Methodenartikel

Geautomatiseerde meting van Cryptococcal soorten Polysaccharide Capsule en cel lichaam

7.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56957

⸱

11 januari 2018

 , 
1Department of Molecular Microbiology and Immunology, Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health

In dit artikel

Samenvatting

Deze techniek wordt beschreven van een geautomatiseerde batch-beeldprocessor, bedoeld voor het meten van de polysacharide capsule en lichaam stralen. Hoewel oorspronkelijk ontworpen voor Cryptococcus neoformans capsule metingen die de geautomatiseerde image processor kan ook worden toegepast op andere gebaseerd contrastdetectie van cirkelvormige objecten.

Samenvatting

Het doel van deze techniek is om te zorgen voor een consistente, nauwkeurige en beheersbaar proces voor grote aantallen polysaccharide capsule metingen.

Ten eerste, een drempel afbeelding is gegenereerd op basis van intensiteitswaarden uniek berekend voor elke afbeelding. Vervolgens worden cirkels gedetecteerd op basis van contrast tussen het object en de achtergrond met behulp van de gevestigde cirkel Hough transformatie (CHT) algoritme. Tot slot de gedetecteerde cel capsules en organen worden vergeleken volgens center coördinaten en RADIUS-grootte en gegevens worden geëxporteerd naar de gebruiker in een beheersbare werkblad.

De voordelen van deze techniek zijn eenvoudige maar belangrijke. Eerste, omdat deze berekeningen worden uitgevoerd door een algoritme in plaats van een mens zowel de nauwkeurigheid en de betrouwbaarheid zijn verhoogd. Er is geen achteruitgang in de nauwkeurigheid of betrouwbaarheid ongeacht hoeveel monsters worden geanalyseerd. Ten tweede, deze aanpak stelt een potentiële standaard gebruiksprocedure voor het Cryptococcus veld in plaats van de huidige situatie waar capsule meting per lab verschilt. Ten derde, gezien het feit dat handmatige metingen van de capsule zacht en monotoon, automatisering kunt snelle metingen op grote aantallen van gistcellen die op zijn beurt vergemakkelijkt hoge doorvoer data-analyse en steeds krachtiger statistieken.

De belangrijkste beperkingen van deze techniek vandaan hoe het algoritme-functies. Ten eerste zal het algoritme alleen genereren cirkels. Hoewel Cryptococcus cellen en hun capsules over een circulaire morfologie nemen, zou het moeilijk om deze techniek van toepassing op niet-cirkelvormige object detectie. Ten tweede, als gevolg van hoe cirkels worden gedetecteerd de CHT-algoritme kan detecteren enorme pseudo-cirkels op basis van de buitenste randen van verschillende geclusterde cirkels. Echter kan een verdraaid cel organen gevangen binnen de pseudo-cirkel gemakkelijk worden gedetecteerd en verwijderd uit het resulterende gegevenssets.

Deze techniek is bedoeld voor het meten van de circulaire polysaccharide capsules van Cryptococcus soorten op basis van de Oost-Indische inkt helder veld microscopie; Hoewel het kan worden toegepast op andere contrast gebaseerd circulaire object metingen.

Inleiding

Cryptococcus neoformans is een pathogene gist overal gevonden over de hele wereld dat is gekoppeld aan ziekten bij de mens vooral in immunosuppressie populaties. C. neoformans is vooral goed voor een beduidende oorzaak is van de totale jaarlijkse sterfgevallen in sub-Saharisch Afrika als gevolg van besmettelijke ziekte1. De belangrijke klinische manifestatie van cryptococcal infectie is meningo, die invasie van het centrale zenuwstelsel door vervoer in besmette macrophages (Trojaans paard wijze volgt) of directe overschrijding van de bloed - hersenbarrière. C. neoformans spreekt verschillende virulentiefactoren waaronder de mogelijkheid om te repliceren op menselijke lichaamstemperatuur, ureaseactiviteit, melanization en vorming van een polysaccharide capsule2. De polysaccharide capsule bestaat uit herhalende glucuronoxylomannan en glucoronoxylomannangalactan polymeren en functies als een beschermende barrière tegen factoren, zoals milieudruk en host immuunrespons op2.

