Duidelijk naar voren komt een protocol voor het detecteren van gelijktijdige uitdrukking van leukemie stamcel merkers op primaire acute myeloïde leukemie cellen door stroom cytometry. We laten zien hoe te kwantificeren drie voorlopercellen populaties en een vermeende LSC bevolking met de toenemende mate van rijping. We hebben bevestigd dat de aanwezigheid van deze populaties in overeenkomstige patiënt-afgeleid-xenografts.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Stroom Cytometry om te schatten leukemie cellen van de stam in primaire Acute myeloïde leukemie en patiënt-afgeleid-xenografts, bij diagnose en Follow Up
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Acute myeloïde leukemie (AML) is een heterogene, en indien niet behandeld, dodelijke ziekte. Het is de meest voorkomende oorzaak van leukemie-geassocieerde mortaliteit bij volwassenen. In eerste instantie is AML een ziekte van hematopoietische stamcellen (HSC) wordt gekenmerkt door de arrestatie van differentiatie, latere accumulatie van leukemie blast cellen, en verminderde productie van functionele hematopoietische onderdelen. Heterogeniteit strekt zich uit tot de aanwezigheid van cellen van de stam van de leukemie (LSC), met deze dynamische cel compartiment evolueren om te overwinnen van verschillende selectie druk opgelegd tijdens leukemie progressie en behandeling. Als u wilt verder definiëren de LSC-bevolking, kunt de toevoeging van CD90 en CD45RA de discriminatie van normale HSCs en multipotente voorlopercellen binnen het CD34 + CD38-cel compartiment. Hier duidelijk naar voren komt een protocol voor het detecteren van gelijktijdige expressie van verschillende vermeende LSC markers (CD34 CD38, CD45RA, CD90) op primaire blast cellen van menselijke AML door multiparametric stroom cytometry. Bovendien tonen we hoe te kwantificeren drie voorlopercellen populaties en een vermeende LSC bevolking met de toenemende mate van rijping. We hebben bevestigd dat de aanwezigheid van deze populaties in overeenkomstige patiënt-afgeleid-xenografts. Deze methode voor de detectie en kwantificering van vermeende LSC mogen worden gebruikt voor klinische follow-up van chemotherapie reactie (dwz., minimale residuele ziekte), zoals residuele LSC AML terugval kan veroorzaken.
Inleiding
Acute myeloïde leukemie (AML) is de meest voorkomende oorzaak van leukemie-geassocieerde mortaliteit. AML is in eerste instantie een klonale ziekte van hematopoietische stamcellen (HSC) wordt gekenmerkt door de arrestatie van differentiatie, latere accumulatie van blast cellen, en verminderde productie van functionele hematopoietische onderdelen. Onlangs, klonen heterogeniteit van de blast-celpopulatie is opgezet in wezen met behulp van de volgende generatie sequencing (NGS) strategieën en toont het bestaan van intra klonale evolutie van tumor cellen1.
Heterogeniteit strekt zich uit tot de aanwezigheid van leukemisch....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
We volgen de Europese normen voor het gebruik van dieren voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt. Deze studie werd goedgekeurd door de lokale ethische Commissie (#3097-2015120414583482v3).
1. de monstervoorbereiding
- Het beenmerg (2 mL) ophalen door DOVO AML in buizen met de anticoagulatie ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) met een concentratie van 1,8 mg per mL beenmerg.
- Uitvoeren van densiteitgradiënt scheiding, een dichtheid verlopende scheiding te isoleren mononucleaire cellen van rode bloedcellen en granulocyten, als volgt. Verdun het beenmerg in 3 delen fosfaat buffer zoutoplossing....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Hier presenteren we een methode om te bepalen van voorlopercellen populaties in normale en kwaadaardige beenmerg menselijke monsters. Wij het beenmerg en de milt van een succesvolle PDX verzameld en multiparametric stroom cytometry uitgevoerd zoals hierboven beschreven. We vergeleken de verschillende subpopulaties van cellen van de blast tussen het diagnostische patiënt monster en de bijbehorende PDX en in het bijzonder de CD34 + CD38-voorlopercellen compartiment, met name in de vermeende LSC verrijkt. We hebben vastgest.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Een nauwkeurige en reproduceerbare evaluatie van membraan of cytoplasmatische markeringen door stroom cytometry vereist dat de instrumentele instellingen elke dag voor optische uitlijning, goede werking van de fluidic systeem, optische gevoeligheid en normalisatie worden geverifieerd met behulp van kalibratie kralen.
Detectie van blast cel populaties in AML met behulp van CD90 en CD45RA door multi parametrische stroom cytometry analyse is een relatief eenvoudige en betrouwbare methode. Een cru.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Franse Vereniging Laurette Fugain, LigueContre le Cancer (Noord-Midden), Fondation de France (leukemie Committee), SIRIC Oncolille en Frans National Cancer Institute.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Pancoll | PAN-Biotech | P04-60500 | |
| RBC Lysis Buffer (10x) | Ozyme | BLE420301 | RBC Lysis solution A : 8,29 g van NH4Cl + 0,037 g van Na2EDTA in 100 mL steriele H2O en RBC Lysis solution B: 1 g van KHCO3 in 100 mL steriele H2O |
| NOD/SCID/IL2Rγcnull (NSG) muizen | JACKSON LABORATORY | Stock No: 005557 | |
| PBS | Gibco by life technologies | 14190-144 | |
| AutoMACS Running Buffer – MACS Separation Buffer | MACS Buffer Miltenybiotec | 130-091-221 | |
| Anti-CD36-FITC (clone FA6-152, Iotest) | Beckman Coulter | PN IM0766U | |
| Anti-CD33-PC5.5 (clone D3HL60.251, Iotest) | Beckman Coulter | B36289 | |
| Anti-CD90-APC (clone 5E10) | Biolegend | 328114 | |
| Anti-CD19-ECD (clone J3-119, Iotest) | Beckman Coulter | A07770 | |
| Anti-CD34-AA700 (clone 581, Iotest) | Beckman Coulter | B92417 | |
| Anti-CD45RA-APC-H7 (clone HI100) | Beckton Dickinson | 560674 | |
| Anti-CD38-Pacific Blue (clone LSI98-4-3, Iotest) | Beckman Coulter | B92396 | |
| Anti-CD45-KO (clone J.33, Iotest) | Beckman Coulter | B36294 | |
| Anti-CD3-PE | Beckman Coulter | IM1451 | |
| Anti-CD20-PE | Beckman Coulter | A07747 | |
| Anti-CD123-PC7 | Beckman Coulter | B13647 | |
| Flow-Set | Beckman Coulter | A63492 | |
| Flow-Check | Beckman Coulter | A63493 | |
| Navios | Beckman Coulter | DS-14644A | |
| LSR Fortessa X20 | BD Biosciences | ||
| CST BD | BD Biosciences | 655051 | |
| FacsFlow | BD Biosciences | 336911 | |
| Anti-hCD45-FITC | Biolegend | BLE304006 | |
| Anti-mCD45-APC | Biolegend | BLE103112 | |
| EasySep human PE selection kit | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep magnet | Stem Cell Technologies | 18551 |
Referenties
- Shlush, L. I., et al. Tracing the origins of relapse in acute myeloid leukaemia to stem cells. Nature. , (2017).
- Terwijn, M., et al. Leukemic stem cell frequency: a strong biomarker for clinical outcome in acute myeloid leukemia. PLoS One.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
