Methodenartikel

Multiplexed isotherme amplificatie gebaseerd diagnostische Platform om te detecteren Zika, Chikungunya en Dengue 1

DOI:

10.3791/57051

⸱

13 maart 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Foundation for Applied Molecular Evolution (FfAME), 2Florida Medical Entomology Laboratory, University of Florida, 3Firebird Biomolecular Sciences LLC

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Huidige multiplexed diagnostiek te detecteren Zika, chikungunya, dengue virussen vereisen complexe monstervoorbereiding en dure instrumentatie en moeilijk te gebruiken in omgevingen met lage resource. Laten we een diagnose die gebruikmaakt van isotherme amplificatie met doelgroepen gerichte strand verschuifbare sondes op te sporen en deze virussen onderscheiden met hoge gevoeligheid en specificiteit.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zika, dengue en chikungunya virussen worden overgebracht door muggen, ziekten met soortgelijke patiënt symptomen veroorzaken. Echter ze hebben verschillende downstream patiënt-te-patiënt transmissie mogelijkheden, en vereisen zeer verschillende behandelingen van de patiënten. Dus, recente Zika uitbraken maken het dringend noodzakelijk dat het ontwikkelen van hulpmiddelen die deze virussen bij patiënten snel te discrimineren en gevangen muggen, selecteert u de juiste behandeling van de patiënt, en te begrijpen en beheren van hun epidemiologie in real-time.

Helaas, huidige diagnostische tests, met inbegrip van die ontvangende 2016 noodsituatie gebruik vergunningen en fast track status, detecteren virale RNA door omgekeerde transcriptie polymerasekettingreactie (RT-PCR), waarvoor instrumentatie, opgeleid gebruikers, en bereiding van de grote monsters. Aldus, moeten zij worden verzonden naar "goedgekeurde" referentielaboratoria, waarvoor van tijd. Inderdaad, in augustus 2016, het Center for Disease Control (CDC) vroeg zwangere vrouwen die was gebeten door een mug en een uitslag Zika-vermelding een onaanvaardbaar 2 tot 4 weken vóór leren wachten of ze besmet werden ontwikkeld. We moeten heel veel tests die kunnen worden gedaan op de site, met weinig middelen en door opgeleide maar niet noodzakelijkerwijs gelicentieerde personeel.

Deze video toont een bepaling dat voldoet aan deze specificaties, met urine of serum (voor patiënten) of geplette muggen karkassen (voor milieu bewaking), werkt alles zonder veel bereiding van de monsters. Mosquito karkassen worden vastgelegd op papier uitvoering quaternaire ammoniumzouten groepen (Q-papier) gevolgd door ammoniak behandeling voor het beheer van gevaren. Deze zijn vervolgens rechtstreeks, zonder RNA isolatie, gestoken assay buizen met gevriesdroogde reagentia moeten geen ketting van koeling. Een gewijzigde vorm van omgekeerde transcriptie lus-gemedieerde isotherme amplificatie met doelgroepen gerichte fluorescently tagged verschuifbare sondes produceert uitlezing, in 30 min, als een signaal van de drie kleuren fluorescentie. Dit wordt gevisualiseerd met een handheld, batterij-aangedreven apparaat met een oranje filter. Voorwaartse besmetting is met verzegelde buizen, en het gebruik van thermolabile uracil DNA glycosylase (UDG) in aanwezigheid van dUTP in het mengsel versterking verhinderd.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Muggen overgebrachte virusinfecties, met inbegrip van Zika-virus, dengue en chikungunya zijn op de opkomst en vraag onmiddellijk beheersstrategieën. Dengue en chikungunya virussen zijn al endemisch in veel van de tropische gebieden waar Zika nu in het westelijk halfrond1zich verspreidt. Zika virus, zoals dengue, deel uitmaakt van de Flavivirus -familie en is inheems in Afrika met een Aziatische en twee Afrikaanse genetische lineages2. Hoewel de identificatie van de Zika-virus uit 1947 dateert, bleef Zika infectie bij de mens sporadische voor een halve eeuw vóór de opkomst in de Stille Oceaan en Amerika. De eerste gemelde uitbraak van Zika koorts vond plaats op het eiland Yap in de Federale Staten van Micronesia in 2007, gevolgd door Frans-Polynesië in 2013 en 2014. De eerste grote uitbraak in Amerika vond plaats in 2015 in Brazilië.

Zika, dengue en chikungunya virussen zijn vooral overgedragen door Aedes aegypti en Aedes albopictus. Zika heeft echter extra downstream mens-tot-mens transmissie mogelijkheden, waarschijnlijk wordt verspreid via seksueel contact, moeder-naar-foetus interactie, en via de borstvoeding3,4,5. Zika koorts werd voor het eerst geloofde alleen milde ziekte veroorzaken. Het was echter later Guillain-Barré syndroom bij volwassenen, microcefalie in pasgeborenen en chronische spier-en ziekten die laatste maanden tot jaren kunnen zijn gekoppeld. Diagnose van Zika ziekte kan lastig zijn, omdat de symptomen van een infectie Zika vergelijkbaar met die van andere mug-spread virussen6 zijn. Voorkomende co-infecties van deze virussen maken differentiële diagnose nog grotere uitdaging7,8. Snelle en betrouwbare detectie van de nucleïnezuren van Zika en andere virussen is daarom nodig om te begrijpen van de epidemiologie in real-time, bij het starten van de controle- en preventiemaatregelen, en het beheren van patiëntenzorg9.

