Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Laminaire stroming gebaseerde testen te onderzoeken Leukocyte aanwerving op gekweekte vasculaire cellen en aanhangend bloedplaatjes

7.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/57009

⸱

9 april 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Cardiovascular Research Institute Maastricht (CARIM), Maastricht University, 2Department of Vascular Surgery, Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University, School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Leukocyten interactie gretig met vasculaire cellen en trombocyten na vaartuig muur letsel of tijdens ontsteking. Hier beschrijven we een eenvoudig laminaire flow gebaseerde assay karakteriseren de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de interacties tussen leukocyten en hun cellulaire partners.

Samenvatting

De aanwerving van de leukocyten op letsel of ontsteking naar sites van letsel of weefselbeschadiging van het is onderzocht tijdens de afgelopen decennia en heeft geleid tot het concept van de leukocyten hechting cascade. Echter, de exacte moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij de aanwervingsprocedures van de leukocyten hebben niet nog volledig geïdentificeerd. Aangezien leukocyte werving blijft een belangrijk onderwerp op het gebied van infectie, ontsteking en immuun onderzoek (auto-), presenteren we een eenvoudig laminaire flow gebaseerde bepaling aan de studie van de onderliggende mechanismen van de hechting, ambtshalve adhesie, en transmigratie van leukocyten onder veneuze en arteriële stroom regimes. De in vitro -assay kan worden gebruikt voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de interacties tussen leukocyten en hun cellulaire partners in verschillende modellen van vasculaire ontsteking. Dit protocol beschrijft een laminaire flow gebaseerde bepaling met behulp van een parallel-flow kamer en een omgekeerde fasecontrastmicroscoop aangesloten op een camera te bestuderen van de interacties van leukocyten en endotheliale cellen of Trombocyten, die kunnen worden gevisualiseerd en vervolgens geregistreerd off line geanalyseerd. Endotheliale cellen, bloedplaatjes of leukocyten kunnen worden voorbehandeld met remmers of antilichamen te bepalen van de rol van specifieke moleculen tijdens dit proces. Schuintrekken voorwaarden, d.w.z. arteriële of veneuze schuifspanning, kunnen gemakkelijk worden aangepast door de viscositeit en de stroomsnelheid van de perfused vloeistoffen en de hoogte van het kanaal.

Inleiding

Op verwonding, ontsteking of infectie beantwoorden leukocyten snel aan pathogen - of schade-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs, DAMPs) omzetten in een geactiveerde staat, en verlaat de bloedstroom naar sites van ontsteking en weefsel schade. Het vermogen van leukocyten om te interageren met hun omgeving cellulaire en moleculaire is essentieel voor de juiste functie als immune cellen, zoals benadrukt door genetische afwijkingen zoals leukocyte hechting deficiëntie1. Leukocyten hechting is het onderwerp van intensief onderzoek de afgelopen decennia geweest en dit heeft geresulteerd in het concept van de leukocyten hechting cascade in de vroege jaren 19902,3. Leukocyten hechting wordt geïnitieerd door de selectine-gemedieerde vangst van leukocyten aan het endotheel, waardoor de cellen om te rollen over de vasculaire oppervlak. Deze rollen kan leukocyten te scannen voor endotheel-afhankelijke trekkende signalen, bijvoorbeeld, chemokines, die de activering van de integrins induceren. Vervolgens bemiddelen de geactiveerde verschijnsel de binding aan endothelial liganden, wat resulteert in krachtige leukocyte arrestatie. Leukocyten kunnen vervolgens bereiden op extravasate door kruipen en verspreiden, voordat het endotheel enkelgelaagde doordringen en transmigrating in het onderliggende weefsel. Het basisconcept van de canonieke leukocyte cascade heeft grotendeels onveranderd gebleven sinds de invoering ervan, met enkele tussenstappen toegevoegd4. Niettemin, de exacte moleculaire mechanismen en de rol van de vele spelers die betrokken zijn bij de aanwervingsprocedures van de leukocyten nog niet zijn opgehelderd tot nu toe, en leukocyten werving blijft een belangrijk onderwerp op het gebied van infectie, ontsteking en (auto-) immuun onderzoek.

