De retinale pigment epitheel (RPE) is een multi-functionele epitheel van het oog. Hier presenteren we een protocol om primaire celculturen afgeleid van de lymfkliertest RPE.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Primaire celculturen van de muis retinale Pigment epitheel
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De retinale pigment epitheel (RPE) is een sterk gepolariseerde multifunctionele epitheel, die is gelegen tussen het neurale netvlies en het vaatvlies van het oog. Het is een vel van gepigmenteerde cellen die hexagonally zijn verpakt en verbonden door strakke kruispunten. De belangrijkste functies van de RPE omvatten absorptie van licht fagocytose van de schuur fotoreceptor buitenste segmenten, ruimtelijke bufferen van ionen, vervoer van voedingsstoffen, ionen en water evenals actieve betrokkenheid in de visuele cyclus. Met deze belangrijke en diverse functies is het uitermate belangrijk om te bestuderen van de biologie van RPE cellen. Een aantal RPE cellijnen zijn vastgesteld; gepasseerd en vereeuwigd cellen zijn echter bekend om snel verliest een deel van de morfologische en fysiologische kenmerken van natuurlijke RPE cellen. Primaire cellen zijn dus meer geschikt voor de studie van de verschillende aspecten van de biologie van de cel van de RPE en functie. Muis primaire RPE celkweek is erg handig voor onderzoekers sinds Muismodellen worden veel gebruikt in biologische studies, maar verzamelen RPE cellen van muis is ook zeer uitdagend vanwege hun kleine omvang. Hier presenteren we een protocol voor de vaststelling van de primaire muisknop RPE celculturen, waaronder enucleation en dissectie van de ogen en isolatie van de RPE bladen opleveren van de cellen voor het kweken. Deze methode kan efficiënt cel worden hersteld. De cellen van de RPE twee muizen verkregen kunnen confluentie op een 12 mm polyester membraan invoegen voorgeladen in cultuur plaat na een week van de cultuur en display enkele van de originele eigenschappen van bonafide RPE cellen zoals zeshoekige vorm en pigmentatie na twee bereiken weken van cultuur.
Inleiding
De retinale pigment epitheel (RPE) is een enkellaags gepolariseerde epitheliale cellen, die zich bevindt tussen het neurale netvlies en het vaatvlies van het oog. De functionaliteit van de RPE cellen en de integriteit van de RPE enkelgelaagde zijn cruciaal voor de visie, omdat de RPE speelt een belangrijke rol in meerdere processen zoals het behoud van de buitenste bloed-retinale barrière, vervoer van water en ionen tussen het netvlies en de choroideus, lichte absorptie, bescherming tegen oxidatieve stress, controle van retinoid metabolisme en fagocytose van de buitenste segmenten van de researchdieren1,2. De locatie van de RPE aan de achterkant van het oog, evenals haar barrièrefunctie voorkomen van drugs systemisch beheerd vanuit doorgeven van het bloed naar het glasvocht humor, maken het moeilijk om te bestuderen van de complexiteit van de RPE functie in vivo. Dus, is er een grote behoefte aan de oprichting van RPE celculturen te bestuderen van de RPE cellen in een flexibele, gecontroleerde omgeving3,4.
