Methodenartikel

Isolatie en karakterisering van tumor initiërende cellen uit Sarcoom patiënt-afgeleide xenografts

DOI:

10.3791/57011

⸱

13 juni 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven een gedetailleerd protocol voor de isolatie van tumor-initiërende cellen van humaan Sarcoom patiënt-afgeleide xenotransplantaten door fluorescentie-geactiveerde celsortering, waarbij gebruik wordt gemaakt van humaan leukocyten antigeen-1 (HLA-1) als een negatieve marker, en voor de verdere validering en karakterisering van deze HLA-1-negatieve tumor initiërende cellen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het bestaan en het belang van tumor initiërende cellen (TICs) zijn in het afgelopen decennium ondersteund door steeds meer bewijsmateriaal. Deze TICs is aangetoond dat zij verantwoordelijk zijn voor tumor initiatie, metastase, en drug resistentie. Daarom is het belangrijk om specifieke TIC-targeting therapie te ontwikkelen naast de huidige chemotherapie strategieën, die vooral gericht zijn op het grootste deel van non-TICs. Om het mechanisme achter de maligniteit van TICs verder te begrijpen, beschrijven we een methode om TICs in menselijke sarcomen te isoleren en te karakteriseren. Hierin tonen we een gedetailleerd protocol om patiënt-afgeleide xenotransplantaten (pdxs) van menselijke sarcomen te genereren en om TICs te isoleren door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) met humane leukocytenantigeen klasse I (HLA-1) als een negatieve marker. Ook beschrijven we hoe functioneel karakteriseren deze TICs, met inbegrip van een Sphere Formation assay en een tumorvorming Assay, en voor het opwekken van differentiatie langs mesenchymale trajecten. De isolatie en karakterisering van de PDX TICs geven aanwijzingen voor de ontdekking van mogelijke gerichte therapie reagentia. Bovendien blijkt uit toenemend bewijsmateriaal dat dit Protocol verder kan worden uitgebreid om TICs van andere soorten menselijke kankers te isoleren en te karakteriseren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Intratumoreel cellulaire heterogeniteit van menselijke kankers wordt ondersteund door het toenemende bewijsmateriaal in de afgelopen tien jaar1. Vergelijkbaar met normaal weefsel, kanker weefsel bestaat uit een kleine subpopulatie van TICs (ook wel kanker stamcellen genoemd), die tumor vormende vermogen vertonen; Ondertussen vertonen de bulk van kankercellen gedifferentieerde fenotypes2. Deze TICs vertonen stamcel achtige eigenschappen, waaronder de uitdrukking van een stamcel marker en het vermogen van zowel zelf vernieuwing als Asymmetrische celdeling, en kunnen dus de vorming van een cellulaire heterogene tumor3initiëren. Recente studies hebben aangetoond dat TICs zijn niet alleen verantwoordelijk voor tumor initiatie, maar zijn ook geassocieerd met tumor agressiviteit4, metastase5, en drug resistentie6. Daarom is het belangrijk om de biologie van TICs te begrijpen en zo een specifieke behandel strategie te ontwikkelen die gericht is op deze TICs.

Op FACS gebaseerde methoden zijn gebruikt om TICs te identificeren met TICs markers, waaronder CD133, CD24 en CD441. De meeste van deze markers worden ook uitgedrukt in normale stamcellen7. Geen van deze markers markeert echter alleen TICs. De rollen die deze moleculen spelen in de maligniteit van TICs zijn nog steeds niet duidelijk. Bijvoorbeeld, CD133 kan vaak worden geïnactiveerd door DNA-methylatie, en dus, deze intertumorele heterogeniteit kan de nauwkeurigheid van deze markers8. ALDH1 is een marker die ook functioneert om de stemdheid van TICs9te behouden. Het lijkt te zijn effectiever bij het identificeren van borstkanker TICs, maar is nog steeds twijfelachtig in andere tumortypes9. Sommige signalering trajecten spelen belangrijke rollen in stamcel biologie, met inbegrip van WNT (Wingless-gerelateerde integratie site), TGF-β (transformeren groeifactor Beta), en Hedgehog1. Maar het is moeilijk om te bewijzen dat deze trajecten zijn TIC-specifieke en de activiteit van deze trajecten gebruiken om te isoleren van de TICs van primaire tumoren. Zo is een betrouwbare roman TIC marker dringend nodig.

