Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Fractionering voor oplossing van oplosbare en onoplosbare Huntingtin soorten

9.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/57082

⸱

27 februari 2018

 ,  ,  , 
1Department of Psychiatry and Human Behavior, University of California Irvine, 2UCI MIND, University of California Irvine, 3Department of Neurobiology and Behavior, University of California Irvine, 4Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

Een methode is beschreven voor fractionering van onoplosbare en oplosbare mutant huntingtin soorten van muis hersenen en cel cultuur. De beschreven methode is nuttig voor karakterisering en kwantificering van het huntingtin eiwit flux en aids in het analyseren van eiwitten homeostase in de pathogenese van de ziekte en in het bijzijn van verstoringen

Samenvatting

De accumulatie van misfolded eiwitten staat centraal in de pathologie in de ziekte van Huntington (HD) en vele andere neurodegeneratieve aandoeningen. Met name is een pathologische spil van HD de afwijkende accumulatie van mutant HTT (mHTT) eiwit in ultrahoog moleculair gewicht complexen en intracellulaire opneming organen samengesteld van fragmenten en andere eiwitten. Conventionele methodes voor het meten en begrijpen dat de bijdragen van verschillende vormen van mHTT-bevattende aggregaten zijn fluorescentie microscopie, westelijke vlekkenanalyse en filter overlappen testen.

Meeste van deze methoden zijn echter conformatie specifiek, en daarom kan niet kunt oplossen door de volledige staat van mHTT eiwit flux vanwege de complexe aard van de totale oplosbaarheid en resolutie.

Voor de identificatie van geaggregeerde mHTT verschillende complexen en aangepaste formulieren is scheiding en solubilisatie van de cellulaire aggregaten en fragmenten verplicht. Hier beschrijven we een methode om te isoleren en visualiseren van oplosbare mHTT monomeren, oligomeren, fragmenten en een onoplosbare ultrahoog moleculair gewicht (HMW) geaccumuleerde mHTT soorten. HMW mHTT bijgehouden met de progressie van de ziekte, komt overeen met muis gedrag uitlezingen en heeft geweest beneficiair gemoduleerd door bepaalde therapeutische interventies1. Deze aanpak kan worden gebruikt met muis hersenen en perifere weefsels celkweek maar kan worden aangepast aan andere modelsystemen of ziekte contexten.

Inleiding

De verstoring van eiwit kwaliteitscontrole netwerken, zodat het juiste vouwen en aantasting van de cellulaire eiwitten is waarschijnlijk centraal in de pathologie in de ziekte van Alzheimer (AD), de ziekte van Parkinson (PD), de ziekte van Huntington (HD), en andere "eiwit misfolding" stoornissen2,3. Een gedetailleerd inzicht in de proteostasis-netwerkonderdelen en hun bijdragen aan de pathologie zijn daarom cruciaal voor de ontwikkeling van verbeterde therapeutische interventies. HD wordt veroorzaakt door de abnormale groei van een herhaling van het CAG binnen het HD-gen wat resulteert in een uitgebreid stuk van polyglutamines (polyQ) in het eiwit huntingtin (HTT)4. Een consistente pathologische functie van HD pathogenese is de resulterende misfolding, accumulatie en aggregatie van HTT in gebieden van de hersenen en perifere weefsels, waarvan is aangetoond te bemoeien op verschillende manieren met de normale cel homeostase en functie 5 , 6. terwijl HTT overal wordt uitgedrukt, middellange Maxomys neuronen in het striatum zijn selectief kwetsbare en meest openlijk waarin dit probleem optreedt met opmerkelijke corticale atrofie ook geassocieerd met HD pathogenese.

De vorming van aggregaten van HTT in de hersenen van HD patiënten en diermodellen heeft meestal geserveerd als een proxy-marker van progressie van de ziekte en dominant-negatieve winst van functie voor mHTT7. Hoewel de precieze mechanismen door welke proteïne misfolding en aggregatie aan mHTT-geïnduceerde toxiciteit bijdragen kunnen onduidelijk blijven, is de vorming van deze insluitsels in de hersenen van HD patiënten en verschillende diermodellen een invariant en onvermijdelijke functie. Insluitsels lijken te bestaan grotendeels uit geaccumuleerde HTT fragmenten met de N-terminal uitgebreid polyQ, die aangeeft dat proteolyse en verwerking van full-length HTT evenals alternatieve splicing8,9 kan spelen een belangrijke rol in de pathogenese van HD. N-terminale HTT fragmenten kan vormen een pathologische vorm van HTT die kan snel aggregaat, ervoor, en versnellen of propageren de aggregatie proces10.

