Methodenartikel

Een methode voor gerichte 16S sequentiebepaling van menselijke melkmonsters

9.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56974

⸱

23 maart 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, University of California at Los Angeles

In dit artikel

Samenvatting

Een semi-geautomatiseerde workflow wordt gepresenteerd voor gerichte sequentiebepaling van het 16S rRNA van menselijke melk en andersoortige laag-biomassa monster.

Samenvatting

Studies van microbiële gemeenschappen geworden wijdverbreide met de ontwikkeling van relatief goedkope, snelle en hoge doorvoer sequencing. Echter, zoals met al deze technologieën, reproduceerbare resultaten hangen af van een laboratorium-werkstroom waarin passende voorzorgsmaatregelen en over besturingselementen. Dit is vooral belangrijk met lage-biomassa monsters waar besmetting van bacteriële DNA kan misleidende resultaten genereren. In dit artikel een overzicht van een semi-geautomatiseerde workflow voor het identificeren van de microben van menselijke borst melkmonsters met behulp van gerichte sequentiebepaling van het 16S ribosomaal RNA (rRNA) V4 regio op een schaal voor de lage en Midden throughput. Het protocol beschrijft de bereiding van de monsters van volle melk inclusief: proeven van lysis, nucleic zuur extractie, versterking van de V4-regio van het 16S rRNA gen, en de voorbereiding van de bibliotheek met kwaliteitscontrole maatregelen. Nog belangrijker is, het protocol en de discussie punten in overweging nemen die meest opvallende aan de voorbereiding en analyse van lage-biomassa monsters zijn, met inbegrip van passende positieve en negatieve controles, de verwijdering van de Inhibitor van de omwenteling van de PCR, monster besmetting door milieu-, reagens, of experimentele bronnen, en experimentele praktijken ter verzekering van de reproduceerbaarheid. Terwijl het protocol zoals beschreven specifiek voor menselijke melkmonsters is, is het aan te passen aan de talrijke lage - en hoge-biomassa monster soorten, met inbegrip van monsters die op de wissers, bevroren puur of gestabiliseerde in een buffer van behoud.

Inleiding

De microbiële gemeenschappen die mens koloniseren worden verondersteld te zijn kritisch belangrijk voor menselijke gezondheid en ziekte beïnvloeden metabolisme, immuunsysteem ontwikkeling, gevoeligheid voor ziekte en reacties op vaccinatie en drug therapie1, 2. inspanningen om te begrijpen van de invloed van de microbiota op de menselijke gezondheid op dit moment benadrukken de identificatie van microben gekoppeld omschreven anatomische compartimenten (d.w.z.huid, darmen, oral, etc.), evenals gelokaliseerde sites binnen Deze compartimenten3,4. Grondslag van deze investigative inspanningen is het snelle ontstaan en de grotere toegankelijkheid van volgende-generatie sequencing (NGS) technologieën die een massaal parallelle platform te voor analyse van de microbiële genetische inhoud (microbiome) van een steekproef bieden. Voor veel fysiologische monsters, de bijbehorende microbiome is zowel complexe en overvloedige (d.w.z., ontlasting), maar voor sommige monsters, het microbiome wordt vertegenwoordigd door lage microbiële biomassa (dat wil zeggenmenselijke melk, lagere luchtwegen) waar gevoeligheid, experimentele artefacten en mogelijke verontreiniging worden belangrijke kwesties. De gemeenschappelijke uitdagingen van microbiome studies en passende proefopzet hebben het voorwerp geweest van meerdere review artikelen5,6,7,8.

