Methodenartikel

Imaging Intermediaire filamenten en microtubuli met 2-dimensionale directe stochastische optische wederopbouw microscopie

DOI:

10.3791/57087

⸱

6 maart 2018

 ,  ,  , 
1Cell Polarity, Migration and Cancer Unit, UMR 3691, CNRS, Institut Pasteur, 2UTechS Photonic BioImaging (Imagopole) Citech, Institut Pasteur

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het algemene doel van deze methodiek is geven de optimale proefomstandigheden van monstervoorbereiding Beeldacquisitie en wederopbouw om uit te voeren van 2D dubbele dSTORM kleurenafbeeldingen van microtubuli en intermediaire filamenten in vaste cellen

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het cytoskelet, samengesteld uit actine Microfilamenten, microtubuli, en intermediaire filamenten (IF), speelt een sleutelrol in de controle van de cel vorm, polariteit en beweeglijkheid. De organisatie van de netwerken actine en microtubulus heeft uitvoerig bestudeerd maar die van IFs is niet nog volledig gekenmerkt. IFs heeft een gemiddelde diameter van 10 nm en vorm een netwerk uit te breiden in het cytoplasma van de cel. Ze zijn fysiek geassocieerd met actine en microtubuli door moleculaire motoren en cytoskeletal linkers. Deze strakke vereniging is de kern van de regelgevende mechanismen die de gecoördineerde regeling van de drie cytoskeletal netten die nodig zijn voor de meeste functies van de cel. Het is daarom belangrijk om te visualiseren IFs alleen en ook samen met elk van de andere cytoskeletal netwerken. Echter, als netwerken zijn zeer dicht in de meeste soorten cellen, met name in gliacellen, waardoor zijn resolutie zeer moeilijk te bereiken met standaard fluorescentie microscopie (lateraal resolutie van ~ 250 nm). Directe stochastische optische wederopbouw microscopie (dSTORM) is een techniek waardoor een winst in laterale resolutie van een orde van grootte. Hier, laten we dat laterale dSTORM resolutie voldoende is voor het oplossen van de dichte organisatie van de IF-netwerken en, in het bijzonder als bundels omringende microtubuli. Deze strakke vereniging dreigt te deelnemen aan de gecoördineerde verordening van deze twee netwerken en mei, uitleggen hoe vimentin IFs sjabloon en organisatie van de microtubuli stabiliseren alsmede microtubulus afhankelijke vesiculaire handel kunnen beïnvloeden. Meer in het algemeen, laten we zien hoe de observatie van twee cytoskeletal componenten met dual-kleur dSTORM techniek brengt nieuw inzicht in hun wederzijdse interactie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cytoplasmatische Intermediaire filamenten (IFs) zijn 10 nm diameter homo- of heteropolymers van een cel type specifieke deelverzameling van als eiwitten. IFs deelnemen aan een groot aantal cellulaire functies zoals cel proliferatie, beweeglijkheid en stress reacties. Hun belangrijke rol wordt benadrukt door het feit dat meer dan 90 ziekten bij de mens direct door mutaties in als eiwitten veroorzaakt worden; bijvoorbeeld, veranderingen in samenstelling als begeleidt groei van de tumor en de verspreiding van1,2,3. Er is steeds meer aanwijzingen dat de drie systemen van het cytoskelet in samenwerking tot controle cellulaire functies zoals cel polarisatie, divisie en migratie2,3 werken. Aangezien er een nauwe koppeling tussen ruimtelijke architectuur en functies, is het van cruciaal belang zijn om inzicht in de structurele organisatie of als met de andere draden en de cytoskeletal cross-talk beter te begrijpen. Dit artikel bevat een protocol voor het uitvoeren van de super resolutie techniek dual-kleur dSTORM (directe stochastische optische wederopbouw microscopie)4 en hoe het wordt gebruikt voor het onderzoeken van de wisselwerking tussen als en microtubuli in vaste, gekweekt cellen in 2 dimensies (2D).