Hoewel de grootte van de cryptococcal polysaccharide capsule grootte niet consequent gekoppeld aan de virulentie heeft, is er bewijs dat er een factor in de pathogenese2,3,4,5, 6,7. Capsule grootte is gekoppeld aan meningitis pathologie6, kan invloed uitoefenen op macrophage Cryptococcus infectie5controle, en kan resulteren in verlies van virulentie als afwezig8. Vandaar, capsule grootte metingen zijn gebruikelijk in cryptococcal onderzoek, maar er bestaat geen fieldwide standaard voor een methode voor de meting van de capsule.

Momenteel, C. neoformans polysaccharide capsule waardering is gebaseerd op handmatige metingen van microscopie beelden, en de exacte methoden van zowel de afbeelding als de meting acquisities variëren tussen laboratoria9,10, 11. Een directe zorg aan deze methode is dat sommige studies vereisen de verwerving van duizenden afzonderlijke metingen, waardoor handhaving nauwkeurigheid en betrouwbaarheid moeilijk. Bovendien, zelfs wanneer de resultaten worden gepubliceerd, er is vaak onvoldoende beschrijving van de meetmethode. Vele publicaties niet uitleggen hoe hun metingen werden verkregen, wat brandvlak werd gebruikt, hoe zij vastbesloten de drempel voor de identificatie van de capsule, of ze gebruikt RADIUS- of diameter, of ze een meting gebruikt of gemiddeld aantal, of andere Details. Sommige publicaties alleen staat hun methode als welk programma is gebruikt, bijvoorbeeld "Adobe Photoshop CS3 werd gebruikt voor het meten van de cellen"11. Dit gebrek aan standaardisatie en rapportage van detail kan maken reproduceerbaarheid moeilijk zo niet onmogelijk. Verschillen in menselijk gezichtsvermogen, computer helderheid, Microscoop instellingen, schuif de verlichting, en andere factoren kunnen variëren niet alleen tussen individuen, maar ook tussen de monsters, overwegende dat de berekeningen op basis van ratio's van pixelwaarden intensiteit constant zal blijven en toepassing tussen de monsters. Deze techniek werd gemaakt in het kader van het verstrekken van een gestandaardiseerde, nauwkeurige, snelle en eenvoudige techniek voor het meten van capsules maten voor een veld waarin er geen vóór was.

Zoals eerder vermeld, de CHT-algoritme is reeds lang gevestigde, en scripts automatisch detecteert cirkels zijn geschreven vóór. Deze methode verbetert in twee gebieden waar andere scripts zou tekortkomen. Eerst, simpelweg het opsporen van cirkels is niet genoeg, omdat met cryptococcal cellen twee verschillende cirkels ten opzichte van elkaar moeten worden gedetecteerd. Deze methode specifiek detecteert cel organen binnen capsules, discrimineert tussen de twee, en berekeningen alleen op de relevante instantie-capsule paren. Ten tweede, zelfs wanneer na de hetzelfde protocol, de verschillende onderzoekers zullen eindigen met verschillende verworven beelden. Doordat de onderzoeker controle over elk algoritme-parameter, kan deze tool worden aangepast aan een breed scala van overname methoden. Er is geen behoefte aan een gestandaardiseerde toepassingsgebied, doelstelling, filter, enzovoort.

Deze techniek kan gemakkelijk worden toegepast op elke situatie waarin de onderzoeker moet detecteren cirkels binnen een afbeelding die contrast met hun achtergrond. Beide cirkels lichter en donkerder dan hun achtergrond kan worden opgespoord, geteld en gemeten met behulp van deze techniek.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. voorbereiding van de Oost-Indische inkt dia

  1. Pipetteer 10 µL van cryptococcal monster in een dia verschijnt. Een circulaire giststam zal werken maar voor dit experiment H99 was de enige spanning gebruikt.
    Opmerking: Als het monster rechtstreeks van de voedingsbodems is, verdunnen 1:2 met PBS of water kan helpen voorkomen dat de Oost-Indische inkt uit clumping.
  2. Pipetteer 2 µL van de Oost-Indische inktvlek op het monster en meng door fysiek duwen van het uiteinde van de pipet om het monster en in een cirkelmotie te verplaatsen totdat de Oost-Indische inkt gelijkmatig verdeelde verschijnt.
  3. Breng een dekglaasje aan over het monster door ingedrukt te houden de linker rand van het dekglaasje aan tegen het oppervlak van de dia, vervolgens voorzichtig en gelijkmatig verlagen de overkant van het dekglaasje aan over het monster.
  4. Laat de dia in de lucht droog voor 5 min.
  5. Zachtjes toepassen een licht laagje nagellak op dekglaasje aan rand om een zegel vormen en de Oost-Indische inktvlek te behouden.

