Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Microprobe capillaire elektroforese massaspectrometrie voor eencellige metabolomica in Live kikker (Xenopus laevis) embryo 's

20.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56956

⸱

22 december 2017

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, George Washington University, 2Department of Anatomy & Regenerative Biology, George Washington University, 3Department of Chemistry & Biochemistry, University of Maryland, College Park

In dit artikel

Samenvatting

We worden stappen beschreven waarmee snel in situ bemonstering van een klein gedeelte van een afzonderlijke cel met hoge precisie en minimale invasie met behulp van capillaire gebaseerde micro-sampling, ter vergemakkelijking van chemische karakterisering van een momentopname van de metabole activiteit in levende embryo's met behulp van een custom-built eencellige capillaire elektroforese en massaspectrometrie platform.

Samenvatting

De kwantificering van kleine molecules in afzonderlijke cellen werpt nieuwe mogelijkheden om beter inzicht te krijgen in de fundamentele processen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van het embryo. Inschakelen eencellige onderzoeken rechtstreeks in levende embryo's, nieuwe analytische benaderingen nodig zijn, met name die gevoelige, selectieve kwantitatieve, robuust en schaalbaar naar de andere cel maten. Hier presenteren we een protocol waarmee de in situ -analyse van het metabolisme in afzonderlijke cellen in vrij ontwikkeling van embryo's van de Zuid-Afrikaanse klauwkikker kikker (Xenopus laevis), een krachtig model in cel en ontwikkelingsbiologie. Deze aanpak gebruikt een capillaire microprobe om een bepaald gedeelte uit één geïdentificeerde cellen in het embryo, verlaten naburige cellen intact voor latere analyse gecombineerd. De verzamelde celinhoud wordt geanalyseerd door een microscale capillaire elektroforese electrospray ionisatie (CE-ESI) interface gekoppeld aan een massaspectrometer high-resolution tandem. Deze aanpak is schaalbaar tot verschillende groottes van de cel en compatibel met de complexe driedimensionale structuur van het zich ontwikkelende embryo. Als voorbeeld tonen we dat microprobe die eencellige CE-ESI-MS in staat de opheldering van metabolische cel heterogeniteit dat zich ontvouwt stelt als een progenitor cel aanleiding tot nakomelingen tijdens de ontwikkeling van het embryo geeft. Naast cel en ontwikkelingsbiologie zijn de protocollen van de analyse van de eencellige hier beschreven vatbaar voor andere cel formaat, celtypes of diermodellen.

Inleiding

Een grondig inzicht in de embryonale ontwikkeling vereist karakterisering van alle moleculaire veranderingen die in elke cel van het ontwikkelende organisme ontvouwen. Next-Generation Sequencing met moleculaire versterking maakt diepe meting van eencellige transcriptomes1 in ontwikkelende systemen2,3, aanzienlijk minder is bekend over de suite van kleinere moleculen geproduceerd in één embryonale cellen, met inbegrip van eiwitten en, vooral, metabolieten (moleculaire massa < ~ 1.500 Da). Met een snelle en dynamische respons op intrinsieke en extrinsieke gebeurtenissen fungeert de metabolome als een krachtige descriptor van moleculaire staat van een cel. De eencellige metabolome, roept daarom de mogelijkheden voor het bijhouden van de ruimtelijke en temporele ontwikkeling van cel heterogeniteit in de vroege embryo en identificeren van nieuwe moleculen voor functionele studies. Echter zonder moleculaire amplificatie beschikbaar voor deze moleculen vraagt detectie van de metabolome om uitzonderlijke gevoeligheid met behulp van spectrometrie van de massa (MS), die is de technologie van de keuze voor metaboliet analyse.

Eencellige MS is een verzameling van technologieën met voldoende gevoeligheid voor het meten van metabolieten in afzonderlijke cellen (Zie beoordelingen 4,5,6,7,8,9 ,10,11,12,13,14,15). Reproduceerbaar bemonstering van cellen en efficiënte winning van metabolieten zijn essentieel voor de succesvolle opsporing van metabolieten in afzonderlijke cellen. Geheel-cel dissectie van geïdentificeerde cellen uit Xenopus embryo's heeft de karakterisatie van kleine moleculen en peptiden16ingeschakeld. Andere benaderingen hanteren micropipetten om te proeven van de individuele levende cellen gevolgd door detectie met behulp van electrospray ionisatie (ESI) MS. Bijvoorbeeld, de metabolieten in plant of zoogdiercellen werden gemeten door eencellige video MS17, druk sonde18, één sonde19en fluidic kracht microscopie20, onder andere technieken21, 22,23,24. Bovendien vereenvoudigt de opneming van chemische scheiding vóór ionisatie in de eencellige MS workflow efficiënt de metabolome, dus het verlichten van eventuele storingen tijdens ion generatie voor detectie. Bovenal biedt scheiding ook verbinding-specifieke informatie om te helpen in de moleculaire identificaties. Capillaire elektroforese (CE) is gebruikt voor het detecteren van metabolieten in één ontleed25,26 of microsampled27neuronen, vastleggen van kleine-molecuul verschillen tussen neuron fenotypen. We onlangs aangepast CE aan ESI tandem MS het traceringsniveau detectie van honderden metabolieten in afzonderlijke cellen die werden ontleed van vroege embryo's van Xenopus laevis16,28inschakelen. Deze studies bleek verrassend metabole verschillen tussen embryocellen in een vroeg stadium van ontwikkeling en leidde tot de ontdekking van metabolieten met eerder onbekende developmental effecten16.