Verschillende super resolutie technieken zijn ontwikkeld de afgelopen tien jaar, en er ontdekkingen waren op de oorsprong van de Nobelprijs voor de Scheikunde in 20145. Onder al deze technieken ligt de enkel molecuul lokalisatie gebaseerde methoden zoals PALM6 (Photo-Activated lokalisatie microscopie) die gebruik maakt van photoswitchable fluorescente proteïnen, STORM7 met paren van fluorophores of dSTORM4 met conventionele fluorophores. Al deze methoden zijn gebaseerd op hetzelfde principe dat uit (i) de switch van de meeste van de fluorescerende verslaggevers in een "off" staat bestaat"(niet-tl), (ii) de stochastische activering van een subset van hen in een TL staat te lokaliseren hun ruimtelijke positie met nanometer nauwkeurigheid, en (iii) de herhaling van dit proces om te activeren zoveel deelverzamelingen van fluorophores mogelijk. Een uiteindelijke afbeelding wordt gereconstrueerd met behulp van alle taalversies van de geactiveerde moleculen, die een laterale resolutie tot ~ 20-40 nm. Verschillende gecommercialiseerd optische systemen waardoor PALM/STORM zijn nu beschikbaar voor biologen voor routinematige experimenten. Hier, werd een dergelijk systeem gebruikt om de structurele studievereniging van microtubuli en IFs. Onder alle single-molecuul lokalisatie gebaseerde methoden, de techniek dual-kleur dSTORM werd geselecteerd, want het is zeer geschikt voor het observeren van zeer dunne lamellaire gebieden (< 1 µm) van Adherente cellen en kan zorgen voor aanzienlijke verbetering van de resolutie van de afbeelding met minimale investering van tijd en geld. DSTORM is inderdaad een zeer handige en veelzijdige techniek die compatibel is met de standaard organische kleurstoffen routinematig gebruikt voor cellulaire kleuring en immunofluorescentie.

Terwijl één dSTORM kleurenafbeeldingen relatief eenvoudig zijn te verkrijgen met behulp van de fluorophore Alexa6478, vereist dubbele kleur dSTORM voor het optimaliseren van de experimentele omstandigheden, zodat de twee kleurstoffen kunnen goed knipperen in de gekozen buffer, vooral wanneer er beperkte Laser macht. Uitstekende papieren zijn reeds beschikbaar op de methoden instellen Multi-Color beeldbewerking met dSTORM9,10,11,12,13, en deze documenten uitleggen in detail de mogelijke bronnen van artefacten en aangetaste beeldresolutie en instructies om ze te overwinnen. In dit artikel, de optimale proefomstandigheden in termen van fixatie van de cellen, immunokleuring, bereiding van de monsters zijn imaging verwerving en afbeelding wederopbouw beschreven om het verwerven van beelden van dichte cytoplasmatische als netwerken en microtubuli in gliacellen met dual-kleur dSTORM. Kort, de in Chazeau et al.12 beschreven methode van extractie/fixatie werd aangepast aan gliale cellen en gebruikt met een na fixatie stap, geoptimaliseerde antilichamen concentratie, een STORM buffer met 10 mM MEA beschreven in Dempsey9 et al. dat was blijken te zijn optimaal voor de experimentele instellen en het type van de steekproef.

Gliacellen express hoofdzakelijk drie soorten als eiwitten: vimentin, nestin en GFAP (gliale zure fibrillary eiwit). Deze drie eiwitten is gebleken dat waren mede polymeriseren in astrocyten14. Eerder toonden wij met behulp van super resolutie gestructureerd verlichting microscopie (SR SIM) dat deze drie als eiwitten kunnen worden gevonden in de dezelfde interne als gloeidraad en dat zij soortgelijke verdeling en dynamiek in gliacellen 15weergegeven. Als gevolg van de overeenkomsten tussen de drie als eiwitten, werd vimentin kleuring gebruikt als een verslaggever voor het hele netwerk als. Met behulp van dSTORM, kunnen we oplossen hoe beperkt als formulier bundels langs microtubuli, die was niet mogelijk met diffractie microscopie technieken15. Deze opmerkingen kunnen helpen te begrijpen hoe vimentin IFs kunnen sjabloon microtubuli en reguleren van hun groei traject, bevordering van het behoud van een polariteit as tijdens cel migratie16. Super resolutiebeelden belangrijke informatie verstrekt over de wederzijdse interactie van de twee cytoskeletal subsystemen en inzicht in de koppeling tussen ruimtelijke vereniging en lokale functie die celtype specifieke17zou kunnen worden gebracht. In het algemeen, kan dual-kleur dSTORM worden gebruikt om te studeren de Overspraak tussen cytoskeletal elementen of andere soorten organellen, mits goede immunokleuring voorwaarden zijn bereikt in termen van dichtheid en specificiteit. Deze techniek nuttig zal zijn voor beter karakteriseren het cytoskelet wijzigingen waargenomen tijdens astrogliosis en in glioblastoma, de meest voorkomende en meest kwaadaardige tumor van het centrale zenuwstelsel, waar de uitdrukking van als eiwitten is gewijzigd 18 ,19,20,21.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Coverslips voorbereiding (dag 1, 30 min)

  1. De 18-mm nº1.5H (170 µm +/-5µm) glazen coverslips op een kunststof rek plaatsen.
  2. Zet het rek in een bekerglas van 100 mL gevuld met aceton en weken voor 5 min.
  3. Het rek overbrengen in een bekerglas van 100 mL gevuld met absolute ethanol en weken voor 5 min.
  4. Het rek overbrengen naar een nieuw bekerglas van 100 mL gevuld met absolute ethanol en plaats het bekerglas in een ultrasone reiniger apparaat (zie tabel van materialen) bij kamertemperatuur. Druk op "on" en wacht 10 minuten.
  5. Het rek onder de motorkap van een laminaire flow en laat de coverslips droog of drogen van de coverslips met gefilterde luchtstroom.
  6. Zet het rek met coverslips in een schonere plasma-apparaat. Zet de vacuümpomp, de deur dicht, wachten op 3 min te maken van het vacuüm en overschakelen op de plasma voor 1 min. Gebruik de coverslips kort na het schoonmaken. Bewaar ze niet.

