Duidelijk naar voren komt een protocol voor het detecteren van gelijktijdige uitdrukking van leukemie stamcel merkers op primaire acute myeloïde leukemie cellen door stroom cytometry. We laten zien hoe te kwantificeren drie voorlopercellen populaties en een vermeende LSC bevolking met de toenemende mate van rijping. We hebben bevestigd dat de aanwezigheid van deze populaties in overeenkomstige patiënt-afgeleid-xenografts.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Stroom Cytometry om te schatten leukemie cellen van de stam in primaire Acute myeloïde leukemie en patiënt-afgeleid-xenografts, bij diagnose en Follow Up
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Acute myeloïde leukemie (AML) is een heterogene, en indien niet behandeld, dodelijke ziekte. Het is de meest voorkomende oorzaak van leukemie-geassocieerde mortaliteit bij volwassenen. In eerste instantie is AML een ziekte van hematopoietische stamcellen (HSC) wordt gekenmerkt door de arrestatie van differentiatie, latere accumulatie van leukemie blast cellen, en verminderde productie van functionele hematopoietische onderdelen. Heterogeniteit strekt zich uit tot de aanwezigheid van cellen van de stam van de leukemie (LSC), met deze dynamische cel compartiment evolueren om te overwinnen van verschillende selectie druk opgelegd tijdens leukemie progressie en behandeling. Als u wilt verder definiëren de LSC-bevolking, kunt de toevoeging van CD90 en CD45RA de discriminatie van normale HSCs en multipotente voorlopercellen binnen het CD34 + CD38-cel compartiment. Hier duidelijk naar voren komt een protocol voor het detecteren van gelijktijdige expressie van verschillende vermeende LSC markers (CD34 CD38, CD45RA, CD90) op primaire blast cellen van menselijke AML door multiparametric stroom cytometry. Bovendien tonen we hoe te kwantificeren drie voorlopercellen populaties en een vermeende LSC bevolking met de toenemende mate van rijping. We hebben bevestigd dat de aanwezigheid van deze populaties in overeenkomstige patiënt-afgeleid-xenografts. Deze methode voor de detectie en kwantificering van vermeende LSC mogen worden gebruikt voor klinische follow-up van chemotherapie reactie (dwz., minimale residuele ziekte), zoals residuele LSC AML terugval kan veroorzaken.
Inleiding
Acute myeloïde leukemie (AML) is de meest voorkomende oorzaak van leukemie-geassocieerde mortaliteit. AML is in eerste instantie een klonale ziekte van hematopoietische stamcellen (HSC) wordt gekenmerkt door de arrestatie van differentiatie, latere accumulatie van blast cellen, en verminderde productie van functionele hematopoietische onderdelen. Onlangs, klonen heterogeniteit van de blast-celpopulatie is opgezet in wezen met behulp van de volgende generatie sequencing (NGS) strategieën en toont het bestaan van intra klonale evolutie van tumor cellen1.
Heterogeniteit strekt zich uit tot de aanwezigheid van leukemische cellen van de stam (LSC). Het is dat deze dynamische cel compartiment evolueert om te overwinnen van verschillende selectie druk tijdens leukemie progressie en behandeling opgelegd hypothetische. Daarom LSC moeten bestand zijn tegen de huidige chemotherapeutische regimes en bemiddelen van relapse van de ziekte, met ernstige klinische gevolgen2. Diverse markeringen zijn beschreven LSC karakteriseren zoals CD1233, CLL-14, CD975 of TIM-3-6. De CD34 + CD38-vaks blast cellen wordt geacht te worden verrijkt voor GSC7 maar ook normale HSC. CD90 en CD45RA uitdrukking toegepast op de CD34 + CD38-(P6) compartiment (Figuur 1) vliegvergunningen scheiden van de verschillende stadia van normale en kwaadaardige hematopoietische precursoren8. Specifiek, normale CD34 + CD38-CD90 + CD45RA-HSCs, multipotente voorlopercellen (MPP) zoals CD34 + CD38-CD90dimCD45RA-cellen en CD34 + CD38-CD90-CD45RA + lymfoïde-primer multipotente voorlopercellen (LMPP) kunnen worden bepaald in de meeste AML gevallen van8 ,9. De intensiteit (MFI's) van de gemiddelde fluorescentie van CD38 is bijzonder belangrijk beschouwd binnen het CD34 + cel compartiment. Omdat CD38 intensiteit drie nieuwe cel compartimenten daarvan definieert: CD38 negatief (P6), CD38 dim (P7) en heldere CD38 (P8) (Figuur 1). De MFI van CD38 kan worden bepaald met behulp van hematogones en/of plasmacellen als een interne positieve controle als deze cellen sterk express CD38.