Hierin gepresenteerd is een robuuste NGS experimentele pijpleiding gebaseerd op gerichte sequentiebepaling van het rRNA 16S V4 regio9 te karakteriseren van de microbiome van menselijke melk. Microbiome analyse van menselijke melk is ingewikkeld, niet alleen door een inherent lage microbiële biomassa10, maar bovendien door hoge niveaus van menselijk DNA achtergrond11,12,13,14 en potentiële overdracht van PCR remmers15,16 in de uitgepakte nucleïnezuur. Dit protocol is afhankelijk van verkrijgbare extractie kits en semi-geautomatiseerde platformen die kunnen helpen bij het minimaliseren van de variabiliteit in de sample voorbereiding batches. Het bevat een welomschreven bacteriële mock Gemeenschap dat naast de monsters wordt verwerkt als een kwaliteitscontrole te valideren van elke stap in het protocol en het bieden van een onafhankelijke metric van de robuustheid van de pijpleiding. Hoewel het protocol als beschreven specifiek voor de menselijke melkmonsters is, het is gemakkelijk aan te passen aan andere steekproef vormen, met inbegrip van de ontlasting, rectaal, vaginale, huid, areolar en mondelinge swabs10,17, en kan dienen als uitgangspunt voor onderzoekers die willen microbiome analyses uitvoeren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Goede persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) gedragen moet worden voor alle stappen van het protocol, en strenge verontreiniging preventie benaderingen dienen te worden genomen. Stroom van het werk van pre amplificatie werkplaatsen aan na versterking werkgebieden te minimaliseren van verontreiniging van monsters te observeren. Alle leveringen gebruikt zijn steriel, gratis RNase, DNase en DNA pyrogeen. Alle Pipetteer tips worden gefilterd. Een stroomdiagram van de stappen van het protocol wordt verstrekt (Figuur 1).

1. steekproef Lysis

Opmerking: De lysis van de steekproef en extractie van de nucleïnezuur worden uitgevoerd met behulp van een DNA/RNA extractie kit in een schone kamer omgeving waar zowel de engineering en de procedurele controles plaats om te minimaliseren van de invoering van milieu bacteriën in de monsters worden.

  1. Gebied van werkvoorbereiding
    1. Het kabinet van de bioveiligheid (BSC) werken schoon gebied met passende oppervlak cleaner te elimineren elke besmetting van de nucleïnezuur.
    2. Inschakelen van de temperatuurregeling vortexer, en zet deze op 37 ° C.
  2. Guanidinium kaliumthiocyanaat lysis-buffermengsel bereiden (zie tabel van materialen)
    1. Controleer de lysis-buffermengsel voor precipitaten. Opnieuw los precipitaten door opwarming van de aarde bij 37 ° C.
    2. 600 µL van lysis buffer met 6 µL β-mercaptoethanol (β-ME) voorbereiden op elk monster. Overwegen een extra 20% volume per monster.
  3. Bereiding van de monsters
    1. Als volle melk is bevroren, ontdooien het op ijs. Geheel aliquoot 5 mL melk in een 15-mL of een 5-mL steriele buis in de BSC en bewaar deze op ijs.
    2. Draai de 5 mL melk aliquoot gedurende 10 minuten bij 5.000 x g bij 4 ° C tot pellet cellen.
    3. Verwijder de vetlaag, nu de bovenste laag in de buis, met een plastic spatel of grote boring pipette uiteinde.