2. imaging dia

  1. Dia's in een heldere veld microscoop met een camera gehechtheid en bekende pixel-naar-micron conversie plaats. Filters, doelstellingen, en het contrast aanpassen zodat de cel capsules zijn duidelijk en cel organen zijn gericht, donkere banden.
    Opmerking: Diverse filters, doelstellingen en contrast instellingen werkt maar een 20 x doelstelling, Ph1 filter en 2 x 2 weggooien wordt aanbevolen.
  2. Zorg ervoor dat het gezichtsveld is dicht maar niet overbevolkte met cryptococcal cellen, met duidelijk contrast tussen cel capsule en achtergrond, en goed gericht met het lichaam van de cel als een donkere band gevisualiseerd.
    Opmerking: Het exacte aantal cellen voor een optimale afbeelding zal variëren afhankelijk van het monster en de doelstelling wordt gebruikt. De belangrijke aspecten zijn om cellen zijn geen gegroepeerde of overlappende, dat de cel focal vliegtuigen niet aanzienlijk variëren, en dat er belangrijke Oost-Indische inkt vlek duidelijk zichtbaar op de achtergrond (ten minste 25% van het veld).
  3. Afbeeldingen opslaan naar een enkele directory met duidelijke titels, zoals het algoritme van de meting zal worden uitgevoerd op afbeeldingen in één map en de outputgegevens zal worden georganiseerd volgens de namen van de afbeeldingsbestanden opslaat.

3. algoritme Setup

  1. Installeren van Python versie 2.7 van
  2. Extra python bibliotheken installeren door het uitvoeren van de commando's "pip install kussen" en "pip install openpyxl".
  3. MATLAB installeren door het volgen van de instructies op
  4. Bouw de MATLAB python bibliotheek door het volgen van de instructies op https://www.mathworks.com/help/matlab/matlab_external/install-the-matlab-engine-for-python.html.
  5. Downloaden van de drie vereiste bestanden opgenomen in dit manuscript aanvullende materialen ("QCA.py", "Analysis2.m" en "TestRun.m").
    Opmerking: Deze bestanden kunnen worden uitgepakt naar een willekeurige locatie, maar alle drie moeten in dezelfde map.

