Methodenartikel

Real-time meting van epitheliale barrière permeabiliteit in menselijke intestinale Organoids

16.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56960

⸱

18 december 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine, Division of Gastroenterology, University of Michigan, 2Department of Cell and Developmental Biology, University of Michigan, 3Department of Internal Medicine, Division of Infectious Disease, University of Michigan

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de meting van epitheliale barrière permeabiliteit in real-time volgende farmacologische behandeling in menselijke intestinale organoids met behulp van fluorescentie microscopie en levende cel microscopie.

Samenvatting

Voorschotten in 3D cultuur van intestinale weefsels verkregen via biopsie of gegenereerd op basis van pluripotente stamcellen via gestuurde differentiatie, hebben geleid tot geavanceerde in vitro modellen van de intestinale mucosa. Gebruik te maken van deze opkomende modelsystemen vergt aanpassing van tools en technieken ontwikkeld voor 2D cultuur systemen en dieren. Hier beschrijven we een techniek voor het meten van epitheliale barrière permeabiliteit in menselijke intestinale organoids in real-time. Dit wordt bereikt door microinjection van fluorescently-geëtiketteerden dextran en beeldvorming op een omgekeerde Microscoop uitgerust met epifluorescerende filters. Real-time meting van de permeabiliteit van de barrière in de darm organoids vergemakkelijkt de generatie van high-resolution temporele gegevens in menselijke intestinale epitheelweefsel, hoewel deze techniek kan ook worden toegepast op vaste timepoint imaging benaderingen. Dit protocol is gemakkelijk aan te passen voor de meting van epitheliale barrière permeabiliteit na blootstelling aan farmacologische agenten, bacteriële producten of toxine of levende micro-organismen. Dit protocol kan ook dienen als een algemene inleiding over microinjection van intestinale organoids met kleine wijzigingen, en gebruikers kunnen ervoor kiezen te vullen dit protocol met aanvullende of alternatieve downstream toepassingen na microinjection.

Inleiding

Het intestinaal epitheel vormt een selectieve barrière die de directionele vervoer van voedingsstoffen, H2O ionen en afvalproducten bemiddelt terwijl het minimaliseren van de niet-specifieke diffusie-gemedieerde uitwisseling van andere deeltjes tussen de lumen en de mesenchymale weefsel of bloed levering1,2. De niet-specifieke permeabiliteit van de intestinale epitheliale barrière is lang beschouwd als een belangrijke functionele parameter in zowel de volksgezondheid als de ziekte3,4,5,6, waarin het tempo van de diffusie van kleine moleculen in het epithelium via de paracellular ruimte. Meting van de permeabiliteit van de epitheliale barrière kan worden uitgevoerd diermodellen7 en in menselijke patiënten8 tot en met de inname van lactulose, die heeft geen specifieke vervoerder in het maag-darmkanaal, en de daaropvolgende verzameling en meting van lactulose concentraties in het perifere bloed. Alternatieve geconsumeerde markers van barrièrefunctie zoals fluorescently geëtiketteerde koolhydraten zijn ook beschikbaar9,10. Deze benadering is aangepast voor intestinale epitheliale celculturen geteeld op Transwell ondersteunt11, een vereenvoudigde aanpak die zorgt voor meer experimentele controle, maar is ook bekritiseerd als een slechte voorspeller van in vivo permeabiliteit als gevolg van het ontbreken van gedifferentieerde epitheliale subtypen en weefsel structuur12. Met behulp van kamers vertegenwoordigen van nog een andere aanpak en laat voor de meting van epitheliale barrièrefunctie in hele intestinale mucosa ex vivo13. Toepassing van deze techniek is vaak beperkt door weefsel beschikbaarheid en voorwaarde13,14. Nieuwe methoden die balans reproduceerbaarheid en doorvoer met fysiologische relevantie zijn dus noodzakelijk.

Recente ontwikkelingen in in vitro organogenese hebben geleid tot de invoering van systemen voor 3D weefselkweek model als een geavanceerde platform voor Recapitulerend de dynamiek van complexe weefsels15,16,17 ,18,19,20,21,22,23. In het bijzonder de menselijke pluripotente stamcellen (hPSC) afgeleid menselijke intestinale organoids (Spa)19,24 naar voren zijn gekomen als een reproduceerbare en experimenteel hanteerbare modelsysteem voor de studie van host-microbiële interacties en epitheliale barrière dynamics25,26,27,28. Ook menselijke weefsel afkomstige organoids (ook bekend als enteroids) kan worden afgeleid uit een eenvoudige biopsie procedure en kan worden gebruikt als een hanteerbare systeem te bestuderen van de menselijke fysiologie en ziekte15,29,30. Microinjection van menselijke intestinale organoids voorziet in de levering van de experimentele samenstellingen25 of microben25,31,32,33 tot en met de apicale epitheliale live oppervlak van de organoid lumen. Leslie en Huang et al. 25 aangepast onlangs deze techniek voor het meten van de permeabiliteit van de barrière in Oberhof microinjected met fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) label dextran na blootstelling aan bacteriële toxines.

Dit protocol is bedoeld als een gids voor het meten van epitheliale barrière permeabiliteit in Oberhof hPSC afkomstige en weefsel afkomstige Oberhof met behulp van fluorescentie microscopie. Met kleine aanpassingen, kan het ook dienen als een algemene inleiding over microinjection van Oberhof met experimentele verbindingen. Gebruikers kunnen dit protocol met aanvullende of alternatieve downstream toepassingen na microinjection aanvullen.

Protocol

Normaal, de geïdentificeerde menselijke volwassen intestinale weefsel was overleden orgaandonoren via de Gift van het leven, de Michigan verkregen. Menselijke ES cel lijn H9 (NIH-register #0062) is afkomstig van de WiCell Research Institute. Alle menselijke weefsels, in dit werk gebruikt is verkregen uit niet-levende donoren, -werd geïdentificeerd en werd uitgevoerd met goedkeuring van de Universiteit van Michigan IRB (protocol # HUM00093465 en HUM00105750).