    4. Verwijderen zonder de pellet te verstoren, alle het supernatant met uitzondering van 100 µL.
    5. De pellet wassen door resuspending in 1 mL steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
    6. Bereiden 1 negatieve controle door toevoeging van 1 mL steriel PBS tot een 5-mL koker.
    7. Spoel de suspensie tot een schone 1.5-mL centrifugebuis, en draaien in een microcentrifuge voor 1 min (5000 x g bij kamertemperatuur (RT)).
    8. Gebruik een 1.000 µL steriele gefilterde pipette uiteinde te ontdoen van de volledige laag van de bovendrijvende substantie/vetzuren.
    9. Als niet uitpakken van dezelfde dag, breek bevriezen de cel pellet door de gegevens in een ethanol/droog ijs drijfmest, en onmiddellijk over te brengen naar de vriezer-80 ° C.
  4. Verstoring van de steekproef en homogenisering (Parel-pak slaag)
    1. Voeg 600 µL van lysis buffer met β-ME naar de pellet, en spoel de suspensie tot een koker kraal.
    2. Elke batch van de extractie van 12 bevat 10 monsters, 1 negatieve controle (bereid in stap 3.7 hierboven) en 1 positieve controle (bereid in de volgende stap).
      1. 1 positieve controle met lysis-buffermengsel en 20 µL van het bacteriële mock monster (de mock Gemeenschap gebruikt heeft een concentratie, eenmaal uitgepakt, van ongeveer 0,2 ng/µL van DNA) voor te bereiden.
    3. Vortex alle bead buizen krachtig gedurende 15 s.
    4. De monsters van de warmte op de temperatuurgevoelig vortexer bij 37 ° C gedurende 10 min, met schudden bij 700-800 rpm.
    5. Buizen in de geautomatiseerde monster disruptor adapter set laden.
    6. Kraal verslaan voor 1 min bij 30 Hz.
    7. Demonteren van de adapter set en handmatig schakelen de adapter instellen met de monster-platen van de linker robotarm tot de rechts robotarm van het instrument.
    8. Kraal beat voor een andere 1 min bij 30 Hz.
    9. Centrifuge buizen bij 17,200 x-g, gedurende 3 min bij 25 ° C.
    10. Alle van het supernatans dat 200 µL Pipetteer voorzichtig niet om om het even welk van de vette laag aan de bovenkant van het monster of de kraal residuele aan de onderkant van het monster, en toepassen van een homogenizer kolom verwijderen.
    11. Centrifuge homogenizer kolommen ter maximum-vaart, 17,200 x-g, voor 3 min bij 25 ° C.
    12. 350 µL van het eluaat overbrengen van de fabrikant van een 2-mL microcentrifuge buis voor gebruik met de geautomatiseerde instrument voor zuivering van DNA en RNA (gebruik niet een andere buis). Wees voorzichtig niet over te dragen van eventuele resterende vette laag.
    13. Als het volume doorstroming minder dan 350 µL is, lysis-buffermengsel met β-ME aan een eindvolume van 350 µL toevoegen.
    14. Laten de monsters op RT voor maximaal 2 uur voordat u verdergaat nucleïnezuur isolatie met behulp van de geautomatiseerde DNA zuivering instrument of bevriezen bij-80 ° C.
  5. Schoonmaak werkgebied
    1. Schoon alle oppervlakken in gebruik met een oplossing van de niet-enzymatische decontaminatie, laat gedurende 10 minuten, dan spuiten met 70% ethanol en veeg beneden het oppervlak.