4. gebruik van het algoritme

  1. De toepassing laten uitvoeren door dubbel te klikken op QCA.py.
    Opmerking: De toepassing kan enige tijd duren om te beginnen. Het "QCA.py"-bestand bevat de programmastructuur die de ".m"-bestanden roept voor het uitvoeren van de werkelijke algoritme.
  2. Volg de stappen in het programma.
    1. Het uitbreidingstype van de afbeeldingsbestanden opslaat voorafgegaan door een punt en gescheiden door puntkomma's (ex. ". TIF;. JPEG") dan klik op de Enter -knop.
    2. Kies de map waarin de afbeeldingsbestanden bevinden zich door op de knop Map selecteren te klikken en te selecteren de map die de afbeeldingen bevat.
    3. Genereer de lijst met afbeeldingsbestanden in de map door te klikken op de knop Genereren Image List . De beelden worden weergegeven in het tekstvak naar rechts. Herziening en zorgen voor dat de lijst is nauwkeurig en volledig.
    4. Selecteer een willekeurige afbeelding in de lijst om te gebruiken als een voorbeeld door te klikken op de knop Willekeurige afbeelding selecteren .
      Opmerking: Als de afbeelding niet kunt openen vanwege een "onjuist beeld modus fout", het algoritme functioneert nog steeds goed ondanks de afbeelding niet weergegeven. Na stap 4.2.7, zal nog steeds de testafbeelding weergeven.
    5. Invoer-Microscoop objectieve en weggooien van instellingen. Als de standaardinstellingen niet overeenkomen met de Microscoop gebruikt, selecteert u "Custom Pixel Conversion" en input van de pixel-naar-um-conversie voor de afbeeldingsbestanden. Zodra geselecteerd, klik op de knop Berekenen conversie en zorgen dat de conversie klopt volgens het tekstvak aan de rechterkant.
      Opmerking: Representatieve beelden getoond in Figuur 1 zijn berekend met 40 x vergroting en 2 x 2 weggooien geselecteerd.
    6. Input parameters van de algoritme voor de detectie van de cirkel.
      1. Ingang van de minimale en maximale straal aantoonbaar voor de buitenste capsule detectie als de Min en Max Capsule RADIUS-posten. Een kleiner bereik zal toestaan meer nauwkeurige resultaten.
      2. Ingang van de minimale en maximale straal aantoonbaar voor de detectie van de cel lichaam als de Min en Max cel lichaam RADIUS-posten.
        Opmerking: Alle vier van deze vermeldingen moet getallen vertegenwoordigen hun respectieve waarden in pixels, volgens de bronafbeeldingen.
      3. Verplaats de schuifregelaars van de Capsule en de gevoeligheid van de cel lichaam aan te passen van de drempel van de gevoeligheid van het algoritme. Een lage gevoeligheid zullen strikte en valse positieve cirkel detectie verminderen, maar ook minder echte kringen kan detecteren. Omgekeerd, een hoge gevoeligheid de opsporingstarief zal toenemen maar kan ook leiden tot valse positieve cirkels.
        Opmerking: Representatieve resultaten werden bekomen met een capsule minimumboogstraal van 7, de capsule maximumstraal van 45, de minimale lichaam straal van 4, de maximale lichaam straal van 30, de capsule gevoeligheid van 87 en lichaam gevoeligheid van 87.
    7. Test de parameters op de willekeurig geselecteerde afbeelding door te klikken op de knop Test starten . De resultaten worden weergegeven in het bovenste midden van het programma, ter vervanging van de oorspronkelijke afbeelding. Als de resultaten nauwkeurig kijken, is het raadzaam om een extra willekeurige afbeelding om eveneens te proberen om dat de geselecteerde parameters past alle geselecteerde afbeeldingen te selecteren.
      1. Maximaliseren van het aantal organen en capsules gedetecteerd en of de cirkels lijken te passen correct visueel te inspecteren. Het aantal organen binnen capsules gedetecteerd zal worden weergegeven in het tekstvak naar rechts. Anders, het manipuleren van de algoritme parameters totdat de resultaten kloppen.
        Opmerking: De dikke gekleurde cirkels zijn slechts om te helpen met visualisatie. De werkelijke cirkels gegenereerd voor meting is een wiskundige curve berekend door de HCT-algoritme.
    8. De detectie algoritme op de gehele Active directory van beeld-bestanden door te klikken op de knop Beginnen analyse uitvoeren Elk beeld zal worden geanalyseerd en het programma verschijnt "klaar" in het tekstvak naar rechts als alle beelden hebben geanalyseerd.
    9. Klik op de knop Match en opruimen . Dit zal overeenkomen met gedetecteerde cel organen aan de gedetecteerde capsules, die zij wonen in en de ware capsule straal berekenen door lichaam van capsule af te trekken.
      Opmerking: Als het algoritme wordt gebruikt voor het detecteren van fluorescentie of een andere situatie waarin slechts één cirkel is ontdekt deze stap niet nodig. In plaats daarvan klikt u op de Alleen trekken organen of de knop Alleen trekken Capsules voor het verzamelen van de gegevens voor alleen de blauwe of alleen de groene cirkels, respectievelijk. Het is belangrijk op te merken dat als alleen de capsule gegevens opgehaald de straal naar de totale straal van de cel verwijzen zal als de straal van de cel lichaam kon niet worden afgetrokken.
    10. Zoek de ingevulde gegevens in het bestand "CleanedOuput.csv" in de image map. Als slechts één gegevenseenheid werd geselecteerd, zal het bestand "CleanedBodies.csv" of "CleanedCapsules.csv" worden aangeduid.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Beelden worden eerst verkregen door microscopie van Oost-Indische inkt dia's met behulp van een heldere veld Microscoop in combinatie met een camera(Figuur 1). Het is belangrijk dat cellen gescheiden en in voldoende lage dichtheid niet te overweldigen de gezichtsveld, alsmede over voldoende vlek kunt maken van contrast tussen cellen en achtergrond. Zoals in het protocol, zal het exacte aantal cellen voor een optimale afbeelding variëren afhan...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De kritische fasen van deze techniek zijn voorbereiding van de Oost-Indische inkt dia en de Microscoop afbeeldingen ophalen. Terwijl het algoritme met succes met een verscheidenheid van dia en beeld technieken getest is wordt het aanbevolen protocol beschreven in dit manuscript. De polysaccharide capsule wordt gedetecteerd op basis van de uitsluiting van de Oost-Indische inkt deeltjes uit het domein van de capsule zoals deze deeltjes zijn te groot om door te dringen de polysacharide fibril netwerk. Oost-Indische inkt uit...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen conflicten van belang om te vermelden.