Een aantal gevestigde RPE cellijnen bestaat, bieden een eenvoudige en handige manier van verkrijgen en opslaan van de cellen; gepasseerd cellen hebben echter enkele nadelen ten opzichte van primaire cellen2,3,4. Ten eerste, worden zij vaak gekenmerkt door veranderingen in de morfologie van de cel. Bijvoorbeeld, werden geen van de bestaande cellijnen gevonden te zijn geschikt voor een betrouwbare studie van de RPE barrière eigenschappen als gevolg van het verlies van cel polariteit fenotype en gedeeltelijke verdwijning van strakke kruispunten4. Naast het verlies van de polariteit en de juiste cel-naar-cel verbindingen verliezen de cellijnen RPE snel hun pigmentatie als gevolg van het ontbreken van de enzymen van de belangrijkste melanogenesis in de volwassen RPE5. De pigmentatie kan worden hersteld, maar de uitgebreide analyse van het mechanisme van nieuwe pigmentatie die zou bestaan uit een combinatie van transmissie-elektronenmicroscopie, gen expressie analyse en chemische tests ter bevestiging van de aanwezigheid van melanine heeft nooit zijn uitgevoerd6. Een meer beperking is dat de cellijnen RPE uitgebreide cel leven (soms - onsterfelijkheid hebben) en onder bepaalde voorwaarden kunnen transformeren in een zichzelf vernieuwende multipotente stamcellen die loskoppelen van het substraat en het formulier drijvende kolonies7, 8. deze beperking maakt het onmogelijk om het gebruik van de cellijnen voor transplantatie3 experimenten.
Gezien de nadelen van de gevestigde cellijnen van RPE, primaire RPE celculturen verkregen uit verse weefsels kunnen dienen als een meer biologisch relevante model te bestuderen van de RPE. Primaire RPE cellen zijn gebruikt niet alleen studeren RPE-specifieke functies zoals vitamine A metabolisme9, fagocytose van de fotoreceptor buitenste segmenten10 en ion transport11, maar ook om te studeren fundamentele celbiologie zoals epithelial cel polariteit2 lysosomale homeostase en autophagy12,13.
In de laatste paar jaar zijn er een aantal publicaties over de oprichting van primaire RPE culturen, die aangeeft een groeiende belangstelling op dit gebied onderzoek3,14,15. Talrijke protocollen voor menselijke RPE cellen en niet-menselijke RPE cellen zoals runderen en varkens RPE cellen werden gepubliceerd16,17,18,19. Het is echter moeilijker te behandelen muis RPE cellen vanwege het veel kleinere formaat. Hoewel er nogal een aantal publicaties beschreven protocollen om te isoleren RPE cellen uit de muis14,20,21, zijn er nog vele onderzoekers worstelen om te isoleren RPE cellen zonder verontreiniging van choroideus cellen of van cellen uit neurale netvlies puin. Hier presenteren we het protocol voor de vaststelling van de primaire muisknop RPE celcultuur, waaronder het verkrijgen van de ogen van de muis, de dissectie van de ogen en isolatie van de RPE bladen opleveren van de cellen voor het kweken. Dit video protocol zou vooral nuttig zijn voor onderzoekers die beginnen te werken met de muis primaire RPE culturen en begeleiding op de dissectie technieken nodig hebben.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Procedures met betrekking tot dierlijke onderwerpen zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) aan Universiteit van Pittsburgh
1. Prepareer oplossingen
- Bereiden groeimedium door aanvulling Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM), hoge glucose met 10% foetale runderserum (FBS), 1% penicilline/streptomycine, 2.5 mM L-glutamine en 1 x MEM niet-essentiële aminozuren. Vooraf warm de media in 37 ° C incubator vóór gebruik.
- Bereiden van 2% (wt/vol) dispase II werkende oplossing:
- Bereid een stockoplossing van 100 mg/mL dispase II door 30 mg dispase II in 300 µL HEPES-gebufferde zoutoplossing (50 mM HEPES/KOH pH 7.4, 150 mM NaCl) oplost. Dit volume is voor 3-4 muizen, kan worden opgeschaald of neer op basis van het aantal muizen voor het experiment). Dit bestand kan worden opgeslagen voor ten minste 1 week bij 4 ° C.
- Bereid de werkoplossing van 2% dispase door het toevoegen van 300 µL van de 100 mg/mL dispase II voorraad aan 1,2 mL steriele DMEM, hoge glucose en filteren van de oplossing door een 0,22 µm filter. Deze stap moet worden uitgevoerd in de laminaire flow kabinet onder steriele omstandigheden. Vooraf warm de bereid dispase II in 37 ° C incubator vóór gebruik.