2. DNA/RNA isoleren

  1. Gebied van werkvoorbereiding
    1. Zet de warmte blok en de temperatuur instellen tot 70 ° C.
    2. Zet de vortexer temperatuurgevoelig en selecteer de temperatuur tot 37 ° C.
    3. Opwarmen van de elutie buffer (EB) met 10 mM Tris-Cl, pH 8,5, in een tube van 50 mL tot 70 ° C.
    4. Opwarmen van 350 µL van bevroren monster lysates in de buizen 2 mL bij 37 ° C tot volledig ontdooid zonder een eventueel neerslag (ongeveer 10 min).
  2. DNA zuivering
    1. Vortex en centrifuge de 2-mL buisjes met proeven van kort (3000 x g voor 10 s).
    2. 2 mL buizen in de shaker geautomatiseerde DNA/RNA zuivering van het instrument laden grafiek, per de instructies van de fabrikant na invoegen.
    3. Krijgen van de rotor-adapters en hen ingesteld op de lade op basis van het aantal monsters.
    4. Label elke adapter van de rotor op basis van het monster de identificatie (ID).
    5. Afgesneden de deksels en de randen van individuele spin kolommen vloeiend voor DNA en RNA.
    6. Voeg de DNA spin kolom zonder de collectie buis in de rotor-adapter. Gooi de collectie buis.
    7. Label 1,5 mL collectie buizen en rotor adapters invoegen.
    8. Rotor adapters in de centrifuge na geautomatiseerde DNA/RNA zuivering van het instrument laden grafiek instellen
    9. Invoegen van fabrikant 1.000 µL filter-tips in tip racks.
    10. RNase-vrij water aan van de fabrikant van een 2-mL microcentrifuge buis op basis van het aantal monsters (per specifieke machineinstructies protocol) toevoegen.
    11. Plaats de buis in buis sleuf "A" van microcentrifuge buis "slots".
    12. Gooi een reagens dat in reagens flessen en vul met een minimaal volume van 10 mL overblijft.
    13. Reagens flessen invoegen in het reagens Flessenrek (behalve EB fles).
    14. Warme EB uit een tube van 50 mL toevoegen aan het reagens fles standpunt 6.
    15. Selectievakje 1,5 mL tubes zijn strak in de rotor adapters geplaatst.
    16. Sluit het instrument deksel en selecteer: "RNA" → "Extractie kit" → "Dier, weefsels en cellen" → "kit's naam 350 µL deel A Custom DNA" → bewerken Elution Volume 100 µL (standaard) of 50 µL voor lage biomassa monsters → 'Start'.
    17. Als alles klaar is, verwijder rotor adapters uit de centrifuge en plaats ze in de lade legt.
    18. Gooi de DNA spin kolom vanaf rotor adapter positie 3.
    19. Gooi niet rotor adapters, RNA is in positie 2.
    20. Verwijderen 1,5 mL collectie buizen met geëlueerd DNA op positie 3 en sla op −20 ° c bedragen.
    21. Verzamelen van monster-bevattende buizen van de shaker en winkel in −20 ° C, als een monster, anders negeren overblijft.
    22. Ga verder met het protocol "kit's naam 350 µL deel B RNA" voor verdere zuivering van RNA.
    23. RNA zuivering zal gebeuren van de ongeveer 350 µL doorstroomtest thats in de middelste positie van de rotor-adapters.
  3. RNA zuivering
    1. Voeg de RNA spin kolom zonder collectie buis en deksel in de rotor-adapter.
    2. Label nieuwe 1,5 mL collectie buizen en voegt u deze in de rotor adapter zoals aangegeven in de handleiding.
    3. Zet de rotor adapters in de centrifuge na geautomatiseerde DNA/RNA zuivering van het instrument laden grafiek.
    4. Sluit het instrument deksel en selecteer: "RNA" → "Fabrikant Kit" → "Dier, weefsels en cellen" → "Standaard deel B RNA" → "Start."
    5. Wanneer voltooid, verwijder rotor adapters uit de centrifuge en plaats ze in de lade legt.
    6. Gooi RNA spin kolom in positie 3.
    7. 1,5 mL collectie buizen met 30 µL geëlueerd RNA op positie 3 te verwijderen en opslaan bij −80 ° C.
    8. Verwijder reagens flessen.
    9. Rotor adapter inhoud via kanalen van de passende gevaarlijk afval afvoeren.
  4. Schone werkplek
    1. Spray alle geautomatiseerde DNA/RNA zuivering van het instrument accessoires, zoals reagens rekken, lade en elke andere ondergrond in gebruiken met een niet-enzymatische decontaminatie-oplossing, laat gedurende 10 minuten en spoel af met gedeïoniseerd water (DI) en laat ze drogen.
    2. Spray de geautomatiseerde instrument met alleen fabrikant goedgekeurde niet-enzymatische decontaminatie oplossing, veeg de binnenkant van de centrifuge samen met alle oppervlakken in gebruik, laat gedurende 10 minuten en vervolgens veeg met 70% ethanol. Gebruik geen andere soorten decontaminatie oplossingen als ze schade aan het instrument veroorzaken kunnen.

