Klonen analyse van embryonale hematopoietische stamcellen precursoren met eencellige Index sorteren gecombineerd met Endothelial Niche co celkweek

Samenvatting

Hier presenteren we methodologie voor de klonale analyse van hematopoietische stamcellen precursoren tijdens lymfkliertest embryonale ontwikkeling. Wij combineren index sortering van afzonderlijke cellen uit de embryonale aorta-gonaden-mesonephros regio met endothelial co celkweek en transplantatie te karakteriseren de fenotypische eigenschappen en het engraftment potentieel van één hematopoietische precursoren.

Samenvatting

De mogelijkheid te bestuderen van hematopoietische stamcellen (HSC) genesis tijdens de embryonale ontwikkeling heeft is beperkt door de zeldzaamheid van HSC precursoren in het vroege embryo en het ontbreken van tests waarmee functioneel het lange termijn potentieel van de multilineage engraftment van individuele putatief HSC precursoren. Hier beschrijven we een methodologie waarmee de isolatie en de karakterisering van functioneel gevalideerde HSC precursoren op het niveau van één cel. Ten eerste, wij gebruiken index Sorteren om de precieze fenotypische parameter van elke cel afzonderlijk gesorteerde winkel met behulp van een combinatie van fenotypische markers te verrijken voor HSC precursoren met extra markeringen voor experimentele analyse. Ten tweede, elke index-gesorteerd op cel is mede gekweekte met vasculaire niche stroma uit de aorta-gonaden-mesonephros (AVA) regio, die ondersteunt de rijping van niet-enten HSC voorlopers van functionele HSC met multilineage, op de lange termijn engraftment potentieel in transplantatie testen. Deze methode maakt een correlatie van fenotypische eigenschappen van klonen hemogenic precursoren met hun functionele engraftment potentieel of andere eigenschappen zoals transcriptionele profiel, het verstrekken van een middel voor de gedetailleerde analyse van de voorloper van de HSC ontwikkeling op het niveau van één cel.

Inleiding

Klonen studies is gebleken heterogeniteit in de lange termijn engraftment eigenschappen van volwassen HSCs, nieuwe inzicht bijbrengen in HSC subtypen en wijzigingen in de HSC gedrag tijdens veroudering¹. Echter, soortgelijke studies van embryonale HSCs en hun uitgangsstoffen zijn uitdagender. Tijdens de vroege embryonale ontwikkeling, HSCs die ontstaan is uit een populatie van precursoren bekend als hemogenic endotheel in een voorbijgaande proces bedoeld als het endotheel hematopoietische overgang². Het eerste HSC, gedefinieerd door hun vermogen om te leveren robuuste, op lange termijn multilineage engraftment na transplantatie in geconditioneerde volwassen geadresseerden, worden niet gedetecteerd totdat na embryonale dag 10.5 (E10.5) in het lymfkliertest embryo, met zeer lage frequentie³ . Tijdens hun ontwikkeling, moeten voorlopers van HSC (pre-HSC) die voortvloeien uit hemogenic endotheel rijping voorafgaand aan het verwerven van de eigenschappen van volwassen HSC die voorzien in efficiënte engraftment in^4,5 van de tests van de transplantatie ondergaan ^{, 6}. de studie van zeldzame HSC oorsprong, een veelheid van hematopoietische progenitorcellen met erythroid, verduisterend myeloïde en lymfoïde potentieel al worden gedetecteerd vóór de opkomst van HSC van pre-HSC^7,8. Pre-HSC onderscheiden van andere hematopoietische progenitorcellen vereist dus, methoden voor klonaal cellen isoleren en hen voorzien van voldoende voor hun rijping signalen naar HSC, om te ontdekken hun engraftment eigenschappen in het testen van de transplantatie.

Een aantal benaderingen zijn beschreven die voldoende zijn voor de detectie van pre-Help en ondersteuning door ex vivo of in vivo rijping naar HSC. Ex vivo methoden hebben afhankelijk van de cultuur van embryonale weefsels, zoals de AGM-regio, waar het eerste HSC in ontwikkeling⁹worden gedetecteerd. Voortbouwend op deze methoden, protocollen waarin de dissociatie opgenomen, hebben sorteren, en opnieuw aggregatie van AVA weefsels toegestaan de karakterisatie van gesorteerde populaties met HSC precursoren tijdens de ontwikkeling van E9.5 naar E11.5 in de para-aorta splanchnopleura (P-Sp) / AGM regio's^4,5,10; deze benaderingen zijn echter niet vatbaar voor high-throughput analyse van precursoren op het niveau van de eencellige vereist voor klonen analyse. Ook in vivo rijping door transplantatie in pasgeboren muizen, waar de communicatie wordt geacht te zijn meer geschikt voor de ondersteuning van eerdere fasen van HSC precursoren, ook heeft onderzoek van gesorteerde populaties van de dooierzak en AVA / P-Sp (P-Sp is de regio van de voorloper van de AVA) met kenmerken van pre-HSC, maar deze methoden ook niet te voorzien van een robuust platform voor single cell analysis^11,12.