Bijvoorbeeld verhoogd tijdens vasculaire ontstekingsziekten zoals atherosclerose, leukocyte inlijving in het vaartuig muur stations plaque ontwikkeling. Unstable atherosclerotische plaques kunnen scheuren, leidt tot massale activering van bloedplaatjes en het systeem van de coagulatie, en vervolgens tot occlusie van het vaartuig5. Dit kan resulteren in ernstige cardiovasculaire uitkomsten zoals een hartinfarct of beroerte. Daarnaast endothelial denudatie als het optreedt klinisch, bijvoorbeeld na stenting van een kransslagader, leidt tot een veelheid van interacties van leukocyten en trombocyten naar de blootgestelde vaartuig muur binnenland (b.v., matrix onderdelen en glad spier cellen) en leukocyten met bloedplaatjes die betrekking hebben op de vasculaire verwonding. Deze interacties zijn belangrijk voor de verdere ontwikkeling van de ziekte zoals monocyt-bloedplaatjes interacties6,7van de vorming van de neointima zou rijden. Bovendien, bloedplaatjes-leukocyte interacties gemedieerd door leukocyten integrine Mac-1 (αMβ2) en bloedplaatjes GPIbα hebben onlangs geïdentificeerd als roman bestuurders van trombose in muizen8.

Gezien de brede beschikbaarheid van mens en dier bloed als een bron van leukocyten en trombocyten voor onderzoek en het brede spectrum van moleculen van geïsoleerde matrix en vereeuwigd cellijnen van leukocyten en vasculaire oorsprong, is het mogelijk te simuleren van leukocyten interacties onder stroom in een laboratorium instellen, met behulp van speciaal ontworpen stroom perfusie kamers. Vele varianten hebben ontwikkeld in de afgelopen decennia, variërend van vacuüm-gedreven aan zelfklevende perfusie kamers. Alle varianten hebben gemeen dat het onbeweeglijke gedeelte (bijvoorbeeld, gekweekte vasculaire cellen of matrix eiwitten) is geassembleerd tot een grotere lekvrije kamer uitgerust met een vooraf gedefinieerde kanaal perfusie van vloeistoffen inschakelen via het onbeweeglijke gedeelte. Vooruitgang in technologie molding ingeschakeld bovendien de ontwikkeling van op maat gemaakte oplossingen op basis van silica polymeren9. De viscositeit en de stroomsnelheid van de perfused vloeistoffen en de hoogte van het kanaal voornamelijk de schuifspanning kenmerken van de stroom perfusie apparaat10te bepalen. In dit artikel presenteren we een studie van de onderliggende mechanismen van de hechting-, ambtshalve hechting is de methode van in vitro en transmigratie van leukocyten onder veneuze en arteriële stroom regimes. Het voordeel van de methoden die hier gepresenteerd is dat ze kunnen worden uitgevoerd met behulp van een gemeenschappelijk camera-aangesloten fluorescentie Microscoop, en geen een onderzoekers vereisen te hoge technische bekwaamheid bezitten. De in vitro -assay kan worden gemanipuleerd in vele opzichten (bijvoorbeelddoor het toevoegen van remmers of blokkeren van antilichamen), en is dus die van toepassing zijn in verschillende modellen van vasculaire ontsteking en laat het onderzoek wrijvingscoëfficiënt eiwitfuncties of de evaluatie van specifieke verbindingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de medisch-ethische en dier ethische Boards van Universiteit Maastricht.

