Methodenartikel

Chromatine Immunoprecipitation (ChIP) van Histone modificaties van Saccharomyces cerevisiae

DOI:

10.3791/57080

⸱

29 december 2017

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Maryland

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een protocol voor het chromatine immunoprecipitation van gemodificeerde histonen uit de ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecipitated DNA wordt vervolgens gebruikt voor kwantitatieve PCR te ondervragen de overvloed en lokalisatie van Histon posttranslationele modificaties in het genoom.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Histon posttranslationele modificaties (PTMs), zoals acetylation, methylation en fosforylatie, worden dynamisch geregeld door een aantal enzymen die toevoegen of verwijderen van deze merken in reactie op signalen ontvangen door de cel. Deze PTMS zijn belangrijke bijdragen aan de regulatie van processen zoals gen expressie controle en reparatie van DNA. Immunoprecipitation (chIP) van de chromatine is een instrumentele aanpak voor het ontleden van de overvloed en lokalisatie van vele Histon PTMs in het genoom in reactie op diverse verstoringen naar de cel. Hier is een veelzijdige methode voor het uitvoeren van chIP van post-translationally gemodificeerde histonen uit de ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) beschreven. Deze methode berust op crosslinking van eiwitten en DNA met behulp van formaldehyde behandeling van gist culturen, generatie van gist lysates door parel verslaan, solubilisatie van chromatine fragmenten door micrococcal nuclease en immunoprecipitation van Histon-DNA complexen. DNA die is gekoppeld aan het merk Histon van belang is gezuiverd en onderworpen aan kwantitatieve PCR analyse om te evalueren van de verrijking op meerdere loci gedurende het genoom. Representatieve experimenten sonderen de lokalisatie van de Histon merken H3K4me2 en H4K16ac in wildtype en mutant gist worden besproken om aan te tonen van data-analyse en interpretatie. Deze methode is geschikt voor een verscheidenheid van Histon PTMs en kan worden uitgevoerd met verschillende gemuteerde stammen of in de aanwezigheid van diverse milieu benadrukt, waardoor het een uitstekend hulpmiddel voor het onderzoeken van veranderingen in de dynamiek van de chromatine onder verschillende omstandigheden.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De dynamische posttranslationele wijziging (PTM) van histones is een belangrijke regelgevende mechanisme voor vele DNA-templated processen, waaronder transcriptie, replicatie en DNA repair1,2. De mogelijkheid om de overvloed en precieze lokalisatie van gemodificeerde histonen gelijktijdig met deze processen is daarom cruciaal te begrijpen hun verordening onder verschillende omstandigheden in de cel. De ontwikkeling van chromatine immunoprecipitation (chIP) als een methode die grotendeels voortvloeide uit de biochemische studies van de interacties tussen eiwitten en DNA, met name in vitro methoden met behulp van chemische crosslinkers, in combinatie met de noodzaak om de dynamiek van eiwit-DNA interacties in vivo en in specifieke regio's van het genoom3,4,5. De vooruitgang van kwantitatieve PCR (qPCR) en sequencing technologieën heeft ook uitgebreid de mogelijkheid om uit te voeren van de experimenten van de chIP met kwantitatieve vergelijkingen en over het geheel genomen, waardoor het een krachtig hulpmiddel voor het ontleden van DNA-eiwit interactie op meerdere niveaus.

ChIP is momenteel een vereiste methode voor elke onderzoeksgroep kochten chromatine-gemedieerde regulering van het genoom zoals er geen vergelijkbare methoden zijn voor het rechtstreeks ondervragen van de fysieke verbinding tussen een gemodificeerde histone en een specifieke genomic locus in vivo. Hoewel er variaties van deze methode met behulp van de volgende generatie sequencing toewijzen histone modificaties gedurende de genoom6,7 beschikbaar zijn, kunnen deze benaderingen betrekking hebben op verschillende wetenschappelijke vragen en hun omvang, kosten en technische middelen kunnen worden beperkt voor sommige onderzoeksgroepen. Bovendien, gerichte chIP-qPCR is noodzakelijk als aanvulling op deze benaderingen door middel van methoden om beide te optimaliseren het chIP-protocol vóór sequencing en valideren van resultaten van de epigenomic datasets. Massaspectrometrie gebaseerde benaderingen voor de identificatie van de volledige aanvulling van Histon merken die zijn gekoppeld aan de genomic regio's ook hebben ontstaan8,9,10,11, echter deze benaderingen hebben sommige beperkingen met betrekking tot die regio's van het genoom kunnen worden bestudeerd en zij vereisen technische expertise en instrumentatie die niet beschikbaar voor alle onderzoeksgroepen is. ChIP blijft derhalve een fundamentele methode voor het analyseren van de omvang en de verdeling van Histon modificaties onder uiteenlopende omstandigheden voor alle onderzoeksgroepen kochten epigenetica, chromatine en de regeling van genomic functies.

