Winning van Hemocytes van Drosophila melanogaster larven voor microbiële infectie en analyse

Samenvatting

Deze methode laat zien hoe om te visualiseren pathogen invasie in insect cellen met driedimensionale (3D) modellen. Hemocytes van Drosophila larven waren besmet met virale of bacteriële pathogenen, ex vivo of in vivo. Besmette hemocytes werden vervolgens vast en gekleurd voor imaging met een confocal microscoop en de daaropvolgende 3D cellulaire wederopbouw.

Samenvatting

Tijdens de pathogene infectie van Drosophila melanogaster, spelen hemocytes een belangrijke rol in de immuunrespons in de infectie. Het doel van dit protocol is dus een methode om te visualiseren de pathogen invasie in een specifieke immuun compartiment van vliegen, namelijk hemocytes te ontwikkelen. Met behulp van de methode gepresenteerde, maximaal 3 × 10 kunnen⁶ live hemocytes worden verkregen bij 200 Drosophila 3^rd instar-larven in 30 min. voor ex vivo infectie. Anderzijds kunnen hemocytes besmette in vivo via injectie van 3^rd instar-larven opgevolgd door hemocyte extractie tot 24 uur na infectie. Deze besmette primaire cellen werden vastgesteld, gekleurd, en beeld met behulp van de confocal microscopie. 3D voorstellingen werden vervolgens gegenereerd van de afbeeldingen tot definitief Toon pathogen invasie. Daarnaast kwalitatief hoogwaardige RNA voor qRT-PCR kan worden verkregen voor het opsporen van het pathogene agens mRNA volgende infectie, en voldoende eiwit kan worden geëxtraheerd uit deze cellen voor westelijke vlekkenanalyse. Tezamen, presenteren we een methode voor definitieve verzoening van pathogen invasie en bevestiging van de infectie met behulp van bacteriële en virale pathogen typen en een efficiënte methode voor de extractie van de hemocyte te krijgen genoeg live hemocytes van Drosophila larven voor ex vivo en in vivo experimenten van de infectie.

Inleiding

Drosophila melanogaster is een gevestigde modelorganisme voor de studie van aangeboren immuniteit¹. Tijdens de aangeboren immuunrespons spelen hemocytes een belangrijke rol in de reactie op pathogene uitdaging. Hemocytes zijn van cruciaal belang voor het inkapselen van parasieten, evenals hebbend een belangrijke functie bij de bestrijding van het pathogene agens via fagocytische actie tijdens schimmel, virale en bacteriële infectie^2,3.

Om best begrijpen van de host ingeboren immuunreactie op pathogene microbiële infectie, is het belangrijk om te visu....

Protocol

1. ex vivo infectie

1. Medium en apparatuur
   1. Bereiden onder steriele condities, verse Drosophila Hemocyte isoleren Medium (DHIM) met 75% Schneiders Drosophila medium met 25% foetale boviene Serum (FBS) en filter steriliseren het.
   2. Laag 2-3 stukjes van 10 x 10 cm paraffine film onder een stereomicroscoop.
   3. De glazen viscometerbuizen voor te bereiden. De trekker van de capillaire kachel ingesteld op 55% van de maximale. Trek het capillair tot een scherpe punt van ongeveer 10 µm.
   4. Aanvulling van de funderingsput het capillair met minerale olie.
   5. Monteren van gevulde capillaire buis op het na....

Resultaten

Als u wilt verzamelen waarmaken hemocytes voor ex vivo infectie, 3 × 10 werden⁶ hemocytes gehaald uit 200 Drosophila 3^rd instar-larven. Ontwikkeling van onze methode, waren een aantal verschillende technieken geprobeerd. Individuele larvale dissectie zou maximaal 1,5 uur, en een gemiddelde van ~ 8000 cellen werden verkregen met behulp van deze methode¹⁸, waarvan de meeste niet levend door het einde van de collectie waren. Ver.......

Discussie

Om beter te begrijpen hoe de cellen van de gastheer besmet raken, is het belangrijk om het verduidelijken van de lokalisatie voor pathogen in de cellen, met name wanneer experimenteren op het eerder geteste pathogenen en cel type combinaties⁴. Terwijl het bestuderen van de cascade van de cellulaire reactie na infectie kunt productief pathogen invasie aangeven, is de combinatie van beeldvorming en cellulaire respons data essentieel om aan te tonen van de ziekteverwekker invasie en infectie. Terwijl.......