Studies van Rafii et al. aangetoond dat Akt-geactiveerde endothelial cel (EG) stroma kan bieden een niche-substraat voor de ondersteuning van volwassen HSC zelf-vernieuwing in vitro^13,14,15. We onlangs vastgesteld dat Akt-geactiveerde EG afgeleid van de AVA regio (AGM-EG) een niche geschikt in vitro voor de rijping van hemogenic precursoren biedt, zo vroeg als E9 in ontwikkeling, tot volwassene-enten HSC, evenals de latere geïsoleerd zelf-vernieuwing van de gegenereerde HSC¹⁶. Gezien het feit dat dit systeem maakt gebruik van een eenvoudige CO 2-dimensionale cultuur, is het gemakkelijk aanpasbaar voor klonen analyse van het potentieel van de HSC van individueel geïsoleerde hemogenic precursoren.

We hebben onlangs gemeld dat een benadering van het potentieel van de HSC van klonen hemogenic precursoren assay door het combineren van index sortering van individuele hemogenic precursoren van lymfkliertest embryo's met AGM-EG mede cultuur en latere functionele analyse van transplantatie testen van¹⁷. Het sorteren van de index is een modus van fluorescentie-activated cell sorting (FACS) dat records (indexen) alle fenotypische parameters (d.w.z., voorwaartse scatter (FSC-A), naast scatter (WS-A), fluorescentie parameters) van elk afzonderlijk gesorteerde cel dat deze functies kunnen met terugwerkende kracht worden gecorreleerd aan latere functionaalanalyse na sorteren. FACS software registreert beide fenotypische informatie voor elke cel en de positie per putje van de 96-wells-plaat waarin het werd geplaatst. Deze techniek is eerder elegant gebruikt voor het identificeren van heterogeniteit in volwassen HSC, fenotypische parameters die verder verrijken voor de lange termijn enten subset van HSC, en fenotypische parameters van HSC correleren met transcriptionele bepalen eigenschappen op de single cell niveau^18,19. Hier, bieden wij gedetailleerde methodologie van deze aanpak waarmee identificatie van unieke fenotypische parameters en bloedlijn bijdragen van pre-Help en ondersteuning tijdens de vroege stadia van embryonale ontwikkeling.

Protocol

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van het Fred Hutchinson Cancer Research Center.

1. bereiding van de AVA-EG Monolayers co cultuur

1. 24 uur voorafgaand aan de AVA dissectie en sorteren, maken AVA-EG cultuurmedia en filter steriliseren.
2. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten Aspirate de gelatine, 0,1% gelatine in water (100 µL per putje) toevoegen aan elk putje van een 96-wells-plaat en de plaat in de kap van een weefselkweek laat met de deksel verwijderd totdat de putten droog zijn.
3. Distantiëren van de AVA-EG monolayers en plaat met 96-wells-platen.
   Opmerking: Handhaven de AGM-EG, bereid als hierboven beschreven¹⁶, in AGM-EG voedingsbodems. Voor consistentie, moeten AGM-EG cellijnen worden bevroren, zodra voldoende aantallen worden verkregen (in het algemeen passage 1-3) en voor co cultuur proeven op een gedefinieerde passage nummer (over het algemeen passage 5-12) gebruikt. AGM-EG cellijnen zijn afgeleid van C57BL/6J (CD45.2) AVA. Zie de Tabel van materialen voor alle media composities.
   1. De media van de AVA-EG cultuur in een maatkolf van 75 cm² gecombineerd en voeg 5 mL PBS. PBS gecombineerd en voeg 3 mL trypsine oplossing (Zie Tabel van materialen).
   2. Incubeer bij 37 ° C gedurende 2-4 minuten totdat de meeste cellen zijn opstijgen van de plaat. Voeg 7 mL AGM-EG cultuurmedia en Pipetteer 8 - 10 keer met een pipet 10 mL Maak afzonderlijke cellen suspensie, en overbrengen naar een tube van 15 mL.
   3. Spin bij 300 x g gedurende 5 minuten, verwijder het supernatant resuspendeer in 10 mL AGM-EG cultuurmedia en schatten van het aantal cellen met een hemocytometer. Verdun de cellen tot een concentratie van 1 x 10⁵ cellen/mL in AGM-EG voedingsbodems.
4. Voeg 100 µL AGM-EG celsuspensie (1 x 10⁴ cellen) toe aan elk putje van een gelatinized 96-wells-plaat. Plaats in een 37 ° C, 5% CO₂ weefselkweek incubator's nachts om de AVA-EG te hechten en vormen een confluente enkelgelaagde.
   Opmerking: Verdeel de AGM-EG stromale cellen dus er beperkte begroeiing is of cel samendoen voor optimale co cultuur.
5. De AGM-EG enkelgelaagde voorbereiden op AVA co cultuur.
   1. De volgende ochtend, bereiden de AVA serumvrij media.
   2. Met behulp van een meerkanaalspipet 12-well, verwijder de AGM-EG voedingsbodems uit de AGM-EG en voeg 200 µL per putje van AVA serumvrij media zonder cytokines te wassen alle resterende serum-bevattende media.
   3. Verwijder het medium en 200 µL per putje van AVA serumvrij media met cytokines toevoegen. Werk snel als verwijderen en het toevoegen van de media, zodat de endothelial laag niet in gevaar komt; bijvoorbeeld, verwijderen en opnieuw toe te voegen media één rij tegelijk. Plaats de 96-wells-platen in een incubator weefselkweek bij 37 ° C, totdat de embryonale cellen klaar voor het sorteren zijn.