Huidige diagnostische tests voor deze virussen omvatten serologische tests, isolatie van het virus, virus sequencing en omgekeerde-transcriptie PCR (RT-PCR). Standaard serologische benaderingen vaak lijden aan ontoereikende gevoeligheid en resultaten kunnen worden bemoeilijkt door Kruisallergie bij patiënten die eerder zijn door andere flavivirussen besmet.

Nucleïnezuur testen blijft daarom de meest betrouwbare manier om te ontdekken en te onderscheiden van deze virussen. Detectie van Zika en andere door muggen overgebrachte virussen wordt meestal uitgevoerd met behulp van de RT-PCR of RT-PCR in real time in verscheidenheid van biologische vloeistoffen, zoals serum, urine, speeksel, sperma, moedermelk en cerebrale vloeistof10,11. Urine en speeksel monsters zijn over het algemeen de voorkeur over bloed, omdat zij vertonen minder PCR-inhibitie, hogere virale belasting, virus aanwezigheid voor langere tijd, en het verhoogde gebruiksgemak verzamelen en verwerken van12,,13. RT-PCR-gebaseerde diagnostische tests, bestaat echter uit uitgebreide steekproef voorbereiding stappen en dure thermische fietsen apparatuur, waardoor het minder optimaal voor de point-of-care.

Omgekeerde transcriptie lus-gemedieerde isotherme amplificatie (RT-LAMP) heeft ontpopt als een krachtige RT-PCR alternatief vanwege de hoge gevoeligheid en specificiteit14, zijn tolerantie voor remmende stoffen in biologische monsters15, en werking op interne temperatuur, die aanzienlijk verlaagt assay complexiteit en bijkomende kosten, waardoor het geschikt is voor omgevingen met lage resource. RT-LAMP, omvat zoals het klassiek wordt uitgevoerd, zes inleidingen die zich aan acht verschillende regio's binnen het doeldocument RNA binden. Het draait bij een constante temperatuur tussen 60 ° C en 70 ° C, en gebruikt een reverse-transcriptase en een polymerase van DNA met sterke strand verdringt activiteit.

Tijdens de eerste stadia van de RT-LAMP vormen voorwaartse en achterwaartse interne inleidingen (FIP en BIP, figuur 1A) samen met de buitenste voorwaartse en achterwaartse inleidingen (F3 en B3) een halter-structuur, de zaad-structuur van de exponentiële versterking van de LAMP. Versterking verder wordt versneld door de lus voorwaartse en achterwaartse inleidingen (LF en LB), die zijn ontworpen om het binden van de enkele gestrande regio's van de halter, en resulteert in de vorming van concatemers met meerdere herhalende lussen16. Klassieke LAMP testen op basis van troebelheid of uitlezing door DNA intercalating kleurstoffen is niet geheel geschikt voor point-of-care detectie van Zika, waar sommige multiplexing is gewenst17,18,19. Multiplex is niet gemakkelijk verkregen in deze systemen, zoals ze gevoelig zijn voor het genereren van vals-positieven te wijten aan uit-target amplifications.

Voor het beheren van deze kwesties, wordt extra materiaal in de vorm van een "deel-verdringt probe" in de literatuur toegevoegd aan de klassieke RT-LAMP het platform20,21,22. Elke sonde heeft een reeks specifieke dubbele-strand en een single-stranded priming-regio. De sonde met de single-stranded regio is gelabeld met een 5'-fluorophore, en de aanvullende sonde wordt gewijzigd met een quencher van 3'-eind. Bij gebrek aan een doel, wordt geen fluorescentie waargenomen als gevolg van de kruising van de strengen van complementaire sonde, waardoor de fluorophore en de quencher in de nabijheid. In aanwezigheid van een doel, het single-stranded gedeelte van de fluorescente sonde bindt aan het complement op de doelgroep, en vervolgens door een strand verdringt polymerase is uitgebreid. Verdere uitbreiding van de polymerase door omgekeerde inleidingen zorgt ervoor dat de scheiding van het quencher deel van haar aanvullende fluorescently geëtiketteerde strand, waardoor de uitstoot van fluorescentie ()figuur 1B). Met dit ontwerp, wordt het signaal gegenereerd na de vorming van de halter, vermindering van de kans op vals-positieve signalen.