De immunodeficiëntie muismodel van knik/SCID/IL2Rγcnull (NSG) wordt veel gebruikt voor engraftment van normaal en kwaadaardige mens hematopoietische cellen10,11. Seriële xenotransplantatie testen worden gebruikt om experimenteel valideren LSC of HSC functie. Deze studies hebben uitgebreid geanalyseerd door grootschalige sequencing benaderingen. Niettemin, is minder bekend over de LSC en HSC immunophenotype van AML blast bevolking geaccepteerd in NSG muizen ten opzichte van haar primaire AML (Figuur 2).
De nummers van de LSC zijn inherent lage dus, identificatie en kwantificering van LSC zijn uitdagend en de hier beschreven methode kan worden gebruikt als een flow cytometrische bepaling bij diagnose en klinische volgen tot evalueren chemotherapie reactie (zoals residuele LSC kan AML terugval veroorzaken). De aanwezigheid van LSC kan duiden op positieve minimale residuele ziekte (MRD). Tot op heden, MRD toezicht op AML meestal vertrouwen op moleculaire methoden (d.w.z., RT-PCR, NGS)10,12. Nochtans, in dit protocol ontdekken we gelijktijdige eiwit expressie van verschillende HSC/LSC markers (CD34 CD38, CD45RA, CD90) op primaire blast cellen van menselijke AML door multiparametric stroom cytometry2,8,9. Deze combinatie van antilichamen kan worden toegepast in een standaard stroom cytometry laboratorium en deze stroom MRD test is vooral interessant wanneer MRD door real-time polymerasekettingreactie (RT-PCR) niet mogelijk is, dat wil zeggen, als leukemie specifieke moleculaire Markeringen zijn niet aantoonbaar in het diagnostische AML monster. Bovendien, dit protocol, is een aanvulling op de meer gevoelige technieken voor moleculaire MRD, zoals het is bedoeld voor het detecteren en kwantificeren van de abnormale hematopoïetische voorlopercellen die vertegenwoordigt een functionele cel kenmerk (Figuur 3).
We laten zien hoe te kwantificeren van drie hematopoïetische voorlopercellen populaties en de vermeende LSC compartiment met verschillende mate van rijping door stroom cytometry met antilichamen beschikbaar in de meeste klinische laboratoria. Bovendien, we bevestigd van de aanwezigheid van deze cel compartimenten in overeenkomstige patiënt-afgeleid-xenografts (PDX) en bij de behandeling opvolgen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
We volgen de Europese normen voor het gebruik van dieren voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt. Deze studie werd goedgekeurd door de lokale ethische Commissie (#3097-2015120414583482v3).
1. de monstervoorbereiding
- Het beenmerg (2 mL) ophalen door DOVO AML in buizen met de anticoagulatie ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) met een concentratie van 1,8 mg per mL beenmerg.
- Uitvoeren van densiteitgradiënt scheiding, een dichtheid verlopende scheiding te isoleren mononucleaire cellen van rode bloedcellen en granulocyten, als volgt. Verdun het beenmerg in 3 delen fosfaat buffer zoutoplossing (PBS: NaCl 137 mM KCl 2.7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1.8 mM). Zorgvuldig overlay 1 deel densiteitgradiënt met 1 volume van de verdunde beenmerg. Spin 30 minuten bij 300 x g zonder rem. Breng de witte buffy vacht laag van cellen van de mononucleated in een nieuwe steriele buis.
- Wassen cellen tweemaal in 10 mL PBS) samen en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min, om de verontreinigende componenten van het serum te verwijderen.