2. cel beplating (dag 1, 20 min)

  1. Groeien de gliale cellijn U373 in Minimum essentiële Medium (MEM) met 10% foetale runderserum, 1% penicilline-streptomycine, en 1% niet-essentiële aminozuur in 10 cm diameter kunststof petrischaal.
  2. Plaats van schone glazen coverslips in 12-Wells-platen onder de motorkap laminaire flow en voeg 1 mL voorverwarmde cel voedingsbodem per putje.
  3. Neem een schotel met cellen uit de cel incubator (37 ° C, 5% CO2).
  4. Verwijder het medium en voeg 10 mL PBS.
  5. Verwijder de PBS en voeg 1 mL 0,05% trypsine-EDTA.
  6. Zet de schotel terug in de incubator voor 2-3 min.
  7. Voeg 10 mL van warme medium voorverwarmd bij 37 ° C op de schotel en resuspendeer de cellen.
  8. Zaad ongeveer 100.000 cellen per putje (~ 150 µL van cellen) in de 12-Wells-platen die de coverslips bevatten.
  9. Wacht ten minste 6 uur (of 's nachts) om de verspreiding van de cel.

3. cel fixatie (dag 2, 2h)

  1. Het cytoskelet buffer met 80 mM buizen, 7 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 150 mM NaCl, bereiden en breng de pH op 6.9.
  2. Wassen van de cellen een keer met PBS.
  3. Verwijder de PBS en voeg voorzichtig 1 mL per putje van extractie/fixatie oplossing (0,25% Glutaaraldehyde, 0,3% Triton X-100 in de buffer cytoskelet) voorverwarmd bij 37 ° C.
  4. Incubeer gedurende 60 s bij kamertemperatuur.
  5. Verwijder de oplossing en zachtjes Voeg 1 mL per putje van voorverwarmde en vers bereide 4% PFA (paraformaldehyde) oplossing verdund in de buffer van het cytoskelet.
    Let op: Gebruik van handschoenen en werken onder de chemische motorkap.
  6. Plaats de 12-well plaat terug in de incubator bij 37° C gedurende 10 minuten.
  7. Verwijder de PFA en voeg 3 mL PBS per well.
    Opmerking: Werken onder de chemische motorkap met handschoenen en zet de gerecycleerde PFA in een bepaalde opslaglocatie.
  8. Spoel tweemaal met PBS.
  9. Verwijder de PBS en vers bereide 10 mM NaBH4 oplossing verdund in PBS om het doven van de autofluorescence vanuit Glutaaraldehyde toevoegen.
  10. Incubeer gedurende 7 minuten bij kamertemperatuur.
  11. Zet de gerecycleerde NaBH4 in een bepaalde opslaglocatie.
  12. Driemaal 5 minuten wassen met PBS.
  13. Verwijder van de PBS en voeg de blokkerende oplossing (5% BSA in PBS).
  14. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (of 's nachts bij 4 ° C).
    Opmerking: Het cytoskelet buffer kan worden opgeslagen bij kamertemperatuur voor een paar maanden. PFA, NaBH4 en Glutaaraldehyde moeten worden behandeld met speciale zorg (kap, handschoenen en specifieke recycling bakken). Oplossingen moeten worden toegevoegd en verwijderd zachtjes om het behoud van de integriteit van de cellen. Het is belangrijk om niet laten de cellen droog.

4. immunokleuring (dag 2, 5h)

  1. Bereid de oplossing van primaire antilichamen met behulp van anti-vimentin en anti-tubuline met een verdunning van de 1:500 in de blokkerende oplossing.
  2. Verdunde primaire antilichamen 100 µL druppels zetten een paraffine film laag en plaats de coverslips op de top van hen met cellen naar beneden.
  3. Incubeer de cellen met primaire antilichamen voor 2 h. Zet de coverslips terug in een 12-well bord gevuld met PBS. Spoel driemaal gedurende 5 minuten elke keer in PBS bij kamertemperatuur op een roteerschudapparaat.
  4. In de tussentijd bereidt de oplossing van de secundaire antilichamen met behulp van anti-muis Alexa647 en anti-rat Alexa555 bij een verdunning van een 1:1, 000 in de blokkerende oplossing. Incubeer de cellen met secundaire antilichamen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Ga verder zoals 4.2. de cellen beschermen tegen licht.
  5. Zet het dekglaasje aan terug in een 12-well plaat gevuld met PBS. Spoel driemaal gedurende 5 minuten elke keer in PBS bij kamertemperatuur op een roteerschudapparaat. Verwijder de PBS en Voeg 0,5 mL PBS vermengd met 1 µL van 0.1 µm tetraspeck kralen.
  6. Zet de putten op een roteerschudapparaat voor 30 min. spoelen met PBS. Verwijder de PBS en Incubeer de cellen gedurende 5 minuten met een 4% PFA oplossing in PBS. Spoel driemaal in PBS.
    Opmerking: Vaste cellen kunnen worden opgeslagen voor een paar weken in PBS bij 4° C. Immunokleuring moet gebeuren op het laatste moment.