Het double-stranded gedeelte van de sonde strand-verdringt kan een willekeurige tekenreeks, en wanneer multiplexing wordt toegepast, dezelfde volgorde kan worden gebruikt met verschillende fluorophore-quencher-paren. Met deze het platform, virus-besmette urine, serum of mug kennisgemaakt monsters squished op papier rechtstreeks met de bepaling zonder bereiding van de monsters. Drie kleuren fluorescentie read-outs zichtbaar voor het menselijk oog werden gegenereerd binnen 30-45 min en signalen waren gevisualiseerd door een 3D-gedrukte observatie-box die gebruikmaakt van een blauwe LED en een oranje filter. Trekkers van de RT-LAMP reagentia ingeschakeld implementatie van deze kit te verlagen van broninstellingen zonder behoefte aan koeling.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opmerking: Muggen waren de enige dieren die direct gebruikt in deze studie. De procedures voor het beheren van kippen, wiens bloed te voeden de besmette muggen werd gebruikt, werden goedgekeurd als IACUC Protocol #201507682 door de Universiteit van Florida institutionele dierenverzorgers en gebruik Committee.Virus voortplanting en mug infectie studies waren uitgevoerd op de BSL-3 faciliteit van het Florida medische entomologie laboratorium in Vero Beach, werden FL. RT-LAMP experimenten uitgevoerd in het laboratorium van de BSL-2 gedeeld door FfAME en Firebird Biomoleculaire Wetenschappen LLC in Alachua, FL.

1. ontwerp van Primers en Strand verdringt sondes

  1. Uittreksel van virale opeenvolgingen voor Dengue 1 uit de brede Instituut database23; sequenties voor Zika en chikungunya van de NIAID Virus Pathogen Database en analyse Resource24.
    1. Maak meerdere reeks aanpassingen (MSAs) voor reeksen van belang met behulp van software spier v3.8.3125. Gegenereerde MSAs gebruiken om te zoeken naar LAMP inleidingen sets binnen een geconserveerde regio van het doel, en het vermijden van niet-relevante of onbedoelde doelen, zoals het onderscheid tussen de subtypes van een doel.
  2. Volg de regels voor het ontwerp voor LAMP inleidingen als beschreven online (http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/), en laat het gebruik van gemengde bases in inleidingen ter dekking van de virus divergentie26. Om te voorkomen dat een Kruisallergie van primer sets, gegenereerd vergelijk LAMP inleidingen tot de NCBI RNA virus database met behulp van de NCBI BLAST27. Vergelijk elke set te elimineren inleidingen die in een multiplexed assay met behulp van NCBI BLAST ook zou dimerize.
  3. Het scherm van het double-stranded gedeelte van de sonde strand-verdringt tegen elke virale genoom en mug genomic volgorde. 5'-uiteinden van doel bindende sonde met fluoresceïne amidite (FAM), HEX kleurstof en 5-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) kleurstof voor Zika, chikungunya en Dengue 1, respectievelijk wijzigen.
    1. Omvatten een primer van de positieve controle instellen voor urine monsters. LAMP inleidingen te richten op menselijke mitochondriaal DNA ontwerpen. Label strand-verdringt sonde met TET op 5'-eind. Label quencher sondes die gedeeltelijk aanvulling op elk fluorescently label sonde met quencher (bijvoorbeeld, Iowa zwart-FQ) op 3'-eind (tabel 1).

2. virus isoleert en besmette mug monsters

  1. Gebruik isoleert van Zika-virus (Puerto Rico-stam), Chikungunya-virus (La Réunion of British Virgin Islands-stam) en Dengue serotype-1 virus (Key West-stam). Virale titers met plaque assay28 of kwantitatieve RT-PCR29bepalen. Uittreksel virale RNAs met behulp van commercieel beschikbare RNA extractie kits.
    Opmerking: Tabel 2 geeft de virale titers van elke virusisolaat dat gebruikt in deze studie.
  2. Volg het artikel gepubliceerd door Yaren et al. voor een gedetailleerde protocol over de besmetting van Ae. aegypti vrouwtjes met Zika en chikungunya virussen20. Zie tabel 2 voor de virale titer van het monster van de mug met Zika-virus besmet.

