K. N., et al. High-throughput SAXS for the characterization of biomolecules in solution: a practical approach. Methods Mol Biol. 1091, 245-258 (2014).
  30. Forster, S., Apostol, L., Bras, W. Scatter: software for the analysis of nano- and mesoscale small-angle scattering. J Appl Crystallogr. 43, 639-646 (2010).
  31. Petoukhov, M. V., et al. New developments in the ATSAS program package for small-angle scattering data analysis. J Appl Crystallogr. 45, 342-350 (2012).
  32. Konarev, P. V., Volkov, V. V., Sokolova, A. V., Koch, M. H. J., Svergun, D. I. PRIMUS: a Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis. J Appl Crystallogr. 36, 1277-1282 (2003).
  33. Svergun, D. I. Determination of the Regularization Parameter in Indirect-Transform Methods Using Perceptual Criteria. J Appl Crystallogr. 25, 495-503 (1992).
  34. Rambo, R. P., Tainer, J. A. Accurate assessment of mass, models and resolution by small-angle scattering. Nature. 496 (7446), 477-481 (2013).
  35. Petoukhov, M. V., Svergun, D. I. Global rigid body modeling of macromolecular complexes against small-angle scattering data. Biophys J. 89 (2), 1237-1250 (2005).
  36. Tria, G., Mertens, H. D., Kachala, M., Svergun, D. I. Advanced ensemble modelling of flexible macromolecules using X-ray solution scattering. IUCrJ. 2 (Pt 2), 207-217 (2015).
  37. Svergun, D., Barberato, C., Koch, M. H. J. CRYSOL - A program to evaluate x-ray solution scattering of biological macromolecules from atomic coordinates. J Appl Crystallogr. 28, 768-773 (1995).
  38. Schrödinger, LLC. The PyMOL Molecular Graphics System Version 1.8. , Available from: https://pymol.org (2015).
  39. Pelikan, M., Hura, G. L., Hammel, M. Structure and flexibility within proteins as identified through small angle X-ray scattering. Gen Physiol Biophys. 28 (2), 174-189 (2009).
  40. Deller, M. C., Kong, L., Rupp, B. Protein stability: a crystallographer's perspective. Acta Crystallogr F. 72 (Pt 2), 72-95 (2016).
  41. Hinsen, K. Structural flexibility in proteins: impact of the crystal environment. Bioinformatics. 24 (4), 521-528 (2008).
  42. Shtykova, E. V., et al. Structural analysis of influenza A virus matrix protein M1 and its self-assemblies at low pH. PLoS One. 8 (12), e82431(2013).
  43. Mallam, A. L., et al. Solution structures of DEAD-box RNA chaperones reveal conformational changes and nucleic acid tethering by a basic tail. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12254-12259 (2011).
  44. Papaleo, E., et al. The Role of Protein Loops and Linkers in Conformational Dynamics and Allostery. Chem Rev. 116 (11), 6391-6423 (2016).
  45. Rozycki, B., Boura, E. Large, dynamic, multi-protein complexes: a challenge for structural biology. J Phys Condens Matter. 26 (46), 463103(2014).
  46. Schlundt, A., Tants, J. N., Sattler, M. Integrated structural biology to unravel molecular mechanisms of protein-RNA recognition. Methods. 118, 119-136 (2017).
  47. Thompson, M. K., Ehlinger, A. C., Chazin, W. J. Analysis of Functional Dynamics of Modular Multidomain Proteins by SAXS and NMR. Methods Enzymol. 592, 49-76 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

EiwitzuiveringSAXS data analyseribosoomassemblagefactorNsa1 eiwithybride structurele modelleringrigid body modelleringab initio modelleringproteolytische screening

Gerelateerde artikelen