2. voorbereiding van enkele celsuspensie van lymfkliertest embryonale weefsels

1. Het ontleden van de AVA van getimede verparingen.
   1. Instellen van getimede verparingen voor het genereren van embryonale weefsels van de gewenste leeftijd.
   2. Oogst embryo's van zwangere koeien op 9,5 tot 11,5 dagen post coitum (dpc), afhankelijk van de fase van pre-Help en ondersteuning te worden geanalyseerd.
      Opmerking: Embryonale weefsels worden geoogst als eerder beschreven en juist geënsceneerde op basis van Somiet graaf¹⁶van C57BL/6J (CD45.2) muizen. We hebben gericht op de analyse van populaties uit de embryonale AGM-regio en zijn voorganger, de P-Sp, tussen E9.5 aan E11.5, gebaseerd op Somiet enscenering.
   3. Het ontleden van de AVA van de embryo's²⁰.
      Opmerking: Gedetailleerde protocollen voor de dissectie van AVA van lymfkliertest embryo's zijn gepubliceerd door anderen²⁰. Als alternatief, dooierzak of andere weefsels die beweerde te hebben pre-HSC activiteit kunnen ook worden geanalyseerd door deze methode.
2. De ontleed embryonale weefsels te distantiëren.
   1. Verzamelen van de ontleed weefsels in een conische tube van 15 mL, met 10 mL PBS met 10% FBS op ijs. Zwaartekracht weefsels regelen de PBS/FBS gecombineerd en onmiddellijk Voeg vervolgens 1 mL van 0,25% collagenase in een waterbad 37 ° C gedurende 25 minuten.
   2. Voeg 1 mL PBS/10% FBS en Pipetteer ongeveer 20 - 30 keer met een 1 mL pipet tip om het verkrijgen van een enkele celsuspensie. Voeg een extra 8 mL PBS/10% FBS en centrifuge cellen bij 300 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant.