3. RT-LAMP in combinatie met Thermolabile Uracil DNA Glycosylase

  1. 10 x primer mix voorbereiding.
    1. Bereiden van 100 µM-stockoplossing van elke primer en sonde (zie stap 1) door toevoeging van nuclease gratis water. Vortex goed en winkel bij-20 ° C tot gebruik.
    2. Voor de 10 X Primer mix voor elke Zika, Dengue 1 of mitochondriaal DNA doel, mix 16 µL van FIP, 16 µL BIP, 2 µL van F3, 2 µL van B3, 5 µL van LF, 2 µL van LB, 3 µL van LB-belichting fluorescerende aangeduid met sonde, 4 µL van quencher sonde , en 50 µL nuclease-vrij te geven van een totaal van 100 µL volume water.
    3. Voor 10 X Primer mix voor Chikungunya, meng 16 µL van FIP, 16 µL BIP, 2 µL van F3, 2 µL van B3, 5 µL van LB, 2 µL van LF, Label 3 µL van LF-belichting fluorescerende sonde, 4 µL van quencher sonde en 50 µL nuclease-vrij te geven van een totaal van 100 µL volume water.
      Opmerking: De sonde concentratie beschreven hierboven gebruikt 300 nM van definitieve fluorescente sonde en 400 nM van quencher sonde. U kunt ook gebruik 80 nM van fluorescently geëtiketteerde sonde en 200 nM voor de quencher probe voor real-time analyse.
  2. Voeg 5 µL van 10 X primer mix (voor 3-plex, voeg 5 µL van elk 10 X primer mix), 5 µL van 10 X isotherme amplificatie buffer (1 X buffer samenstelling: 20 mM Tris-HCl buffer pH 8,8, 50 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 8 mM MgSO4 0,1% Tween-20, 1 mM DTT), 7 µL van dNTP mengsel (10 mM van de dATP, dCTP en dGTP; 5 mM van de dTTP en dUTP), 16 eenheden van de Polymerase van DNA, 15 eenheden van Reverse-Transcriptase, 80 eenheden van recombinante ribonuclease remmer, 2 eenheden van thermolabile UDG, 1-2 µL van wisselende hoeveelheden van vi RAL RNAs en water toe zodat het totale volume maximaal 50 µL in een 0,25 mL PCR buis (Zie Tabel van materialen).
  3. Negatieve controle tests in dit stadium neemt door het vervangen van virale RNA volume met water. Incubeer monsters tussen 65-68 ° C gedurende 45 minuten tot 1 uur, vervolgens analyseren door het uitvoeren van 5 µL van elk monster op 2,5% agarose gel in 1 X TBE buffer met ethidiumbromide (0.4 µg/mL). Gebruik een 25 bp of 50 bp DNA-ladder als markering op de gel.
    Opmerking: Toevoeging van een specifieke sjabloon van de doelsoort is optioneel.
  4. Voor het detecteren van de aanwezigheid van pathogene RNA, testen elke set primer en de neen-template controle door het variëren van de temperatuur en/of magnesium concentratie, aangezien elke RT-LAMP primer set is ontworpen om te werken in wisselende temperaturen (65 ° C tot 68 ° C) of magnesium concentraties (6 tot 10 mM definitieve). Bereiden de experimenten bij kamertemperatuur.

4. RT-LAMP met behulp van virale RNA-Spiked Urine

  1. RT-LAMP inleidingen in verschillende eindconcentraties van urine (0%, 10%, 20% en 50%) in 50 µL van totale reactie volume test. Voor 10% laatste urine concentratie, voeg toe 1 µL van virale RNA aan 5 µL van urine. Toevoegen voor definitieve urine concentratie van 20%, 1 µL van virale RNA naar 10 µL van urine. Voor 50% laatste urine concentratie, voeg toe 1 µL van virale RNA aan 25 µL van urine.
  2. Voor real-time bewaking van RT-LAMP in 10% van de urine, een real-time PCR-instrument te gebruiken (Zie Tabel van materialen) met verschillende fluorophore filters.
    1. Fluorescentie signalen om uit te lezen waarbij FAM-label voor Zika, gebruikt u een filter variërend van 483 tot 533 nm; gebruik voor HEX-geëtiketteerden waarbij voor chikungunya, een filter variërend van 523 tot 568 nm; voor TAMRA-geëtiketteerden waarbij voor Dengue 1, gebruikt u een filter variërend van 558 tot 610 nm; en voor TET-geëtiketteerden waarbij voor mitochondriaal DNA, het gebruik van een filter variërend van 523 tot 568 nm.
      Opmerking: FAM heeft excitatie en emissie-maxima van 495 nm en 520 nm, respectievelijk. HEX heeft excitatie en emissie-maxima van 538 nm en 555 nm, respectievelijk. TAMRA heeft excitatie en emissie-maxima van 559 nm en 583 nm, respectievelijk. TET heeft excitatie en emissie-maxima van 522 nm en 539 nm, respectievelijk.
  3. Gebruik 96-wells-platen zegel de plaat met een doorzichtige plastic folie, incubeer monsters bij 65-68 ° C gedurende 60-90 minuten en opnemen van de fluorescentie elke 30 s met behulp van de lichte cycler. In eerste instantie gebruiken 80 nM van fluorescently geëtiketteerde sondes, en vervolgens test de 300 nM van fluorescently geëtiketteerde sondes.
    1. Bepalen aantoonbaarheidsgrens voor elk doel door toevoeging van serieel verdund virale RNAs in definitieve urine concentratie van 10%.
      Opmerking: Gebruik real-time RT-LAMP om het bepalen van de optimale temperatuur, magnesium concentratie, fluorescently geëtiketteerde sonde concentratie en reactietijd.
  4. Gebruiken om te visualiseren de fluorescentie gegenereerd door strand verschuifbare sondes door oog, een blauwe LED lichtbron van een lichte cycler met excitatie bij 470 nm (gel elektroforese box met ingebouwde blauwe lichtbron zal werken, zie tabel van materialen), en het opnemen van de afbeelding met een mobiele telefooncamera bij kamertemperatuur in het donker.
    Opmerking: Gebruik 300 nM van fluorescently geëtiketteerde sondes, wanneer visualisatie van alle drie kleuren door oog met behulp van de blauwe LED is nodig.