Dankbetuigingen

Wij willen erkennen Anthony Bowen waarvan dia's werden gebruikt als een tweede menselijke side-by-side vergelijking evenals Sabrina Nolan waarvan dia's werden gebruikt als een derde menselijke side-by-side en de tweede vergelijking van de Microscoop.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
India InkBecton, Dickinson and Co.261194
Fisherbrand Superfrost Microscope SlidesFisher Scientific12-550-14325x75x1
Fisherfinest Premium Cover GlassFisher Scientific12-548-B22x22-1
Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear NagellakSally HansenN/A109 onzichtbaar
SAB MediaSigmaS3306
Cryptotoccus neoformansATCC208821H99 stam
Olympus AX70 MicroscoopOlympusAX70TRFNiet meer verkrijgbaar; Helderveld Microscoop
Qimaging Retiga 1300QimagingN/ANiet meer verkrijgbaar; Camera Microscoop-aansluiting
MATLABMathWorksN/AMeest recente versie aanbevolen
Python programmeertaalPythonN/AVersie 2 noodzakelijk; 2.7 aanbevolen
Microsoft ExcelMicrosoftN/AMeest recente versie aanbevolen
Fosfaatbufferoplossing (PBS)SigmaP3813

Referenties

  1. Park, B. J., Wannemuehler, K. A., Marston, B. J., Govender, N., Pappas, P. G., Chiller, T. M. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS. AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).
  2. Kwon-Chung, K. J., et al. Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii, the etiologic agents of cryptococcosis. Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (7), 019760(2014).
  3. Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide. J Clin Invest. 76 (2), 508(1985).
  4. Rumbaugh, J., Pool, A., Gainey, L., Forrester, K., Wu, Y. The Role of Cryptococcal Capsule in Pathogenesis of Cryptococcal Meningitis. Neurology. 80 (7), Supplement (P04.007) 007(2013).
  5. Bojarczuk, A., et al. Cryptococcus neoformans Intracellular Proliferation and Capsule Size Determines Early Macrophage Control of Infection. Sci Rep. 6, (2016).
  6. Robertson, E. J., et al. Cryptococcus neoformans Ex Vivo Capsule Size Is Associated With Intracranial Pressure and Host Immune Response in HIV-associated Cryptococcal Meningitis. J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).
  7. Araujo, G. deS., et al. Capsules from Pathogenic and Non-Pathogenic Cryptococcus spp. Manifest Significant Differences in Structure and Ability to Protect against Phagocytic Cells. PLoS One. 7 (1), 29561(2012).
  8. García-Rivera, J., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J., Casadevall, A. Cryptococcus neoformans CAP59 (or Cap59p) Is Involved in the Extracellular Trafficking of Capsular Glucuronoxylomannan. Eukaryot Cell. 3 (2), 385-392 (2004).
  9. Guimarães, A. J., Frases, S., Cordero, R. J. B., Nimrichter, L., Casadevall, A., Nosanchuk, J. D. Cryptococcus neoformans responds to mannitol by increasing capsule size in vitro and in vivo: Mannitol impacts the structure of C. neoformans capsule. Cell Microbiol. 12 (6), 740-753 (2010).
  10. Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. Induction of Capsule Growth in Cryptococcus neoformans by Mammalian Serum and CO2. Infect and Immun. 71 (11), 6155-6164 (2003).
  11. Rossi, S. A., et al. Impact of Resistance to Fluconazole on Virulence and Morphological Aspects of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii Isolates. Front Microbiol. 7, (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Meting van de cryptokokkenkapselgeautomatiseerde kapselanalyseCircle Hough transformatieIndia inktkleuringdetectie van het cellichaamanalyse van het polysacharidekapselveldmicroscopiedrempelwaardeinstelling van afbeeldingenmatching van kapsel en lichaamhigh throughputmeting

Gerelateerde artikelen