3. antilichaam kleuring van lymfkliertest embryonale stamcellen

1. Voorbereiden op de buffer met blokkerend antilichaam kleuring.
   1. Toevoegen van 10 µg/mL-antimuis CD16/CD32 (Fc receptor (FcR) blok) en 1 µg/mL DAPI (1 mg/mL stockoplossing in H₂O) tot 1 mL PBS met 10% FBS.
   2. Opstellen in een spuit met 3 mL en passeren een 0,22 µm spuit filter te steriliseren. Resuspendeer de pellet van de cel van de gedissocieerde lymfkliertest embryonale weefsels (uit stap 2.2.2) 500 µL blokkeren buffer en incubeer op ijs gedurende 5 minuten.
2. De antilichaam mix¹⁷voor te bereiden.
   1. Toevoegen van 10 µg/mL FcR blok aan 1 mL PBS met 10% FBS en 10 µL van elke anti-VE-cadherine fluorescerende-geconjugeerde antilichaam (CD144, zie de Tabel van materialen) en anti-EPCR fluorescerende-geconjugeerde antilichaam (CD201, zie de Tabel van de materialen). Gebruik een 1:100 in de uiteindelijke verdunning van de antilichamen tenzij anders aangegeven gebaseerd op aanbevelingen van de fabrikant of volgens titraties.
      Opmerking: Deze combinatie van antilichaam wordt gebruikt voor het definiëren van gates voor sorteren, zoals hieronder (stap 4.2) beschreven. Sortering op basis van de co uitdrukking van VE-cadherine en EPCR in staat stelt belangrijke verrijking voor het gedeelte van de AVA-afgeleide cellen met HSC voorloper activiteit, als eerder beschreven¹⁷.
   2. Het toevoegen van extra fluorescerende-geconjugeerde antilichamen voor verdere fenotypische analyse van individuele index-gesorteerd op precursoren.
      Opmerking: Deze antilichamen zijn niet noodzakelijk voor het definiëren van gates voor het sorteren gebruikt. In dit voorbeeld protocol, hebben we opgenomen anti-CD41 PE-geconjugeerde antilichaam en anti-CD45 FITC-geconjugeerd antilichaam voor het analyseren van de relatieve uitdrukking van deze hematopoietische markers, die tijdens de opkomst van pre-Help en ondersteuning van hemogenic endotheel^{4 evolueren ,5,16,17}. Andere markeringen van belang kunnen worden opgenomen zoals gewenst. Monsters gekleurd met isotype fluorescerende-geconjugeerde antilichaam besturingselementen worden gebruikt voor het definiëren van negatieve en positieve gates voor analyse.
   3. Opstellen van de mix van antilichaam in een spuit met 3 mL en passeren een 0,22 µm spuit filter te steriliseren. Voeg 500 µL van het mengsel van antilichaam aan de celsuspensie in blokkeerbuffer, pipet te mengen, en broeden op het ijs gedurende ten minste 15-20 minuten.
3. Wassen van de gekleurde cellen.
   1. 8 mL PBS/10% FBS toevoegen. Centrifugeer de cellen bij 300 x g voor 5 min, aspirate en resuspendeer de cel met 1 mL PBS/10% FBS pellet.
   2. Verwijderen cel klontjes door pipetteren de celsuspensie via een 35 μm cel zeef GLB op een 5 mL-buis. De zeef van de cel met een extra 3 mL PBS/10% FBS wassen. Centrifugeer de cellen bij 300 x g gedurende 5 min, gecombineerd resuspendeer in 500 µL PBS/10% FBS en plaats op het ijs tot FACS.