Humaan MHC klasse I, ook wel HLA-1 genoemd, is een celoppervlak proteïne, uitgedrukt in bijna alle nucleated cellen10. HLA-1 functioneert als een antigeen die een molecuul presenteert dat specifiek wordt herkend door CD8 T-cellen10. Het cytotoxische effect van CD8 T cellen kan worden geactiveerd wanneer kankercellen een tumor antigen presenteren door HLA-1. Daarom kan het ontbreken van HLA-1 op het celoppervlak van de kankercellen leiden tot een immuun ontsnapping uit de cytotoxische CD8 T-cellen. De Downregulatie van HLA-1 is beschreven in verschillende soorten menselijke kanker en is gecorreleerd met slechte prognose, metastase en geneesmiddelresistentie11. We hebben aangetoond dat het verlies van HLA-1-expressie op het celoppervlak kan worden gebruikt om TICs in sarcomen te identificeren, evenals bij prostaatkanker6,12.

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol om TICs van Human Sarcoom pdxs door FACS te isoleren, met behulp van HLA-1 als een negatieve marker, en om deze HLA-1-negatieve tics verder te valideren en te karakteriseren.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle protocollen voor muis experimenten hier besproken waren in overeenstemming met de institutionele richtlijnen en goedgekeurd door de Mount Sinai Medical Center institutioneel menselijk onderzoek ethiek Commissie en Dierenzorg en gebruik Comité.

1. verwerking van het Sarcoom weefselmonster en PDX-vorming

  1. Onder een institutioneel Review Board-goedgekeurd protocol, hebben pathologie servicemedewerkers Sarcoom monsters van chirurgische specimens bereiden en onmiddellijk elk monster op ijs zetten in een 100 mm Petri schaaltje.
  2. Plaats het monster in een conische buis van 15 mL polystyreen met 6 mL Cold Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 kweekmedium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicileen/streptomycine. Het weefselmonster onmiddellijk verwerken.
  3. Optionele Voor Osteosarcoom alleen, volg de volgende stappen, die kunnen worden overgeslagen voor wekedelensarcoom.
    1. Snijd het weefsel in 20 mm3 stuks met behulp van een scalpel. Breng de weefsel stukken over in een buis van 15 mL die 3 mL Collagenase-oplossing bevat (RPMI 1640 met 1 mg/mL Collagenase).
    2. Zet de buis gedurende 30 minuten in een waterbad bij 37 °C.
    3. De buis grondig Vortex en voeg vervolgens 3 mL RPMI 1640 aangevuld met 10% FBS om de Collagenase-activiteit te neutraliseren.
    4. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 350 x g bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant.
  4. Werk in een steriele bioveiligheidskast en plaats het weefselmonster in een 100 mm Petri schaaltje. Voeg 500 μL steriele 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) toe aan het weefsel. Met een steriel scalpel, mechanisch wrijf het weefsel in kleine stukjes totdat geen zichtbare weefsel stuk groter is dan 0,1 mm.
  5. Breng de 500 μL celsuspensie over in een celzeef van 35 μm en verzamel de gefilterde suspensie met een polystyreen buis van 50 mL. Plaats deze 50 mL polystyreen buis met de celsuspensie op ijs.
  6. Voeg nog eens 500 μL PBS aan het weefsel toe. Triturate voor de tweede keer, overdracht van de suspensie door de cel zeef, en verzamel het in dezelfde 50 mL buis.
  7. Herhaal deze stappen (stappen 1.5 – 1.6) totdat de weefsel sectie volledig is losgekoppeld, meestal 6x-8x.
  8. Pellet de celsuspensie door centrifugeren bij 350 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg, regeer de pellet met 5 mL hemolyse-buffer (0,15 M NH4cl, 10 mm khco3en 0,1 mm EDTA) en inbroed de oplossing gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om rode bloedcellen te verwijderen.
  9. Centrifugeer gedurende 5 min bij 350 x g bij kamertemperatuur en verwijder de hemolyse-buffer. Was de pellet met 5 mL PBS. Centrifugeer nogmaals gedurende 5 minuten bij 350 x g en verwijder het supernatant.
  10. Respendeer de pellet met 1 mL PBS en Tel het levensvatbare celgetal met behulp van een hemocytometer of een andere alternatieve methode. Verdun de cellen tot een uiteindelijke concentratie van 1 x 107 cellen in 200 μL PBS. Laat de celsuspensie op ijs.
  11. Laat de kelder membraan matrix op ijs zodat het smelt. Voeg 200 μL kelder membraan matrix toe aan de 200 μL celsuspensie. Zachtjes mengen en op ijs houden.
  12. Subcutaan injecteren de celsuspensie: kelder membraan matrix (1:1) mengsel in twee NOD scid gamma (NSG) muizen in hun flanken. Gebruik voor elke injectie 200 μL.
  13. Bewaak de PDX-formatie door de injectieplaats van de muizen 2x per week te controleren. Verwijder de tumor xenotransplantaatmodellen is wanneer het 1 cm in diameter bereikt.

