Methodenartikel

Gelijktijdige meting van Superoxide/waterstofperoxide en NADH productie door Flavin-bevattende mitochondriale Dehydrogenases

DOI:

10.3791/56975

⸱

24 februari 2018

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Memorial University of Newfoundland

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondriën bevatten verschillende flavin-afhankelijke enzymen die van reactieve zuurstof soorten (ROS produceren kunnen). Controle van ROS is vrijlating uit afzonderlijke sites in mitochondriën uitdagend als gevolg van ongewenste kant reacties. We presenteren een gemakkelijke en goedkope methode voor directe beoordeling van inheemse tarieven voor ROS release met behulp van gezuiverde flavoenzymes en microplate fluorometry.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er werd gemeld dat de mitochondriën maximaal 12 enzymatische bronnen van reactieve zuurstof soorten (ROS) kunnen bevatten. Een meerderheid van deze sites zijn flavin-afhankelijke respiratoire complexen en dehydrogenases die een mengsel van superoxide (O2● -) en waterstof peroxide (H2O2) produceren. Nauwkeurige kwantificering van de ROS-producerende potentieel van afzonderlijke sites in geïsoleerde mitochondriën kunnen zijn uitdagend als gevolg van de aanwezigheid van antioxidant defense-systemen en reacties van de kant die ook O2● -/H2O2 vormen. Gebruik van niet-specifieke remmers die mitochondriale Bioenergetica verstoren kan kunt ook metingen compromis door een wijziging van de ROS release van andere sites van de productie. Hier presenteren we een eenvoudige methode voor de gelijktijdige meting van H2O2 release en nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) productie door gezuiverde flavin alternerende dehydrogenases. Wij hebben voor onze doeleinden hier, gezuiverde pyruvaat dehydrogenase complex (PDHC) en α-ketoglutarate dehydrogenase complex (KGDHC) van oorsprong van de varkens hart gebruikt als voorbeelden. Deze methode zorgt voor een nauwkeurige maatstaf van inheemse H2O2 release tarieven door afzonderlijke sites van de productie door het elimineren van andere potentiële bronnen van ROS en antioxidant systemen. Bovendien, zorgt deze methode voor een directe vergelijking van de relatie tussen de H2O2 release en de enzymactiviteit en de screening van de doeltreffendheid en de selectiviteit van remmers voor de productie van ROS. Over het geheel genomen is deze aanpak kan zorgen voor de grondige evaluatie van inheemse tarieven van ROS release voor afzonderlijke enzymen voorafgaand aan meer geavanceerde experimenten met geïsoleerde mitochondriën of spiervezel permeabel.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het uiteindelijke doel van nutriënten metabolisme is dat adenosinetrifosfaat (ATP). In de cellen van zoogdieren, dit gebeurt in de mitochondriën, dubbel-membraned organellen die de energie opgeslagen in koolstof in ATP omzetten. De productie van ATP begint wanneer koolstof is verbrand door de mitochondriën vormen twee elektron luchtvaartmaatschappijen, NADH en flavine adenine dinucleotide (FADH2)1. NADH en FADH2 worden vervolgens geoxideerd door multi subeenheid respiratoire complexen I en II, respectievelijk, en de bevrijde elektronen zijn overgezet naar de terminal elektron acceptor moleculaire zuurstof (O2) bij complexe IV1. De thermodynamisch gunstige "afdaling" overdracht van elektronen aan O2 aan het einde van de keten is gekoppeld aan de export van protonen in de intermembrane ruimte door complexen I, III en IV. Hierdoor ontstaat een transmembraan elektrochemische gradiënt van protonen (proton-motor), een tijdelijke vorm van Gibbs vrije energie die wordt onttrokken door complexe V om ATP2te brengen. Electron transfer reacties in mitochondriën zijn niet perfect gekoppeld aan de ATP productie. Op verschillende punten in de citroenzuurcyclus en de luchtwegen keten, kunnen elektronen voortijdig communiceren met O2 aan formulier ROS3. Het meest biologisch relevante ROS gegenereerd door mitochondriën zijn O2●- en H2O2. Hoewel O2● - wordt vaak beschouwd als de proximale ROS gevormd door mitochondriën, is het nu duidelijk dat sites van productie een mengsel van O2●- en H2O2 vormen, die is gekoppeld aan het vrije verkeer radicale chemie van flavin prothetische groepen4,5. Op een hoog niveau kunnen ROS gevaarlijke, schadelijke biologische bestanddelen die nodig zijn voor cel functie wat resulteert in oxidatieve nood6. Echter bij lage bedragen vervullen mitochondriale ROS signalering lichaamsfuncties. Bijvoorbeeld heeft H2O2 vrijlating uit de mitochondriën betrokken bij de controle van T-cel activatie, stress signalering (b.v., inductie van Nrf2 signaalroutes), de inductie van celproliferatie en differentiatie, insuline signalering en versie en voeding gedrag7. Aanzienlijke vooruitgang is geboekt in het begrip van de signalering functie van ROS. Echter belangrijke vragen blijven met betrekking tot die enzymen in mitochondriën dienen als de belangrijkste bronnen en hoe de productie wordt gecontroleerd.