Hier beschrijven we een methode voor chIP met behulp van de ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) om te onderzoeken van de verdeling van Histon PTMs op chromatine model. Deze aanpak is afhankelijk van een aantal kernonderdelen van chIP protocollen ontwikkeld in gist en ook toegepast op uiteenlopende model systemen12,13. Interacties tussen gemodificeerde histonen en DNA in de cel worden bewaard door crosslinking met formaldehyde. Na de lysate bereiding, chromatine fragmenten zijn ontbindend in uniform en middelgrote fragmenten door spijsvertering met micrococcal nuclease. Immunoprecipitation van de gemodificeerde histonen is uitgevoerd met commerciële of lab-gegenereerd antilichamen en eventuele bijbehorende DNA is geïsoleerd en geanalyseerd voor verrijking op bepaalde genomic regio's met behulp van qPCR (Figuur 1). Voor vele histone modificaties volstaat de hoeveelheid DNA die dit protocol verkregen voor het testen van meer dan 25 verschillende genomic loci door qPCR.

Deze chIP methode is zeer veelzijdig voor het toezicht op de verdeling van een enkele Histon wijziging op meerdere gemuteerde stammen of milieuomstandigheden, of voor het testen van meerdere histone modificaties in wildtype cellen bij een aantal genomic loci. Bovendien zijn talrijke onderdelen van het protocol gemakkelijk instelbaar tot opsporing van beide zeer - of nederig-overvloedig Histon merken optimaliseren. Ten slotte, uitvoeren van chIP van gemodificeerde histonen in ontluikende gist biedt de mogelijkheid om belangrijke besturingselementen gebruiken voor antilichamenspecificiteit die grotendeels niet beschikbaar zijn in andere systemen. Namelijk, giststammen kunnen worden gegenereerd die puntmutaties in Histon residuen die zijn gericht tot wijziging draagt, en, in sommige gevallen is er slechts een enkele enzym dat wijziging op een bepaalde Histon residu katalyseert (bv. Histon lysine methyltransferases). Daarom kan de chIP worden uitgevoerd in ofwel de Histon mutant of enzym schrapping stammen te assay de mate waarin niet-specifieke binding van het antilichaam kan worden voorkomen en het genereren van vals-positieve resultaten. Dit besturingselement is bijzonder waardevol voor nieuw ontwikkelde antilichamen, en kan zelfs worden gebruikt om te valideren antilichamenspecificiteit voor geconserveerde histone modificaties voorafgaand aan hun gebruik in andere systemen. Deze aanpak vormt een aanvulling op andere methoden om antilichamenspecificiteit test die onderscheid maken tussen verschillende wijziging Staten (zoals mono-, di- en tri-methylering), met inbegrip van sonderen matrices van gemodificeerde peptiden en uitvoeren van westelijke vlekken van histones of nucleosomes met gedefinieerde wijzigingen. Globaal, chIP in de ontluikende gist is een krachtige methode voor de beoordeling van de dynamiek van Histon PTMs in het genoom en het ontleden van de mechanismen inzake hun verordening.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. pre bind-antistoffen tegen magnetische kralen