1. microinjector Setup

  1. Het verkrijgen van de genoemde Materialenintabel materialen.
  2. Plaats de micromanipulator, het ontleden bereik en lichtbron in het biosafety kabinet. Reinig de opstelling microinjection met 70% ethanol of andere ontsmettingsmiddel voorafgaand aan experimenteel gebruik. Vermijd langdurige blootstelling aan ontsmettingsmiddelen met bleekmiddel, die de apparatuur van microinjection kan corroderen.
    Opmerking: Een voorbeeld van een volledige microinjector vergadering wordt weergegeven in Figuur 1.
  3. Plaats het ontleden toepassingsgebied zodat het oog stuk kan via de toegangspoort in het schild worden gebruikt voor de bioveiligheid kabinet.
    1. Afwisselend, gebruiken een schone bankje met positieve lucht-stroomsysteem in plaats van een kabinet met Microscoop toegangspunten bioveiligheid.
  4. Monteren van de micromanipulator aan de rechterkant van de Microscoop volgens de instructies van de fabrikant en aanpassen, zodat de besturingselementen kunnen gemakkelijk worden bereikt en aangepast. De micromanipulator moet worden gemonteerd op een ijzeren plaat of anders gestabiliseerd.
    Opmerking: Linkshandige gebruikers kunnen wilt plaatsen van de micromanipulator aan de linkerkant van het ontleden toepassingsgebied.
  5. Monteren van de houder van de micropipet op de micromanipulator-arm en sluit de analoge buis door het invoegen van het in de micropipet houder.
  6. Vul de spuit van 10 mL glas met ongeveer 5-7 mL steriele minerale olie.
  7. Sluit de 10 mL glas spuit gevuld met minerale olie aan het open einde van de analoge buis met behulp van de Luer lock mechanisme. Plaats de injectiespuit glas aan de linkerkant van het ontleden toepassingsgebied, tegenover van de micromanipulator.
  8. Zachtjes drukken de spuit, minerale olie via de slang te duwen. Ongeveer 10 druppels van minerale olie spoelen van het uiteinde van de micropipet-houder en verzamelen in een petrischaal of soortgelijke vaartuig en negeren.
    Opmerking: Deze stap verwijdert alle lucht uit de slang en moet worden uitgevoerd voor elke sessie van microinjection.

2. voorbereiding van microinjection

  1. 24 h vóór microinjection:
    1. Bereid FITC dextran oplossing door opnieuw het opschorten van FITC dextran bij een concentratie van 2 mg/mL in steriel PBS of zoutoplossing. Bereiden van een totaal volume van > 250 µL.
      Opmerking: Hogere of lagere concentraties van FITC-dextran kunnen worden gebruikt, variërend van ongeveer 0.1 - 10 mg/mL. Aanpassen van de concentratie van FITC-dextran aan stroomafwaarts de imaging-toepassing.
    2. Setup organoid culturen op 4 - of 8-goed glas kamer dia's of andere cultuur schip geschikt voor live microscopie, met maximaal 4-6 Oberhof per putje, ingebed in 50 µL cell matrix oplossing en gekweekt in EGF, bekertje en R-Spondin (ENR) groeifactor media 19 ,24. Zorg voor gelijkmatig de organoids (ongeveer 5 mm uit elkaar) om te voorkomen dat meerdere Oberhof in één microscopische veld vastleggen tijdens real-time analyse van de beeldvorming. Zie McCraken et al. voor een complete gids voor HIO cultuur en onderhoud 24.
      Opmerking: Dit protocol werd ontwikkeld met behulp van stamcellen afgeleid Oberhof en de representatieve resultaten (zie hieronder) aan te tonen het gebruik van dit model weefselkweek. Hetzelfde protocol is echter gemakkelijk aangepast aan weefsel afkomstige intestinale epitheliale organoids15,29. Weefsel afkomstige Oberhof zijn meestal kleiner dan PVC afkomstige Oberhof en ontbreken de ondersteunende mesenchymale basolaterale cel structuur15,29,30. Microinjection van weefsel afkomstige Oberhof kan vereisen een grotere mate van technische bekwaamheid en ervaring. De mate waarop epitheliale barrière permeabiliteit gegevens verkregen met behulp van weefsel afkomstige Oberhof met hPSC afkomstige Oberhof correleren kunnen is onbekend.
    3. Incubeer Oberhof in een standaard cel cultuur incubator op 42 ° C en 5% CO2 vóór microinjection.
  2. 30 minuten vóór microinjection, zet het biosafety kabinet en verhogen het glazen schild aan de optimale werkhoogte.
  3. Verwijder alle overbodige items uit het biosafety kabinet. Rommel verhoogt het risico op morsen van vloeistoffen of andere ongevallen wanneer spaties werkt beperkt.
  4. Spray en grondig reinigen van de ondergrond met 70% ethanol of andere ontsmettingsmiddel. Veeg schoon met behulp van een papieren handdoek.
  5. Controleer het niveau van minerale olie in de glazen injectiespuit gekoppeld aan de microinjector. Als er minder dan 3 mL minerale olie resterende, schroef de spuit en vullen binnen de bioveiligheid kabinet, voorzichtig om te voorkomen dat de invoering van de bubbels. Vult niet meer dan 7 mL.
  6. Zet de lamp voor de verlichting van het ontleden toepassingsgebied. Aanpassen van het oculair voor persoonlijk comfort.