ROS vrijlating door een plaats van productie is afhankelijk van verschillende factoren: 1) de concentratie van het doneren van de elektron site, 2) de redox staat van de elektron doneren site, 3) toegang tot zuurstof, en 4) de concentratie en het type van oxidatie substraat,3, 8 , 9. in de mitochondriën, andere factoren zoals ook invloed op de concentratie van NADH en membraan potentiële kracht ROS productie8,10. Bijvoorbeeld, het tarief van O2● -/H2O2 productie door gezuiverde PDHC of KGDHC neemt toe met toenemende NADH beschikbaarheid-5,11. In dit scenario stromen elektronen achteruit van NADH naar het midden van de FAD in de E-3 subeenheid van PDHC of KGDHC, de site voorO2● -/H2O2 productie12. Ook heeft de levering van NAD+ het tegenovergestelde effect, afnemende ROS vrijlating uit KGDHC12. Zo kunt controlerende binnenkomen of verlaten van elektronen van sites van ROS productie wijzigenhoeveel O2● -/H2O2 wordt gevormd. Bijvoorbeeld, het blokkeren van de E-2 subeenheid van PDHC of KGDHC met de CPI-613, een analoge, resulteert in een bijna 90% afname van O2● -/H2O2 productie13liponzuur. Vergelijkbare resultaten kunnen worden verkregen met de chemische S-glutathionylation katalysatoren, diamide en disulfiram, die bijna af te O2● -/H2O2 productie door PDHC of KGDHC via de vervoeging van glutathion tot en met de E schaffen 2 subeenheid14. De trade-off voor het blokkeren van de elektronen stromen door de E-2 subeenheid van PDHC en KGDHC is een afname van de productie van NADH die ROS vorming door het elektronentransport keten (bijvoorbeeldcomplexe III vermindert). Dit kan door de keten elektronentransport ATP-uitvoer vertragen. Blokkeren van elektron toegang tot sites van ROS productie kunnen over het algemeen een zeer effectief middel O2● -/H2O2 productie te controleren.

Mitochondriën kunnen maximaal 12 potentiële O2● -/H2O2 bronnen6bevatten. De meeste van deze sites zijn flavin bevatten enzymen die het genereren van een mengsel van O2●- en H2O2. Gebruik verschillende substraat of remmer combinaties zijn toegestaan voor de identificatie die respiratoire complexen en mitochondriale dehydrogenases dienen alshoge capaciteit O2● -/H2O2 vorming vestigingen in verschillende weefsels en3. PDHC en KGDHC is gebleken om te dienen als hoge capaciteit O2● -/H2O2 emitterende sites in spieren en lever mitochondriën13,15. Bepaalde problemen blijven echter met betrekking tot het onderzoek van de O2● -/H2O2 vormen van afzonderlijke sites in mitochondriën en de invloed die verschillende substraat en remmer combinaties hebben op potentiële de activiteiten van de enzymen. Dit is te wijten aan de aanwezigheid van ongewenste kant Reacties (bijvoorbeeld, vorming vanO2● -/H2O2 door sites dan het enzym van belang), besmetten endogene voedingsstoffen (bvvetzuren zuren) of organellen (b.v., peroxisomen die ook O2● -/H2O2 vormen), en gebruik van Remmers, dat het gebrek aan selectiviteit, en/of gebruik van stoffen die doen niet volledig ROS productie remmen. Bepaalde remmers kunnen ook veranderen de mitochondriale Bioenergetica en de richting van de stroom van elektronen, en dit verandert ROS release van andere sites van productie en kunstdiscours resultaten. Absolute tarieven voor O2● -/H2O2 release van afzonderlijke sites in mitochondriën zijn ook moeilijk te kwantificeren vanwege de hoge concentratie van O2●- en H2O2 de afschaffing van enzymen in de matrix en intermembrane ruimte. Eliminatie van eventuele concurrerende reacties die met O2● -/H2O2 release metingen interfereren kunnen kan dus nuttig bij het bepalen van dehoge capaciteit O2● -/H2O2 vormen van sites.