De aanwezigheid van deze insluitsels doet echter niet noodzakelijkerwijs met HTT-geïnduceerde toxiciteit of cel dood11correleren. HTT wordt voorgesteld te ondergaan het proces van een samenvoeging van een oplosbare monomeer door oplosbare oligomere soorten en β-sheet fibrillen tot onoplosbare aggregaten en insluitsels12. Oplossen van deze verschillende eiwit soorten via standaard biochemische tests is een uitdaging op het gebied als gevolg van hun stabiliteit in lage-wasmiddel lysis-buffermengsel en moeilijkheden in het visualiseren met behulp van standaard biochemische tests. Methodologische overwegingen zijn dus cruciaal voor het opsporen van de mate en het patroon van opgebouwde en geaggregeerde mHTT.

Het hier gepresenteerde protocol biedt een methode om te visualiseren van verschillende tussenproducten van HTT, specifiek de vorming van een onoplosbare HMW HTT-soorten, die lijkt te nauw track met HD pathogenese en ziekte progressie1,13 ,14. Zijnde kundig voor oplossen en het bijhouden van meerdere soorten mHTT biedt onderzoekers een biochemische instrument om te studeren van de pathogenese van de ziekte en het evalueren van potentiële therapeutische interventies door hun modulatie en het effect op de pathogenese van de ziekte.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dierlijke ethiek verklaring - experimenten werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren van het National Institutes of Health en een goedgekeurde dierlijke onderzoeksprotocol door de institutionele Animal Care en gebruik Comité ( IACUC) aan de Universiteit van Californië, Irvine, een AAALAC geaccrediteerde instelling. Alle inspanningen waren geleverd om te minimaliseren van dierenleed.

1. bereiding van Lysis Buffers

  1. Bereiden "Oplosbare" lysis-buffermengsel (10 mM Tris pH 7.4, 1% Triton-X 100, 150 mM NaCl, 10% glycerol) en steriele filter door 0,22 µm filter.
    1. Meten voor een werkende "Oplosbare" lysis-buffermengsel, N-Ethylmaleimide (NEM) en grondig oplossen in 100 mM phenylmethysulfonyl flouride (PMSF) opgelost in 100% EtOH.
      Opmerking: Lysis Buffer remmers: (i) 20 mM N-ethylmaleimide (NEM); (ii) 0.2 mM PMSF; (iii) 1 mM natrium orthovanadate (Na3VO4); (iv) 1 µg/mL leupeptin; (v) 1 µg/mL aprotinin; (vi) 20 mM Natriumfluoride (NaF).
      Let op: Draag een gezichtsmasker bij het werken met NEM in het gehele protocol. Werken van lysis-buffermengsel moet geschieden verse om actieve remmers.
    2. Voor oplosbare lysis-buffermengsel met proteaseinhibitors, voeg remmers in de volgende volgorde: Natriumfluoride (NaF), aan tot de streep met koude lysis-buffermengsel, natrium orthovanadate (Na3VO4), Aprotinin en Leupeptin.
  2. Voor "Onoplosbaar" lysis-buffermengsel, aanvulling op 4% SDS door 500 µL van 20% SDS aan 2 mL lysisbuffermengsel "Soluble" toe te voegen. Laat bij kamertemperatuur.
    Opmerking: SDS neerslaat uit bewaard bij 4 ° C; Houd dit op kamer temp. Eindsamenstelling van Lysis Buffer: 10 mM Tris (pH 7.4); 1% Triton X-100; 150 mM NaCl; 10% glycerol; 4% SDS (onoplosbaar, alleen).

2. oplosbare/onoplosbare fractionering Protocol

Opmerking: Zie afbeelding 1 voor een schema.