3. gerichte 16S PCR Set-up

Opmerking: De set-up voor de 16S-PCR wordt uitgevoerd in een aangewezen pre amplificatie werkruimte gelegen binnen de schoon-kamer. De reagentia en monsters worden voorbereid en vervolgens geladen op een vloeibare handler voor het uitvoeren van PCR voor elk monster in drievoud (30 monsters, waaronder waar monsters en extractie positieve en negatieve controles, plus 2 PCR van het water controles in drievoud, voor een totaal van 96 gecombineerde monsters en besturingselementen). Zodra de PCR reacties worden geassembleerd en verzegeld, wordt de plaat van het monster overgebracht naar een thermische cycler gelegen in een gebied na versterking voor fietsen.

  1. Gebied van werkvoorbereiding
    1. Reinig het PCR-werkstation. Spray die alle oppervlakken in gebruik met een DNA RNase, DNase, decontaminant, gevolgd door DI water twee keer, en ten slotte 70% ethanol.
    2. Het 16S PCR werkblad voorbereiden (Zie gerichte 16S PCR werkblad) met een nauwkeurige monster lijst en toewijzen verschillende barcoded inleidingen op elk monster9. Afdrukken van het werkblad en de kaarten van de plaat (zie plaat 1).
  2. PCR master mix voorbereiding
    Opmerking: 16S primer selectie is gebaseerd op de regio van belang voor de bijzondere studie, en kan veranderen door het type studie of monster. Daarom voor het bestellen van inleidingen, is het belangrijk om te bevestigen wat ruimte van het 16S rRNA beste versterkt de microben van belang voor de bijzondere studie. Dit protocol zoals geschreven is voor versterking van het 16S V4 regio. Als er verschillende inleidingen/regio zijn geselecteerd, kan dan de onthardende temperatuur in de temperatuurcycli aanpassing vereist.
    1. Werken in het PCR-werkstation te bereiden alles.
    2. Neem 50-100 µL van DNA-monsters van-20 ° C, en alle van de reagentia die nodig zijn, en hen in de ijskast ontdooien. Vortex en kort draaien naar beneden.
    3. De inleidingen zijn vooraf verdund tot de concentratie van de werken van 5 µM in een minimale hoeveelheid 20 µL.
    4. Voorbereiding van de master mix van PCR in de specifieke 5 mL tube met alleen de voorwaartse primer volgens de berekening op het werkblad.
  3. Voorbereiden van de robotic vloeibare handler op geautomatiseerde PCR setup
    1. Bij monsters moet nemen van het instrument van een 32-well monster adapter en laden 50-100 µL van DNA-monsters volgens de 96-wells-plaat kaart volgens de instructies van de fabrikant.
      1. Voor elke PCR plaat, instellen 2 negatieve controles door het plaatsen van 30 µL van het PCR water in een schone monsterbuisje.
      2. Plaats alle monsters op het 32-well instrument steekproef adapter met doppen vergrendeld in open positie.
    2. Voor de omgekeerde inleidingen9
      1. Verwijder de dop van elke omgekeerde primer met specifieke barcode # 's één tegelijk (verandering handschoenen tussen Kruis-om verontreiniging te voorkomen).
      2. Plaats een maximum van 32 inleidingen op het instrument reagens adapter.
    3. Neem een plaat van de PCR 96-Wells en geef deze het label met de naam van de studie, monster nummer, datum, en de technicus de initialen.
    4. Laden van de robot vloeibare handler
      1. Plaats de adapter reagens in positie B1. Ter vermijding van een randeffect, zorgvuldig plaats een van de randen van de adapter tegen de zijkant van de handgreep en breng de andere rand langzaam naar beneden. Zorg ervoor dat druk op alle hoeken van de adapters.
      2. Plaats de adapter van de steekproef in positie C1. Zorg ervoor dat druk op alle hoeken van de adapters.
      3. Vortex de master mix van 5 mL, open het GLB, en plaats het in positie A op de master mix en reagens blok van het instrument.
      4. Plaats de PCR-plaat op de adapter van de 96-Wells-instrument dat bedoeld is om te houden van half skirted PCR platen.
      5. De run start en opslaan als een nieuw bestand.
      6. Volg de aanwijzingen en check Markeer elke prompt: één, tips zijn beschikbaar, twee, afgewerkte doos is beschikbaar, en drie, beginnen.
    5. Nadat de run voltooid is, controleert u of er geen fouten zijn door het controleren van de machine voor foutberichten.
    6. Afdichting van de plaat met de 12 of 8 strip caps, vortex krachtig, en spin down voor 1 min met behulp van een 96-wells-plaat spinner en plaats deze op het ijs of in de koelkast.
    7. Verwijderen van buizen met omgekeerde inleidingen en monsters.
    8. Neem de 96-wells-plaat naar de kamer na versterking en laden van de plaat op de thermische cycler en de cyclus volgens de tabel van thermisch-Fiet & Mountainbike voorwaarden (Zie tabel 1).

4. gerichte 16S Post-PCR kwaliteitscontrole met behulp van Tape-gebaseerd Platform voor de Elektroforese van het Gel

Opmerking: Post-PCR kwaliteitscontrole (QC) en alle volgende stappen worden uitgevoerd in een daarvoor aangewezen gedeelte van de post versterking van het lab. Het DNA wordt geanalyseerd in een geautomatiseerde DNA/RNA fragment analyzer.