2. isolatie van tumor-initiërende cellen door FACS van de PDX

  1. Verwijder chirurgisch de PDX van de muizen zoals eerder beschreven12.
  2. Snijd de tumor in tweeën. Bevestig de helft van de xenotransplantaatmodellen is met 4% Paraformaldehyde 's nachts. Dit is voor histologische analyse. Verwerk de andere helft van het weefsel zoals hierboven beschreven (stappen 1.3 – 1.8) om een tumor celsuspensie te krijgen.
  3. Respendeer de pellet met PBS en Tel het levensvatbare celnummer.
  4. Verdun de celsuspensie in PBS, aangevuld met 5% FBS tot een concentratie van 2 x 106 cellen/ml. Laat de celsuspensie 30 min op ijs liggen verdeel de celsuspensie over twee buisjes. Markeer de buizen met isotoop controle en antilichamen, respectievelijk. Noteer het aantal cellen in elke buis.
  5. Bereid 2 x HLA-1-PE antilichamen door het antilichaam te verdunen met PBS aangevuld met 5% FBS (1:250). Verdun het negatieve Isotype-controle-antilichaam met dezelfde toestand. Meng de celsuspensie uit de "antilichaam" buis met verdund antilichaam (1:1) om de uiteindelijke antilichaam verdunning 1:500 te maken. Meng de celsuspensie van de "isotoop controle" buis met isotoop regeling (1:1). Zet de celsuspensies op ijs voor 90 min.
  6. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 350 x g bij 4 °c en verwijder het supernatant. Voeg 10 mL PBS toe om de pellet 2x te wassen.
  7. Voeg 4 ', 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) toe aan PBS tot een eindconcentratie van 10 μg/mL. Voeg deze DAPI-oplossing toe aan de celpellet om een celsuspensie van 107 -cellen/ml te maken (met behulp van de celnummers van stap 2,4).
  8. Filtreer de celsuspensie door middel van 35 μm zeef doppen in 12 mm x 75 mm polystyreen buizen.
  9. Gebruik een flow cytometer om de HLA-1-negatieve TIC subpopulatie6te sorteren. Gate levensvatbare cellen (DAPI-Negative) en verzamel zowel HLA-1-negatieve als positieve subpopulaties in 2 15 mL Verzamel buisjes, elk met 4 mL RPMI 1640 kweekmedium.