2. lysis van rode bloedcellen (RBC)
- Voeg 2 mL lysisbuffermengsel (ammoniumchloride 0,8%) naar de cel pellet, vortex zachtjes en Incubeer bij kamertemperatuur voor 5 min. Centrifuge bij 300 x g gedurende 5 min.
Opmerking: indien nodig, herhaal deze stap. - Zoals eerder beschreven Wash cellen in PBS (1.3.).
3. de patiënt afgeleid xenografts.
- Blast cellen uit het beenmerg verkrijgen na densiteitgradiënt scheiding en na uitputting van de lymfocyten met behulp van immunomagnetic negatieve selectie (CD3 voor T- en CD20 voor B-lymfocyten). Volg de instructies van de fabrikant.
- 5 x 106 AML blast cellen te injecteren in de ader van de staart van onvoorwaardelijke NSG muizen. Een remmende apparaat gebruiken om de staart veneuze injectie. Houden muizen onder conventionele voorwaarden en met name onder specifieke-pathogenen vrije voorwaarden op alle tijden, met behulp van individuele geventileerde kooien en door manipulatie onder laminaire flow motorkap. Om de twee weken, nemen 60 µL bloed door de methode van de submandibulaire collectie met behulp van een hematocriet capillaire. Plaats het capillair in een 5 mL ronde onderkant buis. Stop het bloeden door zachte druk met behulp van een kleine steriel gaas pad toe te passen. Expulse bloed met een schoon spuit.
- Voeg 1ml lysisbuffermengsel en incubeer gedurende 5min. Centrifugeer dan bij 300 x g gedurende 5 minuten wassen met PBS en centrifugre bij 300 x g gedurende 5 minuten. Verwijder de bovendrijvende substantie, de toevoegen 100 µL PBS met 10% bovien serumalbumine (BSA) vlek met 3 µL anti-menselijke CD45-FITC en 1 µL anti-RattenUitrustingen CD45-APC en Incubeer bij 4 ° C gedurende 30 minuten.
- Cel pellet twee keer in PBS (2 mL) met 10% BSA en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten wassen.
- Aliquot tot 1 x 106 cellen per 100 µL van PBS in stroom cytometry buizen.
- Enquête engraftment om de twee weken door chimerism analyse van CD45 expressie (menselijk versus lymfkliertest) met behulp van stroom cytometry (figuur 2A en B).
- Bij offer (perifere blast count groter is dan 70% of ernstige klinische symptomen van ziekte), verzamelen mononucleaire cellen blast uit gemalen milt en beenmerg door te spoelen zijn verbeend en dijbeen met PBS13zoals hiervoor is beschreven. Euthanaseren muizen door cervicale dislocatie volgens internationale richtlijnen.
- Als cel pellet RBC bevat, uitvoeren lysis van rode bloedcellen met lysis-buffermengsel (stap 2.1).
- Wash cellen pellet in PBS (2 mL) met 10% BSA en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten twee keer.
- Cellen en aliquoot up naar 1 x 106 cellen per 100 µL van PBS in stroom cytometry buizen verzamelen.
4. vlekken
- Voeg geconjugeerde antilichamen (zie stap 4.2) en vortex. Incubeer de cellen gedurende 15 minuten in het donker bij kamertemperatuur.
- Gebruik het volgende paneel voor menselijke primaire of PDX monsters bestaande uit 10 µL van anti-CD36-FITC, 5 µL van anti-CD19-ECD, 5 µL van anti-CD33-PC5.5, 5 µL van anti-CD90-APC, 5 µL van anti-CD34-AA700, 5 µL van anti-CD45RA-APC-H7, 5 µL van anti-CD38-Pacific Blue, 5 µL van anti-CD123-PC7 en 2.5 µL van anti-CD45-KO.
- Niet-afhankelijke antistoffen verwijderen door te wassen van de cellen in 2 mL PBS door centrifugeren bij 300 x g gedurende 5 min.
- Resuspendeer de cellen in 450 µL van PBS voor definitieve flow cytometrische analyse.
5. gating strategie voor stroom cytometry analyse
- Data-acquisitie (minstens 500.000 cellen) uitvoeren op een cytometer van de stroom voorzien van rood, blauw en violet lasers. Controleer de instellingen van de cytometer elke dag voor 1) optische uitlijning, 2) fluidic systeem 3) optische gevoeligheid en 4) normalisatie met behulp van fluorospheres
- Volg de sequentiële gating strategie om te definiëren CD38 expressie (Figuur 1).