  1. Gebied van werkvoorbereiding
    1. Reinig het werkstation door spuiten die alle oppervlakken in gebruik met een RNase, DNase, DNA decontaminant, gevolgd door DI water twee keer, en ten slotte 70% ethanol.
    2. Verzamel alle benodigdheden en apparatuur die nodig is.
  2. Bereiden van reagentia
    1. Plaats monster buffer en ladder in de vortexer temperatuurgevoelig bij 25 ° C gedurende ten minste 30 min.
  3. Terwijl de reagentia zijn warming-up, PCR monsters te bereiden door het bundelen van de 3 PCR wordt gerepliceerd voor elk monster in een enkele buis
  4. Monsters op instrument laden.
  5. Kort vortex en spin down buizen met gebundelde PCR product.
  6. Plaats van het instrument 96-wells-plaat op een rek op RT en geef deze het label.
  7. Kort vortex en spin down de monster buffer en ladder.
  8. Voeg 3 µL monster buffer toe aan elk putje van de 96 goed plaat (behoefte ten minste 53 µL/scherm tape).
  9. Uitvoeren van een even aantal monsters; Als er oneven aantal monsters, Voeg 4 µL van monster buffer aan een lege putje.
  10. Voeg 1 µL van ladder naar een ladder ook.
  11. Na de kaart, 1 µL van gebundelde PCR product toevoegen aan haar aangewezen goed.
  12. Afdekplaat met folie afdichting
  13. Vortex de plaat met behulp van de vortexer en de adapter van het instrument op 2.000 rpm voor 1 min.
  14. Spin opnieuw naar positie het monster aan de onderkant van de buis, als er bubbels spin naar beneden.
  15. Start de software.
  16. De scherminfo tape en laden in het instrument laden.
  17. Monsters in de fragment-analyzer met een 96-Wells-adapter te laden.
  18. Instellen van een run met de controller-software.
  19. Zorg ervoor dat u zelfs genummerde wells.
  20. Schrijven monster IDs.
  21. Controleer dat alle putjes van de cassette scherm grijs zijn gemarkeerd.
  22. Zorg ervoor dat de analyzer herkent alle uiteinden van de pipet.
  23. Selecteer start en geef een bestandsnaam als de resultaten (studie naam, monster getallen en datum) wilt opslaan.
  24. Verwijzen naar de instructies van de fabrikant voor meer informatie.
  25. Na de run voltooid is, gooi tip, scherm tape en buizen.
  26. Analyseren van gegevens voor 16S piek nM (tussen 315-450 bp voor V4). Deze piek hangt af van de inleidingen geselecteerd.