2. het verkrijgen van de ogen van de muis
- De muis met behulp van een erkende methode euthanaseren en plaats deze op een absorberend stootkussen.
- Het dragen van handschoenen, zet de duim en wijsvinger rond het oog en duw voorzichtig de huid proptose de oogbol.
- Breng de tip van gebogen schaar tussen de huid en de oogbol en zorgvuldig uitgesneden op het oog. Om besmetting te voorkomen, dompel kort het oog in 70% ethanol.
- Onmiddellijk plaats het oog in de-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in een petrischaal.
- Herhaal stap 2.2-2.4 te verwijderen van het tweede oog.
3. oog dissectie
- Verwijder voorzichtig het bindweefsel van het oog onder de Microscoop ontleden. Dit kan worden gedaan in PBS of op de droge petrischaal.
- Hechten pincet gebruiken om te heffen van het bindweefsel van de oogbol en knip ze uit met behulp van Vannas-schaar. Dus de knip van de sclera niet af omdat het is vrijwel onmogelijk om het verkrijgen van de intact posterieure oculairrubbers als de sclera wordt gesneden.
- Na het schoonmaken van het bindweefsel, houd de resulterende oogbollen PBS voor de volgende stap van het wassen.
Opmerking: Al de volgende stappen moeten worden uitgevoerd in de laminaire flow kabinet onder steriele omstandigheden.
- De ogen wassen tweemaal in voorverwarmde 37 ° C DMEM (hoge glucose). Zorgvuldig overbrengen de oogballen in de voorverwarmde 37 ° C DMEM (hoge glucose) met behulp van de verlostang. Gecombineerd de oogbollen van het medium en overdracht op vers medium in een nieuwe schotel.
- Gecombineerd DMEM (hoge glucose) medium en de ogen in de voorverwarmde 2% (wt/vol) dispase II werkende oplossing voor 45 min in de incubator 37 ° C te incuberen.
Opmerking: In alle volgende stappen, plaats en manipuleren van ogen of oculairrubbers in het groeimedium, die zal het weefsel beschermt en bieden een goed medium voor de dissectie. - De dispase II oplossing verwijderen en wassen van de ogen twee keer in groeimedium door aspirating van het oude medium en het toevoegen van het nieuwe voorverwarmde 37 ° C groeimedium (Figuur 1a).
Opmerking: Na Dissociatieconstante door dispase II, de oogbollen worden zacht. - Houden van het oog met een tang en een incisie rond de ora serrata van elk van beide ogen met behulp van Vannas scharen onder de ontleden Microscoop geplaatst in de laminaire flow kabinet te maken.
- Houden van de oogbol in de oplossing, verwijder voorzichtig het anterior hoornvlies door uitbreiding van de cut de ora serrata omtrek en trekken het anterior hoornvlies weg nadat de snede voltooid is.
- Verwijder de lens capsule en de bijbehorende iris gepigmenteerde epitheel zachtjes trekken ze uit de oogschelp met een teethed Tang (Figuur 1b, 1 c).
- Incubeer de resulterende achterste oculairrubbers in het groeimedium gedurende 20 minuten bij 37 ° C om de scheiding van de neurale netvlies de RPE.
- Snijd de achterste oculairrubbers in 4 bloemblaadjes onder de ontleden Microscoop geplaatst in de laminaire flow kabinet. De bezuinigingen moeten lang genoeg zijn om het afvlakken van de oogschelp, maar kort genoeg om te houden van de bloemblaadjes aangesloten (Figuur 1 d).
- De oogschelp afvlakken en verwijder het neurale netvlies door heel zachtjes te trekken met een tang terwijl de resterende RPE-vaatvlies-sclera complex met een ander pincet (1e cijfer). Begin te trekken uit de randen, in plaats van het centrum.