Wij bieden hier een protocol dat de detectie van metabolieten in afzonderlijke cellen rechtstreeks in een levende gewervelde embryo met behulp van microprobe eencellige CE-ESI-MS29,30ingeschakeld. De model-organisme gekozen is de 8-tot-32-cel X. laevis embryo, hoewel de aanpak ook voor de latere stadia van ontwikkeling en andere soorten modelorganismen geldt. Dit protocol maakt gebruik van aangescherpte haarvaten met multi-as vertalende controle onder begeleiding door een high-resolution imaging systeem naar een ~ 10 nL gedeelte van geïdentificeerde cellen in situ in het morfologisch complexe zich ontwikkelende embryo gecombineerd. Deze microprobe is schaalbaar naar kleinere cellen en opereert binnen seconden, dat is voldoende snel om bij te houden van de cel geslachten in het embryo. Na uitpakken polar of apolaire kleine molecules, zoals metabolieten en peptides, uit de verzamelde monster in ~ 4-5 µL extractievloeistof, een ~ 10 nL van de resulterende uittreksel wordt geanalyseerd in een op maat gemaakte CE-platform naar een massaspectrometer ESI afgebroken. Bouw en de exploitatie van het CE-ESI-multiple sclerose platform is gebaseerd op protocollen elders beschreven. 31 , 32 de co-axiale CE-ESI-interface wordt geconstrueerd zoals elders beschreven. 31 dit platform wordt onderhouden in het regime kegel-jet sproeien om het traceringsniveau gevoeligheid met een capaciteit voor kwantificering over een 4-5 log-volgorde dynamisch bereik (relatieve28,29,30 of absolute16). Het CE-ESI-MS platform biedt een 60-amol ondergrens voor detectie met 8% relatieve standaardafwijking (RSD) in kwantificatie over een geteste bereik van 10 nM tot 1 µM voor kleine molecules16, die toereikend zijn om te karakteriseren van endogene metabolieten in X. laevis cellen. Microprobed cellen blijven verdelen gaandeweg de embryo via ontwikkeling30, waardoor stoffelijk als ruimtelijk opgelost analyse van cellulaire metabolisme. Inderdaad, eencellige CE-ESI-MS kan worden gebruikt voor het vinden van metabole verschillen tussen cellen die de dorsal-ventrale16,29, dier-plantaardige16, links-rechts28 developmental assen alsmede cellen in beslag nemen die vormen het zenuwweefsel gedoemd dorsale afstamming van een gemeenschappelijk progenitor cel in X. laevis30. Naast het opvragen van metabole verschillen tussen afzonderlijke embryonale cellen op verschillende ontwikkelingsstadia van de X. laevis embryo30, wij verwachten dat de protocollen die hier worden beschreven zijn van toepassing op een breed scala van biomoleculen en de microsampled van de afzonderlijke cellen uit verschillende stadia van embryonale ontwikkeling, alsmede andere soorten cellen en modelorganismen. Bovendien, kan de microprobe worden gebruikt voor microsampling, terwijl een ander platform compatibel met minuscule monsters kan worden gebruikt voor scheiding en/of karakterisering van biomoleculen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle protocollen met betrekking tot het onderhoud en de behandeling van Xenopus laevis werden goedgekeurd door het institutionele Animal Care en gebruik Comité aan de George Washington Universiteit (IACUC geen. A311).

1. voorbereiding van de bemonstering van de instrumenten, Media, oplosmiddelen en bemonstering van gerechten

  1. 1 x Steinberg's oplossing (SS) voor te bereiden door het oplossen van de volgende zouten in ultrazuiver water (~18.2 MΩ.cm bij 25 ° C) in de volgende volgorde en op de aangegeven concentraties na een standaard protocol33: natriumchloride (58.2 mM), kaliumchloride () 0,67 mM), calciumnitraat (0,34 mM), magnesiumsulfaat (0,83 mM), Tris-hydrochloride (4,19 mM) en Tris base (0,66 mM). 0,5 x SS door twee-voudige en 0.1 x SS door tienvoudige verdunning, van 1 x SS ultrazuiver water gebruiken.
  2. Bereidt gerechten, bemonstering door eerste maken 2% agarose in 1 x SS. autoclaaf bij 120 ° C gedurende 20 minuten te ontbinden. Terwijl nog steeds vloeibaar, jas onderin 60 mm petrischaaltjes met de oplossing. Zodra de agarose gel heeft afgekoeld en gestold, vlam het einde van een zes-inch Pasteur pipet totdat het vormt van een bal, en licht aanraken het verwarmde einde om het Impressum van 5-10 wells, ~ 1 mm diep, in de agarose.
    Opmerking: Deze putjes worden gebruikt voor het immobiliseren van de embryo's gedurende de bemonstering.
  3. Bereiden de metaboliet extractievloeistof. De fysisch-chemische eigenschappen van het oplosmiddel (b.v., polariteit en pH) aanpassen aan de klassen van moleculen die in de studie van belang zijn.
    Opmerking: bijvoorbeeld, we gebruiken 40% methanol en acetonitril van 40% in LC-MS grade water als een benadering van de ontdekking te richten voornamelijk polar metabolieten, en een paar apolaire metabolieten en peptiden28.
  4. Maak haar lussen met behulp van schone haren en een pipet van Pasteur zoals elders beschreven33 voor het zachtjes bewegen van embryo's in de petrischaaltjes met minimale verstoring.
  5. Fabriceren tapered-tip micropipetten zoals weergegeven in Figuur 1a.
    1. Eerst, trek borosilicaat haarvaten (1000/500 µm uiterlijke/innerlijke doorsnede) in een vlammend-Brown-type capillaire trekker met de volgende instellingen: warmte = 355; pull = 65, snelheid = 80; tijd = 150.
    2. Volgende, pauze-uit het topje van de getrokken micropipet met behulp van een paar mooie scherpe pincet te verkrijgen van een capillaire tip buitendiameter van ~ 20 µm. waarnemen zulks trede onder een stereomicroscoop om steun van de precisie en de reproduceerbaarheid.
      Opmerking: De haarvaten met een kleine tip zijn gevoelig voor verstopping tijdens aspiratie van de viskeuze cytoplasma. Terwijl de haarvaten met een grotere tip zeker helpen vermijden verstopping en meer van de cellulaire inhoud gecombineerd, kunnen groot-boring haarvaten uitdagingen tijdens de bemonstering van kleinere cellen en mogelijk schade toebrengen aan de cel voor latere bemonstering. Zorgvuldige aanpassing van de druk en het tijdstip van aspiratie kunnen gedeeltelijk deze uitdagingen te verlichten. Wij vinden micropipetten met ~ 20 µm buitendiameter ideaal voor het werk dat hier gepresenteerd.