5. bibliotheek berekening, bundeling, Clean-up, en QC

  1. Na het bepalen van de grootte van de amplicon en molarity van alle monsters, bundelen de bibliotheken om de gewenste eindvolume en nM voor de gepoolde bibliotheek te bereiken (zie voorbeeld berekening).
  2. Sanering en concentraat de gepoolde bibliotheek met behulp van een zuivering silica membraan-gebaseerde kit voor PCR producten, volgens de fabrikant protocol (Zie Tabel van materialen).
    1. Elueer het DNA met een eindvolume van 50 µL.
  3. Meten van de concentratie van de schoongemaakte bibliotheek onmiddellijk met behulp van een dubbele gestrande DNA hoge gevoeligheid kit voor een Fluorimeter, volgens protocol van de fabrikant.
    1. Verdun 2 µL van de gebundelde en gereinigd bibliotheek met 198 µL van de verdunning buffer plus kleurstof (1:100 verdunning).
    2. De gemeten waarde van het fluorimetrische apparaat opnemen en zet het volgens de verdunningsfactor.
  4. Met behulp van de concentratie (ng/µL) lezen voor de gepoolde bibliotheek, berekenen de bibliotheek molarity in nM. 1 µL onverdund bibliotheek gebruiken voor het meten van de OD260/280 op een microvolume spectrofotometer.
    Opmerking: De waarde van 1.8-2.0 geeft voldoende zuiverheid van de bibliotheek.
  5. Bewaren de definitieve bibliotheek bij-20 ° C tot klaar voor de volgende generatie sequencing.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het hier gepresenteerde protocol omvat belangrijke kwaliteitscontrole (QC) stappen om ervoor te zorgen dat de gegevens die zijn gegenereerd meet benchmarks voor de gevoeligheid, specificiteit en besmetting control protocol. Van het protocol eerste QC stap volgt PCR versterking van het 16S V4 regio (Figuur 2). Één µL van het PCR-product van elk monster werd geanalyseerd door elektroforese om te bevestigen dat er binnen het bereik van de verwachte grootte van 3...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Gerichte volgende-generatie sequentiebepaling van het 16S rRNA is een veel gebruikte, snelle techniek voor microbiome karakterisering18. Echter kunnen vele factoren, met inbegrip van de effecten van de batch, milieuverontreiniging, monster kruisbesmetting, gevoeligheid en reproduceerbaarheid negatief beïnvloeden van experimentele resultaten en beschamen hun interpretatie7,19 , 20. om beste robuuste 16S an...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We zouden graag bedanken Helty Adisetiyo, PhD en Shangxin Yang, PhD voor de ontwikkeling van het protocol. Algemene steun voor de internationale moeders Pediatric Adolescent AIDS klinische proeven groep (IMPAACT) werd verzorgd door de nationale Instituut van allergie en besmettelijke ziekten (NIAID) van de National Institutes of Health (NIH) onder de nummers van de Award UM1AI068632 (IMPAACT LOC), UM1AI068616 (IMPAACT SDMC) en UM1AI106716 (IMPAACT LC), met medefinanciering uit de Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health en menselijke ontwikkeling (NICHD) en het National Institute of Mental Health (NIMH). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de NIH.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AllPrep RNA/DNA Mini KitQiagen80204DNA/RNA extractiekit
EliminaseFisher Scientific435532RNase, DNase, DNA decontaminant
Thermo MixerFisher Scientifictemperatuurgestuurde vortexer
Buffer RLT plusQiagen1053393guanidiniumthiocyanaat lyse buffer/ Onderdeel van Allprep kit
ß-MercaptoethanolSigma Aldrich63689-25ML-Fß-ME is een reducerend middel dat RNases onomkeerbaar denatureert door disulfidebindingen te verminderen
LME BeadsMP Biomedicals116914050kralenbuisje
QIAgen TissueLyzerQiagen85300geautomatiseerde set voor monsterverstoreradapter
QIAshredder kolomQiagen79654
QIAgen RB buismicrocentrifugebuis van de fabrikant in kit
QIAcube en gerelateerde plasticwarenQiagen9001292geautomatiseerd instrument voor DNA/RNA-zuivering
DNA exitus plusApplichemA7089niet-enzymatische decontaminatieoplossing
EB BufferQiagen19086elutiebuffer
QIAgility en gerelateerde plasticwarenQiagen9001532robotische vloeistofhandelaar
PCR waterMO BIO17000-
5PRIME HotMasterMixQuantabio2200400
Barcoded reverse primersEurofinGeen catalogusnummersontworpen en besteld
96 well PCR plateUSA scientific1402-9708
Tapestation 2200 en gerelateerde plasticwarenAgilentG2964AAgeautomatiseerde DNA/RNA-fragmentanalyzer
D1000 reagents voor TapestationAgilent5067-5585Staalbuffer en ladder maken deel uit van deze kit
OneStep PCR Inhibitor Removal KitZymo Research50444470Verwijdering van PCR-remmers gebeurt volgens de instructies van de fabrikant.
QIAquick PCR Purification KitQiagen28104DNA opruimingskit: silica-membraangebaseerde zuivering van PCR-producten
Qubit dsDNA HS Assay KitThermo FisherQ32854dimethylsulfoxide-gebaseerde verdunningsbuffer en kleurstof maken deel uit van deze kit.
Qubit FluorometerThermo FisherQ33216
NanoDropThermo Fishermicrovolume spectrofotometer
MiSeq 300 V2 kitIllumina15033624/15033626
MiSeqIlluminaGeen catalogusnummersnext generation sequencer
```

Referenties