5. RT-LAMP op detectie van Zika-geïnfecteerde muggen met behulp van Q-papier technologie

  1. Quaternaire ammonium gemodificeerde filtreerpapier (Q-papier), volgens eerder gepubliceerde methoden met lichte wijzigingen30voor te bereiden.
    1. Ga 1 g van cellulose filtreerpapier cirkels (Zie Tabel van materialen) met een diameter van 3,5 cm in 50 mL 1,8% van waterige NaOH-oplossing voor 15 min voor activering.
    2. Verzamelen van geactiveerde papier cirkels door vacuüm filtratie en vervolgens onder te dompelen hen in 40 mL van een waterige oplossing van (2,3-epoxypropyl) trimethylammoniumformiaat chloride (0,28 g) 's nachts bij kamertemperatuur.
      Opmerking: Houd de massaverhouding van (2,3-epoxypropyl) trimethylammoniumformiaat chloride filtreerpapier 0.28 tegen 1.
    3. De resulterende kationische papier verzamelen door vacuüm filtratie en neutraliseren met 50 mL voor 1 of meer gewichtspercenten azijnzuur.
    4. Het papier driemaal met ethanol wassen en drogen onder een kap met constante luchtstroom.
  2. Q-vellen in kleine rechthoeken (3 x 4 mm) met een papier punch of schaar te knippen. Crush Ae. aegypti vrouwelijke muggen potentieel besmet met Zika op elk papier met een micro stamper.
  3. Voeg aan elke papier 20 µL van 1 M waterige ammoniakoplossing (pH ≈ 12) en 5 min wachten. Daarna wassen elk papier eenmaal met 20 µL van 50% EtOH en eenmaal met 20 µL nuclease-gratis water. Het drogen van het papier in BSL-2 bioveiligheid kabinet gedurende ongeveer 1 uur.
    Opmerking: Op dit punt, monsters kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C's nachts tot gebruik.
  4. Pincet gebruikt, plaatst u elk papier in 100 µL van de RT-LAMP reactiemengsel en Incubeer bij 65-68 ° C gedurende 45 min. Make sure to volledig onderdompelen het papier in de oplossing; het moet niet zweven. Afgelezen en genoteerd van de fluorescentie die voortvloeien uit Zika-virus met behulp van blauwe LED-lichtbron en oranje of gele filter.

6. lyofilisatie van RT-LAMP reagentia voor 100 µL van reactie Volume

  1. 10 X LAMP primer mengsel volgens punt 3.1 voor te bereiden, en voor te bereiden dNTP mengsel met dUTP volgens punt 3.2. Primer mengsel en dNTPs bij-20 ° C bewaren tot gebruik.
  2. Bereiden van 10 mL enzym dialyse buffer van glycerol verwijderen door het mengen van 100 µL van 1 M Tris-HCl pH 7.5, 500 µL van 1 M KCl, 2 µL van 0.5 M EDTA, 100 µL van 10% Triton X-100, 100 µL van 0,1 M DTT en 9.198 mL nuclease-gratis water. Winkel de dialyse buffer bij 4 ° C.
    Opmerking: Zorg ervoor om te filteren (0.2 micron filters) alle reagens bufferoplossingen voorafgaand aan gebruik en bewaar ze bij 4 ° C.
    1. Gebruik van een membraan van ultrafiltratie met 10 kDa cut-off limiet (Zie Tabel van materialen). Plaats van 350 µL van dialyse buffer, 4 µL van 32 stuks van de Polymerase van DNA, 2 µL van 30 eenheden van Reverse-Transcriptase en 2 µL van 80 eenheden van RNase remmer in ultrafiltratie membraan en centrifugeer bij 14.000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
    2. Voeg een ander 350 µL van dialyse buffer aan de ultrafiltratie membraan en centrifuge (14.000 x g) voor een ander 5 min. leeg de collectie buis en herhaal deze stap, dan centrifugeren (14.000 x g) gedurende 3 minuten.
    3. Voor de elutie, omkeren van het membraan en plaats in een nieuwe collectie buis. Spin bij 1.000 x g gedurende 2 min. maatregel het elutievolume; Als minder dan 8 µL, zodat het volume tot 8 µL door dialyse buffer toe te voegen. Slaan de elutie bij 4 ° C, en onmiddellijk overgaan tot de volgende stap.
      Opmerking: Dit protocol is voor één buis lyofilisatie, maar ten minste 10 reactie buizen voor te bereiden op een moment met behulp van de dezelfde ultrafiltratie membraan en gebruiken dezelfde hoeveelheid dialyse buffer.
  3. Meng 10 µL van 10 X LAMP primer als singleplex (voor 3-plex, voeg toe 10 µL van elk 10 X primer mix), 14 µL van dNTP mengsel, 8 µL van dialyzed enzym mix 2 µL van 2 eenheden van thermolabile UDG en 66 µL van nuclease gratis water (voor 3-plex gebruik van 46 µL) in een tube van 0,5 mL microcentrifuge en laat het deksel open. In plaats daarvan, het toevoegen van een andere deksel doorboord met een naald om damp te ontsnappen.
  4. Onmiddellijk bevriezen de buizen bij-80 ° C gedurende 2 uur, en lyophilize de buis voor 4 h. Cover de lyofilisatie kamer met aluminiumfolie voor bescherming tegen licht. Wanneer de reagentia worden gedroogd, verwijderen van de geperforeerde deksels, sluit het oorspronkelijke deksel en opslaan van de buizen met gelyofiliseerd reagentia bij 4 ° C in het donker.
    Opmerking: Reagentia kunnen worden gelyofiliseerd 's nachts, indien nodig.