  7. Plaats de micromanipulator rechts van het ontleden toepassingsgebied. Beveilig de micromanipulator aan een ijzeren plaat een magnetische standaard gebruiken. Schakel de magnetische stand naar de OFF-positie om de positie van de micromanipulator aanpassen en veilig de stand aan de ijzeren plaat door de magnetische stand op de ON-positie.
  8. Microcapillary installatie
    1. Een enkel 1 mm glas gloeidraad ophalen uit de opslagcontainer geleverd door de fabrikant.
    2. Plaats de gloeidraad van glas door het midden van de spoel van de koperen verwarming van de trekker van de micropipet.
      Opmerking: Zie Figuur 2 voor een gids aan de voorbereiding van de trekker van de micropipet.
    3. Plaats de gloeidraad zodat de koperen verwarming spoel ongeveer in het midden van de gloeidraad van het glas is. Dit zal ervoor zorgen dat de trekker twee bruikbaar microinjection naalden van elk glas vezel genereert.
    4. Beveilig de glas gloeidraad met behulp van de klemmen door aanscherping van de top klem eerst, om ervoor te zorgen dat de gloeidraad van het glas binnen de ingekeepte grove om te voorkomen dat de breuk is beveiligd.
    5. De arm van de trekker de maximale verticale positie vóór de aanscherping van de klem van de onderkant uitbreiden
      Opmerking: Deze stap is essentieel. Niet volledig uit te breiden de trekker arm zal leiden tot onregelmatige scheiding van de twee secties van de gloeidraad van het glas.
    6. Controleer de instellingen op de verwarming en het trekken van mechanisme.
Selecteer serie #1 met de knevel (990) en stel van PULL op 059 (Figuur 2).
  • Inschakelen van het instrument met de On/Off knevel.
  • Sluit het beschermend plexiglas schild en druk op de PULL-knop op de onderkant recht gezicht van de trekker. De koperen spoel zal beginnen te verwarmen en zal helder oranje gloed. Als de temperatuur stijgt, zal de gloeidraad glas beginnen te rekken en uiteindelijk gescheiden. Bij scheiding van de twee uiteinden van de gloeidraad van het glas, zal het instrument uitgeschakeld.
    Opmerking: De koper spoel blijft extreem hete gedurende enkele minuten. De gloeidraad getrokken glas zal worden aangeduid als een 'microcapillary' vanaf dit punt naar voren in het protocol.
  • Voorzichtig raak de koperen spoel te verwijderen van een transactie van de glazen microcapillaries. De microcapillary moet een zeer fijne punt. Omgaan met de microcapillary zorgvuldig met latex of nitril handschoenen en onmiddellijk overgaan tot het kabinet van de bioveiligheid met het microinjector-setup.
    Opmerking: De glazen microcapillary is zeer scherp en zeer fragiel. Voorzichtig behandelen.
  • Los van de eindkap voor de micromanipulator-arm. Schuif het botte uiteinde van de getrokken microcapillary in het open uiteinde van de micropipet-houder en duw naar binnen totdat het stopt.
  • Beveilig het botte uiteinde van de microcapillary aan de micromanipulator tak door opnieuw de aanscherping van de eindkap.
    Opmerking: Bij het installeren van de microcapillary op het systeem van microinjection letten scherp uiteindelijk raak. Dit zal verminderen de kans op besmetting en behoud van de fijne punt voor microinjection. Niet correct teneinde de microcapillary kan leiden tot instabiliteit of breuk van de gloeidraad glas tijdens microinjection.
  • Open het puntje van het glas-microcapillary. Tijdens de voorbereiding van de microcapillary getrokken glas, zal het puntje van het punt waarschijnlijk smelten in een zodanige wijze dat de zegel van het puntige einde van de microcapillary. Deze blokkade te verwijderen:
    1. Plaats de micromanipulator zodanig dat de microcapillary naar beneden het glas stadium van het ontleden toepassingsgebied gericht is zonder het aanraken van dit oppervlak.
    2. Vind een steriele plastic oppervlak (de onderkant van een cultuur plaat deksel werkt perfect) en plaats deze in het werkgebied van de Microscoop direct onder de naald van de microcapillary op het podium van het ontleden toepassingsgebied.
    3. Centreren op het puntje van de microcapillary onder het weergavegebied en ervoor te zorgen dat het zichtbaar is wanneer het kijken door het oculair van de Microscoop onder 1.5 X vergroting.
    4. De micromanipulator gebruiken, langzaam verder de micromanipulator arm en microcapillary naar het steriele kunststof cultuur deksel totdat het puntje nauwelijks contact op met het plastic oppervlak en het uiteinde van de microcapillary gratis breekt.
      Opmerking: Streven naar de kleinste mogelijk pauze waarmee de vloeistofstromen van de gloeidraad van het glas om te minimaliseren van de schade aan de HIO tijdens microinjection.
    5. Terug de microcapillary uit de buurt van de steriele oppervlak om te minimaliseren van de kans op accidentele breuk voordat u verdergaat.
    6. Controleer de microcapillary voor stroom door het indrukken van de glazen injectiespuit, minerale olie via de slang te duwen. Als het einde van de microcapillary is geopend, ziet u een kleine druppel van minerale olie die voortkomen uit het topje van de microcapillary na een paar seconden. Als dit niet gebeurt, herhaalt u de vorige stap en opnieuw testen.