Hier presenteren we een eenvoudige methode die voor de gelijktijdige behandeling van O2● -/H2O2 productie en NADH vorming door gezuiverde flavin-afhankelijke dehydrogenases zorgt. Met behulp van gezuiverde enzymen, kunnen ongewenste ROS vormen kant reacties en ROS vernederende enzymen worden geëlimineerd zodat voor een meer nauwkeurige maatstaf van inheemse O2● -/H2O2 productie tarieven voor individuele flavoenzymes. Deze methode kan worden gebruikt om rechtstreeks vergelijken de O2● -/H2O2 vormen van de capaciteit van verschillende gezuiverde dehydrogenases of scherm potentiële site-specific remmers voor O2● -/H2O 2 release. Ten slotte kan meten O2● -/H2O2 en NADH productie gelijktijdig zorgen voor een real-time beoordeling van de relatie tussen de enzymactiviteit en ROS release capaciteit.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. chemische stoffen en gezuiverde enzymen

  1. Aanschaffen van de volgende materialen: PDHC en KGDHC van oorsprong van de varkens hart (of een ander gezuiverde mitochondriale flavoenzyme); H2O2 (30%-oplossing), pyruvaat, α-ketoglutaraat, NAD+, NADH, CoASH, thiamine pyrofosfaat (TPP), mannitol, HEPES, sacharose, EGTA, 3-methyl-2-oxo valeriaanzuur (KMV), superoxide dismutase (SOD), horseradish peroxidase (HRP), 10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine-reagens (AUR) en CPI-613.

2. planning van de bepaling en de bereiding van het reagens

  1. Instellen van de bepaling volgens tabel 1 in een 96-wells-plaat.
    Opmerking: Het totale volume voor elke reactie is 200 µL. voorraad concentraties worden aangepast zodat 20 µL van het reagens wordt toegevoegd aan elk putje. Dit zorgt voor een snelle toevoeging van cofactoren en substraten voor elke reactie goed vóór het opstarten van de bepaling.
  2. Reactie buffer met 220 mM mannitol, sacharose 70 mM, 1 mM EGTA en 20 mM HEPES (pH 7.4 met HCl) voor te bereiden.
    Opmerking: Dit kan veranderen afhankelijk van de fysische eigenschappen van verschillende gezuiverde enzymen.
  3. Onderzoeken van de gezuiverde KGDHC of PDHC voor besmetting met behulp van enzym activiteit testen14,16,17 , of door de immunoblot of Coomassie beitsen5.
  4. Bereiden alle reagentia in de buffer van de reactie als per de werkende oplossing concentraties in tabel 1.
  5. Alle reagentia opslaat als 1 mL aliquots bij-20 ° C. Winkel pyruvaat en α-ketoglutarate bij-80 ° C in 100-µL aliquots ter voorkoming van spontane achteruitgang als gevolg van auto-oxidatie en herhaalde bevriezen-ontdooien.
  6. Bereid de AUR reagens master voorraad in 1 mL van DMSO en vervolgens Verdun tot 100 µM in reactie buffer. Winkel beschermd tegen licht.
    Nota: Hier, de 100 µM-werkoplossing is gemaakt van vers elke 2 tot 3 weken en beschermd tegen licht.

3. het opzetten van de Assay-sjabloon

  1. De assay-procedure op een monochromatische microplate-lezer met dubbele meting mogelijkheden instellen
  2. Definieer de lezing procedure door 'PROTOCOL'. Klik vervolgens op "PROCEDURE".
  3. "Temperatuur" instellen tot 25 ° C (figuur 1A).
  4. Klik op "START KINETIC" om in te stellen Lees voorwaarden (figuur 1A). Stel de tijd en het aantal lees intervallen/experimenten.
  5. Klik op "Lees" (figuur 1B).
    Opmerking: Monsters worden gelezen uit de toppositie met een winst van 50. Tijd: 5 min, lees 30-s tussenpozen. Kanaal 1: Resorufin fluorescentie - excitatie/emissie = 565 nm:600 nm, golflengte breedte van 13,5 nm. Kanaal 2: NADH autofluorescence - excitatie/emissie = 376 nm:450 nm, golflengte breedte van 20 nm.
  6. Selecteer onder "Lezen", wells naar monitor (bijvoorbeeldA1-A4 en B1-B4).
  7. Selecteer "END kinetische".