4. Index sorteren van één Hemogenic precursoren tot 96-wells met AGM-EG Stroma voor co cultuur

1. Bereid de FACS machine voor plaat-modus en uitlijnen naar 96-wells-platen volgens instructies van de fabrikant worden gesorteerd. Selecteer één cel modus en index modus in de software voor maximale zuiverheid masker instellingen en om de verwerving van index parameters voor elke gesorteerde cel sorteren.
2. Verwerven van een steekproef van cellen van het antilichaam gekleurd monsters als u wilt instellen van gates voor sorteren.
   1. Het monster van gekleurde cel op de machine FACS laden en het verwerven van cellen bij het laagste debiet. Uitzetten van de FSC-A verzen SSC-A en selecteer een hek dat cellen van verschillende grootte (figuur 1B) (die is gebaseerd op de observatie dat pre-HSC activiteit wordt geïdentificeerd in cellen van verschillende grootte profielen in de AVA¹⁷) bevat. Plot FSC-A verzen FSC-W en WS-A verzen SSC-W en selecteer de poorten te sluiten paren. Vervolgens plot FSC-A verzen DAPI aan de poort van levende cellen (negatief voor de DAPI) (figuur 1B).
   2. Uitzetten PECy7 (of de relevante fluorescerende voor de VE-cadherine vlek) versus PerCP (of de relevante fluorescerende voor de EPCR vlek). Poort van cellen die zijn positief voor VE-cadherine (waaronder een gemengde bevolking van endotheliale cellen evenals hematopoietische progenitorcellen en pre-Help en ondersteuning van de AVA) en die hoge EPCR-expressie (die verrijkt voor pre-HSC van P-Sp/AGM¹⁷). Dit is de laatste poort die zullen worden aangewend om de index van de afzonderlijke cellen sorteren in stap 4.3 (figuur 1B).
   3. Extra fluorochromes gebruikt voor de kleuring worden uitgezet.
      Opmerking: Afhankelijk van de populaties te analyseren, extra poorten kunnen worden ingesteld op basis van het detecteren van andere merkers voor de kleuring van de cellen opgenomen. Echter kan de opname van de fluorescerende parameters voor elke gesorteerde cel index Sorteren zodanig dat deze parameters kunnen met terugwerkende kracht worden geanalyseerd. Dus is geen extra gating noodzakelijk op dit punt. Voor alle FACS setups, moeten monsters gekleurd met één antilichamen worden gebruikt voor het aanpassen van de compensatie, ter verantwoording voor spill-over de uitstoot van overlappende fluorochromes, en met isotype controle antilichamen, zijn goed voor achtergrondkleuring te bepalen negatief/positief gates.
3. Index Sorteren de AGM-cellen.
   1. Plaats een 96-wells-plaat bereid met de AGM-EG stroma in AVA serumvrij media met cytokines (uit stap 1.5.3) in het blok van de plaat van de FACs Sorteer machine. Laden van het monster en begint monster acquisitie. Index Sorteren/één cel kiezen en beginnen sortingsingle cellen aan afzonderlijke 96-wells. Het laagste debiet gebruiken om te minimaliseren van shear stress op embryonale stamcellen.
   2. Zorg ervoor dat alle gebeurtenissen worden vastgelegd tijdens het sorteren van de index. Hierdoor zal de opsomming van het totale aantal cellen geanalyseerd in de sorteer poort ten opzichte van het werkelijke aantal gesorteerde aan afzonderlijke 96-wells, aangezien niet alle gebeurtenissen die zijn vastgelegd in putjes worden gesorteerd.
   3. Zodra de cellen zijn gesorteerd op een hele 96-wells-plaat, plaatst u de plaat in een incubator weefselkweek bij 37 ° C vastgesteld op 5% CO₂. Herhaal voor extra platen nodig per experiment.
   4. Co cultuur afzonderlijk gesorteerd op cellen in 96-wells met AGM-EG (uit stap 4.3) tot maximaal 7 dagen (5 dagen voor cellen gesorteerd van E11-11,5 embryo's, 6 dagen van E10-10.5 embryo's, 7 dagen vanaf E9-9.5 embryo's). Visualiseer hematopoietische kolonies van verschillende maten en morphologies met een omgekeerde Microscoop op 100 X vergroting (figuur 2B) na de periode van co-cultuur.
      Opmerking: De media hoeft niet te worden gewijzigd tijdens de periode van co-cultuur. Gesorteerd op hemogenic precursoren in eerste instantie kunnen integreren in de AVA-EG laag met een EG-achtige morfologie en kunnen niet worden in eerste instantie onderscheiden van AVA-EG stroma (figuur 2A). Echter volgende 24-48 h in co-cultuur, kleine, afgeronde hematopoietische cellen of clusters van cellen kunnen worden gedetecteerd. Aan het einde van co cultuur (5-7 dagen), kunnen afzonderlijke kolonies van hematopoietische cellen worden gevisualiseerd in de subset van 96-wells waarvoor een gesorteerde cel met klonen hematopoietische potentieel. Als visueel geïnspecteerde wells bevatten meer dan één afzonderlijke kolonie, dan in dit voorbeeld wordt uitgesloten van de downstream-analyse uit te sluiten van monsters die meer dan één cel, gesorteerd per putje hebben gekregen.