5. monstervoorbereiding (dag 3, 5 min)

  1. Zet aliquots van MEA (cysteamine, 1 M, pH 8.3), glucose-oxidase (100 x, 50 mg/mL), katalase (500 x, 20 mg/mL) in een ijs-mand.
  2. Bereiden van 50 mL Tris-NaCl buffer (50 mM Tris, 10 mM NaCl, pH = 8) aangevuld met 10% van de glucose (100 mg/mL).
  3. 1.2 mL imaging buffer net voor beeldbewerking met 10 mM MEA, 0,5 mg/mL (75 U/mL) glucose oxidase, 40 µg/mL katalase (80-200 U/mL) voor te bereiden in de Tris-NaCl buffer met 10% glucose.
  4. Mount het dekglaasje aan met de gelabelde cellen op de magnetische monsterhouder (b.v. chamlide kamer) en voeg de imaging buffer om de kamer volledig te vullen. Zet het deksel op en zorg ervoor dat er geen luchtbellen tussen de imaging buffer en het deksel.
  5. Reinig de onderkant van het monster met absolute ethanol en controleer of er geen lek. Gebruik vet te verzegelen van de monsterhouder goed indien nodig.
    Opmerking: Bereiden van 1 M voorraad van MEA oplossing (pH 8.3 aangepast met behulp van HCl), de voorraad van glucose-oxidase bij 50 mg/mL en de voorraad van katalase bij 20 mg/mL in water, maak aliquots en sla ze op-20 ° C voor maximaal één maand voor MEA en een jaar voor glucose-oxidase en katalase. Refreeze niet aliquots. De Tris-NaCl buffer bereiden en op te slaan bij kamertemperatuur gedurende enkele maanden. Voeg glucose op de dag van het experiment (stap 5.3).