  1. Meng het eiwit A/G magnetische kralen goed en breng 20 µL van magnetische kralen per één immunoprecipitation (IP) monster tot een 1,5 mL koker.
    Opmerking: Wanneer pipetteren kralen, wide-boring, lage-retentie tips gebruiken.
  2. Plaats de buis met kralen in een magnetische stand en laat van parels om te verzamelen aan de kant van de buis. Verwijder het supernatant.
  3. Wassen van de parels 3 keer met 1 mL koude Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) (50 mM Tris-HCl pH 7.5, van 150 mM NaCl).
  4. Voeg toe 200 µL van TBS aan kralen en geschikte hoeveelheid van een antilichaam. Draaien op 8 rpm's nachts bij 4 ° C.
    Opmerking: Voor veel Histon PTM antilichamen, 1-3 µg antilichaam per IP volstaat. Titratie experimenten zijn echter aanbevolen om te bepalen van de juiste concentraties. Aanbevolen concentraties voor goed gekarakteriseerd, commerciële Histon PTM antilichamen zijn vaak nauwkeurig en kunnen worden gevonden in gepubliceerde rapporten of Productliteratuur.
  5. Plaatst u de kralen in een magnetische standaard en verwijder de bovendrijvende substantie. Ze wassen met 1 mL eetlepels
  6. Resuspendeer de kralen in 20 µL van TBS per IP-monster plus een extra 5 µL (in geval van pipetting fout) eetlepels
    Opmerking: De kralen kunnen worden opgeslagen op korte termijn bij 4 ° C tot gebruik.

2. gistcellen groeien

  1. 10 mL YPD (20% pepton, gistextract van 10% en 20% dextrose) inoculeren met een één kolonie van de juiste spanning en groeien bij 30 ° C's nachts in een schudden incubator van 220 toeren per minuut.
  2. Meten van de extinctie op 600 nm (OD600) van de cultuur van de gist met een spectrofotometer. Verdun de cultuur op een OD600 = 0,2 in 100 mL YPD in een maatkolf van nieuwe.
  3. De cellen bij 30 ° C in een schudden incubator op 220 rpm groeien totdat ze halverwege log fase (OD600 = 0,6-0,8).

3. in Vivo Crosslinking van eiwitten aan DNA

  1. Wanneer culturen halverwege log fase bereikt, 2,7 mL van 37% formaldehyde rechtstreeks toevoegen aan het medium, voor een eindconcentratie van 1% formaldehyde. De kolf overbrengen in een shaker bij 25 ° C (of kamertemperatuur) en schud het op 50 rpm gedurende 15 minuten.
  2. Voeg 5 mL 2,5 M glycine aan het medium en blijven schudden bij 50 rpm bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten om quench de formaldehyde.
  3. Overdracht van de cellen om te centrifugeren flessen en draaien de cellen bij 5800 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Decanteren supernatant.
    1. Spoel de cellen door resuspending hen in 45 mL koude TBS en spoel de suspensie in een conische tube van 50 mL. Draai de buis bij 2800 x g gedurende 3 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
    2. Wash die de cellen in 10 mL koude chIP Lysis-buffermengsel (50 mM Tris-HCl pH 7.5, van 150 mM NaCl, 1 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA), 1% nonidet octyl phenoxypolyethoxylethanol (NP-40), opgeslagen bij 4 ° C).
    3. Draai de cellen bij 2800 x g gedurende 3 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
      Opmerking: Cellen kunnen worden met vloeibare stikstof bevroren en opgeslagen bij-80 ° C, totdat zij worden verwerkt.

4. Maak de gist Lysates

  1. Resuspendeer de cellen in 1 mL koude ChIP Lysis-buffermengsel met 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) en 1:1,000 verdunning van de gist proteaseinhibitor cocktail. Spoel de suspensie tot een 2,0 mL schroefdop koker met 200 µL van glaskralen.
  2. De cellen overbrengen in een kraal gewonnen van toestellen voor hoge snelheid agitatie bij 4 ° C en kraal beat 6 keer voor 30 s elke. Houden van de cellen in de ijskast voor minstens 1 min tussen elke parel gewonnen.
  3. De lysate overbrengen naar een 1,5 mL-buis met behulp van gel laden van tips. Centrifugeer het lysate bij 15.500 x g gedurende 20 min bij 4 ° C.
  4. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 250 µL van MNase spijsvertering Buffer (10 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 21 mM CaCl2, 1% NP-40, opgeslagen bij 4 ° C) door pipetteren zachtjes op en neer.
  5. 2.5 µL van MNase aan de reacties toevoegen. Meng ze zachtjes door het omkeren van 4 - 6 maal en Incubeer het onmiddellijk in een waterbad 37 ° C gedurende 20 minuten.
    Opmerking: Digest voorwaarden moeten worden geoptimaliseerd wanneer een nieuwe voorraad van MNase wordt gebruikt. Zie stap 10 voor het protocol.
  6. Onmiddellijk plaats de buizen op ijs zet de reactie stop en voeg 5 µL van het EDTA 0.5 M voor een eindconcentratie van 10 mM EDTA. Meng ze zachtjes door inversie.
  7. Centrifugeer de reactie bij 15.500 x g gedurende 15 min bij 4 ° C en het supernatant overbrengen in een nieuwe 1,5 mL-buis.
    Opmerking: Oplosbare (verteerd) chromatine worden in het supernatant. De pellet bevat iets onverteerd en onoplosbare cel puin.

