Leukocyten interactie gretig met vasculaire cellen en trombocyten na vaartuig muur letsel of tijdens ontsteking. Hier beschrijven we een eenvoudig laminaire flow gebaseerde assay karakteriseren de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de interacties tussen leukocyten en hun cellulaire partners.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Laminaire stroming gebaseerde testen te onderzoeken Leukocyte aanwerving op gekweekte vasculaire cellen en aanhangend bloedplaatjes
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De aanwerving van de leukocyten op letsel of ontsteking naar sites van letsel of weefselbeschadiging van het is onderzocht tijdens de afgelopen decennia en heeft geleid tot het concept van de leukocyten hechting cascade. Echter, de exacte moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij de aanwervingsprocedures van de leukocyten hebben niet nog volledig geïdentificeerd. Aangezien leukocyte werving blijft een belangrijk onderwerp op het gebied van infectie, ontsteking en immuun onderzoek (auto-), presenteren we een eenvoudig laminaire flow gebaseerde bepaling aan de studie van de onderliggende mechanismen van de hechting, ambtshalve adhesie, en transmigratie van leukocyten onder veneuze en arteriële stroom regimes. De in vitro -assay kan worden gebruikt voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de interacties tussen leukocyten en hun cellulaire partners in verschillende modellen van vasculaire ontsteking. Dit protocol beschrijft een laminaire flow gebaseerde bepaling met behulp van een parallel-flow kamer en een omgekeerde fasecontrastmicroscoop aangesloten op een camera te bestuderen van de interacties van leukocyten en endotheliale cellen of Trombocyten, die kunnen worden gevisualiseerd en vervolgens geregistreerd off line geanalyseerd. Endotheliale cellen, bloedplaatjes of leukocyten kunnen worden voorbehandeld met remmers of antilichamen te bepalen van de rol van specifieke moleculen tijdens dit proces. Schuintrekken voorwaarden, d.w.z. arteriële of veneuze schuifspanning, kunnen gemakkelijk worden aangepast door de viscositeit en de stroomsnelheid van de perfused vloeistoffen en de hoogte van het kanaal.
Inleiding
Op verwonding, ontsteking of infectie beantwoorden leukocyten snel aan pathogen - of schade-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs, DAMPs) omzetten in een geactiveerde staat, en verlaat de bloedstroom naar sites van ontsteking en weefsel schade. Het vermogen van leukocyten om te interageren met hun omgeving cellulaire en moleculaire is essentieel voor de juiste functie als immune cellen, zoals benadrukt door genetische afwijkingen zoals leukocyte hechting deficiëntie1. Leukocyten hechting is het onderwerp van intensief onderzoek de afgelopen decennia geweest en dit heeft geresulteerd in het concept van de leukocyten hechting cascade in de vr....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de medisch-ethische en dier ethische Boards van Universiteit Maastricht.
1. op stroming gebaseerde Assay met menselijke cellen
-
Isolatie van bloedplaatjes uit menselijk bloed
- Citraat (3,2%) antistollingsmiddel veneuze bloed trekken.
- Voeg 1/15 hoeveelheid zuur citraat Dextrose toe (ACD: 80 mM Trinatriumcitraat citraat en citroenzuur 52 mM 183 mM glucose) naar het bloed.
- Centrifugeer bij 350 x g zonder rem voor 15 min te verkrijgen van bloedplaatjes rijk plasma (PRP).