6. Beeldacquisitie (dag 3, ~ 1h per cel)

  1. Schakel de Microscoop. Zet de acquisitie software en druk op Start systeem.
  2. Selecteer de knoppen uitvouwen van overname , Tab. het hulpprogramma Setup Imaging in de groep van het hulpprogramma Setup Manager. Selecteer de modus laser WF (breed veld) van overname. Selecteer het doel 100 X nb 1.46 . Selecteer het TIRF u-HP -modus die gebruikmaakt van een collimator te verminderen van het gezichtsveld worden verlicht en de laser energie te concentreren in een kleiner gebied. Gebruik de optovar 1.6 x lens waarmee een pixelgrootte van 100nm.
  3. Selecteer het gereedschap van de tijdreeksen en de time-lapse met 50 000 frames en 0.0 ms tussen frames instellen. Vouw het gereedschap van de kanalen in de acquisitie parameter gereedschapsgroep en selecteer "Toon alle".
  4. Instellen van de Alexa647-track: Controleer de 642 en 405 laser lijnen voor excitatie en aanvaarden om in te schakelen hen. Selecteer het filter "655 LP" emissie in de Imaging Setup. Wijzig de naam van "647".
  5. Klik op '+' in het hulpprogramma kanalen toe te voegen nog een licht pas en selecteer de modus "schakelaar track elke: frame" in het hulpprogramma Setup Imaging . 561, 488 en 405 laserlijnen controleren en aanvaarden om in te schakelen hen. Selecteer de "BP 570-650 + LP750" emissie filteren en gebruik optovar lens 1.6 x. Controleer of de TIRF-uHP-modus is geselecteerd. Wijzig de naam van de track "555".
  6. Selecteer het gereedschap overname modus en stelt u de framegrootte op 200 x 200 pixels. Selecteer het gereedschap Focus apparaten en strategie en de duidelijke focus op 1 000 frames instellen (als er een focus-lock-systeem).
  7. Olie zetten de doelstelling en het monster in te zetten. Selecteer het tabblad zoeken , en open de sluiter van de fluorescentie-lamp. Zoek de focus en kijk voor de cel op het beeld met behulp van het oculair. Zet het in het midden van het gezichtsveld met behulp van de joystick.
  8. Selecteer het tabblad overname om terug te gaan naar de overname-modus. Selecteer de "647" track, stel de 642-laser macht tot 0,2%, stel de 405-laser macht om 0, de belichtingstijd ingesteld op 50 ms en de winst van 50. Kies de modus doorlopend overname te observeren van de cel op het scherm. De focus aanpassen. Zorg ervoor dat er ten minste één tetraspeck parel in het gezichtsveld, verhoogt het contrast om ze te zien indien nodig. Een auto-schaal modus gebruiken voor de weergave. Neem een beeld van de breed-gebied epifluorescence van het vimentin-netwerk door te klikken op Uitlijnen en opslaan. Controleer de TIRF verlichting, klik op TIRF, de hoek van de verlichting en/of collimator aanpassen indien nodig hebben van een homogeen veld van verlichting en opslaan.
    Opmerking: Het is belangrijk dat de TIRF en epifluorescerende beelden van hoge kwaliteit zijn voordat u start van de ruwe data-acquisitie. Discontinue, niet-uniforme wijze gelabelde filamenten zal aanleiding geven tot slechte kwaliteit dSTORM beelden.
  9. Uncheck de "647" track en selecteren en controleren van de "555" track. Neem een beeld van de epifluorescence van het netwerk van microtubuli en opslaan. Nemen van een TIRF afbeelding en sla het ook.
  10. Uncheck de "555" track, selecteren en controleren de "647" track en druk op continue. De winst op 0 zetten en belichtingstijd op 10 ms. Stel de 642-nm laser macht tot 100% om het grootste deel van de Alexa647-kleurstoffen pomp aan de donkere staat (~ 2 kW/cm2). Zodra de fluorophores beginnen te knipperen, zet de blootstelling aan 15 ms en krijgen tot 300. Selecteer de wijze van de TIRF van de verlichting. Het bereik indicator -modus zonder auto-schaal gebruiken om te verifiëren dat enkel molecuul signalen doen niet het verzadigen van de camera (aangegeven door de rode kleur). In dat geval de winst te verlagen totdat de verzadiging verdwijnt. Tetraspeck kralen blijft verzadigde aan het begin van de overname. Druk op Stop om te stoppen met de voortdurende aandacht van de cel.
  11. Vouw van de tool Online verwerking en controleer Online verwerking van PALM om te visualiseren van het beeld van de STORM tijdens de overname. Gebruik de volgende parameters: 9 voor de piek masker grootte (diameter 9 pixels), en 6 voor de piek intensiteit aan lawaai. Scripties parameters definieert de moleculen die bij de verwerking (helder genoeg en niet overlappende) in aanmerking worden genomen. Selecteer in de PAL-statistieken tool, Plot type: histogramen Histogram Bron: Precision. Druk op Start acquisitie.
  12. Heroriënteren tijdens aankoop, indien nodig (als er geen focus-lock device). Aanpassen van de parameters (blootstelling, laser bevoegdheden) en uiteindelijk zet de lijn van de 405-nm laser (vanaf 0,001%) te houden een middelhoge dichtheid van fluorophores met een minimale afstand van 1 µm tussen afzonderlijke moleculen (> 9 pixels van 100 nm, de piek masker grootte) ( Figuur 1A-B). Als de dichtheid van het molecuul een beetje te hoog is, gebruiken de HILO (zeer geneigd en optische gelamineerd blad) wijze van verlichting in plaats van TIRF. Dit zal de kracht van de laser met 20% verhogen. Ervoor te zorgen dat de piek van lokalisatie precisie op het histogram onder de gereconstrueerde afbeelding is gecentreerd rond of minder dan 10 nm.
    Opmerking: Meestal vermindert het aantal moleculen met tijd, en de kracht van 405 nm laser is langzaam dienovereenkomstig verhoogd. Het doel is het verminderen van de localisatie precisie (histogram weergegeven onder de Super resolutiebeeld) zoveel mogelijk met een piek minder dan 10 nm (Figuur 1 c). Verhoogt het contrast van de afbeelding van de PALM indien nodig, als te veel heldere kralen in het veld aanwezig zijn.
  13. Druk op Stop om te stoppen met de film wanneer meer dan 106 lokalisaties hebben bereikt (meestal na 40 000 frames). De lasers terug naar 0,2% zetten (642 nm) en 0 (405 nm). De ruwe gegevens van de STORM-overname opslaan met de indeling .czi. Uncheck track "647" in het hulpprogramma voor kanalen en selecteren en controleren van de track "555".
  14. De belichtingstijd ingesteld op 25 ms en krijgen tot 0. Druk op de knop continue en zowel 488 en 561 lasers vastgesteldop 100% tot pomp Alexa555 kleurstoffen aan de donkere staat (~ 2 kW/cm2 elk). Zodra de fluorophores beginnen te knipperen, zet de winst tot 250, de HILO verlichting modus gebruiken en controleren dat afzonderlijke moleculen niet de camera met de mode van de indicator bereik verzadigen doen. Als dat het geval, verlagen de winst. Druk op Stop. De kracht van de 488-laser tot 50% afnemen.
  15. Druk op Start acquisitie. Tijdens de overname, verhoog geleidelijk de winst om altijd op de grens van verzadiging. Stap voor stap de kracht van de laser van 405 nm te houden een middelhoge dichtheid van één molecuul in het gezichtsveld (zie stap 6.18) verhogen. De kracht van de 488 laser tot 20-30% dalen wanneer de 405 laser hoger is dan 15%. Vervolgens dalen geleidelijk de 488 terwijl het verhogen van de 405 laser lijn zodat het knipperen van de moleculen zo snel mogelijk. De 488 laser lijn in combinatie met de laser 561 excitatie bij maximale intensiteit verhoogt op zowel de korting op de tarieven van de fluorophores, terwijl de 405 laser lijn alleen de op tarief verhoogt.
  16. Stop de overname als de taalversies van de meer dan 500 000 hebben bereikt (na ongeveer 20 000 frames) of meer wanneer geen meer moleculen knipperen. De ruwe gegevens van de STORM-overname opslaan met de indeling .czi.
    Opmerking: Begin altijd met de hogere golflengte te vermijden bleken (of activering) van de andere kleuren. Aangezien de chamlide kamer niet is afgesloten, is het mogelijk de imaging buffer om regelmatig te wijzigen, bijvoorbeeld om te testen verschillende buffer voorwaarden. Met behulp van de 488 laser lijn aan het afbreken van de Alexa 555 kleurstoffen is alleen nodig als de 561 laser macht beperkt (met 100 mW lasers is).