1. op stroming gebaseerde Assay met menselijke cellen

  1. Isolatie van bloedplaatjes uit menselijk bloed
    1. Citraat (3,2%) antistollingsmiddel veneuze bloed trekken.
    2. Voeg 1/15 hoeveelheid zuur citraat Dextrose toe (ACD: 80 mM Trinatriumcitraat citraat en citroenzuur 52 mM 183 mM glucose) naar het bloed.
    3. Centrifugeer bij 350 x g zonder rem voor 15 min te verkrijgen van bloedplaatjes rijk plasma (PRP).
    4. Het supernatant overbrengen in een conische tube van 15 mL en voeg 1/20 ACD hoeveelheid toe.
    5. Centrifugeer bij 1.110 g zonder rem voor 15 min te verkrijgen van bloedplaatjes arme plasma (PPP).
    6. Verwijder het supernatant. Afgesneden van het einde van het uiteinde van de pipet (P-1000), waardoor het brede droeg, welke hulpmiddelen bij de preventie van bloedplaatjes activering en zorgvuldig Suspendeer de pellet bloedplaatjes in hetzelfde volume als PRP in bloedplaatjes buffer pH 6.6 (PB: 136 mM NaCl, 10 mM Hepes 2,7 mM KCl, 2 mM MgCl2, 0,1% bovien serumalbumine en 0,1% glucose). Voeg 1/20 volume van ACD en zachtjes meng.
    7. Pellet de bloedplaatjes 1.110 g zonder rem gedurende 15 minuten.
    8. Verwijder het supernatant en Suspendeer zorgvuldig de bloedplaatjes als hierboven in 1 mL bloedplaatjes buffer (pH 7.5).
    9. Het meten van de concentratie van de bloedplaatjes in een verdunning van 1/10 met een geautomatiseerde hematologie analyzer.
    10. Regel het volume met bloedplaatjes buffer (pH 7.5) om een telling van 2 x 107/mL.
  2. Isolatie van polymorfonucleaire cellen uit menselijk bloed (aangepast uit Brinkmann et al. 11 )
    1. Tekenen 24 mL bloed in heparine (10 U/mL) als antistollingsmiddel.
    2. Voeg 6 mL van 1.077 g/mL dichtheid polysucrose-natrium diatrizoate medium (Zie Tabel van materialen) naar een conische buis 15 mL, en zorgvuldig laag 5-6 mL bloed op de top.
    3. Centrifugeer gedurende 20 min op 800 x g zonder rem.
    4. Gecombineerd en negeren de duidelijke gelige toplaag en overdracht van de lagere roodachtig fase met granulocyten in vers 15 mL conische buizen. Wassen cellen door toevoeging van PBS met 2 mM EDTA tot een eindvolume van 14 mL en Centrifugeer gedurende 10 min op 300 x g zonder rem.
    5. In de tussentijd bereidt een kleurovergang medium dichtheid (bijvoorbeeld, percoll, Zie Tabel van materialen) werkende oplossing door het mengen van 18 mL dichtheid kleurovergang medium met 2 mL 10 x stockoplossing van PBS. Verdun deze werkoplossing met PBS (1 x) te verkrijgen van 4,25 mL elk van 85%, 80%, 75%, 70% en 65% kleurovergang middellange oplossingen.
    6. Bereiden 2 conische buisjes met het verloop van de dichtheid van 2 mL van elke middelgrote percentage boven op elkaar stapelen. Beginnen met de hoogste concentratie en ga verder in aflopende volgorde. Mark de lagen op de buis met een waterdichte marker.
    7. Zorgvuldig laag 2 mL van de cel schorsingen op elk van de twee bereid verlopen.
    8. Centrifugeer gedurende 20 min op 800 x g zonder rem in een zorgvuldig uitgebalanceerde centrifuge.
    9. Na het centrifugeren, het verwijderen van de bovenste laag en de meeste van de 65% laag (eerste ring) met PBMCs en verzamelen in nieuwe buizen de resterende interfasen tot de 85% laag wit (tweede ring, PMN).
    10. Wassen cellen door het invullen van de buizen met PBS 2 mM EDTA en Centrifugeer gedurende 10 min op 300 x g zonder rem.
    11. Verwijder het supernatant en schorten gesedimenteerd cellen (meestal ≥95% PMN) in 1 mL Henks buffer (pH 7,45), met 10 mM Hepes en 0,2% menselijke albumine (Assay buffer).
    12. Met behulp van een hemocytometer cellen tellen en cellen op 1 x 106/mL op te schorten.
    13. Ga verder met fluorescerende labeling en perfusie van leukocyten (stap 3.3).
  3. Voorbereiding van aanhangend bloedplaatjes- en vasculaire cel-monolayers
    1. Cel cultuur schotel voorbereiding (gekweekte cellen)
      1. Vooraf jas de 35 mm cel cultuur gerechten met 1 mL verdunde rat staart collageen (30 µg/mL verdund in PBS gefilterd over een 0,2 µm filter).
      2. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C, negeren de collageen-oplossing, en wassen van de schotel een keer met PBS.
    2. Cultuur van vasculaire cellen in cultuur gerechten
      1. Loskoppelen van de primaire (bijvoorbeeld, HUVEC, HAoEC, HAoSMC) of vereeuwigd vasculaire cellen (bijvoorbeeld, EA. Hy926, SVEC) uitgegroeid tot samenvloeiing in een maatkolf van T75 met 1,5 mL cel detachement (bijvoorbeeld, accutase). Voeg 4.5 mL passende groeimedium neutraliseren de mobiele-detachement oplossing te bepalen van de concentratie van de cel met een cel tellen kamer. Opschorten van de cellen bij 0,5 x 105 cellen/mL in passende groeimedium (b.v., het groeimedium volledig endothelial cel).
      2. Voeg 2 mL celsuspensie aan elk gerecht van 35 mm. De cellen in een bevochtigde incubator bij 37 ° C met 5% CO2 cultuur tot samenvloeiing (waarbij 24-48 h, afhankelijk van het celtype).
    3. Glas dekglaasje aan voorbereiding (aanhangend bloedplaatjes)
      1. Dompel het glas dekglaasje aan eens in de HCl-EtOH (1,2 M / 50% v/v).
      2. Spoel het dekglaasje aan 2 keer in ultrazuiver water.
      3. Droog het dekglaasje aan onder N2.
      4. Pre jas het dekglaasje glas aan met 100 µL, overeenkomstig het standpunt van het kanaal van de kamer van de perfusie van verdunde rat staart collageen type I (30 µg/mL verdund in PBS gefilterd over een 0,2 µm filter).
      5. Incubeer gedurende 30 min op RT, negeren de collageen-oplossing en wassen het dekglaasje aan 3 x met PBS.
      6. Blok de collageen gecoat dekglaasje aan met 1% BSA in HEPES voor 0.5 h op RT.
      7. Wassen en drogen van het dekglaasje aan en dit koppelen in de bedwelmingsruimte perfusie. Bloedplaatjes van menselijke of muis bloed zoals beschreven in stap 1.1 of 2.1, respectievelijk te isoleren.
    4. Immobilisatie van bloedplaatjes
      1. Voeg 70 µL van een schorsing van 2 x 107/mL bloedplaatjes per kanaal en incubeer gedurende 1,5 uur op 37 ° C en 5% CO2.
      2. Zorgvuldig vervangen door niet-aanhanger bloedplaatjes blokkerende oplossing (5% BSA in HEPES) voor minstens 30 min op RT. doorgaan met fluorescerende labeling en perfusie van leukocyten (stap 3.3).
    5. Stimulatie van vasculaire cel enkelgelaagde
      1. De vasculaire cellen stimuleren door het vervangen van de media met verse medium met 10 ng/mL Tumornecrosefactor α (TNFα) voor 4 uur bij 37 ° C en 5% CO2.