    • 3. de steriele Microinjection

    Opmerking: Zodra de microcapillary is opgesteld, geïnstalleerd en getest, beginnen microinjecting Oberhof. Figuur 3 toont een weefsel afkomstige HIO die met succes heeft ingespoten met FITC-dextran.

    1. Vul de microcapillary met het materiaal van de injectie. Het puntje van het glas-microcapillary in de FITC dextran injectie schorsing, voorzichtig om te voorkomen dat het breken van het topje van de microcapillary tegen de randen of de onderkant van de buis te dompelen. Zodra het topje van de microcapillary wordt ondergedompeld in de oplossing, trek terug op de minerale olie spuit te trekken ongeveer 10 µL van het FITC dextran schorsing in de microcapillary.
      Opmerking: Het wordt aanbevolen om te gebruiken van 1,5 mL of 0,5 mL tubes voor de injectie oplossingen/culturen, omdat deze de meest gemakkelijk toegankelijk is voor de geïnstalleerde microcapillary zullen. U kunt ook injectie oplossingen kunnen worden getrokken uit een steriele petrischaaltje of steriele parafilm, die de kans op slijpsel letsel verminderen kan door het beperken van de noodzaak om te houden van een buis in nabijheid van de microcapillary. Als de schorsing zeer viskeuze is of als de opening van de microcapillary uitzonderlijk klein is, duurt het enkele tweede te vullen van de microcapillary. Trek daar niet microinjection schorsingen in de kunststof microinjection buis als dit de hele microinjection systeem kan besmetten.
    2. Stoppen met invullen van de microcapillary wanneer de opschorting microinjection 90% van de lengte van de microcapillary van het glas vult. Druk de spuit iets vóór de intrekking van de microcapillary van de microinjection oplossing om ervoor te zorgen dat het topje van de microcapillary geen zakken van lucht bevat.
      Opmerking: Als het onderzoek van de microcapillary zakken van lucht blijkt, leeg en hervulling.
    3. Verwijder de HIO cultuur plate(s) uit de cel cultuur incubator en overdracht de bioveiligheid kast met de microinjector.
    4. Verwijder het deksel van de plaat HIO cultuur binnen het kabinet biosafety en centreer de eerste put in het werkgebied van de Microscoop zodat het duidelijk zichtbaar door het oculair van de scope op de laagste instelling voor tekstvergroting is.
    5. Draai de arm micromanipulator zodanig dat de microcapillary wordt gewezen naar beneden in de HIO cultuur goed onder een hoek > 45° ten opzichte van het werkgebied van de Microscoop. Dit wordt meest gemakkelijk bereikt door handmatig draaien van de vergadering van de arm van de micromanipulator op de horizontale as op het punt waar de horizontale micromanipulator arm steun aan de verticale stand, omdat de fijne besturingselementen (zwarte wijzerplaten) een beperkt bereik van hebben beweging. Plaats het uiteinde van de microcapillary boven de eerste cultuur goed op ongeveer 1 cm boven het oppervlak van de media (figuur 3A). Een representatieve afbeelding aantonen van microinjection van weefsel afkomstige intestinale epitheliale organoids wordt getoond in figuur 3B.
    6. Controleer of beide het uiteinde van de gloeidraad van het glas en de HIO(s) zijn zichtbaar door de ooglens. Plaats indien nodig.
    7. Verder de microcapillary langzaam door de bedieningsknop van de z-as te draaien.
      Noot: Te oordelen dat de positie van de microcapillary tip, vereist met name de diepte, praktijk. Als het puntje schending van het oppervlak van de media, merken een lichte visuele verstoring van de microcapillary-tip.
    Doorgaan met zorg vanaf dit punt om te voorkomen dat het breken van de microcapillary tegen de onderkant van de cultuur-plaat of beschadiging van de Oberhof.
  • Doorboren de HIO met het topje van de microcapillary. Het buitenoppervlak van de HIO zal iets drukken als het microcapillary begint toe te passen druk en verschijnt weer in vorm, zoals de tip de lumen doordringt. Het kan zijn moeilijk te identificeren van het topje van de microcapillary binnen de HIO lumen. Pas de instellingen van de verlichting of vergroting van het ontleden toepassingsgebied als er moeilijkheden zien van de microcapillary.
  • Handen uit de micromanipulator-besturingselementen verwijderen wanneer de microcapillary is juist met het topje van de microcapillary in de buurt van het centrum van de HIO gepositioneerd.
  • Druk de minerale olie spuit iets om aan te dringen de microinjection oplossing uit de microcapillary en in de HIO lumen. De HIO kan enigszins uitbreiden zodat het volume van de injectie.
    Nota: zorg om te voorkomen dat overdreven vullen de HIO als dit leiden de organoid tot zal te barsten. Als een vuistregel betekent geen zichtbare uitbreiding van het volume HIO het tijd om te stoppen. De gemiddelde omvang van de volwassen HIO lumen is ongeveer 1 µL, maar kan aanzienlijk variëren. Geautomatiseerd injectiespuit pompen kunnen worden gebruikt in plaats van een handmatige spuit om te zorgen voor fijne controle van het geïnjecteerde volume.
  • Trekken de microcapillary uit de HIO met behulp van het besturingselement van de z-as en de positie boven het oppervlak van de media.
  • Verplaatsen naar het volgende doel van HIO met de microcapillary die zijn gepositioneerd boven de media om te voorkomen dat per ongeluk schade aan de Oberhof tijdens het manoeuvreren en Injecteer op een vergelijkbare manier (zie stap 3.6-3.11).
    1. Het bijvullen van de microcapillary met behulp van de hierboven beschreven aanpak.
      Opmerking: Als de tip op elk gewenst moment tijdens de microinjection breekt, probeer niet te blijven injecties. Wijzig de tip volgens de onderstaande instructies.
  • Het wijzigen van de microcapillary tussen behandelingen of in geval van breuk. De klem op het einde van de micromanipulator arm los en verwijder de microcapillary uit de micropipet houder.
    Let op: De microcapillary in de buurt van de scherpe einde niet behandelen. De fijne punt van de microcapillary is uiterst scherp en zal gemakkelijk doorprikken handschoenen en huid. Wees voorzichtig en bewust zijn van alle bewegingen, behandeling van de microcapillary met behulp van de manipulator alleen en nooit plaatsen handen tussen het punt van de microcapillary en de HIO culturen. Het zoeken van medische behandeling onmiddellijk in geval van een naald stok uit een microcapillary met infectieuze agentia of toxinen.
    Opmerking: In sommige gevallen, het kan moeilijk zijn om te succesvol HIO microinjection visueel te bevestigen. De zichtbaarheid van duidelijke microinjection schorsingen kan worden verbeterd door gebruik van toevoeging van hogere concentraties van FITC-dextran.

    • 4. farmacologische behandeling van Oberhof

    1. Om te testen verbindingen geleverd aan de apicale epitheel, resuspendeer in steriele PBS met 2 mg/mL FITC-dextran en microinject in het lumen van de HIO zoals hierboven (punt 3). Resuspendeer Clostridium difficile toxine TcdA op 12,8 ng/µL in PBS met FITC-dextran voor de representatieve experiment.
    2. Om te testen verbindingen geleverd tot het basolaterale compartiment, vervangen door de externe voedingsbodems nieuwe medium met 2 mM ethyleen glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-Dinatriumethyleendiaminetetra azijnzuuroplossing (EGTA)(positive control), PBS voertuig alleen (negatieve controle ), of andere experimentele samengestelde na microinjection van FITC-dextran.
      Opmerking: Dosering en timing van de toepassing van farmacologische stoffen, toxines of andere agenten kunnen variëren naargelang de experimentele vraag.