7. image wederopbouw (5 min)

  1. Gebruik het Model-gebaseerde correctie type met automatische segmenten met een maximale grootte van 8 in het hulpprogramma voor PAL-Drift . Druk op toepassen meerdere keren in een rij totdat de drift wordt gecorrigeerd. Dit model-gebaseerde correctie geldt een algoritme gebaseerd op cross-correlatie analyse die de drift corrigeert.
  2. Met behulp van de hulpprogramma's voor PAL-Filter , verbeteren het uiterlijk van de afbeelding van de STORM door het selecteren van alleen de moleculen die best waren gelokaliseerd. Bijvoorbeeld het beperken van de localisatie precisie tot en met 30 nm en de PSF tot 120-180 nm.
  3. Gebruik een pixelresolutie van 5 of 10 nm in de PAL-render tool, evenals een Gaussiaanse weergavemodus, met een factor van de uitbreiding van 1 PSF Selecteer renderen auto dynamisch bereik HR met een waarde van 95% en Render auto dynamisch bereik SWF-met een waarde van 90%. Selecteer de Render beste kwaliteit.
  4. Selecteer de PALM converteren, in het menu van de PALM van het tabblad verwerking (post-processing modus). Druk op selecteren , en vervolgens toepassen. De gemaakte afbeelding opslaan met een formaat. LSM (en niet .czi, zeer belangrijk).
    Opmerking: De wederopbouw van de afbeelding kan worden uitgevoerd onmiddellijk na de verwerving of later met behulp van de beeldverwerking-modus van de acquisitie software. In de off line post-verwerkingsmodus voor gebruikersgroepsbeleid, is het mogelijk om opnieuw analyseren de stapels met verschillende waarden voor de parameters (piek masker grootte, piek intensiteit aan lawaai). Altijd kiezen om te "negeren overlappende moleculen" en niet "gemiddelde voordat localisatie".

8. de schatting van de nauwkeurigheid van de lokalisatie van een beeld van de STORM (10 min)

  1. Open uw STORM ruwe gegevens en gebruik van de beeldverwerking tab. Selecteer de methode van de PALM en dan PALM weer. Druk op selecteren.
  2. Druk op toepassen om te beginnen met de wederopbouw met behulp van een piek masker grootte van 9 en een piek intensiteit aan lawaai van 6 (of de parameters die u voor de afbeelding kiest).
  3. Selecteer het gereedschap Rechthoek Graphics en teken een rechthoek op de onbewerkte afbeelding rond een enkel molecuul aanwezig op het glasoppervlak. Er zijn meestal een paar afzonderlijke moleculen er.
  4. Druk op toepassen opnieuw, en alleen de moleculen aanwezig binnen de regio van de rechthoek zal worden geanalyseerd.
  5. Selecteer in de PAL-statistieken tool, Plot type: histogram en Histogram Bron: X positie of Y-positie, te visualiseren de positie histogrammen.
  6. Sla de tabel met de lijst met taalversies van de aan de linkerkant onder de foto's.
  7. Met behulp van een software voor data-analyse, het maken van histogrammen van X en Y-posities (Figuur 1 d).
  8. Passen de distributies door een Gaussiaan en sla de σX en σY -waarden. De lokalisatie precisie σSMLM wordt geschat door (σX *σY) ^ 0,5.
  9. Herhaal stap 8.3-8.8 op zoveel moleculen mogelijk en het gemiddelde van de σSMLM