5. analyse van het klonen van hematopoietische nakomelingen na co cultuur

1. Oogst klonen van elk 96-Wells FACS p.a..
   1. Pipetteer krachtig te distantiëren van hematopoietische cellen uit endotheel lagen met behulp van een meerkanaalspipet met 200 µL Pipetteer tips. Probeer niet te distantiëren van het endotheel laag. 100 µL (~ 50% van het monster) voor fenotypische analyse van hematopoietische nageslacht door FACS verwijderen.
   2. Overbrengen naar een 96-Wells-V-bodemplaat samen en centrifugeer bij 300 x g gedurende 2 min naar de pellet van de cellen. Verwijder het medium door flicking media van de plaat met een enkele snelle beweging, terwijl de plaat is omgekeerd (flick plaat).
   3. Plaats de resterende 100 µL cellen in de oorspronkelijke 96-wells-plaat in een 37 ° C incubatorfor gebruik in de volgende engraftment-test (stap 6).
2. Incubeer de cellen met de juiste antilichamen voor hematopoietische analyse.
   1. Resuspendeer de cel pellets in ieder putje van een 96-Wells V-bodem met 50 µL van PBS/2% FBS met 10 µg/mL FcR blok en 1 µg/mL DAPI. Incubeer de plaat bij 4 ° C gedurende 5 min.
   2. Voeg 50 µL van PBS/2% FBS met 10 µg/mL FcR blok en een mix van antilichaam voor HSC analyse met PE-Cyanine7-geconjugeerde anti-VE-cadherine, PerCP-geconjugeerde anti-CD45, PE-geconjugeerde anti-EPCR, APC-geconjugeerde anti-Sca1 en anti-Gr1 FITC-geconjugeerd en anti-F4/80 (elke antilichaam in de uiteindelijke verdunning 1:100 tenzij anders aangegeven op basis van aanbevelingen van de fabrikant of volgens titraties). Incubeer de plaat bij 4 ° C gedurende ten minste 20 min.
3. Verwijder unbound antilichaam met opeenvolgende verdunningen en analyseren van de cellen.
   1. Voeg 200 µL per putje PBS/2% FBS en centrifuge bij 300 x g gedurende 2 min naar de pellet van de cellen. Vervolgens flick plaat te Verwijder het supernatant en 200 µL PBS/2% FBS toevoegen aan elke cel pellet en centrifugeer bij 300 x g gedurende 2 min naar de pellet van cellen.
   2. Flick plaat Verwijder het supernatant en toevoegen van 50 µL per putje PBS/2% FBS voor analyse. Ga verder met het analyseren van cellen door FACS met behulp van een cytometer van de stroom voorzien van een afleesapparaat.
      Opmerking: Verwerven een vaste hoeveelheid cellen (bijvoorbeeld, 35 µL van het totale 50 µL gebruikt voor resuspensie) bij het inventariseren van de deelverzamelingen van hematopoietische nakomelingen.
4. Het analyseren van de gegevens van de FACS voor elk putje met hematopoietische nageslacht aan het scherm voor kolonies die HSC potentiële (Figuur 3 bevatten).
   1. Poort eerst de CD45 positieve bevolking dat is negatief voor myeloïde markeringen Gr1 en F480. Niet uit cellen die nog steeds uitdrukking geven aan lage niveaus van VE-cadherine gate. Cellen uit de AGM-EG-laag die worden verstoord tijdens oogst van hematopoietische kolonies zijn VE-cadherine positieve en negatieve CD45.
   2. Gate CD45⁺VE-CAD-^{- / low}Gr1^-- F4/80 cellen verder op de deelverzameling die hoge niveaus van EPCR en Sca1 express (figuur 3A -C).
      Opmerking: In de voorafgaande studies, kolonies ontbreekt cellen met CD45⁺VE-CAD-^{- / low}Gr1^-F4/80^-Sca1^HalloEPCR^Hallo fenotype (figuur 3D) geen reproducibly aantoonbaar multilineage perifeer bloed engraftment in bestraalde ontvangende muizen¹⁷ (gegevens niet worden weergegeven); deze kolonies moeten dus niet worden opgenomen in de analyse van de latere transplantatie in stap 6.

6. analyse van de Engraftment eigenschappen van individuele klonen en correlatie met fenotypische eigenschappen toegelicht door Index sorteren