3. karakterisering van tumor-initiërende cellen

  1. Sarcosphere Formation
    1. Maak sarcosphere Growth medium met behulp van alpha-MEM Cell Culture medium. Voeg supplementen om een eindconcentratie van B-27 supplementen (1x), N2 supplementen (1x), basis fibroblast groeifactor (bFGF) (20 ng/mL), en epidermale groeifactor (EGF) (20 ng/mL) en penicillaire/streptomycine (100 IU/mL). Filtreer het medium met een celkweek filter van 0,2 μm voor gebruik.
    2. Pellet de gesorteerde HLA-1-negatieve en-positieve subpopulatie uit stap 2,9 en Tel de celaantallen van elke subpopulatie.
    3. Verdun 1,5 x 106 cellen in 15 ml van het sarcosphere groeimedium om de celverdunning van 1 x 105 cellen/ml te maken.
    4. Verdun de cellen met een nieuw sarcosphere groeimedium op een seriële wijze om 15 mL van elke celverdunning van 104, 103en 102 cellen/ml te maken. Bereid vervolgens 4 96-goed Ultra-Low bijlage celcultuurplaten, elk voor een celverdunning.
    5. Breng 100 μL celsuspensie over van de 105 cellen/ml verdunning naar elke put van de eerste 96-goed Ultra-Low bijlage celkweek plaat. Dit bord heeft 104 cellen in elk goed.
    6. Gebruik de andere 3 96-well Ultra-Low bijlage celcultuurplaten voor de andere drie celverdunningen: 104, 103en 102 cellen/ml. Breng 100 μL celsuspensie over naar elke put van de 96-well Ultra-Low bijlage celcultuurplaten. Deze drie cultuur platen hebben 1.000 cellen/goed, 100 cellen/goed, en 10 cellen/goed, respectievelijk.
    7. Plaats de platen in een incubator van 37 °C, 5% CO2 celkweek.
    8. Voeg elke drie dagen nieuwe bFGF en EGF direct toe aan het celkweekmedium (eindconcentratie van 20 ng/mL) zonder het medium te veranderen om cellen die verloren gaan in de suspensie cultuur te vermijden.
    9. Gebruik een lichte Microscoop om de sarcosphere formatie elke dag gedurende drie weken te monitoren, zoals weergegeven in Figuur 2a.
    10. Tel na drie weken het aantal sarcosphere-positieve putten en sarcosphere-negatieve putten van elke celverdunning voor zowel HLA-1-negatieve als HLA-1-positieve cellen.
    11. Bereken de frequentie van de Sphere-vormende cellen op basis van een Poisson-kansverdeling13. Vergelijk de HLA-1-Negative TICs met de HLA-1-positieve bulk cellen.
  2. Seriële-verdunning tumor-formatie assay
    1. Tel de HLA-1-negatieve en-positieve subpopulaties uit stap 2,9.
    2. Maak seriële verdunningen van de cellen met PBS naar concentraties van 106, 105, 104en 103 cellen/ml. Gebruik 1 mL van elke verdunning voor de tumorvorming in 10 muizen.
    3. Voeg 1 mL kelder membraan matrix toe aan de 1 mL celsuspensie van elke verdunning (1:1). Houd de 2 mL van elk mengsel op ijs.
    4. Injecteer subcutaan 200 μL van de cel: basaal membraan matrix mengsel in de flanken van NGS-muizen, met HLA-1-negatieve cellen voor één flank en HLA-1-positieve cellen voor de andere flank van dezelfde muis. Gebruik voor elke verdunning 10 muizen. Gebruik 25G spuiten met een naald voor de injecties.
    5. Monitor de tumorvorming in de muizen voor vier tot acht weken, afhankelijk van het tempo van de tumorgroei.
    6. Bereken de tumor-initiëren celfrequentie door het percentage van tumorvorming op verschillende invoercel nummers. Vergelijk de HLA-1-Negative TICs met de HLA-1-positieve bulk cellen.