2. Microsampling Single cellen en metaboliet extractie

  1. Verkrijgen van embryo's (bevruchte eieren) via gonadotropin-geïnduceerde natuurlijke paring van volwassen Xenopus laevis of via in vitro bevruchting zoals beschreven in protocollen elders33,34.
    Opmerking: Natuurlijke paring zorgt ervoor dat de embryonale ontwikkelingsstadia zijn gespreid terwijl embryo's verkregen door in vitro bevruchting betrouwbaarder in aanbod zijn. In vitro bevruchting vereist echter de volwassen mannelijke kikker offeren.
  2. Vers bereid 2% cysteïne dejellying oplossing door 4 g van cysteïne oplossend in 200 mL ultrazuiver water en ontkleuring pas de oplossing tot pH 8 met behulp van 10 N natriumhydroxide-oplossing.
  3. De gelei jassen rondom de embryo's als ze beginnen te klieven de fase 2-cel als volgt verwijderen: laat embryo's in de dejellying oplossing voor 2 min rusten, dan zachtjes swirl hen voor een extra 2 min om te voorkomen dat embryo's vast te houden aan het oppervlak van de collectie schotel.
  4. Giet voorzichtig schotel inhoud in een bekerglas van schoon en snel decanteren in de dejellying oplossing van het bekerglas. Onmiddellijk betrekking hebben op de eieren met 0,1 x SS te spoelen uit de resterende dejellying oplossing, zachtjes swirl en vervolgens decanteren in de oplossing. Herhaal deze stap vier keer naar de embryo's grondig te wassen.
    Opmerking: Maximaal Gasbedwelming met behulp van de embryo's de dejellying oplossing voor 4 min om levensvatbaarheid te verzekeren. Uitgebreide protocollen bij het verwijderen van de gelei jassen vindt u elders33.
  5. Pipetteer van dejellied embryo's in 1 x SS in een petrischaal. Plaatsen om te minimaliseren verdringing binnen de platen, ~ 100 embryo's per 100 mm schotel33.
    Opmerking: Gerechten met embryo's kunnen worden opgeslagen tussen 14-18 ° C tot ontwikkeling vertragen en embryo's bij gespreide ontwikkelingsstadia verkrijgen met de zelfde ouders. Verdere richtsnoeren inzake temperatuursafhankelijkheid van groei en ontwikkeling worden gepubliceerd op Xenbase en elders33,35,,36,,37.
  6. Soort splijten embryo's stadium 2-cel in een aparte schaal in welke stereotiepe pigmentatie vol vertrouwen markeert de dorsale-ventrale as, met betrekking tot de gevestigde cel lot kaarten38,39,40.
    1. Identificeren van de correct verbrijzelen embryo's door ervoor te zorgen dat de eerste splitsing furrow, die demarks het sagittale vlak, snijdt hoofdbundel de darkly (ventrale) en licht (dorsale) gepigmenteerde dier pole zodanig dat de twee helften spiegelbeelden41 zijn.
  7. Monteer een verzonnen micropipet op een multi-as micromanipulator (handmatig of op afstand bestuurde). De micropipet verbinden met een microinjector.
  8. Gebruik een pipet kunststof overdracht gecombineerd ~ 5 van de 8-cels embryo's en ze vervolgens overbrengen naar de bemonstering schotel met 0,5 x SS.
Met behulp van een haar lus, plaats het embryo te worden bemonsterd in een individuele put, en ervoor te zorgen dat de correct geïdentificeerde cel van belang wordt geconfronteerd met de microprobe op de hoek van een ~ 90°.
Opmerking: Identificeer de cellen op basis van pigmentatie en positie in het embryo, onder verwijzing naar de cel lot kaarten38,39,40.
  • Tijdens het werken onder de stereomicroscoop (bij 20-30 X vergroting), begeleiden u het uiteinde van de micropipet tot de geïdentificeerde enkele cel binnen de levende embryo als aangegeven in Figuur 1 (Zie monsternemingspunten op cellen in deelvenster B en het apparaat in deelvenster C).
  • Trekken een gewenste gedeelte van de inhoud van de cel door negatieve druk pulsen toe te passen op de microcapillary met behulp van de microinjector ('vulling-modus').
    Opmerking: bijvoorbeeld we regelmatig gecombineerd ~ 10-15 nL volume van de cel door toepassing van ~ 3 pulsen van-30 psi op het capillair. Deze hele stap duurt ~ 5 s voor aspiratie30.
  • Zachtjes trekken de microprobe uit de cel en breng de tip in 4 µL van het metaboliet extractievloeistof gekoeld (4 ° C) in een flesje van micro-formaat. Vervolgens passen de schommeling van een druk van + 80 psi voor 1 s tot het capillair met behulp van de microinjector ('duidelijk modus') tot uitzetting van de aspirate in het oplosmiddel.
    1. Strak sluit het flesje ter voorkoming van verdamping en de ampul plaats terug in de ijsemmer 4 ° C tot bemonstering voltooid is. Gooi de gebruikte micropipet slijpsel verpakkingsgasssen om te voorkomen dat een gevaar voor besmetting.
      Opmerking: Om te bepalen het volume van de inhoud van de cel van de aanzuiging, injecteren de aspirate in minerale olie, waar zij een bolvorm verkrijgt. De diameter van deze bol kan worden gemeten met behulp van een microscoop. De aanzuiging volume berekenen: V = 4/3 π r3, V = het volume, waarbij r de straal van de bol is.
  • Als u wilt genieten van dezelfde cel opnieuw of andere cellen van het embryo, herhaal stap 2.7-2.11 (Figuur 1 c). Om te voorkomen dat potentiële carry over tussen opeenvolgende proeverijen, een verse micropipet voor de analyse van elke andere cel te gebruiken.
  • Zodra de bemonstering wordt voltooid, vortex-mix de monster-bevattende microcentrifuge flesjes voor ~ 1 min naar versnellen winning van metabolieten en centrifugeer bij 8.000 × g gedurende 5 min bij 4 ° C tot pellet cellulaire puin en andere deeltjes.
  • Bewaar de cel extracten samen met de cel puin en geprecipiteerde materialen bij-20 ° C voor een dag of bij-80 ° C voor maximaal 1 maand tot meting door CE-ESI-MS.