- Cellen van normale beenmerg monsters worden gebruikt om hematogones of plasmacellen die als positieve controle voor CD38 expressie dienen zal te definiëren.
Opmerking: deze poort is vooral belangrijk om te beoordelen als latere putatief LSC populaties is afhankelijk van de definitie. - Define fysiologische precursoren cellen (normale blast cellen) door CD45dim/SSC (kant spreiding) lage bevolkingscriteria (figuur 1A). Definiëren binnen de bevolking van deze blast, hematogones, die weer een CD38 ++ CD19 + fenotype (figuur 1B) en tot slot, CD36 en CD33 expressie gebruiken om te definiëren van de myeloblasts, monoblasts en erytroblasten (Figuur 1 c). Bepalen CD34 expressie op hematogones zoals in (figuur 1E). Het beoordelen van verschillende subpopulaties van precursoren binnen de cellen van de blast gedefinieerd als P6-P10 (Figuur 1 d). Het compartiment van de CD34 van blast cellen in P6, de P7, P8 voorlopercellen subpopulaties gebaseerd op vooraf ingestelde CD38 poorten te scheiden. Ervoor zorgen dat de P8 compartiment de ontploffingen die dezelfde CD38 intensiteit als de hematogones bevat hebben, P6 bevat cellen die CD38-op basis van de fluorescentie CD38 minus één (FMO) controle en dat P7 cellen tussen de twee uitersten met betrekking tot CD38 zijn expressie (Figuur 1 d).
- Cellen van normale beenmerg monsters worden gebruikt om hematogones of plasmacellen die als positieve controle voor CD38 expressie dienen zal te definiëren.
- Van de CD34 + 38-(P6) scheiden gated cellen, HSC van vermeende LSC met CD90 en CD45RA expressie (figuur 1F).
Opmerking: het HSC fenotype is CD34 + CD38-CD90 + CD45RA- en de multipotente voorlopercellen (MPP) worden gedefinieerd als CD34 + CD38-CD90 - CD45RA-. Het vermeende LSC fenotype is CD34 + CD38-CD90dimCD45RA + en de meer onrijpe downstream bevolking zijn de lymfoïde-primer progenitoren (LMPP) gedefinieerd als CD34 + CD38-CD90-CD45RA +.
6. toezicht door RT-PCR MRD
- Monitor MRD niveaus door RT-PCR zoals eerder beschreven14.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Hier presenteren we een methode om te bepalen van voorlopercellen populaties in normale en kwaadaardige beenmerg menselijke monsters. Wij het beenmerg en de milt van een succesvolle PDX verzameld en multiparametric stroom cytometry uitgevoerd zoals hierboven beschreven. We vergeleken de verschillende subpopulaties van cellen van de blast tussen het diagnostische patiënt monster en de bijbehorende PDX en in het bijzonder de CD34 + CD38-voorlopercellen compartiment, met name in de vermeende LSC verrijkt. We hebben vastgest...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Een nauwkeurige en reproduceerbare evaluatie van membraan of cytoplasmatische markeringen door stroom cytometry vereist dat de instrumentele instellingen elke dag voor optische uitlijning, goede werking van de fluidic systeem, optische gevoeligheid en normalisatie worden geverifieerd met behulp van kalibratie kralen.