    5. live Imaging van Microinjected Organoids

    1. Levende imaging onmiddellijk daaropvolgende microinjection beginnen. De cultuur platen overbrengen in een fluorescente microscoop uitgerust met een bevochtigde kamer onderhouden bij 37 ° C en 21% O2 en 5% CO2 met een geautomatiseerde levende cel imaging systeem. Sluit de milieu zaal en de imaging te starten.
    2. Lanceer de analysesoftware van de afbeelding (bijvoorbeeld softWoRx) van het bureaublad. Klik op "Bestand" en selecteer "Acquire (vastberadenheid 3D)" voor het initialiseren van de beeldvorming en de software van de controle van de Microscoop.
    3. Excitatie/emissie ingesteld op FITC (475 nm excitatie/523 nm emissie), stel het zendvermogen op 5%, en de lens met 4 X. Stel de belichtingstijd op 0,025 ms (figuur 4A).
      Opmerking: Belichtingstijd moet aanpassen aan de sterkte van het fluorescerende signaal worden gevarieerd. In het algemeen, zal alleen het FITC fluorescentie signaal afnemen. Daarom, om ervoor te zorgen maximale gevoeligheid, de eerste blootstelling tijden moeten worden aangepast zodat het opgenomen fluorescent signaal net onder het punt van de verzadiging van de camera en de beeldbewerkingssoftware is.
    4. Vind de Spa op 4 X vergroting met behulp van de digitale controller aangesloten op de Microscoop. Hiermee centreert u de HIO binnen het bekijken gebied (figuur 4A).
    5. Klik op "Weergave" op de werkbalk en selecteer "Point lijst" te onthullen van een nieuw venster. Klik op "Mark punt" voor het opslaan van de huidige positie van het werkgebied in de lijst van punt (figuur 4A).
    6. Herhaal de stappen 5.4 en 5.5 om de standpunten van alle Oberhof geconstateerd. Met behulp van een Kladblok of digitale record, noteer het unieke id-nummer toegewezen aan elke geprogrammeerde microscopie positie en de beelden op die positie. De afbeeldingsbestanden zal worden gelabeld met dit id-nummer en het zal belangrijk zijn te koppelen aan ID nummers van het beveiligingsvak specifieke spa en behandelingen na de gegevensverzameling is voltooid.
    7. Voor het opzetten van geautomatiseerde foto collectie, klik op "Bestand" en vervolgens "Experiment" op de werkbalk. De naam van het experiment met de datum of een andere unieke naam.
    8. Stel de parameters voor foto collectie door te gaan door middel van elk van de tabbladen van de optie zoals weergegeven in figuur 4B.
      1. Verwijder het vinkje "Z afdelen" onder het tabblad "Afdelen".
      2. Voer de parameters vanuit het venster boven links "kunt oplossen door 3D" onder het tabblad "Kanalen". Om tijd te besparen, wordt de eerste rij automatisch ingevuld wanneer het selectievakje aan de linkerkant in ingeschakeld.
      3. Onder het tabblad "time-laps", vinkt u het selectievakje aan bij "Time lapse" en voer het tijdsinterval tussen de afbeeldingen in de rij met het label "Time-laps" en de totale duur van het experiment in de rij met het label "Totale Time". De software zal automatisch het aantal tijdstippen berekenen.
      4. Onder het tabblad "Punten", vinkt u het selectievakje "Bezoek punt lijst".
    U kunt ook handmatig de specifieke point getallen moeten worden opgenomen in het experiment door te typen in het tekstvak invoeren.
  • Wijzig niet de standaardopties onder de tabs "Panelen" of "Acties".
  • Klik op de "Run" tab. Enter de datum van het experiment in het vak met het label "image file name" en stel de gegevens opslaan onder "Instellingen".
  • Klik op de groene pijl de experiment-macro wilt uitvoeren. De teller van het vervallen van een tijd zal de experimentele voortgang bijhouden.
  • Aan het einde van de geplande tijdsverloop, exporteren en opslaan van alle afbeeldingsbestanden als 24-bits RGB TIFF-afbeeldingen (figuur 4C).
    1. Selecteer op de werkbalk, proces, gevolgd door de bouwer van de taak.
    2. In het menu builder, toevoegen door te navigeren naar de map van de data vermeld in 5.9. Markeer alle bestanden die eindigen op ".dv" door "*.dv" in de prompt te typen. Selecteer alle (Ctl + A) en klik op "Toevoegen".
    3. Klik op + onder de sectie met het label "Taak." Selecteer "Export opslaan als..." en klik op het tabblad "Opties".
    4. Instellen "Exportindeling" naar "TIFF-afbeeldingen" en vink het vakje hieronder om toe te voegen een "aangepaste Output Folder". Dit is de locatie waar de TIFF-afbeeldingen worden geëxporteerd. 24-bits RGB onder "TIFF uitvoertype" Selecteer en klik op "Done".
    5. Klik op "Submit to Queue" als de exporteren-Macro wilt uitvoeren.
  • De TIFF-afbeeldingen geëxporteerd in 5.11 naar een externe stuurprogramma of de server als u zal het uitvoeren van de analyse na imaging (afdeling 6) op een andere computer kopiëren.
    Opmerking: De HIO weefsel en de media kan worden opgeslagen voor histologie34, PCR35), westelijke vlek van36, of andere stroomafwaartse analyse.

    • 6. na imaging analyse

    1. Zorg ervoor dat ImageJ37 is geïnstalleerd en goed werkt op de computer moet worden gebruikt voor analyse.
      Opmerking: Fiji37 is een alternatieve verdeling van het ImageJ kern programma dat werkt evengoed voor deze analyse.
    2. Allereerst dat de batchanalyse "Proces" dan "Batch" en uiteindelijk "Macro" te selecteren in het menu ImageJ.
    3. De ingang naar de map met de TIFF-afbeeldingen verzameld tijdens de experimentele tijdsverloop ingesteld. Open de "thesholdmeasure.ijm"-bestand voor de macrofuncties van ImageJ of rechtstreeks kopiëren/plakken de macrocode in het venster. Klik op "Proces" om te beginnen met het verwerken van de bestanden.
      Opmerking: De minimale drempel waarde x (setThreshold(x,255);) kan worden ingesteld op een getal 0 - 255 en moet worden aangepast teneinde te elimineren achtergrond fluorescentie. Waarden < 100 worden aanbevolen. Empirisch het bepalen van de passende drempelwaarde, de imaging macro uitvoeren als in een enkele afbeelding van een organoid met geen fluorescent signaal. De gemiddelde intensiteit van dit beeld kan dienen als een gids voor het vaststellen van de drempel naar behoren. P.a. de representatieve hieronder gepresenteerd, werd de drempel ingesteld op "42".
    4. ImageJ zullen produceren een grote tabel met de ruimte van alle pixels binnen het bereik van de intensiteit drempel, en de gemiddelde, mediaan, minimale en maximale (limiet) intensiteit waarde voor het gebied binnen de plafonds voor de intensiteit van drempel. Sla dit op als een CSV- of XLS.
    5. Verandering in intensiteit na verloop van tijd kan worden berekend in een werkblad39 door het manipuleren van de gegevenstabel als de onderstaande berekening wilt uitvoeren, of kan worden geautomatiseerd met behulp van een geschikte programmeertaal. Een voorbeeldscript van de analyse geschreven in R 40 is voorzien van dit manuscript.
      Opmerking: Voor elke HIO, relatieve fluorescentie intensiteit kan worden gekwantificeerd als figure-protocol-1 . Eliminatie tijd 41 (t-1/2) van FITC-dextran in het lumen HIO was als volgt berekend:
      1. Ten eerste, het berekenen van de "oppervlakte onder de kromme" (AUC) van de curve met een beschrijving van de intensiteit van de relatieve fluorescentie na verloop van tijd (t) als:
        figure-protocol-2
      2. Vervolgens berekenen de "goedkeuring" (figure-protocol-3) ten opzichte van de omvang van de distributie (Vd) gedefinieerd als 1 voor de genormaliseerde fluorescentie bij t = 0:
        figure-protocol-4
      3. Vervolgens bepalen de "eliminatie constant" (figure-protocol-5) als:
        figure-protocol-6
      4. En tot slot de "eliminatie tijd" berekenen (t-1/2) als:
        figure-protocol-7
        De verminderde vergelijking is dus:
        figure-protocol-8

    Resultaten

    Oberhof werden onderscheiden van menselijke pluripotente stamcellen en gekweekt in cel matrix oplossing als eerder beschreven19,24. Na 4 weken in cultuur, had de Oberhof voldoende uitgebreid zodat microinjection. Oberhof waren microinjected met 4 kDa FITC-geconjugeerd dextran geschorst PBS of PBS met Clostridium difficile toxine TcdA. C. difficile is een opportunistische gastro-intestinale pathogen dat toxine-gemedieerde epitheliale toxiciteit in Oberhof25vertoont. Als positieve controle, EGTA toevoegde aan de HIO voedingsbodems in een subset van Oberhof ingespoten met PBS en FITC-dextran. EGTA is een calcium-complexvormer waardoor snelle ambtshalve polymerisatie van de actine cytoskelet42. FITC fluorescentie in real time op een levende imaging Microscoop binnen een gecontroleerd milieu kamer werd gecontroleerd en beelden werden gevangen in 10 minuten intervallen.