    • 3. CE-ESI-MS meting

    1. Opstelling van normen en oplossingen voor CE-ESI-MS
      1. De achtergrond elektrolyt (BGE) bestaande uit mierenzuur van 1% in LC-MS rang water voor te bereiden.
      2. Bereid de oplossing van de schede te bevatten 50% methanol in LC-MS rang water en 0,1% mierenzuur.
      3. Bereid 50 nM acetylcholine-oplossing in de schede oplossing voor dagelijkse evaluatie van de prestaties van het systeem van de CE-ESI-MS.
      4. Bereid 150 mM natriumchloride-oplossing als massa-ijkstandaard voor de lage m/z -bereik in de positieve ion-modus. Een massa (m/z) nauwkeurigheid van < 10 ppm wordt aanbevolen. Volg de instructies van de leverancier van de massaspectrometer voor het uitvoeren van deze stap.
        Opmerking: Als alternatief, andere normen met bekende m/z -waarden kunnen worden gebruikt om massa-kalibreren de massaspectrometer.
    2. Bouw van het CE-ESI-Platform
      1. Construeer een CE-injectie platform staat van snelle verticale vertaling van een fase houdt de BGE flacon en het monster microvaatje laden. Voor de bouw en de exploitatie van het platform, verwijzen naar details in verwijzing31.
      2. Monteer als volgt de CE-ESI-interface (Figuur 1 c). Monteer de electrospray metalen emitter (130/260 µm inner/buitenste diameter en ~ 35 mm lengte) tot een 3-poort T-Unie. Feed de scheiding CE capillair (40/105 µm inner/buitenste diameter en ~ 100 cm lengte) via de emitter electrospray toestaand het om uitsteken ~ 40-100 µm buiten het puntje van de emitter. Werken onder een stereomicroscoop om steun van de nauwkeurigheid.
        1. De schede oplossing capillair (75/360 µm inner/buitenste diameter en ~ 100 cm lengte) verbinden met de resterende poort de electrospray oplossing leveren. Gebruik van juiste mouwen en draai de aansluitingen voor lekvrije werking van de CE-ESI-interface. Verwijzen naar eerdere protocollen31,32 voor meer informatie over de vergadering en trouble shooting van deze interface.
          Opmerking: Afmetingen van de capillaire gevolgen de signaal-ruisverhouding (S/N) en de duur van de scheiding. Bijvoorbeeld, vergemakkelijken smalle-boring en korte haarvaten snelle scheidingen met hogere scheiding spanningen42,43. Bovendien, afhankelijk van de soorten moleculen die van belang zijn in een studie, kunnen scheiding haarvaten worden bedekt om te beperken/voorkomen van ongewenste molecuul-capillair muur interacties44.
      3. Met behulp van een plaat-houder, mount de CE-ESI-interface op het podium van een vertaling van de drie assen en plaats de electrospray emitter tip ~ 2 mm vanaf de opening massaspectrometer (Figuur 1 c).
      4. Spoel schoon onderdelen van de interface, door het leveren van de oplossing van de schede electrospray door de emitter electrospray op 1 µL/min en de BGE door de capillaire CE-scheiding. Gebruik injectiespuit pompen te voeden de oplosmiddelen gestaag.
      5. Spoel het CE scheiding capillair vóór elke meting door een spuit te koppelen aan het einde van de capillaire inlaat. Gebruik voldoende grote spuiten om te hervullen en priming van oplosmiddelen aanvoerlijnen te minimaliseren.
        Opmerking: Experimenten gebruiken meestal 1 mL gasdichte spuiten het electrospray schede oplosmiddel en een 500 µL spuit voor het spoelen van het capillair scheiding te verstrekken.
    3. Validatie van CE-ESI-MS Platform en meting van metabolieten
      Opmerking: Het doel van deze stap is om te bevestigen de analytische gevoeligheid van het CE-ESI-MS instrument dagelijks voor het analyseren van eencellige extracten.
    Met behulp van het platform van de CE-ESI beschreven hier, we kunnen het bereiken van een ondergrens voor detectie op 60 amol met behulp van een vierpolige orthogonale-versnelling time-of-flight massaspectrometer16.
    1. Na het spoelen de scheiding capillaire voor ~ 5 min, breng de inlaat in de BGE oplossing ligt in een roestvrijstalen flesje.
    2. Plaats de electrospray emitter tip ~ 2 mm vanaf de opening massaspectrometer en deze afstand met behulp van een vertaling fase voor het genereren van electrospray in de stabiel regime van de kegel-jet observatie van de spray met een stereomicroscoop tijdens fine-aanpassen (Zie de referenties 31,45). Monitoring van de stabiliteit van de totale huidige ion (TIC) voor ~ 30-45 min voor een stabiele werking.
    3. Toepassen van ~ 20 kV tot de BGE flacon door geleidelijk speedramp up het potentieel meer dan ~ 15 s, meestal ~7.5 µA huidige genereren over het capillair van de scheiding met behulp van mierenzuur van 1% als de BGE. Voor iedere meting, zorgen voor stabiliteit van het systeem door het toezicht op het profiel van de TIC voor ~ 5-10 min en dan lager stapsgewijze het potentieel van de scheiding (CE) naar 0 V (grond).
      Opmerking: Semi-automatisch dit proces, we gebruiken een aangepaste-geschreven software op afstand bedienen de CE hoog voltage power supply31. Als het CE-ESI-multiple sclerose platform instabiel is, zorgvuldig evalueren van de bron van instabiliteit door het testen van het CE-ESI-multiple sclerose platform eerst in de modus alleen-ESI en vervolgens in de operationele modus van CE-ESI als aanbevolen elders31. Kort, om te testen het platform in de ESI-only modus, uitschakelen van de CE-hoogspanning en controleren van het TIC gedurende ~ 30 min. in het kegel-jet spuiten regime. Indien nodig, gaat u als volgt naar adres fouten: (i) inspecteren verbindingen op lekkage; (ii) het schoonmaken van de emitter electrospray met water, isopropanol en water, methanol; (iii) ambtshalve gas oplosmiddelen; (iv) het spoelen van de emitter voor ~ 25 min voordat de test nogmaals. Als het CE-ESI-platform is gevonden in de modus alleen-ESI stabiel maar onstabiel tijdens CE scheiding, inspecteren van het systeem voor Joule verwarming en/of elektrolyse: (i) het capillair scheiding met BGE voor ~ 25 min spoelen en herhaal het experiment; (ii) gebruik lagere scheiding potentieel om een lineaire respons ohms (dat wil zeggen, lineaire CE huidige vs. scheiding spanning kromme); (iii) het inspecteren van het capillair CE voor mogelijke schade, zoals scheuren, en vervang het capillair indien nodig.
    4. Analyseren van ~ 6 nL van het monster als volgt:
      1. Pipetteer 1 µL van de standaardoplossing van acetylcholine in de injectieflacon.
      2. Het capillair scheiding van de BGE flacon in de injectieflacon overbrengen.
      3. Lift de CE injectie fase 15 cm in 1s.
      4. Houden van de fase verhoogde voor 60 s tot de hydrodynamica injecteren ~ 6 nL van het monster in het capillair scheiding.
      5. Vervolgens vertalen het podium terug naar de start van de niveaus (in overeenstemming met de capillaire uitlaat).
      6. Voorzichtig verplaats ik de zinsnede capillaire inlaat in de BGE.
      7. Onmiddellijk na de oprit van de CE-spanning om te beginnen elektroforetische scheiding.
      8. Start MS data-acquisitie.
        Opmerking: Systeemprestaties kan worden gekarakteriseerd met behulp van elke chemische standaard. De eencellige CE-ESI-MS levert lagere detectiegrenzen op ~ 10 nM (~ 60 amol) voor acetylcholine, methionine en histidine16. Geïnjecteerd volume (Vinj), hangt in het capillair in nL, af het hoogteverschil (H, cm) tijdens de injectie, dichtheid (ρ, g cm-3) en viscositeit (η, kg m-1s-1) van de BGE, lengte (L en m) en de straal (r, µm) van de CE- capillaire en injectie duur (tinj, s). Deze relatie wordt uitgedrukt door de volgende formule, waar g (m s-2) de zwaartekrachtsversnelling is:
        figure-protocol-1
    5. Zodra de standaard is geconstateerd, stoppen van data-acquisitie, verlagen de scheiding spanning stapsgewijs naar 0 V (grond), dan de emitter tot 2 cm ophalen met de opening. Spoel het capillair scheiding voor 5 min voor het analyseren van het extract van de cel.
    6. Maatregel 10 nL van de eencellige extract door herhalende stappen 3.3.1-3.3.5 met behulp van 90 s tot de hydrodynamica injecteren het monster.
  • Verwerking van gegevens
    Opmerking: Het doel van de gegevensverwerking is het identificeren en kwantificeren van de verbindingen tussen afzonderlijke cellen. Het protocol van de CE-ESI-MS eencellige genereert smalle electropherographic pieken met typische base breedtes van een paar seconden. Door semi-handmatig uitvoeren van data-analyse, is het mogelijk om te vinden van moleculaire eigenschappen (unieke m/z -waarden met unieke migratie keer) met behulp van de volgende stappen uit. Representatieve scheiding wordt weergegeven voor select geïdentificeerde metabolieten in Figuur 2a.
    1. Massa-kalibreren ruwe databestanden post data-acquisitie.
      Opmerking: We gebruiken signalen van natrium formate clusters die worden gegenereerd tijdens de scheiding van overvloedige natrium-ionen uit de steekproef, die native aanwezig in de cellen of uitgepakte van de voedingsbodems embryo. Het doel van deze stap is te verhogen van metaboliet identificatie in latere stappen door verzekeren een hoge massa (m/z), bij voorkeur < 5 mDa, of < 10 ppm, tussen m/z 50-1, 000. Hier, post data acquisitie kalibratie maakt het mogelijk om routinematig massa nauwkeurigheden < 1 mDa, of < 2 ppm voor m/z 50-500.
    2. Met behulp van een script voor verwerking, doorzoeken voor moleculaire functies het gedetecteerde massa bereik. Gemiddelde massaspectra over elke piek te bepalen van de nauwkeurige massa, en hun overeenkomstige migratie tijden noteren. Voor de identificatie van low-mass metabolieten in de m/z 50-500-bereik, een 500 mDa stap venster te gebruiken om te controleren van moleculaire eigenschappen met S/N > 3.
    3. Integreer de piek gebied-onder-de-curve voor elke moleculaire functie handmatig of automatisch. De resultaatwaarden van de ruimte worden gebruikt als een maatregel van metaboliet overvloed.
    4. Identificeren van moleculaire kenmerken van belang met hoge vertrouwen als volgt (Zie Fig.
    • 2b).
    1. Eerst vergelijken de nauwkeurige massa van de moleculaire functies tegen een metaboliet database (b.v., Metlin46 en HMDB47) met 10 ppm nauwkeurigheid tot het verkrijgen van een lijst van vermeende massa wedstrijden.
    2. Vervolgens beoordelen deze massale wedstrijden door het vergelijken van hun massaspectrum van tandem, verkregen uit de cel extracten met gegevens beschikbaar in de databases van de metaboliet of de tandem massaspectrum gemeten voor de overeenkomstige chemische stof standaard.
    3. Laatst, valideren van deze toewijzingen door het vergelijken van de migratietijd van moleculaire kenmerken opgenomen in de cel extracten met verwante chemische normen door hetzelfde instrument CE-ESI-MS geanalyseerd.
      Opmerking: Om experimentele doorvoer te verbeteren, we meestal identificeren alleen moleculaire kenmerken die door statistisch significant tussen experimentele omstandigheden of celtypes verschillen. Representatieve identificaties zijn afgebeeld in Figuur 2. Ter identificatie van metabolieten met een hoge massa nauwkeurigheid, is het raadzaam extern kalibreren de massaspectrometer dagelijks, real-time herijking tijdens elke meting met behulp van een interne standaard en/of extern massa-kalibreren van elke meting uitvoeren bestand na data-acquisitie (bijvoorbeeldvoor natrium formate clusters hier) worden aanbevolen.
  • Om te vergelijken kleine-molecuul productie tussen afzonderlijke cellen, gebruiken piek gebied-onder-de-curve in geselecteerde ion electropherograms (uit stap 3.4.3) als relatieve maatregelen van samengestelde overvloed.
    Opmerking: In onze experimenten, online software platformen47 werden gebruikt voor het uitvoeren van alle stappen van latere data-analyse, met inbegrip van de volgende stappen uit: ik) filteren van moleculaire eigenschappen met optreden in ten minste 50% van elke steekproef-set (bijv., cel type); II) normalisering van de gegevens; III) statistische (b.v., t-testen) en multivariate data-analyse, zoals de belangrijkste componenten analyse (PCA) en hiërarchische cluster-analyse (HCA). We gebruiken p < 0,05 (Student t-test) mark statistische significantie en vouw-verandering ≥ 1,5 tot de opmerking van de biologische betekenis.
  • Om te bepalen van de absolute concentratie van een klein molecuul in één cel, uitvoering van klassieke methoden voor kalibratie (bijvoorbeeld, externe kalibratie of standaard toevoeging) met behulp van de piek gebied-onder-de-bocht van de samengestelde rente16.

    • Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

    Resultaten

    Wij dienst onlangs microprobe eencellige CE-ESI-MS te karakteriseren van metabolieten in afzonderlijke geïdentificeerde cellen in vrij ontwikkelen Xenopus laevis embryo's29,30. De microprobe maakt snel (~ 5 sec/cel), in situ aspiratie van ~ 10 nL van een afzonderlijke cel, meerdere aspiraties van dezelfde cel of meerdere andere cellen binnen de dezelfde of latere stadia van ontwikkeling van de levende embryo (

    Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

    Discussie

    Microprobe CE-ESI-MS in staat stelt de directe karakterisering van metabolieten in afzonderlijke cellen in levend, vrij ontwikkeling van embryo's. De kern van de aanpak zijn twee technische onderdelen, namelijk in situ capillaire microsampling en hoog-gevoeligheids CE-ESI-MS. vergeleken met geheel-cel dissectie, capillaire microsampling heeft het voordeel van snelle werking (enkele seconden vs. 5 min / cel door dissectie), compatibiliteit met de complexe driedimensionale morfologie van embryo's en schaalbaarheid...

    Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

    Openbaarmakingen

    De auteurs hebben niets te onthullen.

    Dankbetuigingen

    Dit werk werd gesteund door de nationale instituten van gezondheid-subsidies GM114854 (tot P.N.) en CA211635 (tot P.N.), Arnold en Mabel Beckman Stichting Beckman Young Investigator toekennen (P.N.), de DuPont jonge Professor award (naar P.N.), de American Society for massa Spectrometrie Research Award (tot P.N.), en de Stichting van de Club van de kosmos-beurzen (aan R.M.O. en E.P.P.). De adviezen en conclusies in deze publicatie uitgedrukt zijn uitsluitend die van de auteurs en vertegenwoordigen niet noodzakelijk de officiële standpunten van de financieringsbronnen.

    Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

    Materialen

    Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
    NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
    Reagents voor embryocultuurmedia
    KaliumchlorideFisher ScientificBP 366-1
    MagnesiumsulfaatFisher ScientificM 65-3
    CalciumnitraatSigma AldrichC1396
    CysteïneMP Biomedicals101444
    TrizmahydrochlorideSigma AldrichT3253
    TrizmabaseSigma AldrichT1503
    NatriumchlorideFisher Scientific5641-212
    NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
    Metabolietenextractieoplosmiddelen
    Acetonitril (LC-MS-kwaliteit)Fisher ScientificA955
    Methanol (LC-MS-kwaliteit)Fisher ScientificA456
    Water (LC-MS-kwaliteit)Fisher ScientificW6
    NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
    Oplosmiddelen en normen voor CE-ESI-MS
    Mierenzuur (LC-MS-kwaliteit)Fisher ScientificA11710X1-AMP
    Methanol (LC-MS-kwaliteit)Fisher ScientificA456-4
    Water (LC-MS-kwaliteit)Fisher ScientificW6
    NatriumchlorideFisher Scientific5641-212
    AcetylcholinechlorideAcros Organics159170050
    NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
    Microprobefabricage-opstelling
    MicropijpjestrekkerSutter Instrument Co.P-1000
    Borosilicate capillairenSutter Instrument Co.B100-50-10
    Fijne scherpe pincetten: Dumont #5, Biologie/DumoxelFine Science Tools (USA) Inc11252-30Corrosiebestendig en autoklaveerbaar.
    NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
    Microprobemonsternemingsopstelling
    MicromanipulatorEppendorf, Hauppauge, NYTransferMan 4r
    StereomicroscoopNikonSMZ18Moet vibratiegeïsoleerd zijn.
    Verlichter b.v. GoosenecksNikonC-FLED2
    MicroinjectorWarner Instrument, Handem, CTPLI-100A
    Transferpipetten (Kunststof, wegwerp)Fisher Scientific13-711-7M
    Petrischaal 60 mm en 80 mmFisher ScientificS08184
    Glazen Pasteurpipetten (Borosilicaat, wegwerp)Fisher Scientific13-678-20A
    CentrifugeThermo ScientificSorvall Legend X1R
    NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
    CE-ESI-MS-opstelling
    HoogspanningsvoedingSpellmanCZE1000RDe HVPS kan op afstand worden bestuurd met behulp van een laagspanningsprogramma dat wordt gegenereerd door een personal computer. Let op: Hoge spanning vormt een elektrische schokgevaren; alle verbindingsonderdelen moeten worden geaard of zorgvuldig worden afgeschermd om te voorkomen dat gebruikers per ongeluk worden blootgesteld.
    Spuitpompen (2)Harvard Apparatus704506
    StereomicroscoopAmscopeSM-3BZZStereomicroscoop die geschikt is voor 4,5× vergroting, uitgerust met een verlichter om de spuitmodus van de CE-ESI-interface te controleren.
    XYZ-translatietafelThorlabsPT3
    XYZ-translatietafelOp maat gemaaktDeze platform is in staat om nanoliter-hoeveelheden monster via hydrodynamische injectie in de scheidingskapillaren te laden en het BGE voor CE te leveren. Beide interfaces die in dit werk worden beschreven, waren in staat om 6–10 nL monster binnen 1 min in een 1 m scheidingskapillaren te injecteren
    Roestvrijstalen monstervialOp maat gemaakt
    Roestvrijstalen BGE-vialOp maat gemaakt
    Gefusieerd silicakapillaren (40 µm/105 µm ID/OD; 100 cm)Polymicro technologieënTSP040105
    Gefusieerd silicakapillaren (75 µm/360 µm ID/OD; 100 cm)Polymicro technologieënTSP075375
    Roestvrijstalen emitter met stompe punten (130/260 µm ID/OD)Hamilton Co.21031AVoor betere prestaties, laser-cleave en polijst de emittertip fijn.
    Spuiten (gasdicht): 500 - 1000 µLHamilton Co.1750TTL
    Digitaal multimeterFlukeFluke 117
    Hoge resolutie massaspectrometerBruker DaltonicsMaxis Impact HDHoge resolutie tandemmassaspectrometer uitgerust met een atmosferische drukinterface die is geconfigureerd voor ESI
    Afvuringsmix voor massaspectrometerkalibratieAgilent technologiesESI-L G1969-85000
    Data Analysis ver. 4.3 softwareBruker Daltonics
    NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
    Aanvullend materiaal
    Vacuumconcentrator die geschikt is voor gebruik bij 4–10°C