1. De dag van (indien mogelijk) of de ochtend na de fenotypische analyse in stap 5, opnieuw de resterende 100 µL cellen uit elke 96-Wells met hematopoietische koloniën na co cultuur (uit stap 5.1) door krachtig pipetteren met behulp van een pipet tip van 200 µL geschorst.
2. Bereiden en redding cellen toevoegen uit hele beenmerg van congenisch stam B6. SJL-Ptprc^eenPepc^b/BoyJ (B6-CD45.1) volwassen muizen^16,17.
   1. Rekenen genucleëerde beenmergcellen in Turken oplossing onder een hemocytometer. Verdund tot een concentratie van 5 x 10 nucleated⁵ cellen/mL in PBS met 2% FBS.
   2. Voeg 100 µL van redding beenmergcellen (5 x 10-⁴) aan elk putje met hematopoietische nakomelingen voor analyse van transplantatie en meng door pipetteren.
3. Transplantatie van nakomelingen van de individuele klonen in één dodelijk bestraald ontvangende congenisch stam B6. SJL-Ptprc^eenPepc^b/BoyJ (B6-CD45.1) volwassen muis.
   1. Dodelijk bestralen hetzelfde aantal B6 CD45.1 muizen als het aantal klonen om individueel injecteren van nakomelingen van met een enkele kloon (met behulp van 1.000 cGy uit een Cesium-bron).
   2. Teken 200 µL totale celsuspensie dat is (inclusief cellen uit de kloon en 5 x 10,⁴ B6 CD45.1 redding beenmergcellen) in een ½ mL insuline-injectiespuit met een naald 29 G ½ inch.
   3. Dodelijk bestralen B6 CD45.1 volwassen ontvangers 2-24 h vóór injectie.
   4. Injecteren met behulp van een plastic muis afdekking waarmee staart toegang, via het staart ader 200 µL volume met zowel cellen uit elke kloon en 5 x 10⁴ B6 CD45.1 volwassen redding beenmergcellen op steun in begunstigde overleven.
   5. Oor label wegen de ontvangende muizen en controleren van hun gewicht/gezondheid met regelmatige tussenpozen (bv3 - 4 keer / week post bestraling/transplantatie, of per afzonderlijke institutionele standard operating procedures) om goede gezondheid.
4. Analyses van perifeer bloed engraftment op regelmatige tijdstippen (bv2, 16, 24 weken) uit te voeren na de transplantatie.
   1. 50-100 µL bloed via retro-orbitaal afloopgebied of een andere methode van ethisch goedgekeurde bloed te laten verwijderen.
   2. Voeg 3 mL lysis-buffermengsel (16.6 g NH₄Cl, 2 g NaHCO₃ en 74.4 mg EDTA tot 2 L H₂O) naar bloed en Incubeer bij kamertemperatuur voor 5 min. Centrifuge 300 x g voor 5 min. Aspirate en resuspendeer de pellet met 2 mL PBS/2% FBS. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min.
   3. Resuspendeer de pellet met 150 µL PBS/2% FBS met 10 µg/mL FcR blok en 1 µg/mL DAPI, en afzien van 1/3 van het volume op een goed met 50 µL isotype besturingselementen voor donor en afkomst, 1/3 aan een goed met 50 µL antilichaam donor en isotype controles voor afkomst , en 1/3 aan een putje 50 µL antilichamen op te sporen van zowel donor als bloedlijn met.
      Opmerking: Antilichamen voor de detectie van multilineage engraftment: APCeFluor780-geconjugeerde anti-CD45.2, Pe-Cyanine7-geconjugeerde anti-CD45.1, FITC-geconjugeerd anti-CD3, PE-geconjugeerde anti-F4/80, PerCP-geconjugeerde anti-Gr1 en APC-geconjugeerde anti-CD19, of relevante isotype besturingselementen.
   4. Identificeren van klonen met lange engraftment door beoordeling van de bijdrage van het perifeer bloed van FACS na verloop van tijd van CD45.2 (donor)-afgeleid van hematopoietische cellen naar myeloïde (Gr1 en/of F4/80 positief), B-cel (CD19 positief) en T-cel (CD3 positief) (figuur 4A -B).
      Opmerking: Hematopoietische engraftment kan ook worden geanalyseerd door CD45.2 (donor)-bijdrage hematopoietische populaties uit weefsels verkregen uit het beenmerg, milt, thymus en buikvlies, of naar aanleiding van secundaire transplantatie van beenmergcellen geoogst in B6 CD45.1 muizen voor het analyseren van seriële engraftment eigenschappen¹⁷.
5. Correleren de fenotypische eigenschappen van elke kloon zoals bepaald door de index van de eerste eencellige sorteren met zijn engraftment eigenschappen. Met de software van de analyse van de stroom, uploaden sorteer parameters voor elke index-gesorteerd op cel (gecorreleerd aan de 96-Wells waarnaar het werd gesorteerd). Functionele kaartgegevens op stroom percelen te evalueren van de fenotypische eigenschappen van afzonderlijke cellen als ze betrekking op hun functionele output (bijvoorbeeld, op lange termijn, multilineage engraftment hebben) (figuur 4C).

Resultaten

Figuur 1A blijkt een schematische voorstelling van de proefopzet. Zodra P-Sp/AGM weefsels zijn ontleed, gebundeld en losgekoppeld in collagenase, zijn ze gekleurd met antilichamen tegen VE-cadherine en EPCR voor het sorteren van de index. Pre-HSC zijn verrijkt met cellen gesorteerd op VE-cadherine⁺EPCR^hoge (figuur 1B). Andere fluorescerende-geconjugeerde antilichamen kunnen worden opgenomen om te analyseren ...