2. stroom gebaseerde Assay met lymfkliertest cellen

  1. Isolatie van bloedplaatjes uit bloed van de muis
    1. Loting bloed door cardiale punctie met behulp van een naald 21 G (~ 1 mL) van verdoofd (ketamine 80 mg/kg en medetomidine 0,3 mg/kg) 6 – 8 week-oude muizen (C57Bl/6) in citraat (3,2%) als antistollingsmiddel.
    2. Voeg 1/6 ACD hoeveelheid toe.
    3. Centrifuge op 220 x g, middellange rem voor 5 min te verkrijgen van bloedplaatjes rijk plasma (PRP).
    4. Het supernatant (~ 600 µL) plus 1/3 van de rode bloedcellen overbrengen in een nieuwe buis
    5. Centrifugeer bij 95 x g zonder rem voor 6 min.
    6. Het supernatant (PRP) overbrengen en meten van de concentratie van de bloedplaatjes in een verdunning van 1/10 in Tyrode de buffer (TH buffer: 136 mM NaCl, 5 mM Hepes, 2,7 mM KCl, 0.42 mM NaH2PO4* H2O, 2 mM MgCl2, 0,1% bovien serumalbumine en 0,1% glucose) met een geautomatiseerde hematologie analyzer.
    7. Wassen van de bloedplaatjes door het toevoegen van 1/25 volume van ACD + 0,1 U/mL apyrase, samen en centrifugeer bij 2.870 g, middellange rem gedurende 2 minuten.
    8. Verwijder het supernatant en 600 µL TH buffer, 1/10 volume van ACD en 0.1 U/mL apyrase toevoegen. Afgesneden de Pipetteer tip (P-1000), droeg waardoor het brede, die helpt bij het voorkomen van bloedplaatjes activering, en zachtjes schorten de pellet.
    9. Centrifugeer bij 2.870 g, middellange rem gedurende 2 minuten
    10. Verwijder het supernatant en voorzichtig het opschorten van de bloedplaatjes in TH buffer.
    11. Regel het volume met TH buffer om een telling van 2 x 107/mL.
  2. Voorbereiding van aanhangend bloedplaatjes monolayers
    1. Glas dekglaasje aan (aanhangend bloedplaatjes) per 1.3.3 voor te bereiden.
  3. Immobilisatie van bloedplaatjes
    1. Voeg 100 µL van een schorsing van 2 x 107/mL bloedplaatjes per kanaal en incubeer gedurende 1,5 uur op 37 ° C en 5% CO2.
    2. Zorgvuldig vervangen door niet-aanhanger bloedplaatjes blokkerende oplossing (5% BSA in HEPES) voor minstens 30 min op RT. doorgaan met fluorescerende labeling en perfusie van leukocyten (stap 3.3)
  4. Stimulatie van muis bloedplaatjes enkelgelaagde
    1. Voorafgaand aan de perfusie van leukocyten (stap 3.3), de bloedplaatjes te stimuleren door perfusie van trombine (0,5 nM) in HHHSA buffer gedurende 3 minuten bij 37 ° C.