7. testen gelyofiliseerd RT-LAMP reagentia op Urine en Mosquito monsters met Zika

  1. Gebruik de volgende items uit de kit (Zie de Tabel van materialen) voor Zika: een 3D-gedrukte observeren doos met oranje filter (lange pass filter, knippen-op ~ 540 nm), 2 AAA-batterijen voor het observeren van vak gelyofiliseerd reactie buizen ZV gelabeld voor Zika detectie, en 1.1 X rehydratie Buffer in 1,5 mL schroef top buizen.
  2. Bereid 50 mL 1.1 X rehydratie buffer door het mengen van 5,5 mL 10 X isotherme amplificatie buffer die wordt geleverd samen met Polymerase van DNA (Zie de Tabel van materialen), 3,3 mL 100 mM MgSO4110 µL van 0.5 M DTT en 41.09 mL nuclease-gratis water. Meng goed, aliquoot 1 mL van deze oplossing 1,5 mL schroef top buizen, en bewaren bij 4 ° C tot gebruik.
  3. 90 µL van 1,1 X rehydratie buffer toevoegen aan elke reactiebuis (0,5 mL). Ervoor zorgen dat de vloeistof vult de onderkant van de buis met de gelyofiliseerd reagentia (Los mee mengen door schudden, vervolgens kort spin down (1.000 x g)). Voeg 10 µL van urine monster verrijkt met virale RNA de reactie buizen (zie punt 4.1 voor meer informatie).
    1. Als het testen van muggen, voegt een rechthoek van Q-papier bedrijf mug karkassen (zoals opgesteld in de stappen beschreven in de punten 5.2 en 5.3), samen met 10 µL gezuiverd water in plaats van de urine monsters.
      Opmerking: U kunt ook toevoegen 10 µL van speeksel of serum monsters in plaats van de urine. Als de monsters geëxtraheerde DNA of RNA, 2-5 µL van het monster in gerehydrateerd mengsel toevoegen en compleet met 10 µL van eindmonster volume nuclease-gratis water.
  4. Sluit het deksel van de reactie-buizen. Plaats ze in een warmte blok/bad (of incubator) vooraf ingesteld op 65-68 ° C. Incubeer gedurende 30-45 minuten, maar niet meer dan 1 h. Na incubatie, de buis van de warmte te verwijderen. Om te voorkomen dat besmetting van toekomstige tests, ervoor zorgen dat deze buizen gesloten blijven.
  5. Plaats reactie buizen in het observeren; de temperatuur zal dalen tot de kamertemperatuur (bij voorkeur 25 ° C). Zet de schakelaar aan de achterkant van het observeren vak. Observeren van monster door de donkeroranje filter en de opname door de camera van een mobiele telefoon die wordt gehouden op een afstand waar de afbeelding 80% van het gezichtsveld vult.
    Opmerking: Betere visualisatie wordt bereikt in lage lichte omgevingen.
  6. Nadat visualisatie is voltooid, schakel de switch. Bewaar de verzegelde buizen in het donker, bij voorkeur met koeling, als later visualisatie nodig is.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De prestaties van elke RT-LAMP primer (tabel 1) met de overeenkomstige virale RNA substraat, alsook de negatieve controles werden in eerste instantie beoordeeld door gelelektroforese. RT-LAMP inleidingen werden ontworpen om doel NS5 (RNA-afhankelijke RNA-polymerase) voor Zika en Dengue 1, en nsP2 regio (niet-structurele eiwitten P2) voor Chikungunya. Sjablonen waren totaal RNA geëxtraheerd uit virale voorraden gekweekte in Afrikaanse groene aap nier (Vero) cellen. In één ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Muggen overgebrachte virussen waaronder Zika, dengue en chikungunya bedreigen de volksgezondheid en de recente Zika uitbraken hoogtepunt de behoefte aan goedkope point-of-care detectie alternatieven voor diagnostische gegevens van de patiënt, alsmede voor mosquito toezicht. Isotherme amplificatie methoden werden ontwikkeld als betaalbare alternatieven voor PCR-gebaseerde systemen. RT-LAMP-gebaseerde platforms zijn in het bijzonder toegepast op te sporen van een breed scala van ziekteverwekkers. Echter is het gebruik van ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Verscheidene van de auteurs en hun instellingen eigen intellectuele eigendom die zijn gekoppeld aan deze test.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het werk werd gedeeltelijk ondersteund door FDOH-7ZK15 en NIAID 1R21AI128188-01. Onderzoek gemeld in deze publicatie werd gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Allergy and Infectious Diseases, en gedeeltelijk door de biomedische Research programma van Florida Department of Health. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de NIH of Florida Department of Health. Dynamische combinatoriële chemie LLC is erkend voor hun steun en hun bijdrage aan dit project.