9. kanaal registratie (5 min)

  1. Open de afbeelding van de STORM van elke kleur met behulp van de software van Fiji (afbeelding J).
  2. Selecteer het gereedschap Toverstaf voor het meten van de standpunten van elk tetraspeck-kralen.
  3. Berekenen van de X- en Y-verschuivingen voor elke kraal en gemiddelde hen.
  4. De opdracht "Vertalen" te vertalen van het tweede beeld met de berekende X- en Y-verschuivingen.
  5. Het samenvoegen van de twee afbeeldingen met behulp van de opdracht Kanalen verenigen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een microscoop voorzien van 50 mW 405 nm en 100 mW 488, 561 en 642 nm solid-state lasers, een EMCCD van 512 x 512 camera, een alpha Plan Apo 100 X / 1,46 objectieve en Band Pass 570-650 / lange Pass 655 emissie filters werd gebruikt voor de representatieve resultaten hieronder gepresenteerd.

Figuur 1A geeft een voorbeeld van het molecuul dichtheid en signaal / ruisverhouding dat tijdens raw image aq...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kritische stappen in het protocol

Wij presenteren hier een protocol die artefacten in de dSTORM beelden van microtubuli en IFs in gliacellen minimaliseert. Artefacten kunnen worden gecreëerd bij elke stap van de bereiding van de monsters en de beeldvorming: fixatie, blokkeren, immunolabeling, drift tijdens overname, niet-optimale knipperende voorwaarden23. We geven hieronder de belangrijkste stappen.

Schoonmaken van de covers...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken Mickael Lelek, Orestis Faklaris en Nicolas Bourg voor vruchtbare discussie, Andrey Aristov en Elena Rensen voor hulp met de techniek van de super resolutie Shailaja Seetharaman voor zorgvuldige lezing van het manuscript. Wij erkennen dankbaar de UtechS fotonische BioImaging (Imagopole) Citech van Institut Pasteur (Parijs, Frankrijk), alsmede de Frankrijk-BioImaging infrastructuurnetwerk ondersteund door het Franse nationale Research Agency (ANR-10-INSB-04; Investeringen voor de toekomst), en de Région Ile-de-France (program Domaine d'Intérêt Majeur-Malinf) voor het gebruik van de Microscoop van Elyra. Dit werk werd gesteund door de de Ligue Contre le Cancer en het Frans National Research Agency (ANR-16-CE13-0019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Minimum Essential Media (MEM)Gibco41090-028celcultuur
non essential amino acidGibco1140-050celcultuur 1/100e
Penicillin-StreptomycinGibco15140-122celcultuur 1/100e
Fœtaal bovien serumGibco10270-106celcultuur 1/10e
0,05 % Trypsin-EDTA (1X)Gibco25300-054celcultuur
PBS 10xfischer scientific11540486celcultuur
coverslip 18 mm n°1,5HMarienfield/Dominic dutsher900556coverslips
paraformaldehyde (PFA) oplossingSigmaF8775celfixatie
glutaraldehydeSigmaG5882celfixatie
triton X100SigmaT9284niet-ionogene oppervlakteactieve stof. Gebruikt voor celfixatie
natriumborohydrid (NaBH4)Sigma452904-25MLcelfixatie
BSASigmaA7906monsterpassivatie 3% in PBS
Monoklonaal anti-Vimentin (V9) antilichaam geproduceerd in muisSigmaV6630primaire antilichamen
Rat anti alpha tubulinBioradMCA77Gprimaire antilichamen
Geit anti-Rat IgG (H+L) secundair antilichaam, Alexa Fluor 555Fisher scientific10635923secundaire antilichamen
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) secundair antilichaam, Alexa Fluor 647Fisher scientific10226162secundaire antilichamen
TetraSpeck Microspheres, 0,1 µm, fluorescent blauw/groen/oranje/donker roodFisher scientificT7279fluorescente kralen
Chamlide magnetische kamerLive Cell InstrumentCM-B18-1magnetische monsterhouder, maximaal volume 1,2 mL
Cysteamine (MEA)Sigma30070voor de knipperende buffer
glucose oxidase uit Aspergillus nigerSigmaG0543voor de knipperende buffer
glucosesigmavoor de knipperende buffer
catalase uit runderleverSigmaC9322voor de knipperende buffer
Tris (trizma)SigmaT1503voor de knipperende buffer
Wash-N-Dry coversliprekSigmaZ688568
ParafilmSigmaP7793-1EAparaffine film
ultrasoon wasserFisher scientific15-335-6
plasma wasserHarrick plasmaPDC-32G-2