Discussie

De studie van HSC genesis tijdens de embryonale ontwikkeling vereist kunnen detecteren HSC potentiële in hemogenic precursoren nog ontbreekt de bevoegdheid om te bieden op de lange termijn multilineage hematopoietische reconstitutie in getransplanteerde volwassen ontvangers. In dit protocol presenteren we een klonale assay van embryonale hemogenic precursoren door stromale co cultuur op vasculaire niche ECs van de AVA, die de rijping van precursoren naar HSC ondersteunt, met latere functionele analyse van transplantatie ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
AGM-EC kweekmedia
Materialen voor de kweek van endotheelcellen
TrypLE Express	Gibco	12605-028	Gebruiken voor het dissociëren van AGM-EC monolagen
Gelatine 0,1% in water	StemCell Technologies	7903	Gebruiken om AGM-EC monolagen aan plastic te hechten
96-wells weefselkweekplaten	Corning	3599	Gebruiken voor co-cultuur van AGM-EC monolagen en index gesorteerd klonen
Dulbecco's Fosfaat Gebufferd Saline (PBS)	Gibco	14190-144	Gebruiken voor dissectie en FACS-kleuring
500 ml filterflessen	Fisher Scientific	9741202	Gebruiken om Endotheel media steriel te filteren
AGM-EC kweekmedia (500 ml)
Iscove's Gemodificeerd Dulbecco's Medium (IMDM)	Gibco	12440-053	400 ml
Hyclone Fetal Bovine Serum	Fisher Scientific	SH30088.03	100 ml
Penicilline Streptomycine	Gibco	15140-122	5 ml
Heparine	Sigma	H3149	50 mg opgelost in 10 ml media
L-glutamine (200 mM)	StemCell Technologies	7100	5 ml
Endotheel Mitogen (ECGS)	Alfa Aesar	J64516 (BT-203)	Voeg 10 ml media toe om op te lossen en toe te voegen
Materialen voor AGM index sorteren
Collagenase (0,25%)	StemCell Technologies	7902	Gebruiken voor dissociatie van embryonale weefsels
3 ml spuit	BD Biosciences	309657	Gebruiken om antilichaam oplossingen voor FACS sterieel te filteren
0,22 µM spuit-gestuurde filter	Millipore	SLGP033RS	Gebruiken om antilichaam oplossingen voor FACS sterieel te filteren
5 ml polystyreen buis met cel-strainer dop	Corning	352235	Gebruiken om celklonten te verwijderen voorafgaand aan FACS
DAPI (bereid als 1 mg/ml voorraad in H2O)	Millipore	268298	Gebruiken om dode cellen van de sortering uit te sluiten
anti-muis CD16/CD32 (FcR blok)	BD Biosciences	553141	Gebruiken om niet-specifieke kleuring naar Fc-receptoren te blokkeren
Antilichamen voor AGM index sorteren
Anti-muis CD144 PE-Cyanine7	eBioscience	25-1441-82	Kleuren
Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE-Cyanine7	eBioscience	25-4301-81	Isotype controle voor CD144 PE-Cyanine7
Anti-muis CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710	eBioscience	46-2012-80	Kleuren
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP-eFlour710	eBioscience	46-4031-80	Isotype controle voor CD201 PerCP-eFluor710
Anti-muis CD41 PE	BD Biosciences	558040	Kleuren
Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE	BD Biosciences	553925	Isotype controle voor CD41 PE
Anti-muis CD45 FITC	eBioscience	11-0451-85	Kleuren
Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC	eBioscience	11-4031-81	Isotype controle voor CD45 FITC
AGM-serumvrij media (10ml)
X-Vivo 20	Lonza	04-448Q	10 ml
recombinant muis stamcel factor (SCF)	Peprotech	250-03	10 ml (100 mg/ml voorraad) Eindconcentratie 100 ng/ml
recombinant humaan FLT3 Ligand (FLT3L)	Peprotech	300-19	10 ml (100 mg/ml voorraad) Eindconcentratie 100 ng/ml
recombinant humaan trombopoietine (TPO)	Peprotech	300-18	2 ml (100 mg/ml voorraad) Eindconcentratie 20 ng/ml
recombinant muis interleukine-3 (IL3)	Peprotech	213-13	2 ml (100 mg/ml voorraad) Eindconcentratie 20 ng/ml
Materialen voor het kleuren van co-gecultiveerde cellen
96 well plaat, V-bodem	Corning	3894	Gebruiken voor FACS-analyse
Antilichamen voor analyse van Index gesorteerd klonen co-gecultiveerd met endotheelcellen
Anti-muis CD45 PerCP-Cyanine5.5	eBioscience	45-0451-82	Kleuren
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE-Cyanine5.5	eBioscience	35-4031-80	Isotype controle voor CD45 PerCP-Cyanine5.5
Anti-muis CD201 (EPCR) PE	eBioscience	12-2012-82	Kleuren
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE	eBioscience	12-4031-81	Isotype controle voor CD201 PE
Anti-muis Ly-6A/E (Sca-1) APC	eBioscience	17-5981-83	Kleuren
Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC	eBioscience	17-4321-81	Isotype controle voor Ly-6A/E APC
Anti-muis F4/80 FITC	eBioscience	11-4801-81	Kleuren
Rat IgG2a kappa Isotype Control, FITC	eBioscience	11-4321-41	Isotype controle voor