- Breng alle kwartieren weefsels in een nieuwe steriele cultuur schotel gevuld met voorverwarmde 37 ° C groeimedium.
4. isolatie van primaire RPE cellen
- Holding een bloemblaadje van de kwartieren RPE-vaatvlies-sclera complex met super fijne Tang, zachtjes schil af de intact bladen van RPE uit het onderliggende kelder membraan (Bruch van membraan) met behulp van een microchirurgische wassende mes onder de Microscoop ontleden Geplaatst in de laminaire flow kabinet (Figuur 1f).
- Breng de RPE bladen in de nieuwe steriele cultuur schotel met groeimedium met behulp van een P200-micropipet. Bij het overbrengen van RPE bladen, de uiteinden van de pipet met groeimedium NAT waarbij eveneens meerdere malen om te voorkomen dat weefsel kleven binnen de tip. RPE zullen duidelijk te onderscheiden van het vaatvlies: RPE kijkt meer bruinachtig, terwijl vaatvlies donkerder is en plakkerig en pluizig kijkt.
- Gebruik als alternatief, enzymatische spijsvertering en zachte dissociatie zonder pincet om los van de RPE van de choroideus14te.
- De bladen van de RPE 2 - 3 keer met voorverwarmde 37 ° C wassen groeimedium in de schotel steriele cultuur. Na elke stap wassen zorgvuldig de RPE bladen te verzamelen terwijl het vermijden van andere weefsels zoals netvlies puin of vaatvlies. Aan het einde van de laatste wasbeurt de RPE bladen met een P200-micropipet verzamelen en plaats ze in een nieuwe 1,5 mL microcentrifuge buis.
Opmerking: Er is geen noodzaak om het centrifugeren van de RPE bladen: ze sediment zal door de zwaartekracht binnen 1 min. - Verwijder het groeimedium van de extra met behulp van een P200-micropipet. Resuspendeer de cellen in verse voorverwarmde groeimedium, en zachtjes triturate ze met behulp van een P200-micropipet. Vorming van luchtbellen vermijden. De schorsing van een eencellige is ideaal, maar ook het vermijden van teveel verpulvering, RPE cellen zijn anders niet in staat om te overleven. Wij raden zeer voorzichtig verpulvering voor 40 - 50 keer.
5. culturing RPE cellen
- Plaat van de cellen op een plaat van de cultuur.
- Als downstream toepassingen van de cellen RPE behoud van hun polariteit vereist, cellen plaat de RPE van 2 muizen in één 12 mm polyester membraan invoegen voorgeladen in 12-well cultuur platen. De cellen bij hoge dichtheid plating is gewenst omdat in dat geval RPE cellen kunnen houden van de originele eigenschappen, zoals de zeshoekige vorm en pigmentatie.
- Niet bewegen van de plaat of wijzigen van het groeimedium gedurende de eerste 72 uur van kweken. Na 3 dagen, door het oude medium te vervangen door het verse voorverwarmde groeimedium. Daarna wijzigt het kweekmedium om de andere dag. Eenmaal RPE cellen confluency, verklein de FBS in groeimedium naar 2%.