4. standaard curven

  1. Ontdooi de reagentia en slaan op ijs totdat het nodig is.
  2. NADH standaard curve (figuur 2A)
    1. De werkoplossing voorbereiden door NADH in het concentratiebereik van 0,5-10 mM in reactie buffer.
    2. Voeg 20 µL aliquots van elke NADH werken concentratie voorraadoplossing putjes met 180 µL reactie buffer. De uiteindelijke concentratie van NADH in elk is nou 0,05-1 mM.
    3. Klik op "Lees" en stel excitatie/emissie = 376 nm:450 nm, golflengte breedte van 20 nm.
      Nota: Dit is een alleen-lezen eindpunt - kinetische parameters zijn niet vereist.
  3. AUR standaard curve (figuur 2B)
    1. Voorbereiden van de voorraden van de werken van waterstofperoxide in reactie buffer; voorraad concentraties variëren van 200-4000 nM.
    2. Voeg 120 µL van de reactie-buffer toe aan elk putje.
    3. Voeg 20 µL van HRP (voorraad concentratie werken = 30 U/mL, eindconcentratie in de put = 3 U/mL), 20 µL van SOD (voorraad concentratie werken = 250 U/mL, eindconcentratie in de put = 25 U/mL), en 20 µL van AUR (voorraad concentratie werken = 100 µM eindconcentratie in de put = 10 µM) aan elke buffer reactie goed bevatten.
    4. Voeg 20 µL van elke H2O2 voorraad werkoplossing aan elk putje met buffer en assay reagentia. De uiteindelijke reactie volume is 200 µL en de uiteindelijke concentratie van de H2O2 in elk putje is 20-400 nM.
    5. Incubeer de platen gedurende 1 min. in de afleesapparaat bij 25 ° C.
    6. Klik op "Lees" en stel excitatie/emissie = 565 nm/600 nm, golflengte breedte van 13,5 nm. Dit is een alleen-lezen eindpunt - kinetische parameters zijn niet vereist.

5. het meten van O2● - /H2 O2 Release en de NADH productie door KGDHC en PDHC

  1. Zie tabel 1 voor de volgorde van de toevoeging van de verschillende reagentia, de concentratie van elke werkende oplossing, en het volume toegevoegd aan elk goed.
  2. Voeg 40 µL van reactie buffer toe aan elk putje. Voor tests met KMV of CPI-613, Voeg 20 µL van buffer aan elk putje.
  3. Voeg 20 µL van PDHC of KGDHC (werkende voorraad van 1 U/mL, eindconcentratie per putje = 0.1 U/mL) aan elk putje.
  4. Incubeer PDHC en KGDHC bij 25 ° C gedurende 2 minuten.
  5. Voeg 20 µL van KMV (werkende voorraad = 100 mM, eindconcentratie = 10 mM) of 20 µL van CPI-613 (voorraad concentratie werken = 1,5 mM, eindconcentratie = 150 µM) (tabel 2).
    Opmerking: Deze stap kan worden uitgesloten als remmers niet worden gebruikt voor het testen.
  6. Incubeer gedurende 1 minuut bij 25 ° C.
    Opmerking: Deze stap kan worden uitgesloten als remmers niet worden gebruikt voor het testen.
  7. Voeg 20 µL van HRP (voorraad concentratie werken = 30 eenheden/mL, eindconcentratie in de put = 3 eenheden/mL) en 20 µL van SOD (voorraad concentratie werken = 250 eenheden/mL, eindconcentratie in de put = 25 eenheden/mL) aan elk putje.
  8. Voeg 20 µL van coenzym A (voorraad concentratie werken = 1 mM, eindconcentratie = 0.1 mM), 20 µL van TPP (voorraad concentratie werken = 3 mM, eindconcentratie = 0,3 mM), en 20 µL nad+ (werken voorraad concentratie = 10 mM, eindconcentratie = 1 mM) aan elke w Ell.
  9. Verwijder de AUR reagens van beschermende zilverpapier bedekking en Voeg 20 µL aan elk putje.
  10. Voeg 20 µL van pyruvaat (werken voorraad concentratie variërend van 1-100 mM, eindconcentratie voor testen = 0.1-10 mM) aan putjes met PDHC en α-ketoglutarate (werken voorraad concentratie variërend van 1-100 mM, eindconcentratie voor testen = 0.1-10 mM) te Wells met KGDHC.
  11. Klik op "Lees" om te beginnen van kinetische meting.