  3. Geïnduceerde differentiatie langs mesenchymale trajecten
    1. Gebruik de sarcospheres gevormd tijdens de vorige stappen (stap 3.1.9). Breng de sarcospheres over naar een nieuwe 6-put plaat. Cultuur de sarcosphere met 2,5 mL Alfa-MEM aangevuld met 10% FBS om de cellen aan het oppervlak van de kweek plaat te laten hechten.
    2. Na een bevestiging voor twee dagen, schakel het kweekmedium van alpha-MEM aangevuld met 10% FBS aan de 1:1 mengsel van Alfa-MEM aangevuld met 10% FBS en Human mesenchymale stamcel (hMSC) groeimedium.
    3. Na twee dagen, overschakelen naar voltooien hMSC groeimedium.
    4. Wanneer de cellen 90% confluency bereiken, aspireren het hMSC-medium en voeg differentiatie medium toe. Voor osteogene differentiatie, voeg osteogenic differentiatie medium toe (hMSC-groeimedium aangevuld met 10 nM dexamethason, 5 mM β-glycerofosfaat, 50 μg/mL L-ascorbinezuur en 10 mM lithiumchloride). Voor lipogenic differentiatie, voeg adipocyte differentiatie medium (hMSC groeimedium aangevuld met 0,5 μM dexamethason, 0,5 μM isobutylmethylxanthine, en 50 μM indomethacine).
    5. Verander het differentiatie medium elke drie dagen.
    6. Na drie tot vier weken, stop de differentiatie en was de cellen met PBS. Aspiraat vervolgens de PBS en voeg 2 ml 10% formaline toe aan de cellen voor fixatie. Laat de cellen 45 min bij kamertemperatuur zitten. Was ze met gedeïoniseerd water. De cellen zijn nu klaar voor Alizarin Red S kleuring (stap 3.3.6.1) of olie rode O-kleuring (stap 3.3.6.2).
      1. Om osteogenic differentiatie te detecteren, moet u Alizarin Red S kleuring uitvoeren. Zuig water en voeg 2 mL Alizarin Red S werkoplossing (2% Alizarin Red S, pH 6,0) toe aan de cellen en laat ze 5 minuten zitten voor vlekken. Was de cellen met gedeïoniseerd water en observeer de reactie microscopisch.
      2. Om adipogene differentiatie te detecteren, voert u olie rode O-kleuring uit.
        1. Maak een olie rode O-oplossing. Bereid een stamoplossing door 300 mg olie rood O poeder toe te voegen aan 100 mL isopropanol.
        2. Meng binnen 2 uur voor gebruik drie delen (30 mL) olie rode O-stamoplossing met twee delen (20 mL) gedeïoniseerd water. Laat het mengsel 10 minuten op kamertemperatuur zitten.
        3. Filter de werkoplossing met behulp van voor gebruik.
        4. Verwijder het water uit de cellen bereid volgens stap 3.3.6. Voeg 2 mL 60% isopropanol toe om de celmonolaag te bedekken en de cellen zitten 2 min.
        5. Verwijder het isopropanol en voeg 2 mL olie rode O-werkoplossing toe. Laat de cellen 5 minuten op kamertemperatuur zitten.
        6. Spoel de cellen met gedeïoniseerd water en observeer de reactie onder een lichte Microscoop.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een Human Sarcoom PDX werd gegenereerd en gekleurd. De intratumoral heterogeniteit werd aangetoond door immunohistochemie met HLA-1 antilichaam. De xenotransplantaatmodellen is bestond uit twee verschillende subpopulaties, namelijk HLA-1 positief en negatief (Figuur 1a)12. De Sarcoom PDX toonde histologische gelijkenissen met de ouderlijke primaire tumor (Figuur 1a). Sarcoma PDX TICs werden geïsoleerd door FACS. Met behulp van een dubbele sorteermethode werden de HLA-1-negatieve cellen sterk verrijkt van de ouderlijke celpopulatie (Figuur 1b)12.