- Het supernatant overbrengen in een conische ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Studeren endotheel-leukocyte hechting, werden fluorescently geëtiketteerde THP-1 cellen over een TNFα - of niet-gestimuleerd endothelial enkelgelaagde gedurende 2 minuten op 3 dyne/cm2geperfundeerd. Het totale aantal aanhangend monocytic cellen werd vastgesteld na 2 min van perfusie door het vastleggen van 6 onafhankelijke velden over een periode van 2-6 min. De Adherente cellen werden gekwantificeerd in ten minste 6 foto's gevangen met een omgekeerde fase contrast/fluorescenti.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Deze in vitro -test is een eenvoudige methode om te onderzoeken van de onderliggende mechanismen van leukocyten aanwerving tijdens vasculaire ontsteking, maar er zijn een aantal kritische punten te worden opgemerkt. De eerste voorwaarde voor het succesvol uitvoeren van deze test is de perfusie van leukocyten over een intact en confluente vasculaire of bloedplaatjes enkelgelaagde. Dit kan worden bereikt door voorafgaande coating van de oppervlakken met collageen type I. In het algemeen, bij het werken met primair.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Wij danken Drs. Martin M. Schmitt en lijn-Fraemohs. Dit werk werd gesteund door de Nederlandse Stichting voor wetenschappelijkonderzoek (ZonMW VIDI 016.126.358 Landsteiner Foundation for Blood Transfusion Research (LSBR Nr. 1638) en het Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB1123/A2) toegekend aan R.R.K.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Inverted fluorescence microscope e.g. EVOS-FL | Life Technologies Europe bv | ||
| Pump bijv. model: 210-CE | world precision instruments | 78-9210W | |
| Falcon 35 mm TC-behandelde Easy-Grip Style Cell Cultuur Dish | corning | 353001 | |
| 50 mL spuit | Becton Dickinson | 300137 | |
| Siliconen slang | VWR | 228-0700 | |
| Elbow Luer Connector Male | Ibidi | 10802 | |
| Female Luer Lock Coupler | Ibidi | 10823 | |
| Flow chamber | University Hospital RWTH Aachen | Patent DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Strömungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorgängen an Zelloberflächen. 2005. | |
| Ibidi sticky slide VI 0.4 | Ibidi | 80608 | |
| Dekvlakken voor sticky slides | Ibidi | 10812 | |
| Collagene Type I, rat staart | Life Technologies Europe bv | A1048301 | |
| Recombinant Human TNF-α | Peprotech | 300-01A | |
| Thrombin Receptor Activator for Peptide 6 (TRAP - 6) | Anaspec / Eurogentec | 24191 | |
| SYTO 13 groene fluorescerende nucleïnezuurvlek | Life Technologies Europe bv | S7575 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution 10x | Sigma-Aldrich Chemie | H4641 | |
| HEPES bufferoplossing 1M, vloeibaar | Life Technologies Europe bv | 15630049 | |
| BUMINATE Albumine, 25% | Baxter | 60010 | |
| Water voor injectie | B. Braun | 3624315 | |
| Calcium chloride dihydraat | Merck | 102382 | |
| Magnesium chloride hexahydraat | Sigma-Aldrich Chemie | M2670 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich Chemie | A6535 | |
| Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Promocell GmbH | C-12203 | |
| Endotheelcel Groei Medium (Klaar-voor-gebruik) | Promocell GmbH | C-22010 | |
| Primary Human Aortic Endothelial Cells (HAoEC) | ATCC | PCS-100-011 | |
| Vascular Cell Basal Medium | ATCC | PCS-100-030 | |
| Endotheelcel Groei Kit-BBE | ATCC | PCS-100-040 | |
| Primary Human Aortic Smooth Muscle Cells (HAoSMC) | ATCC | PCS-100-012 | |
| Vascular Smooth Muscle Cell Growth Kit | ATCC | PCS-100-042 | |
| Human endothelial cell line, EA.hy926 | ATCC | CRL-2922 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Mouse endothelial cell line, SV 40 transformed (SVEC4-10) | ATCC | CRL-2181 | |
| Human monocytic cell line, THP-1 | DSMZ | ACC-16 | |
| RPMI 1640 met Ultra-Glutamine | Lonza | BE12-702F/U1 | |
| Mouse monocyte/macrophage RAW264.7 | ATCC | TIB-71 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose | Gibco | 11965092 | |
| Accutase | Promocell GmbH | C-41310 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich Chemie | P1644 | |
| Histopaque 1119 | Sigma-Aldrich Chemie | 11191 | |
| 10x PBS | Life Technologies Europe bv | 14200075 | |
| BD Vacutainer Plastic Bloedopvangbuisjes met Natrium Heparien | Becton Dickinson | 367876 | |
| VACUETTE TUBE 9 ml 9NC Coagulation sodium citrate 3.2% | Greiner Bio | 455322 | |
| HCl/EtOH mengsel (1,2 mol/L HCl en 50% ethanol) in water | Sigma-Aldrich Chemie | Bereid door 0,3L HCl (4 mol/L) te mengen met 0,7L van 70% v/v ethanol in een afzuigkap |
Referenties
- Dinauer, M. C. Primary immune deficiencies with defects in neutrophil function. American Society of Hematology. 2016 (1), Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology. Education Program 43-50 (2016).
- Butcher, E. C. Leuko....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