  1. Label twee sets van buizen voor elk monster: "Soluble" en "Onoplosbaar".
  2. Voeg X-µL van ijskoude werken oplosbare lysis-buffermengsel aangevuld met proteaseinhibitors (zie 1.1.1) weefsel.
    Opmerking: X = Volume varieert afhankelijk van weefsel bedrag; Zie tabel 1.
  3. Voor de muis hersenweefsel (d.w.z., striatum), dounce langzaam 30 keer in glas 1 mL douncer en Pipetteer in "Onoplosbaar" aangeduid met buis (Houd op ijs).
    Opmerking: Wees voorzichtig niet te breken oppervlak van vloeistof na het starten van douncing, zoals bubbels vormen zullen en onvolledige homogenisering kunnen opleveren.
  4. Spoel de cellen één keer met koud, 1 x PBS voor cellen (dat wil zeggen, HeLa, HEK293T). Verwijderen van PBS en minimale volume van lysis-buffermengsel toepassen op cellen en lift met cel schraper.
    Opmerking: Hierboven cellijnen, cellen waren uitplaten aan 5 x 105 cellen per 6 goed plaat en uitgegroeid tot in de buurt van confluentie. Een is goed vergelijkbaar met volumes zijn opgebruikt voor muis striatum.
  5. Breng homogenaat of lysate in cel met het label, "Onoplosbaar" buizen en lyse op ijs 1 h (Start klok nadat definitieve buis is verwerkt).
    Opmerking: Voor cel lysates, triturate meerdere malen te breken cel bosjes vóór het opstarten van de incubatie. Vorming van luchtbellen vermijden. Kort vortex pulse elk monster voor 1 s halverwege lysing.
  6. Centrifugeer steekproeven bij 4 ° C bij 15.000 x g gedurende 20 min.
  7. Herstellen bovendrijvende substantie als de breuk "Soluble".
    1. Verwijder met Pipetteer, wees voorzichtig niet te verstoren, pellet/bewolkt laag zoals dit de breuk vervuilen zal. Pipetteer oplosbare fractie in "Soluble" label buis. Houd op ijs.
  8. Pellet met 500 µL van lysis-buffermengsel (x2) en centrifuge bij 4 ° C bij 15.000 x g gedurende 5 minuten wassen nadat elk wassen; het is oke als sommige van de bewolkt laag is afgepipetteerde af.
  9. Verwijder alle resterende was buffer, waardoor alleen de pellet van weefsel na definitieve wassen.
    Opmerking: Vanaf dit punt, onoplosbare monsters moeten nu worden bewaard bij kamertemperatuur.
  10. Resuspendeer pellet met X-µL lysis-buffermengsel aangevuld met 4% SDS (Volume kan worden aangepast afhankelijk van de grootte van de pellet; Zie tabel 1).
  11. Bewerk ultrasone trillingen ten elk monster voor 30 s bij kamertemperatuur met een sonde ultrasoonapparaat (125 watt, 20 kHz, Pulse, Amplitude 40%, Zie Tabel van materialen).
  12. Monsters (rollend kook) kook gedurende 30 minuten; Kort centrifugeren (15 s) bij 6.000 x g over een monster niet te verliezen.
  13. Uitvoeren van DC (detergenten compatibel) eiwit assay (Zie Tabel van materialen) of Lowry eiwit assay voor het meten van de eiwitconcentratie (aanbevolen gestarte verdunningen van 1/5 van het monster in de respectieve lysis-buffermengsel voor celkweek en 1/10 voor weefsel lysates).
    Opmerking: Eiwit concentraties moet worden gelezen met behulp van een DC of Lowry bepaling als gevolg van de hoge concentratie van wasmiddel.
  14. Aliquot monsters in 50 µL partijen om bevriezen-ontdooien problemen te voorkomen.
    Opmerking: Protocol kan worden onderbroken hier vóór verdere biochemische analyse doordat beide fracties bij-20 ° C.