Genen uitgedrukt in stamcellen (bijv. Oct4, nanog en Myc) bleken sterk uitgedrukt te zijn in geïsoleerde HLA-1-negatieve cellen in vergelijking met hun HLA-1-positieve tegenhanger (figuur 1c). Sox-9, een ontwikkelings gen dat werd gerapporteerd om belangrijke rollen in andere kanker stamcellen te spelen, zoals bij borst carcinoom, werden specifiek uitgedrukt in HLA-1-negatieve cellen (figuur 1d).

Om de geïsoleerde HLA-1-negatieve subpopulatie te valideren, werd een sarcosphere Formation assay uitgevoerd om het zelfvernieuwings vermogen van de cellen te onderzoeken. HLA-1-negatieve cellen konden bollen vormen met een initiële invoer van slechts 10 cellen (Figuur 1e)12. Om te onderzoeken de tumor-vormende vermogen, een test van de tumorvorming seriële verdunning werd uitgevoerd. Dezelfde aantallen HLA-1-negatieve en-positieve cellen werden subcutaan geïnjecteerd in elke flank van dezelfde muis. HLA-1-negatieve cellen toonden een significant hogere tumorvorming vermogen (Figuur 1f)12, terwijl xenotransplantaten gevormd door zowel HLA-1-negatieve en-positieve subpopulaties waren cellulaire heterogene tumoren (figuur 1h).

We voerden een genexpressie analyse uit van de geïsoleerde HLA-1-Negative TICs12. Genen geassocieerd met normale mesenchymale celdifferentiatie werden verheven in TICs12. Dus, we ook getest of HLA-1 TICs kan worden geïnduceerd aan terminale differentiatie en resulteren in een verminderde tumorvorming vermogen. De resultaten toonden aan dat HLA-1-negatieve cellen kunnen worden geïnduceerd om te differentiëren langs zowel lipogenic en osteogenic trajecten en tonen sterke olie rode O en Alizarin rode S kleuring (figuur 1g). HLA-1-positieve cellen differentiëren daarentegen niet onder dezelfde omstandigheden. Dus, deze resultaten duiden op een veelbelovende gedifferentieerde therapie strategie die kan worden gebruikt om te richten op Sarcoom TICs.