5. Immunoprecipitate (IP) bewerkt Histones

  1. Bepaal de eiwitconcentratie van elk MNase-vrijgegeven chromatine breuk met behulp van een analyse van Bradford. Voeg 1 mL Bradford reagens aan elk van de 8 wegwerp cuvettes plus 1 extra cuvette voor elke eiwitSteekproef te beproeven.
    1. Voorbereiden van een stamoplossing van 2 mg/mL bovien serumalbumine (BSA).
    2. Voeg het juiste volume om de volgende concentraties van BSA in 1 mL Bradford reagens: 0 μg/mL, 0,5 μg/mL, 1 μg/mL, 2 μg/mL, 4 μg/mL, 6 μg/mL, 8 μg/mL en 10 μg/mL. 2 μL van de MNase-vrijgegeven chromatine breuk aan de extra cuvettes toevoegen.
    3. Bedek de bovenkant van elke Cuvet met een klein stukje parafilm en omkeren de cuvettes 4 - 6 maal de oplossing goed mengen. Incubeer de cuvettes bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
    4. Met behulp van een zichtbaar licht spectrofotometer, meet de extinctie op 595 nm voor de standaard curve en experimentele monsters.
      Opmerking: Gebruik de cuvette zonder BSA (0 μg/mL) tot de spectrofotometer alvorens de eerste meting leeg.
    5. Het uitzetten van een standaard curve met behulp van de extinctie-waarden voor de verschillende concentraties van BSA op software die is gekoppeld aan de spectrofotometer of spreadsheet-software. Gebaseerd op de standaard curve en de verdunningsfactor gebruikt (1:500), de absorptie-waarden gebruiken voor het berekenen van de eiwitconcentratie voor elk van de chromatine breuk monsters.
  2. Voor elk IP, wil 50 µg totale eiwitten uit de MNase-vrijgegeven chromatine afvalfractie ChIP Lysis-buffermengsel tot een eindvolume van 1 mL.
    Opmerking: Als het opzetten van meer dan één IP per lysate, maken een master mix van de lysate en ChIP Lysis Buffer en aliquoot 1 mL tot afzonderlijke buizen voor het onderzoektijdvak.
  3. Verwijder 100 µL van de IP-mix te verwerken als de input monster. Het bevriezen van het input monster bij-20 ° C tot stap 7.1.
    Opmerking: Alle resterende chromatine monster kan ook worden bevroren bij-20 ° C en gebruikt voor een latere IP indien gewenst.
  4. Voeg 20 µL van magnetische eiwit A/G kralen vooraf gebonden met antilichaam aan elk IP-monster.
Draaien van het monster bij 8 omwentelingen per minuut gedurende 3 uur (standaard) of overnachting (indien gewenst) bij 4 ° C.