6. de gegevensanalyse

  1. De 'CTRL'-toets op het toetsenbord ingedrukt en klik op putten voor het genereren van een grafiek met alle kinetische metingen overeenkomt met kanaal 1 (figuur 3A).
  2. Klik op "gegevens" in het pictogram voor de weergave in de hogere juiste hoek voor ruwe waarden voor relatieve fluorescentie eenheden (RFU), gemeten op de punten van de verschillende tijd (figuur 3B).
  3. De waarden voor analyse (tabel 3) exporteren.
  4. Klik op de "Grafiek" drop-down menu rechtsboven (figuur 3B) voor toegang tot de RFU waarden die zijn gekoppeld aan de fluorescentie kanaal 2.
  5. Herhaal stap 6.1 tot 6.3 voor kanaal 2.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 3A wordt een representatieve trace voorziet door de RFU verzameld tijdens de gelijktijdige meting van H2O2 en NADH productie door gezuiverde KGDHC. De onbewerkte gegevens van de RFU voor elk tijdsinterval is afgebeeld in figuur 3B. De ruwe gegevens van de RFU worden vervolgens geëxporteerd voor analyse. Door extrapolatie van standaard curven weergegeven in Figuur 2, kan d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol is gunstig sinds, 1) het elimineert eventuele concurrerende reacties die anders H2O2 detectie (b.v., antioxidant systemen of andere bronnen van ROS), 2 storen) biedt een directe beoordeling van het eigen tempo van de ROS vrijgeven door een flavin-bevattende mitochondriale dehydrogenase, 3) maakt de vergelijking voor de native ROS vrijgeven tarieven van twee of meer gezuiverd flavin gebaseerde dehydrogenases, 4) kunnen zorgen voor een directe vergelijking van de snelheid van ROS...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er is niets bekend te maken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gefinancierd door de Natural Sciences and Engineering Research Raad van Canada (NSERC). Video productie werd uitgevoerd in samenwerking met het centrum voor innovatie in het onderwijs en leren (CITL) op de Memorial University van Newfoundland.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Pyruvate dehydrogenase complexSIGMAP7032-10UNgezuiverde flavo-enzym
alpha-ketoglutaraat dehydrogenase complexSIGMAK1502-20UNgezuiverde flavo-enzym
30% waterstofperoxideoplossingSIGMAHX0640-5reagens, standaardcurves
NAD+SIGMAN0632-1Greagens, activiteit/ROS-afgifte-assay
NADHSIGMAN4505-100MGreagens, standaardcurves
pyruvaatSIGMAP2256-5Greagens, activiteit/ROS-afgifte-assay
alpha-ketoglutaraatSIGMA75892-25Greagens, activiteit/ROS-afgifte-assay
CoASHSIGMAC3019-25MGreagens, activiteit/ROS-afgifte-assay
thiamine pyrofosfaatSIGMAC8754-1Greagens, activiteit/ROS-afgifte-assay
mannitolSIGMAM4125-100Gbuffercomponent
HepesSIGMAH3375-25Gbuffercomponent
sucroseSIGMAS7903-250Gbuffercomponent
EGTASIGMAE3889-10Gbuffercomponent
KMVSIGMA198978-5Greagens, ROS-afgifte-inhibitor
CPI-613Santa Cruzsc-482709reagens, ROS-afgifte-inhibitor
SODSIGMAS9697-15KUreagens, ROS-afgifte-detectie
mierikswortelperoxidaseSIGMAP8375-1KUreagens, ROS-afgifte-detectie
Amplex Ultra RedThermofisherA36006reagens, ROS-afgifte-detectie
Biotech Synergy 2 microplaatlezerBioTek Instrumentsmicroplaatlezer voor assays
Gen5-softwareBioTek Instrumentssoftware, gebruikt voor het verzamelen van ruwe RFU
Graphpad PrismGraphpad softwaresoftware, data-analyse
Microsoft EXCELMicrosoftsoftware, data-analyse