  1. Ahern, P. P., Faith, J. J., Gordon, J. I. Mining the human gut microbiota for effector strains that shape the immune system. Immunity. 40 (6), 815-823 (2014).
  2. Postler, T. S., Ghosh, S. Understanding the Holobiont: How Microbial Metabolites Affect Human Health and Shape the Immune System. Cell Metab. , (2017).
  3. Hall, M. W., et al. Inter-personal diversity and temporal dynamics of dental, tongue, and salivary microbiota in the healthy oral cavity. NPJ Biofilms Microbiomes. 3, 2(2017).
  4. Perez Perez, G. I., et al. Body Site Is a More Determinant Factor than Human Population Diversity in the Healthy Skin Microbiome. PLoS One. 11 (4), e0151990(2016).
  5. Hamady, M., Knight, R. Microbial community profiling for human microbiome projects: Tools, techniques, and challenges. Genome Res. 19 (7), 1141-1152 (2009).
  6. Human Microbiome Project, C. A framework for human microbiome research. Nature. 486 (7402), 215-221 (2012).
  7. Kim, D., et al. Optimizing methods and dodging pitfalls in microbiome research. Microbiome. 5 (1), 52(2017).
  8. Hugerth, L. W., Andersson, A. F. Analysing Microbial Community Composition through Amplicon Sequencing: From Sampling to Hypothesis Testing. Front Microbiol. 8, 1561(2017).
  9. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).
  10. Pannaraj, P. S., et al. Association Between Breast Milk Bacterial Communities and Establishment and Development of the Infant Gut Microbiome. JAMA Pediatr. , (2017).
  11. Ho, F. C., Wong, R. L., Lawton, J. W. Human colostral and breast milk cells. A light and electron microscopic study. Acta Paediatr Scand. 68 (3), 389-396 (1979).
  12. Parmely, M. J., Beer, A. E., Billingham, R. E. In vitro studies on the T-lymphocyte population of human milk. J Exp Med. 144 (2), 358-370 (1976).
  13. Sabbaj, S., et al. Human immunodeficiency virus-specific CD8(+) T cells in human breast milk. J Virol. 76 (15), 7365-7373 (2002).
  14. Jimenez, E., et al. Metagenomic Analysis of Milk of Healthy and Mastitis-Suffering Women. J Hum Lact. 31 (3), 406-415 (2015).
  15. Ghosh, M. K., et al. Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 in breast milk. J Clin Microbiol. 41 (6), 2465-2470 (2003).
  16. Lim, N. Y., Roco, C. A., Frostegard, A. Transparent DNA/RNA Co-extraction Workflow Protocol Suitable for Inhibitor-Rich Environmental Samples That Focuses on Complete DNA Removal for Transcriptomic Analyses. Front Microbiol. 7, 1588(2016).
  17. Bender, J. M., et al. Maternal HIV infection influences the microbiome of HIV-uninfected infants. Sci Transl Med. 8 (349), 349ra100(2016).
  18. Cox, M. J., Cookson, W. O., Moffatt, M. F. Sequencing the human microbiome in health and disease. Hum Mol Genet. 22 (R1), R88-R94 (2013).
  19. Lauder, A. P., et al. Comparison of placenta samples with contamination controls does not provide evidence for a distinct placenta microbiota. Microbiome. 4 (1), 29(2016).
  20. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 12, 87(2014).
  21. Walker, A. W., et al. 16S rRNA gene-based profiling of the human infant gut microbiota is strongly influenced by sample processing and PCR primer choice. Microbiome. 3, 26(2015).
  22. Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples. Gut Pathog. 8, 24(2016).
  23. Kennedy, K., Hall, M. W., Lynch, M. D., Moreno-Hagelsieb, G., Neufeld, J. D. Evaluating bias of illumina-based bacterial 16S rRNA gene profiles. Appl Environ Microbiol. 80 (18), 5717-5722 (2014).
  24. Weiss, S., et al. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biol. 15 (12), 564(2014).
  25. Aho, V. T., et al. The microbiome of the human lower airways: a next generation sequencing perspective. World Allergy Organ J. 8 (1), 23(2015).
  26. Charlson, E. S., et al. Topographical continuity of bacterial populations in the healthy human respiratory tract. Am J Respir Crit Care Med. 184 (8), 957-963 (2011).
  27. Bittinger, K., et al. Improved characterization of medically relevant fungi in the human respiratory tract using next-generation sequencing. Genome Biol. 15 (10), 487(2014).
  28. Jervis-Bardy, J., et al. Deriving accurate microbiota profiles from human samples with low bacterial content through post-sequencing processing of Illumina MiSeq data. Microbiome. 3, 19(2015).
  29. Knights, D., et al. Bayesian community-wide culture-independent microbial source tracking. Nat Methods. 8 (9), 761-763 (2011).
  30. Lazarevic, V., Gaia, N., Girard, M., Schrenzel, J. Decontamination of 16S rRNA gene amplicon sequence datasets based on bacterial load assessment by qPCR. BMC Microbiol. 16, 73(2016).
  31. Kurilshikov, A., Wijmenga, C., Fu, J., Zhernakova, A. Host Genetics and Gut Microbiome: Challenges and Perspectives. Trends Immunol. 38 (9), 633-647 (2017).
  32. ATCC. Mock microbial communities. , Available from: https://www.atcc.org/en/Products/Microbiome_Standards.aspx?utm_id=t170601524l1 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

16S sequencinglage biomassamonstervoorbereidingextractie van nucle nezurenamplificatie van de V4 regiolibrary preparatiekwaliteitscontrolecontaminatiecontrolessemi automatisch protocol

Gerelateerde artikelen