Knokkelkoorts 1 virus (stam BOL-KW010) werd vriendelijk geleverd door het Florida departement van gezondheid Bureau van laboratoria. Zika-virus en de Aziatische afkomst van chikungunya-virus werden genadig verstrekt door de Centers voor Disease Control and Prevention. De bloedlijn van de Indische Oceaan van chikungunya-virus werd beschikbaar gesteld door Robert Tesh (World Reference Center voor opkomende virussen en Arboviruses, door de Universiteit van Texas Medical Branch in Galveston, Texas) aan de UF-FMEL. Wij danken S. Bellamy, B. Eastmond S. Ortiz, D. Velez, K. Wiggins, R. ZimLer en K. Zirbel voor hulp bij de studies van de infectie. Wij danken ook M. S. Kim voor het verstrekken van Q-papier.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
SafeBlue Illuminator/ Electrophoresis System, MBE-150-PLUSMajor ScienceMBE-150Gel elektroforese
G:BOX F3SyngeneG:BOX F3Gel imaging
LightCycler 480 Instrument II, 96-wellRoche Applied Science05 015 278 001Real-time PCR
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membraneMillipore SigmaUFC501096ultrafiltratie membraan voor dialyse
Eppendorf 5417C CentrifugeMarshall ScientificEP-5417Ccentrifuge
Myblock Mini DrybathBenchmark ScientificBSH200droogbad
FreeZone Plus 6 Liter Cascade Console Freeze Dry SystemLabconco7934020lyofilisaat
all priers en probesIDTcustomRT-LAMP primers en probes
dNTP setBiolineBIO-39049
Deoxyuridine Triphosphate (dUTP)PromegaU1191
Bst 2.0 WarmStart DNA PolymeraseNew England BiolabsM0538Lenzym
WarmStart RTx Reverse TranscriptaseNew England BiolabsM0380Lenzym
RNase Inhibitor, MurineNew England BiolabsM0314Lenzym
Antarctic Thermolabile UDGNew England BiolabsM0372Lenzym
50bp DNA Step LadderPromegaG4521marker
LightCycler 480 Multiwell Plate 96, whiteRoche Applied Science4729692001real-time RT-LAMP analyse