3. fluorescerende Labeling en perfusie van leukocyten (PMN of THP-1 voor mens en RAW264.7 of primaire muisknop monocyten voor lymfkliertest Flow gebaseerde Assay)

  1. Fluorescerende etiketten
    1. Label de leukocyten (1 x 106/mL) met de cel-permeant groen fluorescent nucleïnezuur vlek (1 µM). Incubeer de cellen gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
    2. De cellen met PBS door centrifugeren bij 300 x g gedurende 5 minuten wassen en schorten cellen tot een concentratie van 0,5 x 106 cellen/mL (5 mL per testvoorwaarde, afhankelijk van het debiet) in assay buffer.
  2. Flow kamer assay voorbereiding
    1. Voor de hechting van de leukocyten op een cel enkelgelaagde, negeren het kweekmedium van de cel van de schotel, en omgezet in stroom aanwezig. Buizen verbinden met de spuit. Voor de hechting van de leukocyten op geïmmobiliseerdet bloedplaatjes, verbinden met de micro dia de spuit. Vooraf warm een waterbad 37 ° c.
    2. Neem een perfusie spuit (50 mL), installeren spuit op de spuit houder, en de pomp op trekken modus. Stelt het volume van de pomp tot 0 mL, en de diameter tot 26.70 mm voor de 50 mL spuit.
    3. Sluit een kniestuk luer aan één uiteinde van de buis. Plaats een luer lock koppelstuk aan de spuit en verbind de slang met de elleboog luer aansluiting om de luer lock koppelstuk. Sluit het uiteinde van de gratis buis aan de kamer van de stroom.
  3. Leukocyten perfusie en hechting
    1. Voor de hechting van de leukocyten op een cel enkelgelaagde, negeren het kweekmedium van de cel van de schotel, en omgezet in stroom aanwezig. Buizen verbinden met de spuit. Voor de hechting van de leukocyten op geïmmobiliseerdet bloedplaatjes, verbinden met de micro dia de spuit.
    2. Voor leukocyten perfusie en hechting over een vasculaire- of bloedplaatjes enkelgelaagde, plaats van de tweede buis in een conische buis van 50 mL, met assay buffer en vul buizen met 1 mL pipet, dan knijp van de buis en sluit u deze aan een stroom-kamer.
    3. Voorafgaand aan de leukocyten perfusie,2 CaCl 3 mM en 2 mM MgCl2 toevoegen aan de celsuspensie en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C.
    4. Perfuse assay buffer vóór perfusie van cellen te verwijderen mogelijk lucht uit de kamer en buizen.
    5. Nauwe buis eindigt door knijpen ze strak en schakelaar buizen uit assay buffer te celsuspensie, luchtbellen voorkomen overlappingsbreedte. Perfuse cellen met passende stroom tarief/schuifspanning totdat de eerste cellen aankomen.
    6. Perfuse cellen met passende stroom tarief/schuifspanning gedurende 2 minuten, en ten minste 6 foto's tussen 2 – 6 min etappen te verwezenlijken, Adherente cellen met een omgekeerde fase contrast/fluorescentie Microscoop (bijvoorbeeldEVOS-FL) vastleggen met behulp van 100 X vergroting aangesloten voor een digitale CCD of CMOS camera.
      Opmerking: Flow rate/schuifspanning hangt flow kamer afmetingen en viscositeit van perfusaat. Voor perfusie kamer hier gebruikt (Zie Tabel van materialen):
      Τ =η* 97.1*Φ
      Τ: schuifspanning (1 dyn/cm2)
      Η: viscositeit (0,015 dyn * s/cm2)
      Φ: debiet (0,67 mL/min)
  4. Leukocyten ambtshalve hechting
    1. Voor de-adhesion, schakelen buis van celsuspensie aan assay buffer door uitknijpen de slang, luchtbellen voorkomen steeds gevangen
    2. Loskoppelen cellen door perfusie met assay buffer met een passende stroom tarief/schuifspanning (zie 3.3.7 Opmerking).
  5. Leukocyten zielsverhuizing
    1. Voor leukocyten zielsverhuizing, perfuse leukocyten (stap 3) totdat een voldoende hoeveelheid van leukocyten houden (~ 50 cellen/weergaveveld).
    2. Leukocyten schorsing vervangen door assay buffer.