6. wassen IPs en elueer Histone-DNA complexen

  1. Plaats van de buizen in een magnetische standaard en laat kralen verzamelen aan de kant van de buis. Verwijder de bovendrijvende vloeistof met behulp van een precisiepipet. Wassen van de kralen achtereenvolgens met 1 mL van elk van de onderstaande buffers.
    1. Uitvoeren van elk wassen met roterende bij 8 omwentelingen per minuut gedurende 5 minuten bij 4 ° C, plaatsen van kralen in een magnetische stand bovendrijvende vloeistof verwijderen en toevoegen van volgende buffer: 2 x - ChIP Lysis-buffermengsel, 2 x - hoge zout was Buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA 1% NP-40, opgeslagen bij 4 ° C), 1 x - LiCl/wasmiddel wassen Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 1% natrium deoxycholate, opgeslagen bij 4 ° C), 1 x - TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA, opgeslagen bij 4 ° C), en 1 x - TE.
    2. Met de laatste TE wassen, kunt u het kralen overbrengen door een nieuwe buis overbrengen van de meeste van de kralen, dan nog eens 0,5 mL TE wassen van de buis en de overdracht van de resterende kralen met 0,5 mL voor TE.
  2. Voeg 250 µL van versgemaakte ChIP elutie Buffer (1% SDS, 1 mM NaHCO3). Vortex de oplossing kort. Draaien van de monsters bij 8 omwentelingen per minuut gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Plaats buis in een magnetische staan en het verzamelen van de kralen. Zorgvuldig het supernatant overbrengen in een nieuwe buis en te voorkomen dat de kralen.
    Opmerking: Het eluaat bevat immunoprecipitated eiwitten en bijbehorende DNA.
  4. Voeg een andere 250 µL van ChIP elutie Buffer aan kralen. Draaien van de monsters bij 8 omwentelingen per minuut gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  5. Zorgvuldig overbrengen in het supernatant de buis met de eerste elutie. Indien nodig, een kleiner volume (240 µL) verwijderen voor alle IP-adressen om te voorkomen dat de kralen verstoren.

7. omgekeerde eiwit-DNA Crosslinks

  1. Ontdooi de input monsters en 400 µL van ChIP elutie Buffer toevoegen aan elke input.
  2. Aan zowel de invoer als IP-monsters, Voeg 20 µL van 5 M NaCl, 5 µL van 20 mg/mL glycogeen en 12,5 µL van 20 mg/mL proteïnase K. Mix goed door omkeren of flicking buizen. Incubeer de monsters in een waterbad van 65 ° C's nachts.

8. zuiveren en concentreren van DNA

  1. Voeg toe 10 µL van 10mg/mL RNase A aan de invoer- en IP-monsters. Incubeer de monsters in een waterbad 37 ° C gedurende 30 minuten.
  2. 600 µL van fenol: chlorofrom:isoamyl alcohol (25:24:1 PCI) toevoegen aan de waterige oplossing en meng ze goed. Draaien ze bij 15.500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    1. Verwijder de waterige laag een nieuwe buis. Voeg 600 µL van PCI en meng ze goed. Draai de buis bij 15.500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. De waterige laag overbrengen in een nieuwe buis.
      Let op: Werk in de zuurkast en passende persoonlijke beschermingsmiddelen dragen bij het werken met PCI. Beschikken over vloeibare en vaste afvalstoffen zoals geïnstrueerdg door institutionele richtsnoeren.
  3. 0.1 x volume 3M natriumacetaat en 1 mL koude 100% ethanol te precipiteren van DNA toevoegen. Omkeren van de buis 4 - 6 maal de oplossing goed mengen. Incubeer bij-20 ° C's nachts.
    1. Draai de buis bij 15.500 x g gedurende 20 min bij 4 ° C. Verwijder voorzichtig het supernatant met een pipet.
    2. Het wassen van de pellet in 1 mL koude 70% ethanol. Draai het bij 15.500 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Verwijder voorzichtig het supernatant met een pipet.
    3. Luchtdroog de korrels in de kap gedurende ongeveer 20 minuten (totdat het helemaal droog is). Resuspendeer IP-monsters in 50 µL nuclease-gratis water en resuspendeer input monsters in 100 µL van nuclease-gratis water. Bewaren van de DNA-monsters bij-20 ° C tot het uitvoeren van qPCR.