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Patterson, J., Sammon, M., Garg, M. Dengue, Zika and Chikungunya: Emerging Arboviruses in the New World. Western Journal of Emergency Medicine. 17 (6), 671-679 (2016).
  2. Faye, O., et al. Molecular Evolution of Zika Virus during Its Emergence in the 20th Century. PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (1), e2636(2014).
  3. Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus (I). Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46, (1952).
  4. Musso, D., Gubler, D. J. Zika Virus. Clin Microbiol Rev. 29, (2016).
  5. Musso, D. Zika Virus Transmission from French Polynesia to Brazil. Emerging Infectious Diseases. 21 (10), 1887-1887 (2015).
  6. Gasque, P., Bandjee, M. C. J., Reyes, M. M., Viasus, D. Chikungunya Pathogenesis: From the Clinics to the Bench. The Journal of Infectious Diseases. 214 (Suppl 5), S446-S448 (2016).
  7. Villamil-Gómez, W. E., et al. Zika, dengue, and chikungunya co-infection in a pregnant woman from Colombia. International Journal of Infectious Diseases. 51, 135-138 (2016).
  8. Sardi, S. I. Coinfections of Zika and Chikungunya viruses in Bahia, Brazil, identified by metagenomic next-generation sequencing. J Clin Microbiol. 54, (2016).
  9. Shukla, S., Hong, S. -Y., Chung, S. H., Kim, M. Rapid Detection Strategies for the Global Threat of Zika Virus: Current State, New Hypotheses, and Limitations. Frontiers in Microbiology. 7, 1685(2016).
  10. Jesse, J. W., et al. Single-Reaction Multiplex Reverse Transcription PCR for Detection of Zika, Chikungunya, and Dengue Viruses. Emerging Infectious Disease journal. 22 (7), 1295(2016).
  11. Pabbaraju, K., et al. Simultaneous detection of Zika, Chikungunya and Dengue viruses by a multiplex real-time RT-PCR assay. Journal of Clinical Virology. 83, 66-71 (2016).
  12. Musso, D., et al. Detection of Zika virus in saliva. Journal of Clinical Virology. 68, 53-55 (2015).
  13. Gourinat, A. C., O'Connor, O., Calvez, E., Goarant, C., Dupont-Rouzeyrol, M. Detection of zika virus in urine. Emerg Infect Dis. 21, (2015).
  14. Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28, (2000).
  15. Edwards, T., Burke, P. A., Smalley, H. B., Gillies, L., Hobbs, G. Loop-mediated isothermal amplification test for detection of Neisseria gonorrhoeae in urine samples and tolerance of the assay to the presence of urea. J Clin Microbiol. 52, (2014).
  16. Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Mol Cell Probes. 16, (2002).
  17. Tian, B., et al. Attomolar Zika virus oligonucleotide detection based on loop-mediated isothermal amplification and AC susceptometry. Biosensors and Bioelectronics. 86, 420-425 (2016).
  18. Wang, X., et al. Rapid and sensitive detection of Zika virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 238, 86-93 (2016).
  19. Song, J., et al. Instrument-Free Point-of-Care Molecular Detection of Zika Virus. Analytical Chemistry. 88 (14), 7289-7294 (2016).
  20. Yaren, O., et al. Point of sampling detection of Zika virus within a multiplexed kit capable of detecting dengue and chikungunya. BMC Infectious Diseases. 17 (1), 293(2017).
  21. Kubota, K., Jenkins, D. M., Alvarez, A. M., Su, W. W. Fret-based assimilating probe for sequence-specific real-time monitoring of loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Biol. Eng. Trans. 4, 81-100 (2011).
  22. Kubota, R., Jenkins, D. M. Real-Time Duplex Applications of Loop-Mediated AMPlification (LAMP) by Assimilating Probes. Int. J. Mol. Sci. 16 (3), 4786-4799 (2015).
  23. Li, J., Macdonald, J. Advances in isothermal amplification: novel strategies inspired by biological processes. Biosens Bioelectron. 64, (2015).
  24. Pickett, B. E. ViPR: an open bioinformatics database and analysis resource for virology research. Nucleic Acids Res. 40, (2012).
  25. Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res. 32, (2004).
  26. Boonham, N. Methods in virus diagnostics: from ELISA to next generation sequencing. Virus Res. 186, (2014).
  27. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215, (1990).
  28. Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems. Journal of visualized experiments: JoVE. (93), e52065(2014).
  29. Reiskind, M. H., Pesko, K., Westbrook, C. J., Mores, C. N. Susceptibility of Florida Mosquitoes to Infection with Chikungunya Virus. The American journal of tropical medicine and hygiene. 78 (3), 422-425 (2008).
  30. Glushakova, L. G., et al. Detection of chikungunya viral RNA in mosquito bodies on cationic (Q) paper based on innovations in synthetic biology. Journal of Virological Methods. 246, 104-111 (2017).
  31. Hsieh, K., Mage, P. L., Csordas, A. T., Eisenstein, M., Tom Soh, H. Simultaneous elimination of carryover contamination and detection of DNA with uracil-DNA-glycosylase-supplemented loop-mediated isothermal amplification (UDG-LAMP). Chemical Communications. 50 (28), 3747-3749 (2014).
  32. Tang, Y., Chen, H., Diao, Y. Advanced uracil DNA glycosylase-supplemented real-time reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (UDG-rRT-LAMP) method for universal and specific detection of Tembusu virus. Sci Rep. 6, 27605(2016).
  33. Thomas, A. H. Fluorescence of pterin, 6-formylpterin, 6-carboxypterin and folic acid in aqueous solution: pH effects. Photochem Photobiol Sci. 1, (2002).
  34. Wu, D., Lehane, M. J. Pteridine fluorescence for age determination of anopheles mosquitoes. Med Vet Entomol. 13, (1999).
  35. Janis, A. M. Inactivation and environmental stability of Zika virus. Emerg Infect Dis J. 22, (2016).
  36. Poloni, T. R., et al. Detection of dengue virus in saliva and urine by real time RT-PCR. Virology Journal. 7 (1), 22(2010).
  37. Jones, P., Okeoma, C. Detection of Chikungunya virus (CHIKV) in urine of infected mice: a potential non-invasive diagnostic tool for CHIKV. J Infect Dis Ther. 3 (4), 1000226(2015).
  38. Glushakova, L. G., et al. High-throughput multiplexed xMAP Luminex array panel for detection of twenty two medically important mosquito-borne arboviruses based on innovations in synthetic biology. J. Virol. Methods. 214, 60-74 (2015).
  39. Yaren, O., Benner, S. A. Loop Mediated Amplifications with Nucleoside Analogs. US Provisional patent. , 62,381,759 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Multiplexed Isothermal AmplificationPoint of Care DiagnosticsRT LAMP AssayZika Virus DetectionChikungunya Virus DetectionDengue Virus DetectionQ Paper TreatmentFluorescent Probe ReadoutHandheld Observation DeviceThermolabile UDG Prevention

Gerelateerde artikelen