figure-results-1
Figuur 1: isolatie van HLA-1-negatieve cellen uit intratumoreel heterogene Sarcoom PDXs. (A) HLA-1-negatieve cellen (pijlen) werden aangetroffen in verschillende subtypen van humane sarcomen door immunohistochemie (IHC). (a en b) Clear cell Sarcoom. (c en d) Pleomorfe liposarcoom. (e en f) Leiomyosarcoom. (g en h) Kwaadaardige perifere zenuw schede tumor. (i en j) Liposarcoom, niet anderszins gespecificeerd. (k en l) Gededifferentieerde liposarcoom. Schaalbalk = 100 μm. (B) Sarcoom pdxs waren histologisch vergelijkbaar met de ouderlijke Tumor (hematoxyline en eosine [H & E] vlek) en toonden cellulaire heterogeniteit in de HLA-1-expressie door IHC. Hier worden representatieve foto's van Sarcoom pdxs, waaronder een Clear cell Sarcoom (CCS), een gededifferentieerde chondrosarcoom (DCS), en een gededifferentieerde liposarcoom (DDL) getoond. Schaalbalk = 100 μm. (C) de subpopulatie van HLA-1-negatieve cellen werd geïsoleerd door Flowcytometrie met een dubbele sorteermethode. Van boven naar beneden: eerste sortering, tweede sortering en zuiverheids controle. Geïsoleerde HLA-1-negatieve en HLA-1-positieve cellen werden onderworpen aan een latere functionele analyse, inclusief een tumor formatie test. De resultaten van dit cijfer zijn afkomstig uit een vorige publicatie12. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: karakterisering van HLA-1-negatieve TICs door functionele assays. A) een bol-formatie test toonde aan dat slechts 10 HLA-1-negatieve cellen in staat waren om Sarcoom bollen te vormen. Links: representatieve foto's van Sarcoom bollen. Rechts: Sphere-forming frequentie; gemiddelde ± SD. scale Bar = 100 μm. (B) HLA-1-negatieve cellen geïsoleerd van de SARCOOM PDX waren zeer tumorigenic. Hier getoond zijn representatieve foto's van de tumor gevormd door HLA-1-negatieve en-positieve cellen van DDL. Duizend cellen van HLA-1-negatieve en HLA-1-positieve DDL-cellen werden geïnjecteerd in afzonderlijke flanken van dezelfde muis. C) de mRNA-niveaus van stamcel genen Oct4, nanogen Myc werden op hogere niveaus uitgedrukt in HLA-1-negatieve cellen vergeleken met HLA-1-positieve cellen. De gegevens vertegenwoordigen het gemiddelde ± SD (n = 5). D) sterke positieve kleuring van olie rood O en Alizarin Red S toont een terminale differentiatie langs lipogenic en osteogenic trajecten die worden geïnduceerd uit Sarcoom TICs. (E) HLA-1-immunokleuring van pdxs gevormd door HLA-1-positieve (linker) en-negatieve (rechts) subpopulaties. Schaalbalk = 100 μm. De resultaten van dit cijfer zijn afkomstig uit een vorige publicatie12. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er zijn verschillende kritische stappen die het succes van dit protocol beperken tot het isoleren en karakteriseren van tumor initiërende cellen van menselijke Sarcoom PDXs. menselijke Sarcoom bevat veel verschillende subtypes. We hebben geconstateerd dat de PDX-formatie sterk afhankelijk is van Sarcoom subtypen. Klinisch agressieve sarcomen met een histologisch niet-gedifferentieerd fenotype (bijv. pleomorfe ongedifferentieerde sarcomen [succespercentage 100%, n = 2], gededifferentieerde liposarcomen [succespercentage 100%, n = 2] en synoviale sarcomen [ succespercentage 100%, n = 3]) hebben een hoog slagingspercentage van PDX-vorming. Ondertussen vertonen sarcomen met gedifferentieerde fenotypes (bijvoorbeeld, goed gedifferentieerde liposarcomen [slagingspercentage 0%, n = 3]) lagere PDX-vormings percentages. Het is mogelijk dat tumor initiërende cellen in meer kwaadaardige subtypen aanwezig zijn in een hoger percentage dan in minder kwaadaardige, gedifferentieerde subtypen. Bovendien, wij raden het voltooien van de tumor-initiëren cel isolatie procedure binnen één dag zonder enige stop om elk verlies van de levensvatbaarheid van de cel te minimaliseren.

We hebben vastgesteld dat HLA-1-negatieve cellen zijn wijd verspreid in menselijke sarcomen. Maar het percentage HLA-1-negatieve cellen kan variëren tussen de monsters van verschillende patiënten. Met deze methode, we hebben met succes geïsoleerde tumor initiëren cellen uit monsters die HLA-1-negatieve cellen variërend van minder dan 0,5% tot meer dan 30%12hebben. Het is belangrijk om te karakteriseren de HLA-1-negatieve cellen functioneel door de vorming van de bol en tumorvorming assays ter bevestiging van de tumor-initiëren van de celidentiteit van geïsoleerde HLA-1-negatieve cellen.

Het hier gepresenteerde protocol heeft echter ook beperkingen. Eerdere gegevens toonden aan dat de HLA-1-uitdrukking epigenetisch gereguleerd is, wat consistent is met de waarneming van de cellulaire heterogeniteit van de HLA-1-expressie binnen dezelfde tumor12. HLA-1 genomische mutaties werden gedetecteerd in sarcomen en andere soorten kanker. Mutaties in HLA-1-genen kunnen leiden tot het volledige verlies van HLA-1 op het celoppervlak in de hele tumor of om niet-functionele gemuleerde HLA-1 uit te drukken. In beide gevallen kan HLA-1-negativiteit niet worden gebruikt om TICs binnen de tumor te identificeren.