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Herrmann, H., Aebi, U. Intermediate Filaments: Structure and Assembly. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (11), (2016).
  2. Huber, F., Boire, A., Lopez, M. P., Koenderink, G. H. Cytoskeletal crosstalk: when three different personalities team up. Curr Opin Cell Biol. 32, 39-47 (2015).
  3. Leduc, C., Etienne-Manneville, S. Intermediate filaments in cell migration and invasion: the unusual suspects. Curr Opin Cell Biol. 32, 102-112 (2015).
  4. Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Ed Engl. 47 (33), 6172-6176 (2008).
  5. Gevaux, D. Nobel Prize in Chemistry: seeing the nanoscale. Nat Nanotechnol. 9 (11), 878(2014).
  6. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  7. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  8. Metcalf, D. J., Edwards, R., Kumarswami, N., Knight, A. E. Test samples for optimizing STORM super-resolution microscopy. J Vis Exp. (79), (2013).
  9. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
  10. Dempsey, G. T. A user's guide to localization-based super-resolution fluorescence imaging. Methods Cell Biol. 114, 561-592 (2013).
  11. van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protoc. 6 (7), 991-1009 (2011).
  12. Chazeau, A., Katrukha, E. A., Hoogenraad, C. C., Kapitein, L. C. Studying neuronal microtubule organization and microtubule-associated proteins using single molecule localization microscopy. Methods Cell Biol. 131, 127-149 (2016).
  13. Olivier, N., Keller, D., Rajan, V. S., Gonczy, P., Manley, S. Simple buffers for 3D STORM microscopy. Biomed Opt Express. 4 (6), 885-899 (2013).
  14. Eliasson, C., et al. Intermediate filament protein partnership in astrocytes. J Biol Chem. 274 (34), 23996-24006 (1999).
  15. Leduc, C., Etienne-Manneville, S. Regulation of microtubule-associated motors drives intermediate filament network polarization. J Cell Biol. 216 (6), 1689-1703 (2017).
  16. Gan, Z., et al. Vimentin Intermediate Filaments Template Microtubule Networks to Enhance Persistence in Cell Polarity and Directed Migration. Cell Syst. 3 (5), 500-501 (2016).
  17. Nieuwenhuizen, R. P., et al. Co-Orientation: Quantifying Simultaneous Co-Localization and Orientational Alignment of Filaments in Light Microscopy. PLoS One. 10 (7), e0131756(2015).
  18. Yang, Z., Wang, K. K. Glial fibrillary acidic protein: from intermediate filament assembly and gliosis to neurobiomarker. Trends Neurosci. 38 (6), 364-374 (2015).
  19. Maslehaty, H., Cordovi, S., Hefti, M. Symptomatic spinal metastases of intracranial glioblastoma: clinical characteristics and pathomechanism relating to GFAP expression. J Neurooncol. 101 (2), 329-333 (2011).
  20. Hol, E. M., Pekny, M. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and the astrocyte intermediate filament system in diseases of the central nervous system. Curr Opin Cell Biol. 32, 121-130 (2015).
  21. Skalli, O., et al. Astrocytoma grade IV (glioblastoma multiforme) displays 3 subtypes with unique expression profiles of intermediate filament proteins. Hum Pathol. 44 (10), 2081-2088 (2013).
  22. Endesfelder, U., Malkusch, S., Fricke, F., Heilemann, M. A simple method to estimate the average localization precision of a single-molecule localization microscopy experiment. Histochem Cell Biol. 141 (6), 629-638 (2014).
  23. Whelan, D. R., Bell, T. D. Image artifacts in single molecule localization microscopy: why optimization of sample preparation protocols matters. Sci Rep. 5, 7924(2015).
  24. Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
  25. Olivier, N., Keller, D., Gonczy, P., Manley, S. Resolution doubling in 3D-STORM imaging through improved buffers. PLoS One. 8 (7), e69004(2013).
  26. Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., van den Broek, B., Jalink, K. Optimizing Imaging Conditions for Demanding Multi-Color Super Resolution Localization Microscopy. PLoS One. 11 (7), e0158884(2016).
  27. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
  28. Mikhaylova, M., et al. Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies. Nat Commun. 6, 7933(2015).
  29. Nieuwenhuizen, R. P., et al. Measuring image resolution in optical nanoscopy. Nat Methods. 10 (6), 557-562 (2013).
  30. Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nat Protoc. 12 (6), 1198-1228 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

dSTORM imagingtweekleuren STORMvimentinefilamentencytoskeletale netwerkenmonstervoorbereidingbeeldreconstructiefluorescentiemicroscopiesuperresolutiemicroscopie

Gerelateerde artikelen