    Post-hoc analyse van beeldvorming gegevens bleek aanzienlijke verschillen in de bewaring van FITC fluorescentie (Figuur 5). Oberhof geïnjecteerd met PBS behield bijna alle van de fluorescent signaal aanwezig op t = 0, maar Oberhof die ook met TcdA van behandeld met EGTA ingespoten werden tentoongesteld een substantiële afname van fluorescerende intensiteit door 8 uur na microinjection (figuur 5a). Imaging gegevens werden gekwantificeerd voor alle Oberhof op alle tijdstippen voor het genereren van een hoge resolutie dataset vertegenwoordigen de relatieve verandering in intensiteit van de fluorescentie na verloop van tijd in elke experimentele voorwaarde (figuur 5B). Verschillen in epitheliale permeabiliteit werden beoordeeld door de berekening van de gemiddelde eliminatie tijd (t-1/2 ) van FITC voor elke groep van de behandeling (tabel 1) en vergelijken van de verschillen in t t,1/2 tussen groepen met behulp van de Student t-test. Controle-behandelde Oberhof behouden het merendeel van de FITC fluorescent signaal voor meer dan 16 uur (t-1/2 = 17 ± 0,3 h). Behandeling met EGTA aanzienlijk verminderd FITC-dextran eliminatie tijd ten opzichte van controle Oberhof (t-1/2 = 2.6 ± 0,2 h; P = 1.3 x 10-8). In overeenstemming met eerder gepubliceerde resultaten25, microinjection van TcdA aanzienlijk verhoogd epitheliale barrière permeabiliteit ten opzichte van de controle behandeling (t-1/2 = 7.6 ± 0,6 h; P = 5.4 x 10-4). Dus, zowel extern (EGTA) en microinjected (TcdA)-verbindingen zijn geschikt voor het induceren van belangrijke wijzigingen in epitheliale barrière permeabiliteit in Oberhof. Deze resultaten suggereren dat de effecten van een breed scala van farmacologische stoffen, metabolieten, bacteriële producten, cytokines, groeifactoren en andere verbindingen op de epitheliale barrièrefunctie kunnen worden geëvalueerd aan de hand van deze aanpak.

    BehandelingHalfwaardetijd (h)SEM (h)Lagere 95% CI (h)Boven 95% CI (h)n
    Controle17.110.316.45 uur17.7811
    EGTA2,580.191.783,383
    TcdA7.560.635.939.186

    Tabel 1: Mean eliminatie time (t1/2) voor de FITC-dextran in Oberhof behandeld met EGTA of TcdA. Eenheden zijn uren na microinjection.

    figure-results-1
    Figuur 1: basis lay-out van een microinjector en micromanipulator voor HIO microinjection. Dit beeld toont de volledige aanvulling van apparatuur die wordt gebruikt voor het uitvoeren van microinjection van Oberhof. Belangrijke onderdelen worden aangeduid en bestelinformatie vindt u in de tabel van de materialen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

    figure-results-2
    Figuur 2: de trekker van de micropipet. De koper verwarming spoel hc, bovenste klem c1, onder klem (c2), de trekker van de arm (pa), warmte selectie knevel (ht) worden aangeduid met de pijlen. De juiste instelling voor serie 1 en trek in rode tekst worden aangegeven. De inzet toont een gloeidraad correct gemonteerd glas klaar voor verwarming. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

    figure-results-3
    Figuur 3: representatieve beelden van een weefsel afkomstige HIO ingespoten met FITC-dextran. (A) afbeelding tonen de positionering van het glas-microcapillary vlak voor opneming in de HIO en microinjection. (B) helderveld beeld van een weefsel afkomstige menselijke intestinale organoids na microinjection van FITC-dextran. Merk op dat het signaal van de fluorescentie zelfs zonder het gebruik van een specifiek filter set blijkt. Deze verkleuring helpt microinjection precisie. 3 X vergroting Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

    figure-results-4
    Figuur 4: Live imaging werkstroom. (A) Screenshot ter illustratie van de noodzakelijke stappen voor het instellen van de parameters van de Microscoop, vinden de Oberhof op de dia en de positie van het werkgebied voor elke HIO te worden beeld opslaan. (B) pre imaging instellingen voor het vastleggen van het FITC-kanaal met regelmatige tussenpozen op elk van de posities opgegeven in A. (C) na imaging export van gegevens opmaken de DV-bestanden als TIFF-afbeeldingen met een TIFF-afbeelding per HIO per tijdstip.Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

    figure-results-5
    Figuur 5: representatieve resultaten. (A)-cel van de stam afgeleid menselijke intestinale organoids (HIO) microinjected met 2 mg/mL FITC-dextran (4 kDa) beeld voor 20 uur. Oberhof werden ook microinjected met PBS (control) of de Clostridium difficile toxine TcdA (12,8 ng/µL) of 2 mM EGTA toegevoegd aan de externe cultuur media behandeld. 4 X vergroting. (B) Plot van gemiddelde genormaliseerde FITC intensiteit na verloop van tijd in Oberhof behandeld met PBS (control), TcdA of EGTA. Foutbalken vertegenwoordigen S.E.M. en n = 11 Oberhof (Control), 3 Oberhof (EGTA), 6 Oberhof (TcdA). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

    Discussie

    Dit protocol wordt een algemene methode voor de microinjection van hPSC afkomstige Oberhof en intestinale organoids weefsel-afgeleide en de meting van epitheliale barrière permeabiliteit in real-time. We hebben ook aangetoond dat onze benadering van analyse en interpretatie van de gegevens die zijn gegenereerd met behulp van deze methoden. Gezien de groeiende aanneming van intestinale organoids modelsystemen16,20,21,28 en de jarenlange interesse in intestinale barrière permeabiliteit als een fysiologisch relevante functionele resultaat3,4,5,6, wij verwachten dat anderen werken op dit gebied zal zitten kundig voor toepassing en voortbouwen op deze methoden.