9. kwantitatieve PCR (qPCR) detecteren verrijkt Genomic regio 's

  1. Maak een qPCR master mix voor elke reeks inleidingen. Één reactie bevat 5 µL van 2 x qPCR-mix, 0,25 µL van 20 µM voorwaartse primer en 0,25 µL van 20 µM omgekeerde primer.
    Opmerking: Goede primer ontwerp en tests voor qPCR experimenten zijn elders beschreven14,15,16.
  2. Het maken van DNA master mixen voor elk DNA-monster. Één reactie bevat 0,5 µL van DNA en 4.0 µL van nuclease-gratis water.
  3. 5.5 µL van de master mix van geschikte primer en 4.5 µL van de juiste master mix van DNA toevoegen aan elk putje op een 384-well qPCR plaat.
    Opmerking: Starten met het toevoegen van 5.5 µL van de primer mix aan elk putje. Draai de plaat bij 200 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur alvorens 4.5 µL van het mengsel van DNA toe te voegen.
  4. Houden het zegel aan de plaat en draai bij 200 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur.
  5. Uitvoeren van qPCR met behulp van een systeem real-time qPCR met de volgendevoorwaarden: 95 ° C gedurende 3 min; 40 cycli van 95 ° C voor 10 s, 55 ° C gedurende 30 s; smeltende kromme 65 ° C tot 95 ° C met stappen van 0,5 ° C, 5 s.
  6. Voor elk paar primer, berekenen de percentage input van het IP-monster ten opzichte van de 5% input staal dat wordt gebruikt in de qPCR. Gebruik de middelen van de technische triplicates van de PCR de berekeningen uit te voeren.
    Opmerking: Als de aanzienlijke variatie wordt waargenomen in de PCR triplicates, is het het beste om te herhalen van de qPCR met aandacht voor master mix samenstelling, pipetting fouten en kruisbesmetting tussen putten in de 384-well plaat.
    1. Waardecorrecties op Cq voor de invoer voor 100% door af te trekken van het aantal cycli die de verdunningsfactor van de ruwe Cq waarden vertegenwoordigen.
      Opmerking: Vijf procent invoer vertegenwoordigt een verdunningsfactor van 20-fold, die gelijk is aan 4,32 cycli (aanmelden2 20 = 4.32).
    2. Bereken het percentage invoeren als 2 ^ (Cqinput - CqIP) vermenigvuldigd met 100.

10. Bepaal MNase Digest voorwaarden (aanbevolen voorafgaand aan de eerste volledige chIP Experiment)

  1. Stappen 2.1 via 4.4 van het voorgaande protocol. Het protocol voor het genereren van genoeg lysate voor meerdere voorbeelden van MNase spijsvertering van de chromatine-bevattende pellet opschalen. Resuspendeer de pellets in 1,25 mL MNase spijsvertering Buffer bij stap 4.4. De monsters 5 buizen dus dat elk aliquot bevat 250 µL van de geresuspendeerde in MNase spijsvertering Buffer chromatine-pellet.
  2. Toevoegen van 0, 1,5, 2,5 of 5 µL van MNase aan elke buis. Meng ze zachtjes door het omkeren van 4 - 6 maal en onmiddellijk uit te broeden de buizen in een waterbad 37 ° C gedurende 20 minuten.
  3. Stoppen reacties door onmiddellijk het plaatsen van de buizen op ijs en het toevoegen van 5 µL van het EDTA 0.5 M voor een eindconcentratie van 10 mM.
Meng de oplossing voorzichtig door inversie.
  • Centrifugeer de buizen bij 15.500 x g gedurende 15 min bij 4 ° C en het supernatant overbrengen in een nieuwe 1,5 mL-buis.
  • SDS toevoegen aan de definitieve concentratie van 1% (25 µL van de stockoplossing 10%) en NaHCO3 tot en met 0,1 M eindconcentratie (25 µL van 1 M stockoplossing) aan de monsters in de 1,5 mL tubes.
  • Voeg toe 20 µL van 5M NaCl, 5 µL van glycogeen en 12,5 µL van 20mg/mL proteïnase K aan de monsters in de 1,5 mL tubes. Ze bij 65 ° C na een nacht bebroeden.
  • Voeg 10 µL van 10 mg/mL RNaseA. Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
  • 300 µL van PCI toevoegen aan de waterige oplossing en meng ze goed. Spin bij 15.500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    1. Verwijderen van waterige laag een nieuwe buis. Voeg 300 µL van PCI en meng goed. Spin bij 15.500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Waterige laag overbrengen in een nieuwe buis.
  • 0.1 x volume 3 M Natriumacetaat (meestal ~ 30 µL) en 1 mL koude 100% ethanol te precipiteren van DNA toevoegen. Omkeren van de buis 4 - 6 maal goed mengen. Incubeer de buis bij-80 ° C gedurende 1 uur of -20 ° C's nachts.
    1. Draai de buis bij 15.500 x g gedurende 20 min bij 4° C. Verwijder voorzichtig de bovendrijvende vloeistof met een pipet.
    2. Het wassen van de pellets in 1 mL koude 70% ethanol. Spin bij 15.500 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
    3. Laat die de pellets drogen in de kap ongeveer 20 min (of totdat het helemaal droog). Resuspendeer de pellets in 30 µL van nuclease-gratis water.
  • Voeg het DNA laden kleurstof en 20 µL draaien op een 2% agarose gel te visualiseren verteerd DNA.

    • Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

    Resultaten

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Een belangrijk onderdeel van dit protocol is het optimaliseren van de concentratie van micrococcal nuclease (MNase) gebruikt om te verteren de chromatine in oplosbare fragmenten, zoals beschreven in stap 10. Dit is essentieel voor het verkrijgen van hoge resolutie gegevens met betrekking tot de verdeling van Histon modificaties aan de genomic regio's van belang. Een MNase titratie moet worden uitgevoerd om te bepalen van de meest geschikte concentratie te bereiken vooral mono-nucleosomes ...

    Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

    Discussie

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    De hier beschreven procedure zorgt voor de efficiënte herstel van DNA in verband met gewijzigde histonen in gistcellen door immunoprecipitation. Dit wordt gevolgd door de qPCR gebruikend inleidingen die nadere uitwerking van de regio's van belang zijn voor het bepalen van de lokale verrijking of uitputting van specifieke histone modificaties. Ondanks de bijna twintig jaar geleden als een methode ontwikkeld, blijft chIP de bepalende assay voor het onderzoeken van de status van de wijziging van de Histon op verschillende g...

    Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

    Openbaarmakingen

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    De auteurs hebben niets te onthullen.

    Dankbetuigingen

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    De auteurs bedank leden van de groene lab voor nuttige discussies. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van de NIH R03AG052018 en R01GM124342 naar E.M.G.

    Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

    Materialen

    Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
    NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
    Gist ExtractResearch Products International (RPI)Y20025-1000.0
    PeptonResearch Products International (RPI)P20250-1000.0
    DextroseThermoScientificBP350-1
    FormaldehydeSigma-AldrichF8775
    GlycineFisher ScientificAC12007-0050
    TrisAmresco0497-5KG
    EDTASigma-AldrichE6758-500G
    NaClThermoScientificBP358-10
    4-Nonylfenyl-polyethyleenglycolSigma-Aldrich74385Equivalent aan NP-40
    MgClThermoScientificS25533
    CaCl2Sigma-Aldrich20899-25G-F
    LiClThermoScientificAC413271000
    NatriumdodecylsulfaatAmrescoM107-1KG
    NatriumdeoxycholeaatSigma-Aldrich30970-100G
    NatriumacetaatSigma-AldrichS2889
    NaHCO3ThermoScientificS25533
    PMSFSigma-AldrichP7626-5G
    GistproteaseremmercocktailVWR10190-076
    25 Fenol:24 Chloroform:1 Isoamyl AlcoholVWR Life Science97064-824
    EthanolSigma-AldrichE7023
    Nuclease-vrij waterVWR100720-992
    Micrococcal NucleaseWorthington BiochemicalLS004797
    GlycogenThermoScientificR0561
    Proteinase KResearch Products International (RPI)P50220-0.1
    RNase A Sigma-AldrichR6513-50MG
     Bradford Assay ReagensThermoScientific23238
     BSA Standaard 2 mg/mLThermoScientific23210
    α H4EMD Millipore04-858
    α H4K16acEMD MilliporeABE532
    α H3Abcamab1791
    α H3K4me2Active Motif39142
     High Rox qPCR MixAccuris qMax Green, Low Rox qPCR MixACC-PR2000-L-1000
    Protein A/G Magnetische KralenThermoScientific88803
    Magneetstandaard voor 1,5 mL buisjesFisher ScientificPI-21359
    Zuur-gewassen glazen kralenSigma-AldrichG8772
     Microbuisjes HomogenisatorBenchmarkD1030
    2,0 mL schroefdopbuisjes met afdichtringenSigma-AldrichZ763837-1000EA
    Gel laadtipsFisher Scientific07-200-288
    CuvettesFisher Scientific50-476-476
    ParafilmFisher Scientific13-374-10
    50 mL kegelbuisjesFisher Scientific14-432-22
    384-Well PCR PlaatFisher ScientificAB-1384W
     Gyratorische VloerschudderNew Brunswick ScientificModel G10
    SpectrofotometerThermoScientificND-2000c
     Real-Time PCR Detectie SysteemBio-Rad1855485