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mailloux, R. J. Teaching the fundamentals of electron transfer reactions in mitochondria and the production and detection of reactive oxygen species. Redox Biol. 4, 381-398 (2015).
  2. Nicholls, D. G. Forty years of Mitchell's proton circuit: From little grey books to little grey cells. Biochim Biophys Acta. 1777 (7-8), 550-556 (2008).
  3. Brand, M. D. Mitochondrial generation of superoxide and hydrogen peroxide as the source of mitochondrial redox signaling. Free Radic Biol Med. 100, 14-31 (2016).
  4. Massey, V. Activation of molecular oxygen by flavins and flavoproteins. J Biol Chem. 269 (36), 22459-22462 (1994).
  5. Mailloux, R. J., Gardiner, D., O'Brien, M. 2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue. Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).
  6. Sies, H., Berndt, C., Jones, D. P. Oxidative Stress. Annu Rev Biochem. 86, 715-748 (2017).
  7. Kuksal, N., Chalker, J., Mailloux, R. J. Review. Progress in understanding the molecular oxygen paradox - function of mitochondrial reactive oxygen species in cell signaling. Biol Chem. , (2017).
  8. Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417 (1), 1-13 (2009).
  9. Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. J Biol Chem. , (2017).
  10. Harper, M. E., Green, K., Brand, M. D. The efficiency of cellular energy transduction and its implications for obesity. Annu Rev Nutr. 28, 13-33 (2008).
  11. Ambrus, A., et al. Formation of reactive oxygen species by human and bacterial pyruvate and 2-oxoglutarate dehydrogenase multienzyme complexes reconstituted from recombinant components. Free Radic Biol Med. 89, 642-650 (2015).
  12. Tretter, L., Adam-Vizi, V. Generation of reactive oxygen species in the reaction catalyzed by alpha-ketoglutarate dehydrogenase. J Neurosci. 24 (36), 7771-7778 (2004).
  13. Slade, L., et al. Examination of the superoxide/hydrogen peroxide forming and quenching potential of mouse liver mitochondria. Biochim Biophys Acta. 1861 (8), 1960-1969 (2017).
  14. O'Brien, M., Chalker, J., Slade, L., Gardiner, D., Mailloux, R. J. Protein S-glutathionylation alters superoxide/hydrogen peroxide emission from pyruvate dehydrogenase complex. Free Radic Biol Med. 106, 302-314 (2017).
  15. Quinlan, C. L., et al. The 2-oxoacid dehydrogenase complexes in mitochondria can produce superoxide/hydrogen peroxide at much higher rates than complex I. J Biol Chem. 289 (12), 8312-8325 (2014).
  16. Mailloux, R. J., Craig Ayre, D., Christian, S. L. Induction of mitochondrial reactive oxygen species production by GSH mediated S-glutathionylation of 2-oxoglutarate dehydrogenase. Redox Biol. 8, 285-297 (2016).
  17. Mailloux, R. J., Gardiner, D., O'Brien, M. 2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue. Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).
  18. Ambrus, A., Adam-Vizi, V. Human dihydrolipoamide dehydrogenase (E3) deficiency: Novel insights into the structural basis and molecular pathomechanism. Neurochem Int. , (2017).
  19. Young, A., Gardiner, D., Brosnan, M. E., Brosnan, J. T., Mailloux, R. J. Physiological levels of formate activate mitochondrial superoxide/hydrogen peroxide release from mouse liver mitochondria. FEBS Lett. 591 (16), 2426-2438 (2017).
  20. Fisher-Wellman, K. H., et al. Mitochondrial glutathione depletion reveals a novel role for the pyruvate dehydrogenase complex as a key H2O2-emitting source under conditions of nutrient overload. Free Radic Biol Med. 65, 1201-1208 (2013).
  21. Kussmaul, L., Hirst, J. The mechanism of superoxide production by NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) from bovine heart mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (20), 7607-7612 (2006).
  22. Huang, L. S., Borders, T. M., Shen, J. T., Wang, C. J., Berry, E. A. Crystallization of mitochondrial respiratory complex II from chicken heart: a membrane-protein complex diffracting to 2.0. A. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 4), 380-387 (2005).
  23. Yeh, J. I., Chinte, U., Du, S. Structure of glycerol-3-phosphate dehydrogenase, an essential monotopic membrane enzyme involved in respiration and metabolism. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3280-3285 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Flavine bevattende dehydrogenasenmicroplaatfluorometriepyruvaatdehydrogenasecomplexalfa ketoglutaraatdehydrogenasecomplexAmplex Ultrared reagensmierikswortelperoxidasesuperoxide dismutaseNADH autofluorescentie

Gerelateerde artikelen