    Referenties

    1. Tang, F. C., Lao, K. Q., Surani, M. A. Development and applications of single-cell transcriptome analysis. Nat. Methods. 8 (4), S6-S11 (2011).
    2. Veselovska, L., et al. Deep sequencing and de novo assembly of the mouse oocyte transcriptome define the contribution of transcription to the DNA methylation landscape. Genome Biol. 16 (209), (2015).
    3. Tran, D. A., Bai, A. Y., Singh, P., Wu, X. W., Szabo, P. E. Characterization of the imprinting signature of mouse embryo fibroblasts by RNA deep sequencing. Nucleic Acids Res. 42 (3), 1772-1783 (2014).
    4. Wang, D. J., Bodovitz, S. Single cell analysis: the new frontier in 'omics'. Trends Biotechnol. 28 (6), 281-290 (2010).
    5. Svatos, A. Single-cell metabolomics comes of age: new developments in mass spectrometry profiling and imaging. Anal. Chem. 83 (13), 5037-5044 (2011).
    6. Rubakhin, S. S., Romanova, E. V., Nemes, P., Sweedler, J. V. Profiling metabolites and peptides in single cells. Nat. Methods. 8 (4), S20-S29 (2011).
    7. Bodenmiller, B., et al. Multiplexed mass cytometry profiling of cellular states perturbed by small-molecule regulators. Nat. Biotechnol. 30 (9), 858-889 (2012).
    8. Rubakhin, S. S., Lanni, E. J., Sweedler, J. V. Progress toward single cell metabolomics. Curr. Opin. Biotechnol. 24 (1), 95-104 (2013).
    9. Kleparnik, K., Foret, F. Recent advances in the development of single cell analysis: A review. Anal. Chim. Acta. 800, 12-21 (2013).
    10. Zenobi, R. Single-cell metabolomics: Analytical and biological perspectives. Science. 342 (6163), 1243259(2013).
    11. Gholipour, Y., Erra-Balsells, R., Nonami, H. In situ pressure probe sampling and UV-MALDI MS for profiling metabolites in living single cells. Mass Spectrom (Tokyo). 1 (1), A0003(2012).
    12. Comi, T. J., Do, T. D., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Categorizing cells on the basis of their chemical profiles: progress in single-cell mass spectrometry. J. Am. Chem. Soc. 139 (11), 3920-3929 (2017).
    13. Lombard-Banek, C., Portero, E. P., Onjiko, R. M., Nemes, P. New-generation mass spectrometry expands the toolbox of cell and developmental biology. Genesis. 55, e23012(2017).
    14. Yang, Y. Y., et al. Single-cell analysis by ambient mass spectrometry. Trac-Trends Anal. Chem. 90, 14-26 (2017).
    15. Lanni, E. J., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging and profiling of single cells. J. Proteomics. 75 (16), 5036-5051 (2012).
    16. Onjiko, R. M., Moody, S. A., Nemes, P. Single-cell mass spectrometry reveals small molecules that affect cell fates in the 16-cell embryo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (21), 6545-6550 (2015).
    17. Mizuno, H., Tsuyama, N., Harada, T., Masujima, T. Live single-cell video-mass spectrometry for cellular and subcellular molecular detection and cell classification. J. Mass Spectrom. 43 (12), 1692-1700 (2008).
    18. Nakashima, T., et al. Single-cell metabolite profiling of stalk and glandular cells of intact trichomes with internal electrode capillary pressure probe electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Chem. 88 (6), 3049-3057 (2016).
    19. Pan, N., et al. The single-probe: A miniaturized multifunctional device for single cell mass spectrometry analysis. Anal. Chem. 86 (19), 9376-9380 (2014).
    20. Guillaume-Gentil, O., et al. Single-cell mass spectrometry of metabolites extracted from live cells by fluidic force microscopy. Anal. Chem. 89 (9), 5017-5023 (2017).
    21. Saha-Shah, A., Green, C. M., Abraham, D. H., Baker, L. A. Segmented flow sampling with push-pull theta pipettes. Analyst. 141 (6), 1958-1965 (2016).
    22. Hu, J., et al. Synchronized polarization induced electrospray: Comprehensively profiling biomolecules in single cells by combining both positive-ion and negative-ion mass spectra. Anal. Chem. 88 (14), 7245-7251 (2016).
    23. Zhang, L. W., Vertes, A. Energy charge, redox state, and metabolite turnover in single human hepatocytes revealed by capillary microsampling mass spectrometry. Anal. Chem. 87 (20), 10397-10405 (2015).
    24. Zhang, L. W., et al. In Situ metabolic analysis of single plant cells by capillary microsampling and electrospray ionization mass spectrometry with ion mobility separation. Analyst. 139 (20), 5079-5085 (2014).
    25. Lapainis, T., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Capillary electrophoresis with electrospray ionization mass spectrometric detection for single-cell metabolomics. Anal. Chem. 81 (14), 5858-5864 (2009).
    26. Nemes, P., Knolhoff, A. M., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Metabolic differentiation of neuronal phenotypes by single-cell capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Chem. 83 (17), 6810-6817 (2011).