    Referenties

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Jaiswal, D., Turniansky, R., Green, E. M. Choose Your Own Adventure: The Role of Histone Modifications in Yeast Cell Fate. J Mol Biol. 429 (13), 1946-1957 (2017).
    2. Suganuma, T., Workman, J. L. Signals and combinatorial functions of histone modifications. Annu Rev Biochem. 80, 473-499 (2011).
    3. Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. P Natl Acad Sci USA. 82 (19), 6470-6474 (1985).
    4. Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
    5. Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. P Natl Acad Sci USA. 81 (14), 4275-4279 (1984).
    6. Lefrançois, P., et al. Efficient yeast ChIP-Seq using multiplex short-read DNA sequencing. BMC Genomics. 10, 37(2009).
    7. Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
    8. Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic Loci. Cell. 136 (1), 175-186 (2009).
    9. Byrum, S. D., Raman, A., Taverna, S. D., Tackett, A. J. ChAP-MS: a method for identification of proteins and histone posttranslational modifications at a single genomic locus. Cell Rep. 2 (1), 198-205 (2012).
    10. Soldi, M., Bremang, M., Bonaldi, T. Biochemical systems approaches for the analysis of histone modification readout. Biochim Biophys Acta. 1839 (8), 657-668 (2014).
    11. Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP approach combines ChIP and mass spectrometry to dissect locus-specific proteomic landscapes of chromatin. J Vis Exp. (86), (2014).
    12. Kuo, M. H., Allis, C. D. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods. 19 (3), 425-433 (1999).
    13. Meluh, P. B., Broach, J. R. Immunological analysis of yeast chromatin. Methods Enzymol. 304, 414-430 (1999).
    14. Rozen, S., Skaletsky, H. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods Mol Biol. 132, 365-386 (2000).
    15. Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines. Methods. 50 (4), S1-S5 (2010).
    16. Rodríguez, A., Rodríguez, M., Córdoba, J. J., Andrade, M. J. Design of primers and probes for quantitative real-time PCR methods. Methods Mol Biol. 1275, 31-56 (2015).
    17. Briggs, S. D., et al. Histone H3 lysine 4 methylation is mediated by Set1 and required for cell growth and rDNA silencing in Saccharomyces cerevisiae. Gene Dev. 15 (24), 3286-3295 (2001).
    18. Bernstein, B. E., et al. Methylation of histone H3 Lys 4 in coding regions of active genes. P Natl Acad Sci USA. 99 (13), 8695-8700 (2002).
    19. Pokholok, D. K., et al. Genome-wide map of nucleosome acetylation and methylation in yeast. Cell. 122 (4), 517-527 (2005).
    20. Krogan, N. J., et al. The Paf1 complex is required for histone H3 methylation by COMPASS and Dot1p: linking transcriptional elongation to histone methylation. Mol Cell. 11 (3), 721-729 (2003).
    21. South, P. F., Harmeyer, K. M., Serratore, N. D., Briggs, S. D. H3K4 methyltransferase Set1 is involved in maintenance of ergosterol homeostasis and resistance to Brefeldin A. P Natl Acad Sci USA. 110 (11), E1016-E1025 (2013).
    22. Margaritis, T., et al. Two distinct repressive mechanisms for histone 3 lysine 4 methylation through promoting 3'-end antisense transcription. PLoS Genet. 8 (9), e1002952(2012).
    23. Jezek, M., et al. The histone methyltransferases Set5 and Set1 have overlapping functions in gene silencing and telomere maintenance. Epigenetics. 12 (2), 93-104 (2017).
    24. Suka, N., Luo, K., Grunstein, M. Sir2p and Sas2p opposingly regulate acetylation of yeast histone H4 lysine16 and spreading of heterochromatin. Nat Genet. 32 (3), 378-383 (2002).
    25. Kimura, A., Umehara, T., Horikoshi, M. Chromosomal gradient of histone acetylation established by Sas2p and Sir2p functions as a shield against gene silencing. Nat Genet. 32 (3), 370-377 (2002).
    26. Rothbart, S. B., et al. An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity. Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).

    Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

    Herprints en machtigingen

    Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

    Toestemming aanvragen

    Trefwoorden

    Micrococcaal nucleasekwantitatieve PCRgistlysaatformaldehyde crosslinkingmagnetische korrelsH3K4me2H4K16ac

    Gerelateerde artikelen