3. westelijke vlek en kwantificering

  1. Westelijke vlekken zoals gerapporteerd elders uitvoert1,13 door verdunnen 30 µg van voorbeeld 1:1 bij het laden van de buffer (1.6 x laden kleurstof, 1 x verminderen).
    Opmerking: 30 µg eiwit per fractie is voldoende, maar kan worden aangepast voor een optimale resolutie. 3 - 8% Tris-acetaat poly-acrylamide gels moeten worden gebruikt voor de onoplosbare breuk. 4 - 12% bis-Tris gels worden aanbevolen voor de oplosbare fractie.
  2. Monsters (rollende kook) gedurende 5 min. Centrifuge kort koken (15 s) bij 6.000 x g monster te verzamelen.
  3. Breuken door SDS-pagina en westelijke vlek, volgens protocol van de fabrikant voor gereduceerde monsters analyseren.
    Opmerking: Onoplosbare breuk verhelpt best wanneer overgezet naar 0,45 µM nitrocellulose membraan. 0,45 of 0,2 µM nitrocellulose kan worden gebruikt voor de oplosbare fractie, afhankelijk van de grootte van de proteïne van belang. Wat optimalisatie kan worden verlangd voor de beste overdracht van HMW materialen.
  4. Vlek membraan met hele eiwit vlek (bijvoorbeeld, MEMcode, zie de Tabel van materialen) te visualiseren van eiwitten laden van efficiëntie.
    Opmerking: Western blots kunnen worden geanalyseerd door gemiddelde pixel intensiteit. Oplosbare breuken kunnen worden genormaliseerd op een house-keeping proteïne beste geschikt voor het experimentele systeem. Onoplosbare breuk als relatieve eiwit overvloed werd gecontroleerd door de omkeerbare eiwit kleuring of Histon 3 normalisatie op aparte vlek.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Resolutie van oplosbare en onoplosbare cel lysates na fractionering kan worden opgespoord met behulp van westerse analyse en filter retardatie assays (Figuur 2). Als voorbeeld, HEK293T cellen werden transfected met behulp van transfectiereagens (b.v., lipofectamine 2000) met HTT exon 1 coderen cDNA met 97 glutamine herhaalt15 gevolgd door de poly proline rijke regio en deze cellen mochten uitdrukkelijke voor 44 h. cellen werde...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Enkele voorzorgsmaatregelen zijn nodig voor de bovenstaande protocollen om ervoor te zorgen consequent en kwantitatieve resultaten. Eerst, mHTT in beide breuken spontaan zal aggregaten vormen na verloop van tijd op meerdere bevriezen dooi cycli, met name bij een hoge concentratie. Het is dus cruciaal voor aliquots van het eiwit preps bevriezen en ontdooien alleen het benodigde volume voordat u de test uitvoert zoals beschreven in het bovenstaande protocol. Verder, als onoplosbare breuk resulteert in witte neerslaande bij...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gesteund door de NIH (RO1-NS090390). Wij zouden ook willen bedanken Dr. Joan Steffanfor technische bijstand en discussie tijdens de ontwikkeling van deze test.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Sterile FilterMilliporeSCGP505RESchroefdopwissel, steriele vacuümfilter
1 mL Tissue Grinder, DounceWheaton357538
SonicatorQsonicaModel Q125
DC Protein AssayBiorad5000111Vergelijkbaar met Lowry assay
Tris 1M buffer oplossingAlfa AesarJ60636
Triton X-100FisherBP151-100
NaCl 5M oplossingTeknovaS0251
GlycerolFisherBP229-1
20% SDS oplossingTeknovaS0295
N-ethylmaleimideSigmaE1271
PhenylmethylsulfonylfluorideSigmaP7626maak 100mM stockoplossing in 100%EtOH, bewaar bij 4°C
NatriumorthovanadateSigmaS6508Maak 0,5M stockoplossing in water
LeupeptineSigmaL2884Maak 10mg/ml stockoplossing in water
AprotinineSigmaA1153Maak 10mg/ml stockoplossing in water
NatriumfluorideSigmaS4504Maak 500mM stockoplossing in water
Anti-HTTMilliporeMAB5492Gebruik 1:1000 voor western blot, 1:500 voor filter retardatie assay
Anti-GAPDHNovus BiologicalsNB100-56875Gebruik 1:1000 voor oplosbare western blot