Detectie van blast cel populaties in AML met behulp van CD90 en CD45RA door multi parametrische stroom cytometry analyse is een relatief eenvoudige en betrouwbare methode. Een cru...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Franse Vereniging Laurette Fugain, LigueContre le Cancer (Noord-Midden), Fondation de France (leukemie Committee), SIRIC Oncolille en Frans National Cancer Institute.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Pancoll | PAN-Biotech | P04-60500 | |
| RBC Lysis Buffer (10x) | Ozyme | BLE420301 | RBC Lysis solution A : 8,29 g van NH4Cl + 0,037 g van Na2EDTA in 100 mL steriele H2O en RBC Lysis solution B: 1 g van KHCO3 in 100 mL steriele H2O |
| NOD/SCID/IL2Rγcnull (NSG) muizen | JACKSON LABORATORY | Stock No: 005557 | |
| PBS | Gibco by life technologies | 14190-144 | |
| AutoMACS Running Buffer – MACS Separation Buffer | MACS Buffer Miltenybiotec | 130-091-221 | |
| Anti-CD36-FITC (clone FA6-152, Iotest) | Beckman Coulter | PN IM0766U | |
| Anti-CD33-PC5.5 (clone D3HL60.251, Iotest) | Beckman Coulter | B36289 | |
| Anti-CD90-APC (clone 5E10) | Biolegend | 328114 | |
| Anti-CD19-ECD (clone J3-119, Iotest) | Beckman Coulter | A07770 | |
| Anti-CD34-AA700 (clone 581, Iotest) | Beckman Coulter | B92417 | |
| Anti-CD45RA-APC-H7 (clone HI100) | Beckton Dickinson | 560674 | |
| Anti-CD38-Pacific Blue (clone LSI98-4-3, Iotest) | Beckman Coulter | B92396 | |
| Anti-CD45-KO (clone J.33, Iotest) | Beckman Coulter | B36294 | |
| Anti-CD3-PE | Beckman Coulter | IM1451 | |
| Anti-CD20-PE | Beckman Coulter | A07747 | |
| Anti-CD123-PC7 | Beckman Coulter | B13647 | |
| Flow-Set | Beckman Coulter | A63492 | |
| Flow-Check | Beckman Coulter | A63493 | |
| Navios | Beckman Coulter | DS-14644A | |
| LSR Fortessa X20 | BD Biosciences | ||
| CST BD | BD Biosciences | 655051 | |
| FacsFlow | BD Biosciences | 336911 | |
| Anti-hCD45-FITC | Biolegend | BLE304006 | |
| Anti-mCD45-APC | Biolegend | BLE103112 | |
| EasySep human PE selection kit | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep magnet | Stem Cell Technologies | 18551 |
Referenties
- Shlush, L. I., et al. Tracing the origins of relapse in acute myeloid leukaemia to stem cells. Nature. , (2017).
- Terwijn, M., et al. Leukemic stem cell frequency: a strong biomarker for clinical outcome in acute myeloid leukemia. PLoS One. 9 (9), e107587(2014).
- Jordan, C. T., et al. The interleukin-3 receptor alpha chain is a unique marker for human acute myelogenous leukemia stem cells. Leukemia. 14 (10), 1777-1784 (2000).
- van Rhenen, A., et al. The novel AML stem cell associated antigen CLL-1 aids in discrimination between normal and leukemic stem cells. Blood. 110 (7), 2659-2666 (2007).
- Bonardi, F., et al. A proteomics and transcriptomics approach to identify leukemic stem cell (LSC) markers. Mol Cell Proteomics. 12 (3), 626-637 (2013).
- Kikushige, Y., Miyamoto, T. Identification of TIM-3 as a Leukemic Stem Cell Surface Molecule in Primary Acute Myeloid Leukemia. Oncology. 89, Suppl 1. 28-32 (2015).
- Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat Med. 3 (7), 730-737 (1997).
- Kersten, B., et al. CD45RA, a specific marker for leukaemia stem cell sub-populations in acute myeloid leukaemia. Brit J Haematol. 173 (2), 219-235 (2016).
- Goardon, N., et al. Coexistence of LMPP-like and GMP-like leukemia stem cells in acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 19 (1), 138-152 (2011).
- Ng, S. W., et al. A 17-gene stemness score for rapid determination of risk in acute leukaemia. Nature. 540 (7633), 433-437 (2016).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J. Immunol. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- Roloff, G. W., Lai, C., Hourigan, C. S., Dillon, L. W. Technical Advances in the Measurement of Residual Disease in Acute Myeloid Leukemia. J Clin Med. 6 (9), (2017).
- Swamydas, S., Lionakis, M. S. Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments. J Vis Exp. (77), e50586(2013).
- Gabert, J., et al. Standardization and quality control studies of 'real-time' quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia - a Europe Against Cancer program. Leukemia. 17 (12), 2318-2357 (2003).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