    Er zijn verschillende stappen die essentieel zijn voor de toepassing van deze techniek. Toegang tot hoogwaardige hPSC- of weefsel afgeleide HIO weefsel voorafgaand aan uitgebreide experimenten met microinjection dienen te worden vastgesteld. HIO macrostructuur mogelijk heterogene, met variatie in zowel de grootte en de vorm, hoewel weefsel identiteit en cellulaire morfologie is zeer reproduceerbaar bij gebruik van vastgelegde methode voor het genereren van Oberhof24. Sferische Oberhof, bestaande uit een enkele semi-transparante lumen en het meten van ongeveer 1 mm in diameter zijn ideaal voor microinjection en meting van luminal fluorescentie in real-time. In sommige gevallen mislukt microinjection, wat resulteert in de ineenstorting van de HIO of duidelijk lekkage van geïnjecteerde materiaal. Mislukte Oberhof kunnen worden verwijderd uit de cultuur ook naar eigen goeddunken van de gebruiker met behulp van een standaard micropipet. Overwegen de doelstelling lenzen beschikbaar op een imaging platform bij het selecteren van Oberhof voor microinjection en beeldbewerking. In het algemeen, 2-4 X objectieven zijn ideaal voor het vangen van het volledige HIO fluorescent signaal, hoewel een 10 X doelstelling kan worden gebruikt als energiebesparende lenzen niet beschikbaar zijn of als de beschikbare Oberhof < 1 mm in diameter. Imaging-software moet voldoende zijn voor de geautomatiseerde inname van fluorescerende beelden op bepaalde punten na verloop van tijd.

    Diverse wijzigingen van dit protocol zijn mogelijk om de experimentele wensen. Bijvoorbeeld, de resultaten van barrière functie tests kunnen worden afhankelijk van de moleculaire omvang van de verbindingen in gebruik43 en het kan dienstig zijn om te testen dextran preparaten van verschillende moleculair gewicht. Daarnaast kan helderveld beeldvorming worden uitgevoerd naast fluorescentie imaging als indicatie van de algemene structurele integriteit van de weefsels25. Bij het uitvoeren van microinjection van levende bacteriën25,28,31,32,33,44, kan het nodig zijn om toe te voegen van penicilline en streptomycine of gentamicine aan de voedingsbodems HIO voorafgaand aan of na microinjection. De buitenkant van de microcapillary zal tijdens het vullen met de bacteriecultuur schorsing besmet raken en dit kan worden overgedragen aan de HIO-media. Afwisselend, microinjection kan worden uitgevoerd op Oberhof geschorst in extracellulaire matrix (bijvoorbeeld Matrigel) zonder media, de media toe te voegen nadat de microinjection is voltooid. Dit kan besmetting van de extracellulaire matrix en het buitenvlak van de HIO beperken. Bij het plannen van microbiële groei testen, kan het nodig te verwijderen van antibiotica in de media na 1-2 uur te voorkomen van vertragen of verhinderen van de groei van microinjected organismen zijn.

    Tot slot is erkennen dat niet alle onderzoekers toegang tot microscopie apparatuur geschikt is voor in vitro imaging hebben zullen, het belangrijk erop te wijzen dat de procedures die worden beschreven in dit protocol voor het verzamelen van gegevens van de fluorescentie kunnen worden toegepast op afbeeldingen die op vaste tijdstippen met behulp van standaard epifluorescerende microscopie zonder geautomatiseerde beeld vastleggen of milieucontrole. Voorbeelden van deze aanpak kunnen worden gevonden in de verslagen door Leslie en Huang et al. 25, die onderzocht van C. difficile toxine activiteit in intestinale organoids hPSC afkomstige, en Karve en Pradan et al. 44, die epitheliale barrière permeabiliteit in soortgelijke hPSC afkomstige intestinale organoids microinjected met levende E. coli onderzocht. Handmatige bediening van beeldvormingsapparatuur kan resulteren in een grotere variatie en problemen bij het normaliseren van het fluorescerende signaal. Wanneer het uitvoeren van handmatige beeldvorming van FITC-dextran geïnjecteerd Oberhof is het essentieel te handhaven vaste vergroting, fluorescerende excitatie-intensiteit en blootstelling tijden gedurende het gehele experiment om te voorkomen dat het verstoren van de intensiteit van de fluorescentie-metingen.

    Openbaarmakingen

    De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten bekend te maken.

    Dankbetuigingen

    De auteurs bedank Drs. Stephanie Spohn en Basel Abuaita voor de vele nuttige discussies op organoid microinjection. JRS wordt ondersteund door de intestinale stamcel Consortium (U01DK103141), een gezamenlijk onderzoeksproject, gefinancierd door het nationale Instituut van Diabetes en spijsverterings en ziekten van de nier (NIDDK) en het National Institute of Allergy en besmettelijke ziekten (NIAID). JRS en VBY worden ondersteund door de roman NIAID, alternatief modelsystemen voor zuurbestendige ziekten (NAMSED) consortium (U19AI116482). DRH wordt ondersteund de mechanismen van microbiële pathogenese opleiding subsidie van de National Institute of Allergy and Infectious Disease (NIAID, T32AI007528) en het klinisch en translationeel Science award aan de Michigan-Instituut voor klinische en gezondheid Onderzoek (UL1TR000433).

    De volledige gegevensbestanden en data analyse code die wordt gebruikt in dit manuscript zijn beschikbaar op https://github.com/hilldr/HIO_microinjection.

    Materialen

    Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
    NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
    EGTA 0,5 M steriele (pH 8,0)Bioworld405200081
    Cell matrix oplossing (Matrigel)Corning354230
    Deltavision RT live cel-beeldvormingssysteemGE Life Sciences29065728http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences/brands/deltavision/
    CameraGE Life Sciences29065728Inbegrepen bij Deltavision systeem
    softWoRx BeeldvormingssoftwareGE Life Sciences29065728Inbegrepen bij Deltavision systeem
    BioveiligheidscabinetLabconcoCell Logic+http://www.labconco.com/product/purifier-cell-logic-class-ii-type-a2-biosafety-cabinets-2/4262
    1X PBSLife Technologies10010-023
    Advanced DMEM-F12Life Technologies12634-010Onderdeel van ENR media; zie McCraken et al. 24
    B27 supplement (50X)Life Technologies17504044Onderdeel van ENR media; zie McCraken et al. 24
    L-glutamine (100X)Life Technologies25030-081Onderdeel van ENR media; zie McCraken et al. 24
    HEPES bufferLife Technologies15630080Onderdeel van ENR media; zie McCraken et al. 24
    ManipulatorNarshgeUM-3C
    MicromanipulatorNarshgeUM-1PF
    PipetthoudersNarshgeUP-1Alternatief voor Xenoworks pipethouders
    Magnetische standaardNarshgeGJ-1
    DissectiemicroscoopOlympusSX61Aanbevolen microscoop, hoewel andere modellen waarschijnlijk compatibel zijn
    Olympus IX71 Fluorescerende microscoopOlympusIX71Inbegrepen bij Deltavision systeem
    CoolSNAP HQ2Photometrics29065728Inbegrepen bij Deltavision systeem
    Recombinant C. difficile Toxin A/TcdA ProteïneR&D Systems8619-GT-020
    EGFR&D Systems236-EGOnderdeel van ENR media; zie McCraken et al. 24
    R-spondin 1R&D Systems4645-RSOnderdeel van ENR media; zie McCraken et al. 24
    NogginR&D Systems6057-NGOnderdeel van ENR media; zie McCraken et al. 24
    MineralolieSigma-AldrichM8410
    FITC-dextran (4 kDa)Sigma-Aldrich46944
    MicropipetpullerSutter InstrumentsP-30
    Nunc Lab-Tek II Chamber SlidesThermoFisher Scientific154526PK
    GlasfilamentenWPITW100F-4
    MicropipethoudersXenoworksBR-MH2Voorkeursapparaat
    Analoge slangensetXenoworksBR-AT
    1/16 inch duidelijke ferruleXenoworksV001104
    1-1,2 mm O-ringXenoworksV300450