    3. Record transmigrating cellen tegen tijd vervallen elke 10-15 s gedurende 30-60 minuten bij 37 ° C.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Studeren endotheel-leukocyte hechting, werden fluorescently geëtiketteerde THP-1 cellen over een TNFα - of niet-gestimuleerd endothelial enkelgelaagde gedurende 2 minuten op 3 dyne/cm2geperfundeerd. Het totale aantal aanhangend monocytic cellen werd vastgesteld na 2 min van perfusie door het vastleggen van 6 onafhankelijke velden over een periode van 2-6 min. De Adherente cellen werden gekwantificeerd in ten minste 6 foto's gevangen met een omgekeerde fase contrast/fluorescenti...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Deze in vitro -test is een eenvoudige methode om te onderzoeken van de onderliggende mechanismen van leukocyten aanwerving tijdens vasculaire ontsteking, maar er zijn een aantal kritische punten te worden opgemerkt. De eerste voorwaarde voor het succesvol uitvoeren van deze test is de perfusie van leukocyten over een intact en confluente vasculaire of bloedplaatjes enkelgelaagde. Dit kan worden bereikt door voorafgaande coating van de oppervlakken met collageen type I. In het algemeen, bij het werken met primair...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij danken Drs. Martin M. Schmitt en lijn-Fraemohs. Dit werk werd gesteund door de Nederlandse Stichting voor wetenschappelijkonderzoek (ZonMW VIDI 016.126.358 Landsteiner Foundation for Blood Transfusion Research (LSBR Nr. 1638) en het Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB1123/A2) toegekend aan R.R.K.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Inverted fluorescence microscope e.g. EVOS-FLLife Technologies Europe bv
Pump bijv. model: 210-CE world precision instruments78-9210W
Falcon 35 mm TC-behandelde Easy-Grip Style Cell Cultuur Dishcorning353001
50 mL spuitBecton Dickinson300137
Siliconen slang VWR228-0700
Elbow Luer Connector MaleIbidi10802
Female Luer Lock CouplerIbidi10823
Flow chamberUniversity Hospital RWTH AachenPatent DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Strömungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorgängen an Zelloberflächen. 2005. 
Ibidi sticky slide VI 0.4Ibidi80608
Dekvlakken voor sticky slides Ibidi10812
Collagene Type I, rat staartLife Technologies Europe bvA1048301
Recombinant Human TNF-αPeprotech300-01A
Thrombin Receptor Activator for Peptide 6 (TRAP - 6)Anaspec / Eurogentec24191
SYTO 13 groene fluorescerende nucleïnezuurvlekLife Technologies Europe bvS7575
Hanks’ Balanced Salt Solution 10xSigma-Aldrich ChemieH4641
HEPES bufferoplossing 1M, vloeibaarLife Technologies Europe bv15630049
BUMINATE Albumine, 25% Baxter60010
Water voor injectieB. Braun3624315
Calcium chloride dihydraatMerck102382 
Magnesium chloride hexahydraat Sigma-Aldrich ChemieM2670
ApyraseSigma-Aldrich ChemieA6535
Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)Promocell GmbHC-12203
Endotheelcel Groei Medium (Klaar-voor-gebruik)Promocell GmbHC-22010
Primary Human Aortic Endothelial Cells (HAoEC)ATCC PCS-100-011
Vascular Cell Basal Medium ATCCPCS-100-030
Endotheelcel Groei Kit-BBEATCCPCS-100-040
Primary Human Aortic Smooth Muscle Cells (HAoSMC)ATCCPCS-100-012
Vascular Smooth Muscle Cell Growth KitATCCPCS-100-042
Human endothelial cell line, EA.hy926ATCCCRL-2922
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)ATCC30-2002
Mouse endothelial cell line, SV 40 transformed (SVEC4-10)ATCCCRL-2181
Human monocytic cell line, THP-1DSMZACC-16
RPMI 1640 met Ultra-GlutamineLonzaBE12-702F/U1
Mouse monocyte/macrophage RAW264.7ATCCTIB-71
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucoseGibco11965092
AccutasePromocell GmbHC-41310
PercollSigma-Aldrich ChemieP1644
Histopaque 1119Sigma-Aldrich Chemie11191
10x PBSLife Technologies Europe bv14200075
BD Vacutainer Plastic Bloedopvangbuisjes met Natrium HeparienBecton Dickinson367876
VACUETTE TUBE 9 ml 9NC Coagulation sodium citrate 3.2% Greiner Bio455322
HCl/EtOH mengsel (1,2 mol/L HCl en 50% ethanol) in waterSigma-Aldrich ChemieBereid door 0,3L HCl (4 mol/L) te mengen met 0,7L van 70% v/v ethanol in een afzuigkap