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Schneider's Drosophila Medium	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	21720024	1.1.1), 2.1.2)
Fetal Bovine Serum	GE Healthcare Life Sciences  (HyClone)	SH30070.03HI	1.1.1), 2.1.2)
Filter (0.22 µL)	RESTEK	26158	1.1.1)
Strainer (100 µm)	Greiner bio-one	542000	1.2.1), 2)
Stereo microscope	Amscope	SM-1BSZ-L6W	1.2), 2)
Glass capillary	Fisher Scientific	21-171-4	1.1), 1.2), 2)
Capillary puller	Narishige International USA, Inc.	PC-10	1.1.3)
Mineral oil	Snow River Products		1.1.4)
Nanoinjector	Drummond Scientific Company	3-000-204	1.1), 1.2), 2.2)
Forceps	VWR	82027-402	1.1.5), 1.2), 2), 3.1.7)
CO2 delivery apparatus	Genesee Scientific	59-122BC	1.2), 2)
Trypan Blue	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	15250061	1.3)
Hemocytometer	Hausser Scientific	3100	1.3)
24 well plate	Greiner bio-one	662160	1.4), 2.2)
Coxiella burnetii - mCherry	Dr. Heinzen, R.		1.4), 2.2)
Drosophila fruit juice plates	Cold Spring Harbor Protocols		2.1) http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full
Agar	Fisher Bioreagents	BP1423-500	2.1.1.1)
Methyl paraben	Amresco	0572-500G	2.1.1.2)
Absolute ethanol	Fisher Bioreagents	BP2818-500	2.1.1.2)
Welch's 100% Grape juice frozen concentrate, 340 mL	Amazon	B0025UJVGM	2.1.1.3)
Petri dishes, 10 x 35 mm	Fisher Scientific	08-757-100A	2.1.1.4)
Microscope cover glass	Fisher Scientific	12-545-80	1.4.4), 2.2.2)
Yeast, Bakers Dried Active	MP Biomedicals	0210140001	2.1) Voeg 2 delen water toe aan 1 deel gist (v/v)
Tungsten needle	Fine Science Tools	10130-20	2.1)
Holding forceps	VWR	HS8313	2.1)
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	FLO4042-500	3.1.3)
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500	3.1.3)
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP9706-100	3.1.3)
4',6-diamidino-2-phenylindole	Thermo Fisher Scientific	62247	3.1.4)
Antifade mounting medium	Thermo Fisher Scientific	P36930	3.1.6)
Confocal microsope	Leica	TCS SP8-X White Light Confocal Laser Scanning Microscope	3.2)
3D imaging reconstruction software	Leica	LASX with 3D visualization module	3.3)
Microscope slides	Fisher Scientific	12-552-3	3.1.6)
Invertebrate iridescent virus 6 (IIV6)	Dr. Teixeria, L.		4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi: 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008)
Listeria monocytogenes	ATCC	strain: 10403S	4) Listeria monocytogenes strain 10403S (Bishop and Hinrichs, 1987) werd gekweekt in Difco Brain-heart infusion (BHI) bouillon (BD Biosciences) bevattende 50 µg/ml streptomycin bij 30 °C.
DNase I	Thermo Fisher Scientific(Invitrogen)	18068015	gDNA degradatie
cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad	1708891	cDNA synthese
IIV6_193R_F	IDT		qRT-PCR, 5'- TCT TGT TTT CAG AAC CCC ATT -3'
IIV6_193R_R	IDT		qRT-PCR, 5'- CAC GAA GAA TGA CCA CAA GG -3'
RpII_qRTPCR_fwd	SIGMA-ALDRICH		qRT-PCR, 5'- GAA GCG TTT CTC CAA ACG -AG
RpII_qRTPCR_rev	SIGMA-ALDRICH		qRT-PCR, 5'- TTG AGC GTA AGC ATC ACC -TG
SYBR Green qRT-PCR reagent	Thermo Fisher Scientific	K0251, K0252, K0253	qRT-PCR
Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific	4351107, 7500 Software v2.0	qRT-PCR
Anti-Listeria monocytogenes antibody	abcam	ab35132	Western blot
Anti-Actin antibody produced in rabbit	SIGMA-ALDRICH	A2066	Western blot
Anti-Rabbit IgG (H+L), HRP Conjugate	Promega	W4011	Western blot

```