    Referenties

    1. Standring, S., Borley, N. Gray's anatomy: The anatomical basis of clinical practice. , Churchill Livingstone/Elsevier. (2008).
    2. Buckley, A., Turner, J. R. Cell biology of tight junction barrier regulation and mucosal disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. , (2017).
    3. Clayburgh, D. R., Shen, L., Turner, J. R. A porous defense: The leaky epithelial barrier in intestinal disease. Lab Invest. 84, 282-291 (2004).
    4. Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nat Rev Immunol. 9, 799-809 (2009).
    5. Bischoff, S. C., et al. Intestinal permeability-a new target for disease prevention and therapy. BMC Gastroenterol. 14, 189(2014).
    6. Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: A therapeutic target? Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 14, 9-21 (2017).
    7. Krugliak, P., Hollander, D., Schlaepfer, C. C., Nguyen, H., Ma, T. Y. Mechanisms and sites of mannitol permeability of small and large intestine in the rat. Dig Dis Sci. 39, 796-801 (1994).
    8. Johnston, S. D., Smye, M., Watson, R. P. Intestinal permeability tests in coeliac disease. Clin Lab. 47, 143-150 (2001).
    9. Salles Teixeira, T. F., et al. Intestinal permeability measurements: General aspects and possible pitfalls. Nutr Hosp. 29, 269-281 (2014).
    10. Wang, L., et al. Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease. J Immunol Methods. 421, 44-53 (2015).
    11. Donato, R. P., et al. Studying permeability in a commonly used epithelial cell line: T84 intestinal epithelial cells. Methods Mol Biol. 763, 115-137 (2011).
    12. Balimane, P. V., Chong, S. Cell culture-based models for intestinal permeability: A critique. Drug Discov Today. 10, 335-343 (2005).
    13. Vidyasagar, S., MacGregor, G. Ussing chamber technique to measure intestinal epithelial permeability. Methods Mol Biol. 1422, 49-61 (2016).
    14. Herrmann, J. R., Turner, J. R. Beyond Ussing's chambers: contemporary thoughts on integration of transepithelial transport. Am J Physiol Cell Physiol. 310, C423-C431 (2016).
    15. Sato, T., et al. Single lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
    16. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165, 1586-1597 (2016).
    17. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11, 347-358 (2016).
    18. Rookmaaker, M. B., Schutgens, F., Verhaar, M. C., Clevers, H. Development and application of human adult stem or progenitor cell organoids. Nat Rev Nephrol. 11, 546-554 (2015).
    19. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470, 105-109 (2011).
    20. Aurora, M., Spence, J. R. HPSC-derived lung and intestinal organoids as models of human fetal tissue. Dev Biol. 420, 230-238 (2016).
    21. Dedhia, P. H., Bertaux-Skeirik, N., Zavros, Y., Spence, J. R. Organoid models of human gastrointestinal development and disease. Gastroenterology. 150, 1098-1112 (2016).
    22. Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. Elife. 4, (2015).
    23. Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells. Curr Pathobiol Rep. 4, 47-57 (2016).
    24. McCracken, K. W., Howell, J. C., Wells, J. M., Spence, J. R. Generating human intestinal tissue from pluripotent stem cells in vitro. Nat Protoc. 6, 1920-1928 (2011).
    25. Leslie, J. L., et al. Persistence and toxin production by clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function. Infect Immun. 83, 138-145 (2015).
    26. Leslie, J. L., Young, V. B. A whole new ball game: Stem cell-derived epithelia in the study of host-microbe interactions. Anaerobe. 37, 25-28 (2016).
    27. Zachos, N. C., et al. Human enteroids/Colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology. J Biol Chem. 291, 3759-3766 (2016).
    28. Hill, D. R., Spence, J. R. Gastrointestinal organoids: Understanding the molecular basis of the host-microbe interface. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 3, 138-149 (2017).
    29. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nat Protoc. 8, 2471-2482 (2013).
    30. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
    31. Engevik, M. A., et al. Loss of nHE3 alters gut microbiota composition and influences bacteroides thetaiotaomicron growth. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305, G697-G711 (2013).
    32. Forbester, J. L., et al. Interaction of salmonella enterica serovar typhimurium with intestinal organoids derived from human induced pluripotent stem cells. Infect Immun. 83, 2926-2934 (2015).
    33. Engevik, M. A., et al. Human clostridium difficile infection: Inhibition of nHE3 and microbiota profile. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 308, G497-G509 (2015).
    34. Bancroft, J., Gamble, M. Theory and practice of histological techniques. , Churchill Livingstone. (2008).
    35. Kennedy, S., Oswald, N. PCR troubleshooting and optimization: The essential guide. , Caister Academic Press. (2011).
    36. Kurien, B., Scofield, R. Western blotting: Methods and protocols. , Springer. New York. (2015).
    37. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH image to imageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
    38. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
    39. Winston, W. Microsoft excel data analysis and business modeling. , Pearson Education. (2016).
    40. R Core Team. A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2017).
    41. Rosenbaum, S. Basic pharmacokinetics and pharmacodynamics: An integrated textbook and computer simulations. , Wiley. (2016).
    42. Selden, L. A., Estes, J. E., Gershman, L. C. The tightly bound divalent cation regulates actin polymerization. Biochem Biophys Res Commun. 116, 478-485 (1983).
    43. Vojdani, A. For the assessment of intestinal permeability, size matters. Altern Ther Health Med. 19, 12-24 (2013).
    44. Karve, S. S., Pradhan, S., Ward, D. V., Weiss, A. A. Intestinal organoids model human responses to infection by commensal and shiga toxin producing escherichia coli. PLoS One. 12, e0178966(2017).

    Herprints en machtigingen

    Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

    Toestemming aanvragen

    Trefwoorden

    MicroinjectietechniekFITC dextranreal time imagingmenselijk darmweefselpermeabiliteitsmetingfluorescent dextranblootstelling aan toxinenlive imaging

    Gerelateerde artikelen