    27. Aerts, J. T., et al. Patch clamp electrophysiology and capillary electrophoresis mass spectrometry metabolomics for single cell characterization. Anal. Chem. 86 (6), 3203-3208 (2014).
    28. Onjiko, R. M., Morris, S. E., Moody, S. A., Nemes, P. Single-cell mass spectrometry with multi-solvent extraction identifies metabolic differences between left and right blastomeres in the 8-cell frog (Xenopus) embryo. Analyst. 141 (12), 3648-3656 (2016).
    29. Onjiko, R. M., Plotnick, D. O., Moody, S. A., Nemes, P. Metabolic comparison of dorsal versus ventral cells directly in the live 8-cell frog embryo by microprobe single-cell CE-ESI-MS. Anal. Methods. , (2017).
    30. Onjiko, R. M., Portero, E. P., Moody, S. A., Nemes, P. In situ microprobe single-cell capillary electrophoresis mass spectrometry: Metabolic reorganization in single differentiating cells in the live vertebrate (Xenopus laevis) embryo. Anal. Chem. 89, 7069-7076 (2017).
    31. Nemes, P., Rubakhin, S. S., Aerts, J. T., Sweedler, J. V. Qualitative and quantitative metabolomic investigation of single neurons by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Nat. Protoc. 8 (4), 783-799 (2013).
    32. Knolhoff, A. M., Nemes, P., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Methodologies for Metabolomics. Wevers, R., Lutz, N., Sweedler, J. V. , 119-139 (2013).
    33. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
    34. Moody, S. A. Cell lineage analysis in Xenopus embryos. Methods Mol Biol. 135, 331-347 (2000).
    35. Bowes, J. B., et al. Xenbase: a Xenopus biology and genomics resource. Nucleic Acids Res. 36, D761-D767 (2008).
    36. Karpinka, J. B., et al. Xenbase, the Xenopus model organism database; new virtualized system, data types and genomes. Nucleic Acids Res. 43 (D1), D756-D763 (2015).
    37. James-Zorn, C., et al. Xenbase: expansion and updates of the Xenopus model organism database. Nucleic Acids Res. 41 (D1), D865-D870 (2013).
    38. Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 16-cell stage Xenopus embryo. Dev. Biol. 119 (2), 560-578 (1987).
    39. Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo. Dev. Biol. 122 (2), 300-319 (1987).
    40. Dale, L., Slack, J. M. W. Fate map for the 32-cell stage of Xenopus laevis. Development. 99 (4), 527-551 (1987).
    41. Klein, S. L. The first cleavage furrow demarcates the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos. Dev. Biol. 120 (1), 299-304 (1987).
    42. Rollman, C. M., Moini, M. Ultrafast capillary electrophoresis/mass spectrometry of controlled substances with optical isomer separation in about a minute. Rapid Commun. Mass Spectrom. 30 (18), 2070-2076 (2016).
    43. Moini, M., Martinez, B. Ultrafast capillary electrophoresis/mass spectrometry with adjustable porous tip for a rapid analysis of protein digest in about a minute. Rapid Commun. Mass Spectrom. 28 (3), 305-310 (2014).
    44. Huhn, C., Ramautar, R., Wuhrer, M., Somsen, G. W. Relevance and use of capillary coatings in capillary electrophoresis-mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem. 396 (1), 297-314 (2010).
    45. Nemes, P., Marginean, I., Vertes, A. Spraying mode effect on droplet formation and ion chemistry in electrosprays. Anal. Chem. 79 (8), 3105-3116 (2007).
    46. Zhu, Z. J., et al. Liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry characterization of metabolites guided by the METLIN database. Nat. Protoc. 8 (3), 451-460 (2013).
    47. Wishart, D. S., et al. HMDB 3.0 The Human Metabolome Database in 2013. Nucleic Acids Res. 41 (D1), D801-D807 (2013).
    48. Liu, J. X., Aerts, J. T., Rubakhin, S. S., Zhang, X. X., Sweedler, J. V. Analysis of endogenous nucleotides by single cell capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analyst. 139 (22), 5835-5842 (2014).
    49. Hubrecht, L., Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin). A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , North-Holland Pub. Co. (1967).
    50. Grant, P. A., Herold, M. B., Moody, S. A. Blastomere explants to test for cell fate commitment during embryonic development. J. Vis. Exp. (71), (2013).
    51. Sellick, C. A., Hansen, R., Stephens, G. M., Goodacre, R., Dickson, A. J. Metabolite extraction from suspension-cultured mammalian cells for global metabolite profiling. Nat. Protoc. 6 (8), 1241-1249 (2011).

    Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

    Herprints en machtigingen

    Trefwoorden

    In situ microsamplingextractiemiddel voor metabolietenelectrospray ionisatie interfacehoge resolutie tandem massaspectrometrieprincipale componentenanalysemetabole celheterogeniteit
    Microprobe capillaire elektroforese massaspectrometrie voor eencellige metabolomica in Live kikker (Xenopus laevis) embryo 's
    Neem contact met ons op
    Aanbevelen aan bibliotheek

    Privacy

    Gebruiksvoorwaarden

    Beleid

    Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.