Opmerking: De cellen kunnen worden gesplitst met behulp van 0,25% trypsine. Echter na de splitsing van kunnen de cellen verliezen hun zeshoekige vorm en pigment in de latere passages. We raden niet aan de cellen splitsen, maar als dat nodig is door de downstream toepassingen van de cultuur, houd er rekening mee dat de primaire cellen voor onbepaalde tijd kan niet worden gepasseerd: ze bekend is dat de onderscheiden na 5-7 passages.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De muis primaire RPE cultuur van 2 muizen in 12 mm polyester membraan invoegen bereikt 90-95% confluentie opgericht na 1 week in cultuur. Na 2 weken van de cultuur, de cellen bereikt 100% confluentie en begon te vormen een mozaïek van cellen zeshoekige, gepigmenteerde en bi-nucleated. 3 weken van de cultuur, de cellen blijven vormen van de vorm en de pigmentatie, echter kreeg na 4 weken een deel van de cellen hyperpigmented (Figuur 2).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De gepresenteerde gedetailleerde protocol mogelijk maakt betrouwbare inrichting van muis primaire RPE culturen die confluentie bereiken na 1 week en presenteren van de belangrijkste kenmerken van de RPE zoals zeshoekige vorm en pigmentatie na 2 weken. De verkregen RPE cellen kunnen worden gebruikt voor een aantal downstream toepassingen zoals vitamine A metabolisme9, fagocytose van de fotoreceptor buitenste segmenten10 en ion vervoer11, epitheliale c...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
DS heeft ontvangen onderzoek gelden van Bayer HealthCare en F. Hoffmann-La Roche, Duitsland en Zwitserland. De resterende auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen. Dit werk wordt ondersteund door onderzoek te voorkomen blindheid (onbeperkte subsidies aan de Wilmer Eye Instituut en de Universiteit van Pittsburgh). Dit werk wordt ook ondersteund door start-up middelen naar DS uit oogheelkunde, Universiteit van Pittsburgh.
Dankbetuigingen
Deze studie werd mede gefinancierd door de BrightFocus Foundation (DS).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| dieren | |||
| 2~3 weken oude wildtype muizen | |||
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
| reagentia | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), hoge glucose | GIBCO | 11965092 | |
| Dispase II | Sigma | D4693 | |
| Foetaal bovien serum (FBS) | Sigma | F4135 | |
| Penicilline-Streptomycine (10.000 U/mL) | GIBCO | 15140122 | |
| MEM Non-Essentiële Aminozuren Oplossing (100X) | GIBCO | 11140050 | |
| Fosfaat-buffered saline (PBS), 1X, pH 7.4 | GIBCO | 10010023 | |
| HEPES | Cellgro | 61-034 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 | |
| NaCl | Ambion | AM9759 | |
| L-Glutamine (200 mM) | GIBCO | 25030-081 | |
| Ethyl Alcohol | Fisher Scientific | 111000200 | |
| RPE65 antilichaam | Een geschenk van Dr. Michael Redmond | ||
| Fluoresceïne Phalloidin | Invitrogen | F432 | |
| Geit anti-Konijn IgG (H+L), Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11011 | |
| Geit serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Polysciences, Inc | 00380 | |
| ZO-1 Polyklonaal Antilichaam | ThermoFisher Scientific | 40-2200 | |
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
| instrumenten en apparatuur | |||
| Laminair stromingskast | Baker | SterilGARD SG403A | |
| Dissectiemicroscoop (Zoom stereomicroscoop) | Nikon | SMZ1500 | |
| CO2 incubator met hete lucht sterilisatie | Binder | C150 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Petri schotels | Fisher Scientific | 0875712 | |
| 12 mm polyester membraan inzetstukken vooraf geladen in 12-well kweekplaten, poriegrootte: 0.4 µm, steriel | Corning Incorporated | COR-3460 | |
| Westcott tenotomie schaar, std messen, scherp | STEPHENS instrumenten | S7-1320 | |
| Castroviejo suturing pincet 0.12mm | Stroz Ophthalmic Instruments | E1796 | |
| Crescent rechte mes | Beaver-Visitec International | 373808 | |
| Dumont Pincet #5, 11 cm, recht, 0.1x0.06 mm tips, Dumostar | World Precision Instruments | 500233 | |
| Vannas Schaar, 8 cm, 45° Hoek, Standaard | World Precision Instruments | 500260 | |
| Millex-GS Spuitfilter Unit, 0.22 µm | Millipore | SLGL0250S | |
| Spuit, 5 mL | BD | 309632 | |
| Omgekeerde laboratoriummicroscoop Leica DM IL LED | Leica | ||
| Pipet | Gilson | ||
| Barrière en niet-gefilterde pipettentips | Thermo Scientific |
Referenties
- Martínez-Morales, J. R., Rodrigo, I., Bovolenta, P. Eye development: a view from the retina pigmented epithelium. Bioessays. 26, 766-777 (2004).
- Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE cells: past, present and future. Exp Eye Res. 126, 5-15 (2014).
- Fronk, A. H., Vargis, E. Methods for culturing retinal pigment epithelial cells: a review of current protocols and future recommendations. J Tissue Eng. 7, (2016).
- Rizzolo, L. J. Barrier properties of cultured retinal pigment epithelium. Exp Eye Res. 126, 16-26 (2014).
- Lu, F., Yan, D., Zhou, X., Hu, D. N., Qu, J. Expression of melanin-related genes in cultured adult human retinal pigment epithelium and uveal melanoma cells. Mol Vis. 13, 2066-2072 (2007).
- Boulton, M. E. Studying melanin and lipofuscin in RPE cell culture models. Exp Eye Res. 126, 61-67 (2014).
- Saini, J. S., Temple, S., Stern, J. H. Human Retinal Pigment Epithelium Stem Cell (RPESC). Adv Exp Med Biol. 854, 557-562 (2016).
- Akrami, H., et al. Retinal pigment epithelium culture;a potential source of retinal stem cells. J Ophthalmic Vis Res. 4, 134-141 (2009).
- Hu, J., Bok, D. The use of cultured human fetal retinal pigment epithelium in studies of the classical retinoid visual cycle and retinoid-based disease processes. Exp Eye Res. , 46-50 (2014).
- Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture. Exp Eye Res. 126, 51-60 (2014).
- Reichhart, N., Strauss, O. Ion channels and transporters of the retinal pigment epithelium. Exp Eye Res. 126, 27-37 (2014).
- Valapala, M., et al. Lysosomal-mediated waste clearance in retinal pigment epithelial cells is regulated by CRYBA1/βA3/A1-crystallin via V-ATPase-MTORC1 signaling. Autophagy. 10, 480-496 (2014).
- Shang, P., et al. The amino acid transporter SLC36A4 regulates the amino acid pool in retinal pigmented epithelial cells and mediates the mechanistic target of rapamycin, complex 1 signaling. Aging Cell. , (2017).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nat Protoc. 11, 1206-1218 (2016).
- Pfeffer, B. A., Philp, N. J. Cell culture of retinal pigment epithelium: Special Issue. Exp Eye Res. 126, 1-4 (2014).
- Singh, S., Woerly, S., McLaughlin, B. J. Natural and artificial substrates for retinal pigment epithelial monolayer transplantation. Biomaterials. 22, 3337-3343 (2001).
- Sonoda, S., et al. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nat Protoc. 4, 662-673 (2009).
- Ho, T. C., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. Tissue culture of retinal pigment epithelium following isolation with a gelatin matrix technique. Experimental eye research. 64, 133-139 (1997).
- Toops, K. A., Tan, L. X., Lakkaraju, A. A detailed three-step protocol for live imaging of intracellular traffic in polarized primary porcine RPE monolayers. Exp Eye Res. , 74-85 (2014).
- Gibbs, D., Kitamoto, J., Williams, D. S. Abnormal phagocytosis by retinal pigmented epithelium that lacks myosin VIIa, the Usher syndrome 1B protein. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 6481-6486 (2003).
- Gibbs, D., Williams, D. S. Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells. Adv Exp Med Biol. 533, 347-352 (2003).
- Pitkänen, L., Ranta, V. P., Moilanen, H., Urtti, A. Permeability of retinal pigment epithelium: effects of permeant molecular weight and lipophilicity. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46, 641-646 (2005).
- Mao, Y., Finnemann, S. C. Analysis of photoreceptor outer segment phagocytosis by RPE cells in culture. Methods Mol Biol. 935, 285-295 (2013).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