Referenties

  1. Ochaba, J., et al. PIAS1 Regulates Mutant Huntingtin Accumulation and Huntington's Disease-Associated Phenotypes In Vivo. Neuron. 90 (3), 507-520 (2016).
  2. La Spada, A. R., Taylor, J. P. Repeat expansion disease: progress and puzzles in disease pathogenesis. Nat Rev Genet. 11 (4), 247-258 (2010).
  3. Reiner, A., Dragatsis, I., Dietrich, P. Genetics and neuropathology of Huntington's disease. Int Rev Neurobiol. 98, 325-372 (2011).
  4. The Huntington's Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
  5. Sassone, J., Colciago, C., Cislaghi, G., Silani, V., Ciammola, A. Huntington's disease: the current state of research with peripheral tissues. Exp Neurol. 219 (2), 385-397 (2009).
  6. Weydt, P., et al. Thermoregulatory and metabolic defects in Huntington's disease transgenic mice implicate PGC-1alpha in Huntington's disease neurodegeneration. Cell Metab. 4 (5), 349-362 (2006).
  7. Schulte, J., Littleton, J. T. The biological function of the Huntingtin protein and its relevance to Huntington's Disease pathology. Curr Trends Neurol. 5, 65-78 (2011).
  8. Gipson, T. A., Neueder, A., Wexler, N. S., Bates, G. P., Housman, D. Aberrantly spliced HTT, a new player in Huntington's disease pathogenesis. RNA Biol. 10 (11), 1647-1652 (2013).
  9. Neueder, A., et al. The pathogenic exon 1 HTT protein is produced by incomplete splicing in Huntington's disease patients. Sci Rep. 7 (1), 1307(2017).
  10. Arndt, J. R., Chaibva, M., Legleiter, J. The emerging role of the first 17 amino acids of huntingtin in Huntington's disease. Biomol Concepts. 6 (1), 33-46 (2015).
  11. Saudou, F., Finkbeiner, S., Devys, D., Greenberg, M. E. Huntingtin acts in the nucleus to induce apoptosis but death does not correlate with the formation of intranuclear inclusions. Cell. 95 (1), 55-66 (1998).
  12. Kim, S., Kim, K. T. Therapeutic Approaches for Inhibition of Protein Aggregation in Huntington's Disease. Exp Neurobiol. 23 (1), 36-44 (2014).
  13. O'Rourke, J. G., et al. SUMO-2 and PIAS1 modulate insoluble mutant huntingtin protein accumulation. Cell Rep. 4 (2), 362-375 (2013).
  14. Shibata, M., et al. Regulation of intracellular accumulation of mutant Huntingtin by Beclin 1. J Biol Chem. 281 (20), 14474-14485 (2006).
  15. Apostol, B. L., et al. A cell-based assay for aggregation inhibitors as therapeutics of polyglutamine-repeat disease and validation in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5950-5955 (2003).
  16. Wanker, E. E., et al. Membrane filter assay for detection of amyloid-like polyglutamine-containing protein aggregates. Methods Enzymol. 309, 375-386 (1999).
  17. Sontag, E. M., et al. Detection of Mutant Huntingtin Aggregation Conformers and Modulation of SDS-Soluble Fibrillar Oligomers by Small Molecules. J Huntingtons Dis. 1 (1), 119-132 (2012).
  18. Grima, J. C., et al. Mutant Huntingtin Disrupts the Nuclear Pore Complex. Neuron. 94 (1), 93-107 (2017).
  19. Sontag, E. M., et al. Methylene blue modulates huntingtin aggregation intermediates and is protective in Huntington's disease models. J Neurosci. 32 (32), 11109-11119 (2012).
  20. Trushina, E., Rana, S., McMurray, C. T., Hua, D. H. Tricyclic pyrone compounds prevent aggregation and reverse cellular phenotypes caused by expression of mutant huntingtin protein in striatal neurons. BMC Neurosci. 10, 73(2009).
  21. Shahmoradian, S. H., et al. TRiC's tricks inhibit huntingtin aggregation. Elife. 2, e00710(2013).
  22. Kim, Y. M., et al. Proteasome inhibition induces alpha-synuclein SUMOylation and aggregate formation. J Neurol Sci. 307 (1-2), 157-161 (2011).
  23. Goldberg, N. R. S., et al. Human Neural Progenitor Transplantation Rescues Behavior and Reduces alpha-Synuclein in a Transgenic Model of Dementia with Lewy Bodies. Stem Cells Transl Med. 6 (6), 1477-1490 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Huntingtin eiwitprote nefractioneringscheiding van oplosbare en onoplosbare fractieshoog moleculair gewichtWestern blot analyseSDS PAGEprote ne assaycellysecentrifugatiesonicatie
Fractionering voor oplossing van oplosbare en onoplosbare Huntingtin soorten
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.