Referenties

  1. Dinauer, M. C. Primary immune deficiencies with defects in neutrophil function. American Society of Hematology. 2016 (1), Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology. Education Program 43-50 (2016).
  2. Butcher, E. C. Leukocyte-endothelial cell recognition: three (or more) steps to specificity and diversity. Cell. 67 (6), 1033-1036 (1991).
  3. Springer, T. A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm. Cell. 76 (2), 301-314 (1994).
  4. Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
  5. Legein, B., Temmerman, L., Biessen, E. A. L., Lutgens, E. Inflammation and immune system interactions in atherosclerosis. Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (20), 3847-3869 (2013).
  6. Wang, Y., Sakuma, M., et al. Leukocyte engagement of platelet glycoprotein Ibalpha via the integrin Mac-1 is critical for the biological response to vascular injury. Circulation. 112 (19), 2993-3000 (2005).
  7. Zhao, Z., Vajen, T., et al. Deletion of junctional adhesion molecule A from platelets increases early-stage neointima formation after wire injury in hyperlipidemic mice. Journal of cellular and molecular medicine. , (2017).
  8. Wang, Y., Gao, H., et al. Leukocyte integrin Mac-1 regulates thrombosis via interaction with platelet GPIbα. Nature communications. 8, 15559(2017).
  9. Fujii, T. PDMS-based microfluidic devices for biomedical applications. Microelectronic Engineering. 61-62, 907-914 (2002).
  10. Son, Y. Determination of shear viscosity and shear rate from pressure drop and flow rate relationship in a rectangular channel. Polymer. 48 (2), 632-637 (2007).
  11. Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of visualized experiments : JoVE. (36), e1724(2010).
  12. Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of visualized experiments : JoVE. (77), e50586(2013).
  13. Schmitt, M. M. N., Megens, R. T. A., et al. Endothelial junctional adhesion molecule-a guides monocytes into flow-dependent predilection sites of atherosclerosis. Circulation. 129 (1), 66-76 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Laminar flow-assayisolatie van bloedplaatjesflowkamerschuifspanningendotheelcellenfluorescentiemicroscopieceladhesietumornecrosefactorTRAP-6-stimulatie
Laminaire stroming gebaseerde testen te onderzoeken Leukocyte aanwerving op gekweekte vasculaire cellen en aanhangend bloedplaatjes
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.