Met behulp van HLA-1 als een negatieve marker, hebben we met succes geïsoleerde TICs van een verscheidenheid van menselijke Sarcoom subtypen en gevalideerd onze resultaten door functionele analyse. Zo konden we moleculaire studies uitvoeren, waaronder genexpressie analyse op de TICs, om een specifieke behandeling te ontwikkelen die gericht is op deze TICs.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd ondersteund door NCI-P01-CA087497 (naar C.C.-C. en D.H.) en NIH-U 54-0OD020353 (naar C.C.-C., D.H. en J.D.-D.), de Agilent thought Leader Award (aan C.C.-C.), en de Martel Foundation (naar C.C.-C. en J.D.-D.).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.2 μm celkweekfilterThermoFisher450-0020
100 mm Petri-schaalFalcon353003
15 mL conische buisFalcon352196
35 μm celzeefFalcon352340
50 mL polystyreenbuisFalcon352070
96-well ultra-lage binding celkweekplaatCorning7007
Alizarin Rood SSigma-AldrichA5533
B-27Gibco08-0085SA
bFGFInvitrogenPHG0021
dexamethasonSigma-AldrichD4902
EGFInvitrogenPHG0311
HLA-1-PE antilichaamAbcamab43545
hMSC groeimediumATCCPCS-500-030
indomethacinSigma-AldrichI7378
isobutylmethylxanthineSigma-AldrichI5879
isopropanolSigma-AldrichW292907
Isotype Control AntilichaamAbcamab103534
L-ascorbinezuurSigma-AldrichA5960
lithiumchlorideSigma-Aldrich62476
Matrigel basaal membraanmatrixCorning354230
MEM AlphaGibco12571-063
N2Gibco17502-048
NSG muizenThe Jackson Lab005557
Oil Red OSigma-AldrichO0625
PBSCorning21-040-CM
penicilline/streptomycineGibco15140-122
RPMI 1640Gibco11875-093
Spuit met naaldBD309626
β-glycerofosfaatSigma-AldrichG9422

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Medema, J. Cancer stem cells: the challenges ahead. Nature Cell Biology. 15 (4), 338-344 (2013).
  2. Jordan, C., Guzman, M., Noble, M. Cancer stem cells. The New England Journal of Medicine. 355 (12), 1253-1261 (2006).
  3. Jordan, C. Cancer stem cells: controversial or just misunderstood? Cell Stem Cell. 4 (3), 203-205 (2009).
  4. Bapat, S., Mali, A., Koppikar, C., Kurrey, N. Stem and progenitor-like cells contribute to the aggressive behavior of human epithelial ovarian cancer. Cancer Research. 65 (8), 3025-3029 (2005).
  5. Charafe-Jauffret, E. Breast cancer cell lines contain functional cancer stem cells with metastatic capacity and a distinct molecular signature. Cancer Research. 69 (4), 1302-1313 (2009).
  6. Domingo-Domenech, J., et al. Suppression of acquired docetaxel resistance in prostate cancer through depletion of notch- and hedgehog-dependent tumor-initiating cells. Cancer Cell. 22 (3), 373-388 (2012).
  7. Reya, T., Morrison, S., Clarke, M., Weissman, I. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).
  8. Yi, J., et al. Abnormal DNA methylation of CD133 in colorectal and glioblastoma tumors. Cancer Research. 68 (19), 8094-8103 (2008).
  9. Ginestier, C., et al. ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome. Cell Stem Cell. 1 (5), 555-567 (2007).
  10. Garrido, F., et al. Natural history of HLA expression during tumour development. Immunology Today. 14 (10), 491-499 (1993).
  11. Chang, C. C., Campoli, M., Ferrone, S. Classical and nonclassical HLA class I antigen and NK cell-activating ligand changes in malignant cells: current challenges and future directions. Advances in Cancer Research. 93, 189-234 (2005).
  12. Han, D., et al. Targeting sarcoma tumor-initiating cells through differentiation therapy. Stem Cell Research. 21, 117-123 (2017).
  13. Hu, Y., Smyth, G. K. ELDA: Extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays. Journal of Immunology. 347, 70-78 (2009).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Fluorescentie geactiveerde cel sorteringHLA I negatieve markersfeerformatie assaytumorformatie assaymesenchymale differentiatieHLA I downregulatiekankerstamcellensarcoom xenografts

Gerelateerde artikelen